Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Ovo Electroporation i Chicken Auditory Brainstem

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55628
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

Auditoriska hjärnstammarneuroner av avians och däggdjur är specialiserade på snabb neural kodning, en grundläggande process för normala hörselfunktioner. Dessa neuroner härrör från tydliga prekursorer av embryonisk hindbrain. Vi presenterar tekniker som använder elektroporation för att uttrycka gener i bakbenet av kycklingembryon för att studera genfunktionen under hörselutveckling.

Abstract

Elektroporation är en metod som introducerar gener av intresse för biologiskt relevanta organismer som kycklingembryon. Det är länge etablerat att kycklingembryon är en effektiv forskningsmodell för att studera grundläggande biologiska funktioner för hörselsystemutveckling. På senare tid har kycklingembryot blivit särskilt värdefullt när man studerar genuttryck, reglering och funktion i samband med hörsel. I ovo kan elektroporation användas för att rikta sig till hörselhjärnstamregioner som är ansvariga för högspecialiserade hörselfunktioner. Dessa regioner innefattar kycklingkärnans magnocellularis (NM) och kärnan laminaris (NL). NM- och NL-neuroner uppstår från tydliga prekursorer av rhombomerer 5 och 6 (R5 / R6). Här presenterar vi i ovo elektroporation av plasmidkodade gener för att studera genrelaterade egenskaper i dessa regioner. Vi visar en metod för rumslig och tidsmässig kontroll av genuttryck som främjar antingen vinst eller förlust av funktionell fenotypes. Genom att rikta auditiva neurala progenitorregioner associerade med R5 / R6 visar vi plasmidtransfektion i NM och NL. Temporal reglering av genuttryck kan åstadkommas genom att anta ett tet-on-vektorsystem. Detta är ett läkemedelsinducerbart förfarande som uttrycker genen av intresse i närvaro av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporationstekniken - tillsammans med antingen biokemiska, farmakologiska och eller in vivo funktionella analyser - tillhandahålls ett innovativt tillvägagångssätt för att studera hörselnormutveckling och associerade patofysiologiska fenomen.

Introduction

Snabb neural kodning av ljud är avgörande för normala hörselfunktioner. Dessa inkluderar ljudlokaliseringsförmåga 1 , tal i brusdiskriminering 2 och förståelsen av andra beteenderelevanta kommunikationssignaler 3 . Analoga neuroner som finns i den auditiva hjärnstammen hos både avianer och däggdjur är högspecialiserade för snabb neural kodning 4 . Dessa inkluderar kycklingkärnans magnocellularis (NM), kärnlaminarisen (NL) och deras däggdjursanaloger, den anteroventrala cochleära kärnan (AVCN) och den mediala överlägsen olivan (MSO) respektive 5 . Utvecklingsmekanismer som reglerar snabb neuralkodning är emellertid dåligt förstådda i den auditiva hjärnstammen. Därför är det fördelaktigt att studera specifika gener som ansvarar för snabb neural kodning för att bättre förstå deras uttryck, reglering och funktion i auDiktutveckling.

Den utvecklande kycklingembryon är ett effektivt och väletablerat forskningsverktyg för att studera grundläggande biologiska frågor om hörsystemutveckling 6 , 7 . Nyliga molekylära framsteg har behandlat dessa biologiska frågor i det utvecklande kycklingembryon genom att uttrycka eller knacka ner gener av intresse för att analysera in vivo genfunktion 8 , 9 . Undersökning av specifika geners reglerande roll är en betydande framsteg när det gäller att förstå patologier som hör samman med hörselunderskott. Här presenterar vi i ovo elektroporation av plasmidkodade gener i den hönshörande hjärnstammen där snabb neural kodning av ljud inträffar 10 . Genom att rikta auditiva neurala progenitorregioner associerade med rombomerer 5 och 6 11 , 12 (R5 /R6) visar vi rumslig kontroll av plasmidtransfektion i NM och NL. Dessutom visar vi temporell reglering av uttryck genom att anta ett tet-on-vektorsystem. Detta är ett läkemedelsinducerbart förfarande som uttrycker genen av intresse i närvaro av doxycyklin (Dox) 8 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av institutioner för institutionell djurvård och användningskommittéer från Nordvästuniversitetet och genomfördes i enlighet med nationella institut för hälsovårdsriktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur.

1. Ägghantering

  1. Köp befruktade ägg från en lokal leverantör. Förvara ägg vid 13 ° C i kylskåp i högst 5 dagar före inkubation. Livskraften hos embryon minskar avsevärt efter 1 vecka.
  2. Swab varje ägg med 70% etanol innan du placerar i inkubatorn.
  3. Ange 1-2 dussin ägg på deras sidor i en inkubator med temperaturen inställd till 38 ° C vid ~ 50% fuktighet. Detta säkerställer korrekt embryopositionering för elektroporation respektive optimal bärbarhet.
    OBS: Efter 48-52 timmars inkubation kommer äggen att ligga vid Hamburger-Hamilton (HH) steg ~ 12-13 och redo för elektroporation.

2. Framställning

  1. Plasmid Mixing
    1. Tillsätt 1 μL 0,1% snabb grön (0,1% i 18 MΩ avjoniserad och destillerad H2O [ddH2O]) för varje 7 / il DNA-blandning.
    2. För sam-elektroporering av flera plasmider, blanda plasmider i ett förhållande 1: 1. Den slutliga DNA-koncentrationen bör vara 5-8 μg / μl.
  2. Fyll injektionspipetten
    1. Dra pipetter på en mikropipettdragare. Fyll pipetten med 1-2 μL plasmider med en 28G sprutnål.
    2. Bryt pipettips till 10 - 20 μm med hjälp av pincett. Använd ett mikroskop för att hjälpa till att bestämma storleken på den brutna pipettens spets. Fäst pipetten på pipetthållaren på picospritzern.

3. Windowing

OBS: Fönstret har publicerats före 13 . Se referens 13 för ytterligare visuell information.

  1. Torka alla instrument och arbetsområdet med 70%etanol.
  2. Ta det önskade antalet uppsatta ägg ur inkubatorn (mellan 6-10), lämna vid rumstemperatur, och viska ägg individuellt med 70% etanol igen. Ägg förblir livskraftiga under minst 2 timmar efter inkubatoravlägsnande.
  3. Placera ägget ovanpå en ljusbelysning för att identifiera embryopositionering. Kringa mitt i det mörka området ( dvs. embryo) med en penna.
  4. Använd en 19G-nål och peka ett hål i den trubbiga änden av ägget.
  5. Poke ett annat hål nära den rita cirkeln på äggets spetsiga sida. Ta bort en liten del av den yttre äggskalan (ca 16 mm 2 ) med 19G nålen och ta sedan bort ett litet stycke av det inre äggskalet (ca 8 mm 2 ) med tång.
  6. Med en 3 ml spruta försedd med en 19G-nål, ta ut 1,5-2,5 ml albumin från ägget genom det trubbiga ändhålet. Var noga med att vinkla nålen nedåt vid 45 °.
  7. Täck det oändliga hålet med en liten bit tejp (1 cm x 1 cm). Täck den dras cirkeln anD det andra hålet med tejp (2,5 cm x 4 cm).
  8. Med böjda saxar (skärkant = 2,5 cm) skär ett fönster i cirkeln. Saxar ska vara parallella med äggskal och fönsterets diameter bör vara mindre än 2 cm.

4. Plasmidinjektion

  1. Slå på picospritzer. Ställ trycket på 18 psi och varaktigheten till 5 μs. Slå på lufttanken och lampan för dissektionsmikroskopet.
  2. Gör 30 ml stamlösning av en 1:10 utspädning av köpköpt indisk bläck blandat i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förvara vid 4 ° C. Injektion av indisk bläck är ett viktigt steg för att få en bättre visualisering av kycklingembryon.
    1. Fyll en 1 ml spruta med den utspädda indiska färglösningen. Fäst en 27G nål och utvisa eventuella bubblor som finns i sprutan.
    2. Sätt in nålen precis under äggula membranet ~ 2 - 3 mm från embryot och injicera ~ 0,2 ml indiskt bläck försiktigt under embryot. DoInjicera inte mer än 0,5 ml av den indiska bläcken eftersom det kan minska embryoöverlevnaden.
  3. Placera det fönsterade ägget på en ägghållare under dissektionsmikroskopet. Använd den högsta förstoringen för bästa visualisering av plasmidinjektionsstället.
  4. Använd pincett, ta bort membranet över injektionsområdet. Auditiva hjärnstamområden av intresse ( dvs. NM och NL) härrör från Rhombomeres 5 och 6 (R5 / R6). R5 / R6 är belägna intill otocyterna (en embryonisk struktur hos ryggradsdjur som utvecklas till inre örat) som fungerar som landmärken för R5 / R6 plasmidinjektioner.
  5. Sänk den DNA-fyllda pipetten in i det neurala röret som ligger över R5 / R6-regionen och mellan otocyter med hjälp av mikromanipulatorn. En schema över idealisk placering visas i Figur 1A .
  6. Applicera lufttryck (18 psi, 5 μs varaktighet) från picospritzeren för att mata ut DNA i neuralröret.

5. Elektroporation

  1. Slå på tHan aktuell / spänningsstimulator.
  2. Fyll en 3 ml spruta med PBS och fäst sprutfiltret. Tillsätt 1-2 droppar PBS på embryot.
  3. Sänk den bipolära elektroden till embryot med hjälp av mikromanipulatorn med den negativa elektroden över injektionsstället (medial) och den positiva elektroden i sidled till R5 / R6 ( Figur 1A ). Undvik direkt kontakt med embryot. Använd bipolära elektroder där elektrodmaterialet är platina iridium. Justera avståndet mellan spetsarna till 0,5 mm med tangor.
  4. Använd en ström / spänningsstimulator, puls 20 gånger vid 50 V i 1 ms med 1 s intervaller.
  5. Efter elektroporation tillsätt en droppe PBS över det exponerade området. Ta försiktigt bort elektroden och rengör den med en laboratorievävnad och 70% etanol. Stäng fönstret och exponera embryot med band.
  6. Etikett äggskal med den injicerade plasmidtypen och luktdatumet.
  7. Placera ägg tillbaka i inkubatorn med fönstersidan uppåt. Inkubera vid 38 ° C med 50% Luftfuktighet tills önskat utvecklingsstadium uppnås.
  8. Om en tet-on-vektor elektroporeras för temporal kontroll av genuttryck, applicera Doxycycline (Dox) var 24: e timme för att inducera genuttryck (se avsnitt 6).

6. Tet-on-system för temporal kontroll av genuttryck

  1. Använd följande plasmider:
    PCAGGS-T2TP: en transposasuttryckande plasmid.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: en plasmid som stabilt uttrycker det Dox-bindande proteinet.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: en plasmid som innehåller ett dubbelriktat tet-on-promotor (TRE) -drivande uttryck av EGFP-reportern och en andra gen av intresse.
    OBS: Ovanstående tre plasmider behöver co-elektroporeras i ett förhållande 1: 1: 1.
  2. Beredning av stamlösning:
    1. Lös Dox i sterilt PBS för att producera en 1 mg / ml stamlösning. Förvaras vid -20 ° C.
  3. Dox-ansökan:
    1. Att inducera uttrycketN av genen av intresse under vissa utvecklingsstadier, applicera Dox var 24: e timme.
    2. När du applicerar Dox, ta ut ägget, öppna fönstret, pipett 50 μL Dox på chorioallointoiska membranet, stäng fönstret och lägg ägget tillbaka i inkubatorn.

7. Framställning av utsöndringsområde för hjärnstammar

OBS! Följande avsnitt (7-9) och procedurer har publicerats före 14 . Vänligen se dessa referenser för ytterligare visuell information.

  1. Förbered en agarlösning (40 mg / ml agaros, dvs 4% i ddH20). Häll agarlösningen i en petriskål och låt den stelna vid rumstemperatur. Förvara täckt agarplatta i kylskåpet för framtida användning under hjärnstammsskivning av vävnad.
  2. Fortsatt bubbla artificiell cerebral spinalvätska (ACSF) med 95% 02 och 5% CO2 (pH 7,2-7,4 och osmolaritet: 295-310 mOsm / L).
  3. Rengör arbetsområdet och vibratom med 70% EtOH och skölj bladet med destillerat vatten.
  4. Placera en ren vätskeabsorptionsplatta på arbetsområdet med lämpliga dissekeringsverktyg.
  5. Ta agarplattan ut ur kylskåpet, skär en liten agarbit (10 mm x 10 mm x 8 mm). Lim agarblocket till scenen av en vibratomskivningskammare med användning av kommersiellt tillgänglig superlim.

8. Isolering av Kyckling Auditory Brainstem

  1. Öppna ägget på tejpade fönstret. Punjera membransäcken med en skalpell och ta bort kycklingembryonets huvud.
  2. Dekapitera kycklingen med vassa saxar.
  3. Placera knivbladets spets något bakom ögonen. Inse genom skallen vid rostral-till-caudal mittlinjen. Applicera lätt tryck beroende på åldern på embryot. Äldre embryon kräver mer tryck.
  4. Tryck försiktigt bort huden och fjädrarna för att exponera skallen och verifiera mittlinjen.
  5. Ansök sTrong tryck, skiva rostral delen av skalle med ett rakblad. Lägg omedelbart bladet bakom ögonen och skär genom hela skalle och hjärnvävnad.
  6. Gör mittlinje-till-laterala snitt med en sax i kranens caudala region, något främre mot nackmusklerna på båda sidor av huvudet. Utsätt hjärnan och cerebellum genom att dra bort skalen och överflödig vävnad.
  7. Klipp vävnad kopplad till hjärnstammen med sax och ta bort hjärnstammen, som frigörs fritt från skallen.

9. Framställning av hjärnstamskivor för in vivo elektrofysiologi eller bildbehandling

  1. Pinna hjärnstammen genom optisk tekta.
  2. Ta bort hjärnbenet genom att skära peduncles med sax, exponera golvet i den fjärde ventrikeln.
  3. Använd pincett, ta bort eventuell membranvävnad och blodkärl från hjärnstammens yta.
  4. För att blockera hjärnstammen, gör en horisontell klippning längst upp i rostral änden av golvet i de fyraTh ventrikel, bara caudal mot cortexen. Gör laterala snitt vinkelrätt genom optisk tekta för att isolera hjärnstammen.
  5. Placera en liten mängd superlim på vibratomstadiet framför agarblocket.
  6. Lyft hjärnstammen i ryggmärgen med pincett och placera den på superlimet med rostral sida ner och dorsal sida mot vibratombladet. Ta bort överflödigt lim med en laboratorievävnad eller filterpapper.
  7. Häll oxygenerad ACSF i vibratomsteget. Ställ vibratombladet i en vinkel på 20-22 °. Starta vibratom vid maximal amplitudoscillation. Flytta scenen upp mot bladet så att toppen av vävnaden är parallell med bladet.
  8. Flytta snabbt bladet mot hjärnstammens vävnad. Sakta ner bladet avsevärt före bladets kontakt med vävnad.
  9. Skiva vävnad med den långsamaste framåthastigheten. När bladet är genom hela koronavävnadssektionen, ta försiktigt bort skivan med en överföringspipett. </ Li>
  10. Sänk scenen 200-300 μm och skiva igen. Upprepa tills anatomiska landmärken av auditiva kärnor blir synliga, t.ex. den distinkta dorsala / ventrala neuropilregionen NL och den mediala placeringen av NM i förhållande till NL.
  11. Var noga med att skära skivor i ACFS. Detta kan göras vid rumstemperatur (22 ° C) eller nära fysiologiska förhållanden (~ 41 ° C) med ett varmt vattenbad. Notera ordningen för skivning. Den första skivan motsvarar den mest kaudala regionen av vävnad och den sista skivan motsvarar den mest rostrala regionen. Detta representerar ungefär den tonotopiska organisationen av den auditiva hjärnstammen, från respektive lågfrekventa kodningsregioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi visar här att i ovo elektroporation tillåter genuttryck i ett normalt utvecklande biologiskt system. Plasmidkodade gener injiceras focally i neuralröret som ligger över R5 / R6. Ett schematiskt exempel på elektrod- och pipettplaceringarna i förhållande till viktiga anatomiska markörer visas i figur 1A . Den korrekta platsen för plasmidinjektion bekräftas 24 h efter elektroporation och visas i Figur IB . Den inriktade injektionen av plasmider i neuralröret som ligger över R5 / R6 tillåter uttryck i specifika auditiva hjärnstamregioner, nämligen NM och NL (11) . Figur 1C visar en in vitro hjärnstammsskiva från ett E12-embryo under DIC-belysning (differential interference contrast). De hörselområden som intresserar sig är skisserade. Med lysande belysning ( Figur 1C 1 ) uttrycker YFP neuroner inom NM och NL är synliga. Figur 1D visar DIC-belysning för ett E18-embryo under hög förstoring. De klassiska adendritiska cellkropparna av många NM-neuroner är uppenbara. Med floriserande belysning ( Figur 1D 1 ) är en YFP-uttryckande NM-neuron tydligt synlig medan andra transfekterade neuroner är borta från fokusplanet. Eftersom endast en bråkdel av neuroner i den riktade NM-regionen transfekteras tillåter andra neuroner inom samma kärna att fungera som interna kontroller vid dubbla patch-clamp elektrophysiology experiment. Transgener kan också temporärt regleras av läkemedelsapplikation, vilket möjliggör genuttryck och manipulation vid exakta utvecklingsperioder 8 .

Figur 1
Figur 1: I Ovo Electroporation i Kyckling AuDitory Brainstem. ( A ) Schematisk av elektroporation i bakbenet av HH stadium 12 kycklingembryon. Injektionspipetten fylls med plasmid-DNA och snabbt grönt färgämne för visualisering av den injicerade hindbrainen (rhombomerer 5/6 [R5 / R6]). I denna studie användes en plasmid som samuttryckte en gen av intresse och den gult-fluorescerande proteinet (YFP) -reporteraren. Elektroporerade embryon inkuberas ytterligare tills önskat utvecklingsstadium uppnås. ( B ) Embryonisk (E) dag 4 kycklingembryo som visar platsen för YFP-uttryck i förhållande till vänstra ögat (pil, E) och vänster otocyst (pil, O). Streckad vit linje representerar dorsal hjärnan och hjärnstammen gräns. Skala bar = 480 μm. ( C och C 1 ) Brainstemskiva (300 μm tjock) från en E12-kyckling med differentiell interferenskontrast (DIC, C ) och fluorescerande (YFP, C 1 ) illuminatio n. Streckade vita linjer representerar gränserna för kärnmagnetocellularis (NM) och nucleus laminaris (NL). Observera, hjärnstammens skiva visar bara en sida av vävnaden. Vita pilhuvuden representerar mittlinjeskiktet i hjärnstammens skiva. Vita pilar visar YFP-uttryckande regioner i NM och NL. V = ventral, M = medial. Skala bar = 240 μm. ( D och D 1 ) Hög förstoring (80X vatten nedsänkningsmål) av en E18-höns embryo hjärnstamskiva innehållande NM. De klassiska adendritiska cellkropparna 15 är tydligt synliga under DIC-belysning (uppåtpil, D ). Med fluorescerande belysning för samma skiva är en transfekterad NM-neuron identifierad av YFP-fluorescens klart synlig (uppåtpil, D 1 ). Asterisker = YFP som uttrycker NM-neuroner strax under fokalplanet. Skala bar = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I ovo elektroporation är en metod att uttrycka eller knacka ner gener av intresse för att analysera in vivo genfunktion 8 , 9 . I kycklingembryon är det en innovativ metod för att uttrycka plasmidkodade gener i olika auditiva hjärnstamregioner 8 . För att säkerställa ett optimalt uttryck krävs flera viktiga steg. Först injicera endast embryon vars otocyter är tydligt synliga. Om otocyter inte är synliga är embryot inte på rätt utvecklingsstadium för elektroporation. För det andra gör mindre pipettips det enklare att tränga in i nervröret och resultera i mindre vävnadskador. Det brutna spetsen bör dock vara tillräckligt stor för att utvisa DNA. För det tredje fyller du hela nervrörsområdet som ligger över R5 / R6 med DNA (som visualiseras genom spridning av den snabba gröna lösningen). Slutligen är placeringen av stimulatorelektroden så nära embryot som möjligt important. Men se till att du undviker direkt kontakt med embryot, eftersom nuvarande pulser kan scorch och skada vävnad.

Modifieringar av tekniken kan bidra till att förbättra embryonernas livskraft och uttryck av plasmider. För det första är det viktigt att sätta ägg inom 24 timmar efter ankomst för att upprätthålla hög lönsamhet. För det andra måste fönstets fönster tätt förseglas med tejp som förlust av vätska ( dvs. uttorkning) genom en otillräcklig tätning ökar embryodödsfallet. För det tredje, för att optimera visualisering av otocysten, injicera indisk bläck från rostralsidan av embryot, med den minsta möjliga bläck som möjligt. Slutligen kan stimulerande elektroder flyttas något mellan R5 / R6-regioner för att sprida det elektriskt laddade området utan att öka strömstyrkan.

Trots ovanstående förslag bör det noteras att det finns begränsningar. Dessa inkluderar varierande frekvenser av transfekterade nervceller, deras placering inom hjärnstammens skiva ochEmbryoöverlevnad. Även om transfektionseffektivitet varierar mellan embryon, rapporterade vi tidigare med elektroporationsparametern som beskrivs här ~ 5-10% NM / NL-neuroner transfekteras konsekvent 8 . Även vid högre hastigheter av neurontransfektion utgör beredningen av hjärnstammens vävnad för in vitro patch-clamp elektrophysiology utmaningar. Till exempel är hjärnstammens skivor mellan 200-300 pm tjocka och ibland är transfekterade neuroner för djupa i vävnaden för att adekvat plåstras och utföra funktionella analyser. Slutligen är embryoöverlevnad efter framgångsrik elektroporation också variabel, om än inte så mycket som transfektionshastighet. Beroende på önskad embryoålder för experimentell användning kan överlevnadsvariabiliteten rasas mellan 80-20%, vars senare motsvarar de äldsta embryonerna (> E18).

Betydelsen av ovo- elektroporering i kyckling är fördelaktig gentemot däggdjursmodellsystem i flera r Easons 16 . För det första är det relativt billigt och ett utmärkt alternativ till transgena eller knockdown-djur. För det andra delar kycklingen analoga kärnor med däggdjur som behandlar tidsmässig information av ljud på den cellulära, synaptiska och neurala nätverksnivån 17 . Ett exempel på liknande hörselfunktion uppträder mellan AVCN / MSO hos däggdjur och NM / NL av kycklingar, analoga auditiva hjärnstammestrukturer, respektive 4 , 5 . I motsats till traditionella högfrekventa höra mammaliska forskningsmodeller, såsom möss och råttor, använder kycklingar dock signaler som tillhandahålls av både låg- och högfrekvenssignaler för att koda hörselinformation 18 . Slutligen är kycklingar hörselskadliga djur; Det vill säga att deras hörselsystem är nära funktionell mognad vid födseln och uppkomsten och förfiningen av hörsel inträffar under embryonala steg utan miljöpåverkan> 19 , 20 . Däremot börjar hörapparaten för typiska däggdjursforskningsmodeller 10-13 dagar efter födseln 21 , 23 .

I samband med biokemiska, farmakologiska och funktionella analyser ger ovo genetiska manipuleringar ett innovativt tillvägagångssätt för att studera neuronspecifik utveckling av anatomiska och fysiologiska specialiseringar, vilket möjliggör kontroll av väldefinierade tidsperioder vid auditiv hjärnstammsutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria och Mrs Ximena Optiz-Araya för första hjälpen med protokolluppsättningen och för att tillhandahålla plasmider. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCD-bidrag DC013841 (JTS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Tags

Utvecklingsbiologi Auditory brainstem avian utveckling, Kärnlaminaris kärnmagnokellularis plasmid
<em>I Ovo</em> Electroporation i Chicken Auditory Brainstem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. … More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter