Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

أصبح تصوير التشكل للأجنة الحشرات مع ضوء على أساس ورقة مضان المجهر الدولة من الفن. ويحدد هذا البروتوكول ويقارن ثلاث تقنيات التركيب المناسبة للأجنة خنفساء الدقيق الحمراء، ويدخل اثنين من رواية خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب مناسبة تماما لتصوير العيش، ويناقش ضوابط الجودة الأساسية ويشير إلى القيود التجريبية الحالية.

Abstract

أصبح الدقيق الحمراء خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء هام كائن نموذج حشرة في علم الوراثة التنموية والبيولوجيا التطورية التطوري. مراقبة الأجنة خنفساء مع خفيفة على أساس ورقة مضان المجهر لها مزايا متعددة على widefield التقليدية ومتحد البؤر المجهري مضان. نظرا لخصائص فريدة من نوعها المجهر القائم على ورقة خفيفة، وثلاث صور ثلاثية الأبعاد من العينات الحية يمكن تسجيلها مع نسب عالية إشارة إلى الضجيج وانخفاض كبير في الصورة تبيض وكذلك صور سمية على طول عدة اتجاهات على مدى فترات تدوم عدة أيام. مع أكثر من أربع سنوات من التطوير المنهجي وزيادة مستمرة من البيانات، والوقت يبدو مناسبا لوضع إجراءات التشغيل القياسية لاستخدام التكنولوجيا ورقة الخفيفة في المجتمع خنفساء وكذلك في المجتمع الحشرات بشكل عام. يصف هذا البروتوكول ثلاث تقنيات التركيب مناسبة وأو لأغراض مختلفة، تقدم خطين خنفساء المعدلة وراثيا جديدة مصنوعة خصيصا مناسبا للتصوير الحية على المدى الطويل، وتشير خمسة الأصباغ الفلورية لتسمية هياكل داخل الخلايا من الأجنة ثابتة وتوفر معلومات عن ما بعد معالجة البيانات للتقييم في الوقت المناسب من البيانات المسجلة. تركز ممثل النتائج على التصوير الحي على المدى الطويل، باجتزاء البصرية ومراقبة من نفس الجنين على طول عدة اتجاهات. يتم توفير قواعد البيانات منها كمورد للتحميل. وأخيرا، يناقش بروتوكول مراقبة الجودة لفحوصات التصوير الحية، والقيود الحالية وتطبيق الإجراءات المحددة لأنواع الحشرات الأخرى.

ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لعلماء البيولوجيا التطورية الذين يسعون حلول التصوير التي يتفوق المعدات المختبرية القياسية. وهي تشجع محاولة مستمرة لإغلاق الفجوة بين المختبرات / المجتمعات الموجه من الناحية الفنية، والذي تطوير وصقل مايكرويننسخ منهجيا، ومختبرات علوم الحياة / المجتمعات، والتي تتطلب حلولا "التوصيل والتشغيل" للتحديات التقنية. وعلاوة على ذلك، فإنه يدعم هذا النهج البديهي أن يتحرك الأسئلة البيولوجية في مركز الاهتمام.

Introduction

الطحين خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء الأحمر، الذي ينتمي إلى عائلة كبيرة من الخنافس darkling (Tenebrionidae)، لديها تاريخ طويل في مجال العلوم الزراعية والحياة وهو ثاني أفضل درس كائن نموذج نموذج حشرة بعد ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة. خلال العقود الأربعة الماضية، أصبحت قوية وشعبية نموذج حشرة كائن في علم الوراثة التنموية في البيولوجيا التطورية التطوري، وخلال السنوات العشرين الماضية، في التشكل الجنيني لمجموعة متنوعة من الأسباب:

ذبابة الفاكهة وخنفساء على حد سواء تنتمي إلى كاملات الانسلاخ، ولكن تباينت ما يقرب من 300 مليون سنة مضت 1، 2، 3، 4. في حين أن التطور الجنيني ذبابة الفاكهة يعتبر عادة على النحو المستمد للغاية، خنفساء يظهر الوضع القابل للأجداد جمعةopment التي وجدت في نسبة كبيرة من أنواع الحشرات 5، 6، 7، 8، 9. أولا، خنفساء يسلك تنمية رأس غير ملتف، أي فمها وهوائيات تظهر بالفعل خلال مرحلة التطور الجنيني 10، 11، 12، 13، 14، 15. ثانيا، خنفساء يتبع مبادئ التنمية قصيرة من الجراثيم، أي تضاف شرائح البطن بالتتابع من منطقة النمو الخلفي خلال germband استطالة 16 و 17 و 18 و 19. ثالثا، خنفساء تطور ويحط في وقت لاحقاثنين من الأغشية الجنينية، أي خارج السلى، والذي يغطي الجنين فقط البطني، والمصلية، الذي يغلف الجنين تماما 20 و 21 و 22. كل من الأغشية تلعب مخلق حاسما 23 وكذلك دور وقائي ضد الكائنات الدقيقة 24 و 25 و 26 جفاف. رابعا، والساقين embryonically النامية تعمل بكامل طاقتها خلال مرحلة الحياة اليرقات وبمثابة براعم للأرجل الكبار خلال التحول العذراء 27، 28، 29، 30، 31.

نظرا لحجم ومطالبهم متواضعة صغيرة، وزراعة خنفساء في المختبر هي اضحة إلى حد ما. ثقافات البرية من نوع (WT) سلالات أو خطوط المعدلة وراثيا تتكون عادة من حوالي 100-300 البالغين ويمكن أن تظل داخل زجاجات سعة لتر واحد من الزجاج (البصمة 80 سم 2) شغل 3-4 سم عالية (حوالي 50 غ) مع متوسط النمو التي تتكون من القمح والحبوب الكاملة الطحين تستكمل مع الخميرة الجافة الخاملة. A إمدادات المياه ليست ضرورية. وهذا يسمح حتى معامل صغيرة للحفاظ على العشرات من الثقافات خنفساء داخل حاضنات الحشرات الصغيرة أو متوسطة الحجم متوفرة تجاريا. يتم فصل مراحل تطور لاحقة من خنفساء (اليرقات بعد حوالي رابع الطور، الشرانق والكبار) بسهولة من وسط النمو عن طريق النخل. ويتم الحصول على أجنة متزامنة التي يحتضنها البالغين لفترات قصيرة على وسط وضع البيض. لتحقيق تنمية سريعة، يتم الاحتفاظ الثقافات خنفساء في 32 ° C (حوالي أربعة أسابيع في الجيل)، في حين يتم تنفيذ حفظ الأوراق المالية عادة في 22-25 درجة مئوية (حوالي عشرة أسابيع في جيل).

خلال العقد الماضي، العديد من تك القياسيةوقد تم تكييف hniques تدريجيا والأمثل للخنفساء، على النحو الموجز في كتب الناشئة نموذج الكائنات 32. من أهمية كبيرة ومتقدمة أساليب وراثية مثل الجنينية 33، اليرقات 34، 35 أو الوالدين 36 و 37 RNA القائم على التدخل إسقاط الموروثة، والتحول سلالة الجرثومية سواء مع piggyBac 38، 39 أو نظام ترانسبوزاز مينوس 40 و كريسبر / الجينوم أساس Cas9- الهندسة 41. وعلاوة على ذلك، تم التسلسل الجينوم خنفساء قبل نحو عقد من الزمن 42، والآن في الجولة الثالثة من الجينوم الافراج عن التجمع 43، والذي يسمح تحديد كفاءة والجينوم على نطاق والتحليل المنهجي للجينات 44 45 و 46. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر للنهج الوراثية النسبية 47، 48، 49، 50 جينومات أربعة أنواع coleopteran أخرى. بالتعاون مع تسلسل الجينوم، تم إجراء تحليلين الوراثية على نطاق واسع، أي شاشة الطفرات إقحامي 51 و جين ضربة قاضية شاشة أساس التدخل RNA منهجي 52 و 53.

مضان التصوير الحي مع widefield، متحد البؤر أو ضوء المجهر القائم على ورقة (LSFM) يسمح لمراقبة التشكل الجنيني للخنفساء بوصفها وظيفة من الزمن (أي التشكل) في سياق متعدد الأبعاد (الجدول 1). في widefield ومضان المجهري متحد البؤر، وكسكيتويسترشد أوجه وانبعاث الضوء من خلال العدسة نفسها موضوعية. في كلا النهجين، يضيء العينة كامل لكل طائرة ثنائية الأبعاد المسجلة. وبالتالي، يتم إخضاع العينات إلى مستويات طاقة عالية جدا. في LSFM، إلا أن fluorophores في المستوى البؤري متحمسون بسبب فصل الإضاءة والكشف باستخدام اثنين من العدسات موضوعية مرتبة عموديا (الشكل 1). LSFM يأتي في اثنين من تطبيقات شريعي - في طائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) والرقمية الممسوحة ضوئيا ضوء الليزر على أساس ورقة مضان المجهر (DSLM، الشكل 2) - وتقدم العديد من المزايا الهامة على الأساليب التقليدية: (ط) الجوهرية القدرة باجتزاء البصرية، (ب) قرار محوري جيد، (ج) انخفاض بقوة مستوى الصورة تبيض، (د) منخفضة جدا صور سمية، (ت) ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، (السادس) عالية نسبيا سرعة الاستحواذ، (السابع) التصوير على طول عدة اتجاهات و (السادسب) اختراق الأنسجة أعمق بسبب استخدام منخفضة العددية فتحة إضاءة العدسات الهدف 54 و 55 و 56.

وقد تم بالفعل تطبيق LSFM بنجاح في خنفساء لتوثيق ما يقرب من التشكل الجنيني كامل 57 وتحليل مبادئ تمزق الغشاء خارج الجنينية في بداية إغلاق الظهرية 23. لزيادة جاذبية LSFM في المجتمع خنفساء وللعلوم الحشرات بشكل عام، فإنه من الأهمية بمكان وضع إجراءات التشغيل القياسية وتحسين الطرق والبروتوكولات ومجموعة الموارد إلى المستوى الذي يصبح المجهر وسهولة -استخدام أداة قياسية في مختبرات البيولوجيا التنموية، والأسئلة البيولوجية البقاء في مركز الاهتمام.

يبدأ هذا البروتوكول مع أساسيات خنفساء </ م> زراعة، أي صيانة، والاستنساخ وجمع الأجنة. بعد ذلك، موضحة استراتيجيتين التجريبية: (ط) التصوير المباشر لخطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب و (ب) تصوير الأجنة الثابتة التي كانت ملطخة الأصباغ الفلورية (الجدول 2). وفي وقت لاحق، وشرح ثلاث تقنيات المتصاعدة مع أغراض مختلفة قليلا في التفاصيل (الشكل 3 والجدول 3): (ط) عمود الاغاروز، (ب) نصف الكرة الاغاروز و (ج) صاحب بيت العنكبوت رواية. بروتوكول ثم يشرح الإجراء الحصول على البيانات مع LSFM. وترد طرائق التصوير والاعتبارات الرئيسية. وأخيرا، أوضح استرجاع الجنين ويتم تقديم اقتراحات لمعالجة البيانات الأساسية. في نتائج تمثيلية، بيانات التصوير على الهواء مباشرة من اثنين من الرواية وترد 58 خطوط المعدلة وراثيا الدبقية الأزرق ويتم توفير قواعد البيانات التصوير منها كمورد للتحميل حسب الطلب. بالإضافة إلى ذلك، صورةوتعرض البيانات للأجنة الثابتة التي كانت ملطخة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ مضان. وتركز النقاش على مراقبة الجودة، والقيود الحالية للنهج التصوير الحي والتكيف البروتوكول إلى الأنواع الأخرى.

هو مكتوب على بروتوكول لالمجاهر مضان القائم على ورقة الخفيفة التي تكون مجهزة مع غرفة العينة وآلية المشبك للتدوير لحاملي موحد عينة 54، 59، 60، والتي عادة ما تكون العناصر على شكل اسطوانة مصنوعة من المعدن والبلاستيك أو الزجاج مع قطر في نطاق ملليمتر. البروتوكول هو أيضا مناسبة لكلا تطبيقات شريعي، أي SPIM وDSLM، فضلا عن الاجهزة مع اثنين أو أكثر إضاءة والكشف عن الأسلحة 61 و 62 و 63. نتائج تمثيلية تظهر البيانات في قناتين الطيفية، الأخضر (ايلlumination مع ليزر 488 نانومتر، والكشف من خلال 525/50 ممر الموجة فلتر) والأحمر (الإضاءة مع ليزر 561 نانومتر، والكشف من خلال 607/70 ممر الموجة مرشح)، ولكن بروتوكول يمكن توسيعها إلى ثلاث أو أربع قنوات الطيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تربية الثقافات خنفساء

ملاحظة: يتم تحديد الشروط القياسية باعتباره درجة حرارة الحضانة من 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪ في 12 ساعة مشرق / 12 ساعة دورة الظلام. لمزيد من المعلومات حول خنفساء تربية، تتوفر 64 المبادئ التوجيهية ذات الصلة. يتطلب هذا البروتوكول اثنين من وسائل الإعلام على الطحين المختلفة، والتي يمكن أن تكون مستعدة بكميات كيلوغرام وتخزينها لعدة أشهر.

  1. قبل العمل مع الطحين والخميرة الجافة الخاملة، تخزين حزم فتحها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ومن ثم السماح لهم الاحماء لدرجة حرارة الغرفة. هذا الإجراء يزيل مسببات الأمراض المحتملة.
  2. يمر الكامل والدقيق القمح والحبوب والخميرة الجافة غير نشطة من خلال غربال مع 710 ميكرون حجم فتحات الشباك، ثم إعداد المتوسطة النمو من خلال استكمال الطحين والحبوب الكاملة منخول مع 5٪ (ث / ث) منخول الخميرة الجافة الخاملة.
  3. تمرير 405 دقيق القمح الناعم والخميرة الجافة غير نشطة من خلال غربال مع 250 & #181؛ م حجم فتحات الشباك، ثم إعداد المتوسطة وضع البيض من قبل المكمل لمنخول 405 دقيق القمح مع غرامة 5٪ (ث / ث) منخول الخميرة الجافة الخاملة.
  4. تمرير ثقافة خنفساء كل منها من خلال غربال مع 800 حجم ميكرون شبكة. تجاهل متوسط ​​النمو بقايا. نقل اليرقات، والشرانق والكبار على طبق زجاجي كبير.
  5. في حالة وجود أية ثقافة ذرية، ونقل حوالي 80 اليرقات و / أو الشرانق إلى زجاجة جديدة لتأسيس ثقافة جديدة ذرية. إذا لم يكن هناك اليرقات و / أو الشرانق موجودة، وتأخذ حوالي 40 البالغين بدلا من ذلك. إضافة 50 غرام من متوسط ​​النمو واحتضان تحت الظروف القياسية.
  6. جمع حوالي 300 البالغين (500-700 ملغ) في زجاجة جديدة أخرى لتأسيس ثقافة التصوير. إضافة 50 غرام من متوسط ​​النمو واحتضان تحت الظروف القياسية. السماح للثقافة التصوير ليستقر لمدة 24 ساعة على الأقل في المدى المتوسط ​​نمو جديدة قبل جمع الأجنة.
  7. استبدال المتوسطة نمو ثقافة التصوير على الأقل كل سنتين نحنEKS، والتي يمكن أن يتم ذلك بالتزامن مع جمع الأجنة (انظر 3.2). بعد شهرين إلى ثلاثة أشهر، واستبدال ثقافة التصوير تماما من قبل الكبار جديد من الثقافة ذرية.
  8. إذا تم استخدام خط المعدلة وراثيا غير متماثل، الإشراف الثقافات ذرية في كثير من الأحيان عن طريق إزالة الحيوانات غير المعدلة وراثيا. من الناحية المثالية، وتوليد خطوط متماثل إذا التحوير منها ليست قاتلة أو يسبب العقم عند موجودة على كل من الكروموسومات. يكون الثقافات متماثل عادة ما يكون متوسط ​​مستوى أعلى مضان والظروف التجريبية الشاملة وأضيق، منذ راثى واحد فقط موجود.

2. إعداد مجهر والمعايرة

ملاحظة: الجنين خنفساء لديه طول الأمامي الخلفي من حوالي 600-660 ميكرون ويبلغ قطرها مستعرضة من حوالي 300-330 ميكرون. معظم الكاميرات CCD الحديثة حجم رقاقة الاستشعار من حوالي 9 مم × 7 ملم، أي قطر من 11.4 ميكرون، وعلى مسافة بكسل بكسل من 6.45 ميكرون.عندما جنبا إلى جنب مع التكبير 10x عدسة الهدف، الجنين يمكن تصوير جملة وتفصيلا مع الملعب بكسل من 0.645 ميكرون. معظم الكاميرات sCMOS الحديثة لديها أكبر حجم رقاقة الاستشعار من حوالي 16 ملم × 14 ملم، أي يبلغ قطرها 21.3 ميكرون، وعلى مسافة بكسل بكسل 6.5 ميكرون. عندما جنبا إلى جنب مع 20X التكبير عدسة الهدف، الجنين يمكن تصوير جملة وتفصيلا مع الملعب بكسل من 0.325 ميكرون.

  1. إرفاق الإضاءة والهدف كشف عدسات المجهر. تأكد من أن أشعة الليزر والمرشحات مضان تطابق امتصاص fluorophore والأطياف الانبعاثات بشكل جيد للغاية.
  2. إرفاق حجرة العينة إلى المجهر. ملء حجرة العينة مع PBS 7.4 درجة الحموضة أو أي عازلة التصوير مناسبة أخرى.
  3. تبديل ومعايرة المجهر. وقد نشرت إجراءات ومبادئ توجيهية حل لمشاكل المجاهر مبنية خصيصا على أساس ورقة الخفيفة (أكثر تحديدا لتنفيذ DSLM) معايرة شاملة العلاقات العامةeviously 65. بالنسبة للأجهزة التجارية، اتبع إرشادات الشركة المصنعة بعناية فائقة. سوء قد تستنفد غرفة عينة من المتوسطة واحداث فوضى في الصك وكذلك العينة.

3. جمع المعدلة وراثيا أو WT الأجنة

  1. تمرير مستعمرة التصوير من خلال غربال مع 800 ميكرون حجم شبكة. جمع الخنافس الكبار في زجاجة جديدة وإضافة 10 غرام من متوسط ​​وضع البيض. احتضان الثقافة وضع البيض لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70٪ في الضوء.
  2. تمرير ثقافة وضع البيض من خلال غربال مع 800 ميكرون حجم شبكة لفصل البالغين من وسط وضع البيض، والذي يحتوي على حوالي 30-100 الأجنة. نقل الكبار لزجاجة جديدة وإضافة إما ز القديم أو 50 من متوسط ​​النمو الطازجة.
  3. إذا يجب أن تبدأ الملاحظة في المرحلة الأريمة موحدة (على سبيل المثال مجموعة البيانات DS0002)، واحتضان المتوسط ​​وضع البيض لمدة 15 ساعة عند 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪. تيس تبدأ في بداية تراجع germband (على سبيل المثال مجموعات البيانات DS0001 و DS0003)، واحتضان الأجنة لمدة 23 ساعة عند 32 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪. وإذا رغبت مراحل النمو الأخرى، الرجوع إلى الأدب منهما 64 و 65 و التكيف مع فترة حضانة و / أو درجة الحرارة عند الضرورة.

4. الأجنة Dechorionation

ملاحظة: إن المشيمه هو الطبقة الخارجية من قشر البيض ويتكون من البروتينات والسكريات. إنه خفيف بقوة ماصة ولكنه ليس أساسيا لتحقيق التنمية السليمة وبالتالي يمكن إزالتها كيميائيا.

  1. تمرير المتوسطة وضع البيض من خلال غربال مع 300 ميكرون حجم شبكة. جمع الأجنة في مصفاة الخلية مع 100 ميكرون حجم شبكة والتخلص من بقايا المتوسطة وضع البيض.
  2. إعداد لوحة 6 جيدا على النحو التالي: ملء A1، A2، A3 والآبار B3 مع 10 مل PBS 7.4 درجة الحموضة وB1 و B2 الآبار مع 9 مل PBS. ثم يضاف بعناية1 مل هيبوكلوريت الصوديوم إلى B1 و B2. مراقبة سير خطوات 4،3-4،8 تحت المجهر ستيريو. هيبوكلوريت الصوديوم تنبيه غير قابلة للتآكل.
  3. إدراج مصفاة خلية في A1 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة دقيقة واحدة في إطار التحريض لطيف. يجب أن جزيئات الدقيق أكبر من فصل الأجنة.
  4. نقل مصفاة الخلية إلى البئر B1 (هيبوكلوريت الصوديوم في برنامج تلفزيوني ودرجة الحموضة 7.4) ويهز لوحة بقوة لمدة 30 ثانية. يجب أن الجسيمات الدقيق المتبقية فصل تماما من الأجنة.
  5. نقل مصفاة الخلية إلى A2 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة في إطار التحريض لطيف.
  6. لdechorionation، ونقل مصفاة الخلية إلى B2 جيدا (هيبوكلوريت الصوديوم في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة). يهز لوحة بقوة حتى تمزقات المشيمه ويفصل من الأجنة. المشيماء يشبه، غشاء رقيق شبه شفافة مع حواف يمزق، في حين أن الأجنة dechorionated لديها خيال عادي.
  7. عشر نقلالبريد مصفاة الخلية إلى A3 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة في إطار التحريض لطيف. إذا لا تزال تعلق أي شظايا المشيمه للأجنة بعد الغسيل، وكرر الخطوة 4.6.
  8. تخزين الأجنة في البئر B3 (PBS 7.4 درجة الحموضة). التخزين لعدة ساعات لا يضر الأجنة، ولكن نأخذ في الاعتبار أن التنمية لا يزال مستمرا.
  9. لخطوط المعدلة وراثيا غير متماثل، وإزالة أي أجنة غير الفلورسنت إذا أمكن ذلك. لتثبيت وتلطيخ للWT أو الأجنة وراثيا، تابع الخطوة 5. للحصول على التصوير الحي من الأجنة وراثيا، تابع الخطوة 6.

5. المحي غشاء Permeabilization، التثبيت، وتلطيخ

ملاحظة: الغشاء المحي هو الطبقة الداخلية من قشر البيض. ومن منيع أصباغ الفلورسنت ويجب أن permeabilized كيميائيا قبل تلطيخ الآن.

  1. ملء قارورة التلألؤ مع الحل تثبيت / permeabilization (1.5 مل 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق في PBS الرقم الهيدروجيني 6.9 لالثانية 1.5 مل ن هيبتان). نقل الأجنة مع الفرشاة لقارورة. قارورة غطاء مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من الضوء واحتضان لمدة 30 دقيقة على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. تنبيه امتصاص العرق السامة والمسببة للتآكل، ن هيبتان هي قابلة للاشتعال والسامة.
  2. إزالة الحل تثبيت وعلاج الأجنة ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في 3 مل 0.1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة، وبعد ذلك مرة واحدة لمدة 15 دقيقة في 3 مل 1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. تنبيه تريتون X-100 للتآكل.
  3. إزالة حل permeabilization وإضافة 0.5 مل من محلول تلطيخ إلى القارورة. يتم توفير حلول تلطيخ النموذجية في الجدول 2. الأجنة وصمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. لالأصباغ المقترحة في الجدول 2، وغسل ليست ضرورية.

6. إعداد تركيب الاغاروز

  1. إضافة 1 غرام المنخفض الذوبانالاغاروز إلى 100 مل PBS 7.4 درجة الحموضة ويسخن المزيج لمدة 2-3 دقيقة في فرن الميكروويف في 800 W. إذا جزيئات صغيرة الاغاروز لا تزال موجودة، كرر عملية التسخين في 30 ثانية فترات حتى تذوب الجزيئات تماما. لا يحتاج الاغاروز متزايدة لتكون طازجة في كل مرة، وعزز الاغاروز يمكن إعادة المسال من قبل التدفئة كما هو موضح أعلاه. هذه العملية يمكن أن تتكرر 5-6 مرات من قبل قد تبخرت الكثير من المياه.
  2. السماح للالاغاروز ليبرد إلى ما يقرب من 40-45 درجة مئوية، ثم ملء اثنين من 1.5 مل أنابيب رد فعل مع الاغاروز ساخنة والحفاظ على تلك الأنابيب عند 35 درجة مئوية في thermoblock.

7. الأجنة تركيب والإدراج في غرفة عينة

  1. الخيار 1: عمود الاغاروز (الشكل 3A-C، العمود الأول، الجدول 3، العمود الثاني)
    1. ملء مل حقنة 1.0 مع الماء المقطر ونعلق عليه إلى واحدة من فتحات الزجاج الشعرية باستخدام خرطوم مطاطي صغير.ملء منتصف الطريق الشعرية مع الماء المقطر.
    2. اختيار الجنين مع الفرشاة وضعه على الجانب الداخلي من الآخرين فتح الزجاج الشعرية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية قبل الجنين يجف.
    3. عصا الشعرية في الاغاروز السائل ورسم ببطء بضعة ميكرولتر من الاغاروز السائل جنبا إلى جنب مع الجنين في شعري. ثم بسرعة تزيد قوة رسم بحيث يتم سحب الجنين جنبا إلى جنب مع الاغاروز. في النهاية، يجب أن يكون عدد قليل ميكرولتر من الاغاروز فوق وتحت الجنين. تعيين الشعرية جانبا لبضع دقائق، والسماح للالاغاروز يصلب.
    4. تقصير الشعرية مع قطع الزجاج الماس يبلغ طوله حوالي 5 ملم. يجب ملء جزء المتبقي تماما مع الاغاروز وينبغي أن يكون الجنين داخل الربع الثاني.
    5. أدخل اسطوانة الصلب مع دبوس في حجرة العينة، ومن ثم الصاق جزء الشعرية على رأس دبوس. عمود الاغاروز يجب أن تبرز بضعة ملليمترات وROM جزء الشعرية مع الجزء الذي يحتوي على الجنين.
  2. الخيار 2: نصف الكرة الاغاروز (الشكل 3A-C، العمود الثاني، الجدول 3، العمود الثالث)
    1. رسم 200 ميكرولتر من الاغاروز السائل إلى مل حقنة 1.0، ثم استخدامه لملء الأنابيب الصلب من الأعلى مع الاغاروز حتى أشكال نصف الكرة الأرضية في افتتاح السفلي. يجب أن يكون قطرها نصف الكرة مساويا لقطر الماسورة. انتظر بضع دقائق حتى عززت agarose.
    2. اختيار الجنين مع الفرشاة وإعادة ترتيب ذلك على طرف الفرشاة بحيث تصبح نهاية الأمامي يمكن الوصول إليها. تراجع نصف الكرة الاغاروز إلى الاغاروز السائلة لتغطية ذلك مع طبقة رقيقة.
    3. وضع الجنين مع نهايته الأمامية تستقيم على قطب من نصف الكرة الاغاروز. تحويل أنابيب الصلب حول وتصحيح وضع الجنين مع الفرشاة. إذا لزم الأمر، وتثبيت الجنين عن طريق إضافة 2 ميكرولتر الاغاروز إلى الحدود جنين / نصف الكرة الغربي. المثاليلاي، ينبغي تغطية أقل من نصف سطح الجنين في الاغاروز ويجب على الأجنحة تكون حادة قدر الإمكان.
    4. إدراج أنابيب الصلب مع نصف الكرة الأرضية والجنين ببطء إلى حجرة العينة.
  3. الخيار 3: صاحب بيت العنكبوت (الشكل 3A-C، العمود الثالث، الجدول 3، العمود الرابع)
    1. اختيار الجنين مع الفرشاة وضعه جانبا.
    2. تغطية حفرة فترة زمنية محددة لصاحب بيت العنكبوت مع 5-8 ميكرولتر الاغاروز السائل، ثم إزالة معظم الاغاروز حتى لا يبقى سوى فيلم الاغاروز رقيقة.
    3. وضع الجنين على الفيلم الاغاروز وضبط موقفها. بعناية نقل الجنين الى مركز محور س من الحفرة فترة زمنية محددة، ومواءمة محورها الأمامي الخلفي ممدود مع محور ممدود من الحفرة فترة زمنية محددة.
    4. تضاف حامل بيت العنكبوت مع الجنين شنت ببطء في حجرة العينة. وضع صاحب بيت العنكبوت بحيث لا تتداخل مع الإثارة وانبعاثضوء، أي 45 درجة بالنسبة إلى X- وض محور.

مضان المجهر أساس ورقة-8. الخفيفة

  1. تقرر على طول كم من الاتجاهين (وعلى طول والتوجهات) ينبغي تصوير الجنين. أربعة اتجاهات (جنبا إلى جنب توجهات 0 درجة و 90 درجة مئوية، 180 درجة و 270 درجة) وعادة ما توفر مفاضلة جيدة بين التغطية وحمل الطاقة.
  2. إعداد عدد من القنوات مضان. المؤشرات الرئيسية لكل قناة هي خط ليزر، مرشح مضان، قوة الليزر ومدة التعرض. للتصوير الحية على المدى الطويل، من المهم أن حمل الطاقة متكامل لا يتجاوز التسامح الجنين. ومدة التعرض من 25-50 مللي يضمن التصوير السريع، في حين أن قوة الليزر ما بين 100 و 300 مللي واط ينبغي ألا يؤثر على سلامة الجنين. لعينات ثابتة، وقت التعرض وقوة الليزر يمكن الضعف على الأقل.
  3. لفحوصات التصوير الحية، تكوين مرور الوقت. شركاتوليته مرحلة التطور الجنيني من خنفساء يستغرق حوالي سبعة أيام في درجة حرارة الغرفة (23 ± 1 ° C)، وأقل قليلا من ثلاثة أيام في 32-35 ° C 64. تحديد الفترة الزمنية وفقا للأحداث التخلق التي ينبغي مراعاتها. لفترات زمنية قصيرة، والنظر في تخفيض وقت التعرض وقوة الليزر (انظر 8.2).
  4. وضع الجنين في وضع نقل الضوء على X- وy محاور في مركز مجال الرؤية دون تعريضها ليزر. تدوير الجنين 360 درجة في 90 ° الخطوات لفحص الجنين عن أي ضرر يمكن أن حدثت أثناء عملية التركيب.
  5. تدوير الجنين بشكل مناسب حول المحور الصادي لمحاذاة محاور الجنينية مع محاور المجهر، على سبيل المثال محور الجانبي مع محور س، أي محور ظهري بطني مع محور ض. عند استخدام تقنية صاحب بيت العنكبوت، قد المحاذاة لا يكون ممكنا.
  6. في وضع مضان، وتحديد كومة ض FOص كل اتجاه. إضافة 25-50 ميكرون كما عازلة المكاني في الجبهة من وراء الجنين. بما في ذلك المخزن المؤقت، وض المكدس نموذجي يغطي حوالي 350-400 ميكرون للجنين خنفساء. أيضا تحديد ض تباعد، التي ينبغي أن تكون أربع مرات التباعد الأفقي، أي التباعد على طول X- و y-محاور 66.
  7. إذا يتم تصوير اثنين أو أكثر من الأجنة في موازاة ذلك، أعد في 8.4 مع الجنين القادم.
  8. للتصوير على المدى الطويل، وضمان أن يتم تعبئة حجرة العينة مع كافية PBS 7.4 درجة الحموضة أو عازلة التصوير الأخرى. تشمل أيضا افتتاح حجرة العينة.
  9. بدء عملية التصوير. للتصوير الحية على المدى الطويل، ومراقبة حيازة الصحيح على طول كل الاتجاهات في جميع القنوات لجميع الأجنة. في بعض الأحيان تحقق خلال الأيام القادمة أن الأجنة على قيد الحياة وفي المكان المناسب.

9. الجنين استرجاع ومراقبة الجودة

  1. وبمجرد الانتهاء من التصوير، وإزالة صاحب العينة معالأجنة من حجرة العينة. الأجنة فقط من فحوصات التصوير الحية يجب أن يتم استردادها. يمكن التخلص منها الأجنة الثابتة والملون.
  2. إذا تم إجراء فحص التصوير الحي، ونقل الجنين الى شريحة الكائن. لتقنية عمود الاغاروز، استخراج الأجنة من المحيط الاغاروز مع مشرط، والصغرى سكين أو شفرة حلاقة. لتقنية نصف الكرة الاغاروز، ونقل الكرة الأرضية مع الجانب المسطح إلى الشريحة الكائن. إزالة الجنين ليست ضرورية. لتقنية صاحب بيت العنكبوت، ترجل بلطف الأجنة من الفيلم الاغاروز مع الفرشاة. احتضان الشريحة الكائن في وعاء زجاجي صغير في الغلاف الجوي الرطوبة المشبعة تحت ظروف قياسية حتى يفقس يرقات.
  3. بعد الفقس، ونقل اليرقات إلى الآبار الفردية من 24 لوحة جيدا وإضافة 500 ملغ من متوسط ​​النمو إلى كل بئر. احتضان تحت الظروف القياسية. مقارنة الوقت اللازم لتطوير كامل والتشكل من اليرقات تصوير لWT غير المصورة وlarv المعدلة وراثياعبد اللطيف (انظر المناقشة). في المقايسات التي تميز تنمية WT، يجب أن تكون هناك انحرافات واضحة المورفولوجية ملحوظ بشكل مثالي.
  4. وبمجرد أن اليرقات تطوير للبالغين الأصحاء، وتزويدهم شركاء WT المناسب من نفس السلالة الخلفية. بعد أسبوعين، تحقق لإنتاج ذرية. ضع في اعتبارك أيضا للتحقق من خصوبة النسل عن طريق التزاوج منهم بين يقلص. فقط عندما تتطور الأجنة تصوير في البالغين الخصبة التي تنتج ذرية خصبة، وإجراء التصوير يمكن اعتبار غير الغازية.

10. معالجة الصور البيانات

ملاحظة: للحصول على معالجة بيانات الصورة، وأوصت مفتوحة المصدر برامج معالجة الصور يماغيج 67 أو فيجي مشابه لها 68. تم العثور على كلا الإصدارين فضلا عن وثائق شاملة على www.imagej.net. تنسيق الملف القياسي لبيانات LSFM هو شكل ملف صورة الموسومة (TIFF). يسمح خيار حاوية جوهري في ستوالغضب من مداخن صورة مثل ض المداخن أو سلسلة زمنية من التوقعات القصوى ض ضمن ملف واحد التي يمكن فتحها في يماغيج أو فيجي عن طريق السحب والإفلات.

  1. إذا لزم الأمر، وتناوب على ض مداخن لتحقيق المواءمة بين المحور الأمامي الخلفي للجنين مع المحور الصادي (صورة → → تحويل تدوير). يرجى ملاحظة أن المعلمات التناوب يجب أن يتم تعيين بشكل فردي لكل اتجاه، ولكن ليس لمرور الوقت والقنوات مضان.
  2. اقتصاص مداخن ض على طول X-، Y- وض محاور بحيث الحد الأدنى من الخلفية فقط (20 - 40 بكسل على طول X- ومحاور ذ، 5-10 طائرات على طول محور ض) تبقى (لس - ومحاور ذ، استخدم أداة التحديد المستطيلة، ثم صورة → المحاصيل، وبالنسبة للض محور، واستخدام صورة → الأكوام → → أدوات شريحة حارس). يرجى ملاحظة أن المعلمات المحاصيل يجب أن يتم تعيين بشكل فردي لكل اتجاه، ولكن ليس لنقاط الوقت والقنوات مضان.
  3. حساب الحد الأقصى لإسقاط ض لكل ض المكدس(صورة → الأكوام مشروع Z →، واختيار ماكس الكثافة). حسابات كثافة الإسقاط هي إجراءات تبسيط البيانات التي تعمل على إزالة البعد المكاني واحد.
  4. للحصول على بيانات التصوير الحي على المدى الطويل، والنظر في استخدام يماغيج أو النصي فيجي التي تنفذ معالجة الخطوات 10،1-10،3 لجميع الاتجاهات، وجميع النقاط الوقت وجميع القنوات مضان 65. من الناحية المثالية، سلسلة جميع القصوى التوقعات ض لكل قناة والتوجيه وحفظها على شكل سلسلة من الوقت في حاوية TIFF واحد. بدلا من ذلك، المكونات في BigDataViewer 69 لفيجي يمكن استخدامها للتنقل من خلال مجموعات البيانات الكبيرة تيرابايت.
  5. اعتمادا على طرائق الخط والتصوير المعدلة وراثيا، والتعديلات كثافة ديناميكية من مداخن الوقت قد يكون من المرغوب فيه بسبب الصورة تبيض و / أو fluorophore تقلبات التعبير. إما ImageJ- أو فيجي مضمن ظيفة بليتش تصحيح (صورة → → ضبط تصحيح بليتش، اختر الرسم البياني مطابقة) أو dedicaواقترح تيد البرمجيات 65.
  6. ينصح إذا تم تسجيل الجنين و / أو على طول عدة اتجاهات وفي القنوات مضان متعددة، والجمع الأفقي للالاتجاهين (صورة → الأكوام → → أدوات الجمع) ودمج قناة (صورة → اللون دمج → القنوات).
  7. تسجيل ودمج ض مداخن المكتسبة على طول عدة اتجاهات 70، في نهاية المطاف في تركيبة مع إزالة التفاف 71، يسمح حساب صورا ثلاثية الأبعاد فائقة الجودة موحدة وقرار موحد الخواص. كل من المكونات الإضافية هي مفتوحة المصدر ومثبتة مسبقا في فيجي، لكنها تتطلب وجود معالم (المجهرية الفلورسنت، مثل حبات) حول العينة.
  8. إطار عمل مفتوح المصدر لاستخراج واسعة النطاق البيانات الكمية والتحليل وتتوفر أيضا، على سبيل المثال لتقسيم وتتبع نواة الخلية 72 أو سلل شكل اعتراف 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول في إطار تجريبي للتصوير مضان المعيشة أو ثابتة وملطخة الأجنة خنفساء مع LSFM. ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات الصورة تبيض والصور سمية، وهي نتيجة مباشرة لقدرتها باجتزاء البصرية، LSFM بشكل خاص مناسبة تماما لتصوير حي على المدى الطويل.

وAGOC رواية {ATub'H2B-mEmerald} # 1 خط المعدلة وراثيا يعبر عن انصهار بروتين histone2B-mEmerald تحت سيطرة المروج ألفا تويولين 1 74. فإنه يدل على محسن يشبه الفخ نمط التعبير 51، حيث يتم الحصول عليها بشكل رئيسي في إشارة مضان من المصلية، الكيس المحي والعديد من مجموعات الخلايا العصبية. باستخدام هذا الخط، تم تسجيل 66 ساعة من التطور الجنيني في درجة حرارة الغرفة (23 ± 1 ° C)، وتغطي تراجع germband وإغلاق الظهرية (فيلم التكميلي 1). هذهخط يمكن استخدامها لتصور مجموعات الخلايا العصبية داخل الزوائد الرأس (الشكل 4A) وديناميات الهجرة المصلية خلال إغلاق الظهرية (الشكل 4B). وAGOC رواية {ATub'H2B-mEmerald} # 4 خط يحمل نفس التحوير والخط رقم 4، ولكن في مكان مختلف الجيني. فإنه لا تظهر واضحة نمط فخ محسن، ولكن إشارة مضان هو spatiotemporally اكتشاف بتواجد مطلق كما هو موضح سابقا لهذا المروج 74. تم تصوير هذا الخط في الانتقال من المعيدة لgermband استطالة للتدليل على قدرة باجتزاء البصرية على مستويين عمق (الشكل 4C). ميزة أخرى، لا سيما بالنسبة التصوير الحي، هو اكتساب ض أكوام على طول اتجاهات متعددة عن طريق تناوب عينة، الذي هو المعيار لالاجهزة LSFM المستخدمة في البيولوجيا التطورية. على سبيل المثال، في الدبقية الأزرق 58 خط، عينة تناوب كلالدودة الحلزونية مراقبة إعادة تنظيم الخلايا الدبقية على طول وحول الحبل العصبي البطني وكذلك ديناميكية انتشار في الفص رئيس اليسار، وهو ما يمكن ملاحظته بشكل صحيح فقط من موقع ظهري، في نفس الجنين (الشكل 4D، الفيلم التكميلي 2). يتم توفير قواعد البيانات التصوير الحية المرتبطة بهذه الدراسة ومعلومات الموارد، الفوقية والوصول للتنزيل توجد في الجدول التكميلي 1.

منذ اختيار خطوط المعدلة وراثيا للتصوير الحية لا تزال محدودة، والأصباغ الفلورية صغيرة يمكن استخدامها لتسمية تحديدا الهياكل داخل الخلايا. SYTOX الخضراء تربط إلى الخلية نواة ويمكن تصور في القناة الخضراء، في حين YOYO-1 و BOBO-3 يوديد ربط المغلف النووي ويمكن تصور في قناة خضراء أو حمراء، على التوالي (الشكل 5A). هذه الأصباغ يمكن استخدامها لتسليط الضوء على بعض البنية الجنينيةالقوام، مثل ندبة المصلية (الشكل 5B، العمود الأول)، والخلايا الخلفية بطني المصلية (الشكل 5B، العمود الثاني) أو الأنسجة المصلية-السلى-germband ثلاثي الطبقات التي تبرز أثناء إغلاق نافذة المصلية (الشكل 5B ثالث ل الطابور الخامس). ثنائي اللون تلطيخ يسمح التصور من هيكلين الخلايا في الجنين نفسه، على سبيل المثال المغلف النووي مع الهيكل الخلوي الأكتين، والتي يمكن ملطخة الأصباغ Phalloidin اليكسا فلور مترافق. على سبيل المثال، YOYO-1 يوديد يمكن دمجها مع Phalloidin 546 (الشكل 5C)، في حين BOBO-3 يمكن دمجها مع Phalloidin 488 (الشكل 5D).

كما أنها مريحة لإصلاح وصمة عار الأجنة وراثيا التي تعبر بالفعل ببروتين معين، منذ إجراء تثبيت يروي fluorescenc جوهريه إشارة فقط هامشيا. على سبيل المثال، الأجنة من AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 خط المعدلة وراثيا، التي يتم فيها الكشف عن نوى في القناة الخضراء، ويمكن ملطخة Phalloidin 546 بحيث الهيكل الخلوي الأكتين تصبح مرئية في القناة الحمراء (الشكل 6 ).

شكل 1
الشكل 1: مقارنة التقليدية Widefield، متحد البؤر الليزر الضوئي وخفيفة على أساس ورقة الإسفار المجهري. يستخدم التقليدية المجهر widefield برنامج التحصين الموسع ومضان مصابيح زينون قوس / زئبق بخار مع مرشحات مناسبة أو ضوء عالية الطاقة الثنائيات ومصادر الضوء. لكل المكتسبة صورة ثنائية الأبعاد، مضاءة العينة كلها مع مخروط الضوء محدودة غير حيود. في متحد البؤر المسح بالليزر مضان المجهر، شعاع الليزر جاوس محدودة الحيود هو SC anned من خلال العينة ويتم الكشف عن مضان متفكك نقطة بنقطة. وعلى غرار التقليدية المجهر widefield برنامج التحصين الموسع ومضان، يضيء العينة كاملة لكل المكتسبة صورة ثنائية الأبعاد. في ضوء القائمة على ورقة مضان المجهر، شعاع الليزر جاوس محدودة الحيود ينير العينة عموديا على محور الكشف. تم الكشف عن مضان إما الطائرة عن طريق الطائرة أو خط سطرا. خلال الاستحواذ على صورة ثنائية الأبعاد، فقط كمية صغيرة تركزت على المستوى البؤري للهدف كشف يواجه الآثار المترتبة على ضوء الإثارة. لا يضيء حجم المتبقي من العينة، لا تسهم في الخروج من التركيز طمس، لا تعاني من آثار الصورة السامة ولا يفقد fluorophores بسبب الصور التبييض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

EP-together.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: مبدأ الإسفار المجهر أساس ورقة-الخفيفة. في LSFM، يتم تقسيم الإضاءة والكشف في اثنين على الأقل من المسارات الضوئية. يستخدم الذراع إضاءة واحدة على الأقل لتوليد ورقة الخفيفة (السماوي)، في حين تم تجهيز الذراع كشف واحد على الأقل مع مرشح المناسب وكاميرا للكشف مواز للإشارة مضان (الأخضر). LSFM اثنين من تطبيقات شريعي واحد (أو انتقائية) إضاءة الطائرة المجهر (خلفية زرقاء) والرقمية الممسوحة ضوئيا المجهر ورقة ضوء الليزر (خلفية حمراء). عن طريق تحريك العينة ورقة الخفيفة بالنسبة لبعضها البعض، ويتم الحصول على صور ثلاثية الأبعاد. ويتم جمع المعلومات على طول عدة اتجاهات من خلال تناوب العينة حول المحور الصادي، الذي تفضيلي الموجهة على طول الجاذبية.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): ثلاث تقنيات مختلفة التركيب المستخدمة في تسجيل لالجنينية التنمية من خنفساء مع مضان المجهر أساس ورقة-الخفيفة. (A) يشير عمود الاغاروز لاسطوانة الصلب مع دبوس صغير الذي يدفع عمود الاغاروز، الذي هو جزء لا يتجزأ من جنين، للخروج من الزجاج الشعرية. هي التي شنت نصف الكرة الاغاروز على انابيب الصلب. ويرد الجنين إلى القطب في نصف الكرة مع كمية صغيرة من الاغاروز. صاحب بيت العنكبوت هو ورقة من المعدن مع وجود ثقب فترة زمنية محددة شنت على رأس الأسطوانة الصلب. يتم لصقها الجنين لفيلم الاغاروز رقيقة تمتد رالكرة في الشباك بأقل حفرة. (B) مخططات تقنيات تركيب ثلاثة داخل المجهر ورقة خفيفة. (C) وتقنيات تركيب ثلاثة تطبيقها ضمن DSLM. (D) الصور المثالية من الأجنة من خط المعدلة وراثيا، الدبقية الأزرق سجلت مع التقنيات الثلاث في تصاعد مستمر. الأجنة، والتي هي في بداية تراجع germband، وتظهر مع نهاية الخلفي من الموجه نحو الأعلى إلى تطابق الصور ضوء انتقال العدوى. FM، ووضع مضان. ZA، والحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تصوير لايف من خنفساء الأجنة. (A </ قوي>) جنين للAGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 سطر في الانتقال من تراجع germband إلى إغلاق الظهرية. هذا الخط المعارض نمطا محسن فخ التعبير. تم العثور على إشارة مضان أساسا في المصلية، الكيس المحي وعدد قليل من مجموعات الخلايا العصبية. يظهر الجنين على مدى 15 ساعة مع فاصل زمني من 5 ساعات. وتظهر الصور بالتفصيل مجموعات الخلايا في الزوائد الرأس. في البداية، ومجموعات لا تزال من قبل خلايا المصلي (العمود الأول) مغطاة، على تمزق المصلية، وخلايا تتبع جنبا إلى جنب مع الحركة تحول من الرأس. (B) نفس الجنين يظهر أثناء إغلاق الظهرية لل01:30 ساعة مع فاصل من 0:30 ساعة. وتظهر الصور بالتفصيل هجرة المصلية تمزق على الكيس المحي. (C) الصف العلوي: جنين من AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 خط في الانتقال من المعيدة لgermband استطالة. الأوسط والأدنى المتتابعة: وتظهر طائرات واحدة في اثنين من الأعماق على مدى فترة من 10:30 ساعة مع فاصل 01:30ح. (D) جنين فإن الخط الأزرق الدبقية خلال تراجع germband يظهر مدى فترة من 50:30 ساعة مع فاصل من 7:30 ساعة. وتظهر الصور بالتفصيل إعادة تنظيم مخلق من الخلايا الدبقية في الفص الأيسر رئيس. ZA، والحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. طائرة PA واحدة مع تعديل كثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: التثبيت، تلطيخ، وIimaging من WT الأجنة خلال Germband الاستطالة. (A) الأجنة ملطخة إما SYTOX الأخضر، أي وصمة عار غامض النووية، أو YOYO-1 يوديد أو BOBO-3 يوديد، أي اثنين من البقع الغلاف النووي. (B) YOYO-1 ملطخة يوديد-امبريس. تفاصيل تظهر ندبة المصلية (العمود الأول)، والغلاف النووي للخلايا المصلية كبيرة الخلفي بطني (العمود الثاني) أو المنظمة الأنسجة بثلاث طبقات من المصلية، والسلى والأنسجة الجنينية الفعلية (الثالث إلى العمود الخامس). (C) تلطيخ ثنائي اللون مع يويو-1 التأيد وPhalloidin 546. (D) تلطيخ ثنائي اللون مع Phalloidin 488 و BOBO-3 يوديد. ZA، والحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: صور الثابتة والملون المعدلة وراثيا الأجنة من AGOC {ATub "H2B-mEmerald} # 1 سطر. هذا الخط المعدلة وراثيا يعبر عن mEmerald التسميةإد histone2B (H2B) تحت سيطرة المروج ألفا تويولين 1، الذي يصادف نوى / لونين بتواجد مطلق في جميع أنحاء التطور الجنيني بأكملها. كانت ملطخة الجنين أكثر مع فلور اليكسا 546 Phalloidin التي تصف أكتين الهيكل الخلوي / و الأكتين. ZA، والحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

معيار مضان نوع المجهر
حقل واسع التقليدية المسح الضوئي ليزر متحد البؤر ضوء ورقة القائم
الإعداد العدسة الشيئية عدسة موضوعية واحدة، متوسطة عالية NA اثنين من العدسات مرتبة عموديا موضوعية، الإضاءة: منخفض NA، كشف: ارتفاع NA
مصدر ضوء الإضاءة مصدر الضوء الأبيض ومناسبة مرشحات (مثل مصابيح الزئبق القصير قوس)
أو الصمام المستندة مع مرشحات تنظيف 		الليزر مع فلتر تنظيف
(على سبيل المثال الصمام الثنائي ليزر أو DPPS) 		الليزر مع فلتر تنظيف
(على سبيل المثال الصمام الثنائي ليزر أو DPPS)
الإضاءة في صورة ثنائية الأبعاد عينة كاملة عينة كاملة
(مسح شعاع جاوس عادة ثنائية الأبعاد) 		طائرة الوصل الوحيدة
(DSLM: الأبعاد واحد جاوس مسح شعاع)
كشف موازى
(عادة CCD أو sCMOS الكاميرا) 		تسلسلي
(أنبوب مضخم) 		موازى
(عادة CCD أو المجلس الأعلى للقضاءكاميرا OS)
سرعة التصوير سريع (ميلي ثانية لكل صورة) بطيئة (ثانية لكل صورة) سريع (ميلي ثانية لكل صورة)
خارج من التركيز مضان أي تمييز سدت تماما تقريبا عن طريق الثقب
(الكفاءة الرفض تعتمد على قطر) 		تقريبا غير موجودة
(فقط بسبب تناثر)
الأبعاد المكانية 2
(س / ص) 		3
(س / ص / ض) 		3
(س / ص / ض)
درجات إضافية من الحرية 2
(الوقت، قناة مضان) 		2
(الوقت، قناة مضان) 		3
(الوقت، قناة مضان والتوجيه)
قرار الجانبي ص
(0.6 λ / NA) 		0.66 ص
(0.4λ / NA) 		ص
(0.6 λ / NA)
القدرة البصرية باجتزاء لا نعم فعلا
(التمييز في مسار الكشف) 		نعم فعلا
(التمييز في إضاءة الطريق 75)
توافر والسعر يغلب عليها الطابع التجاري، وتكلفة منخفضة يغلب عليها الطابع التجاري، ومكلفة التجارية، ومكلفة
مبنية خصيصا، 54،59،60،75 معتدلة
المنشورات التصوير الحية التي تغطي الأجنة خنفساء ستة 44،76،77،78،79،80 سبعة 23،77،79،81،82،81
(الغزل مبائر القرص) 83،84،85 		أربعة 23،57،65،86

الجدول 1 - خصائص يتألقتقنيات الامتحانات التنافسية الوطنية المجهري المستخدمة في خنفساء يعيش التصوير.

صبغ تلطيخ تخفيف
SYTOX الخضراء النوى (غامض) 1: 10000 (1: 100 في [ده 2 O و 1: 100 في 1٪ (ث / ت) BSA في PBS)
YOYO-1 يوديد المغلف النووي 1: 10000 (1: 100 في [ده 2 O و 1: 100 في 1٪ (ث / ت) BSA في PBS)
BOBO-3 يوديد المغلف النووي 1: 10000 (1: 100 في [ده 2 O و 1: 100 في 1٪ (ث / ت) BSA في PBS)
اليكسا فلور 488 Phalloidin الأكتين الهيكل الخلوي 1: 100 (في 1٪ (ث / ت) BSA في PBS)
اليكسا فلور 546 Phalloidin الأكتين الهيكل الخلوي

الجدول 2 - تلطيخ حلول.

عمود الاغاروز
(الخيار 1) 		نصف كرة
(الخيار 2) 		صاحب بيت العنكبوت
(الخيار 3)
المنطق مضمن الجنين في عمود الاغاروز أن يتم الضغط من الشعرية يتم لصقها نهاية الخلفي من الجنين إلى قطب من أحد نصفي الكرة الأرضية الاغاروز يتم لصقها الجنين لفيلم الاغاروز رقيقة تغطي حفرة فترة زمنية محددة
حامل العينة اسطوانة الصلب مع دبوس أنبوب فولاذي اسطوانة الصلب مع
حفرة فترة زمنية محددة
غير محدود (أي) غير محدود (أي) أربعة (0 درجة و 90 درجة مئوية، 180 درجة، 270 درجة)
مستوى المهارات المطلوبة معتدل متوسط منخفض
الاغاروز حول الجنين متوسط منخفض معتدل
عدد الأجنة في كل دورة ما يصل الى ثلاثة واحد ما يصل الى ستة
استرجاع الجنين صعب سهل سهل
معدات التخلص منها الشعيرات الدموية الزجاج - -
تنصح ل تصوير حي والأجنة الملون على المدى القصير تصوير حي على المدى الطويل تصوير حي والأجنة الملون على المدى الطويل
<قوية> مراجع ثلاثة 23،87،88 اثنين 57،65 هذا المنشور

الجدول 3 - تركيب طرق مزايا وعيوب.

aberrational تحريض النمط الظاهري المنطق خطوة المرجعية (المنهجية)
تدخل RNA الجنينية يتم حقن مزدوج تقطعت بهم السبل-RNA في الأجنة خلال المرحلة الأريمة المخلوي أن يطرق إلى أسفل واحد أو الجينات أكثر تحديدا حقن الأجنة بعد الخطوة 4.8. اثنين 33،81
تدخل RNA الوالدين انقر نقرا مزدوجا الذين تقطعت بهم السبل RNA يتم حقن أفقيا في الاناث لو الشرانق بين شرائح البطن 3 و 4، الأمر الذي يؤدي إلى الجينات تدق إلى أسفل في ذرية اتخاذ الشرانق من الخطوة 1.5. اثنين 36،37
الجنينية خطوط متحولة قاتلة المتنحية ثقافات وضع البيض التي تحمل الجنينية طفرة قاتلة العائد متخالف المتنحية حوالي 25٪ زيجوت متماثلة الألائل ذرية متحولة عبور خط متحولة إلى خط التصوير خلال الخطوة 1.5. ثلاثة 39،51،89
تطبيق العوامل الخارجية وتطبق بعض العوامل النشطة بيولوجيا أو السامة خارجيا إلى الأجنة عن طريق إضافتها إلى المخزن المؤقت التصوير إضافة عامل إلى عازلة التصوير خلال الخطوة 2.2. اثنين 83،85

الجدول 4 - LSFM تصوير لايف Aberrational الظواهر

= "1"> الجدول التكميلي 1 - الفوقية ومعلمة لمجموعات البيانات على المدى الطويل لايف التصوير DS0001-0003. يرجى الضغط هنا لتحميل الملف.

فيلم التكميلي 1 - تصوير لايف من الأجنة خنفساء من AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 المعدلة وراثيا الخط.
هذا الخط المعارض نمطا محسن فخ التعبير. تم العثور على إشارة مضان في المقام الأول في المصلية، الكيس المحي ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية. يظهر الجنين على أربعة توجهات من 0:00 ساعة إلى 66:00 ساعة مع فاصل من 0:30 ساعة بين نقاط الوقت. يبدأ الفيلم في بداية تراجع germband وينتهي بمجرد الانتهاء من إغلاق الظهرية. معدل الإطار هو خمسة لقطة في الثانية. ZA،الحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. يرجى الضغط هنا لتحميل الملف.

فيلم التكميلي 2 - تصوير لايف من الأجنة خنفساء من المعدلة وراثيا خط الدبقية الأزرق.
يظهر الجنين على أربعة توجهات من 0:00 ساعة إلى 66:00 ساعة مع فاصل من 0:30 ساعة بين نقاط الوقت. يبدأ الفيلم في بداية تراجع germband وينتهي بمجرد الانتهاء من إغلاق الظهرية. معدل الإطار هو خمسة لقطة في الثانية. ZA، والحد الأقصى إسقاط ض التكيف مع كثافة. يرجى الضغط هنا لتحميل الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

رقابة جودة

في فحوصات التصوير الحية، يجب أن تكون إجراءات إعداد وتسجيل غير الغازية، أي لا الميكانيكية والتعامل مع المواد الكيميائية (جمع، dechorionation و التركيب على حامل العينة) ولا تحميل الطاقة المتكاملة خلال الملاحظة أن تؤثر على سلامة العينة. للدراسات التي تميز تنمية WT، فمن المستحسن استخدام البيانات الوحيدة من التجارب التي الجنين على قيد الحياة في عملية التسجيل، يتم استرداد بنجاح وتطور الى البالغين الأصحاء. يجب على الكبار لا تظهر أي الانحرافات المورفولوجية، يجب أن تكون خصبة ويجب ذرية لها أيضا أن تكون خصبة. هناك ثلاثة أسباب رئيسية لمعدلات البقاء على قيد الحياة منخفضة، خاصة في فحوصات التصوير الحي على المدى الطويل:

أولا، وتمت تغطية سطح الجنين على نطاق واسع مع الاغاروز خلال الخطوة 7، والتي ربما تعيق أيون والغاز والصرف يضيق ميكان الجنينically. الأجنة المصابة، وخصوصا عندما تصويرها خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، وعادة ما تتطور بصورة غير واضحة لعدة ساعات، اعتقال فجأة وتفقد إشارة مضان على وجه السرعة. مع بعض الخبرة، وجزء سطح مضمن في الاغاروز باستخدام تقنية نصف الكرة الأرضية يمكن أن تظل أقل من الثلث، بينما مع تقنية صاحب بيت العنكبوت، في وتغطي معظم النصف من سطح الأرض طبقة الاغاروز رقيقة جدا. ثانيا، تحميل الطاقة المتكاملة تطبيقها على الجنين يتجاوز التسامح. القيم الواردة في الخطوة 8.2 تخدم كقاعدة عامة من الإبهام، ولكن ينبغي النظر فيها المعايير التالية: (أ) الأجنة أثناء التطور الجنيني المبكر لا تحمل أشعة الليزر وكذلك الأجنة أثناء التطور الجنيني في وقت متأخر، (ب) على الرغم من أن الطاقة المتكاملة الحمل قد تكون متطابقة، وارتفاع قوة الليزر مع أي أقل وقت التعرض أو فترات زمنية أطول ويبدو أن أكثر إرهاقا من أقل قوة الليزر مع وقت التعرض عالية أو فترات زمنية أقصر، موجات (ج) أعلى وعادة ما تكون أكثر تحملا و (د) لخطوط المعدلة وراثيا، والحد من التسامح ويبدو أن خط محددة، في حين أن قوة التعبير fluorophore يبدو أن يتناسب عكسيا مع التسامح أشعة الليزر. بالإضافة إلى ذلك، وتصميم من البروتين الانصهار و / أو التوطين داخل الخلايا أيضا أن تلعب دورا في ذلك. ثالثا، تلف الجنين أثناء عملية التركيب. العامل الأكثر أهمية هنا هو أن فترة حضانة في محلول هيبوكلوريت الصوديوم قصيرة قدر الضرورة لإزالة المشيماء. حضانة مرات أطول قد يضر الأجنة. كما ينبغي الحرص على عدم ثقب أو ضغط الأجنة مع الفرشاة وللحفاظ على تصاعد الاغاروز في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تحديد الأجنة التي تضررت خلال الخطوة 8.4 قبل عملية التصوير الفعلية تبدأ، بحيث يمكن استبدال الأجنة التالفة بأخرى قابلة للحياة.

باتباع هذه المبادئ التوجيهية، عادة حوالي 85-90٪ من امبريالسراج البقاء على قيد الحياة إجراء التصوير الحي ويفقس. حوالي 90٪ من الأجنة التي تحاك تتطور إلى البالغين الأصحاء وخصبة. تظهر نسبة البقاء على قيد الحياة لتكون مستقلة عن التصوير في درجة الحرارة وتقنيات تركيب (عند استخدام عمود الاغاروز لفترات التصوير لم يكن أكثر من نصف يوم)، ولكن تنخفض قليلا مع مستويات مرتفعة من الإشعاع الليزر. كعنصر تحكم إضافية، وخصوصا خلال توصيف الأولي من خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب لتصوير حي مضان أو إطار تأسيس مرحلة السلائف لتسلسل تجريبي شامل، فمن المستحسن لتشغيل غير المصورة-WT والأجنة وراثيا بالتوازي مع تصوير الأجنة، التي حضنت في نفس درجة حرارة الجنين المصورة، ومقارنة الوقت اللازم لتطوير والتشكل 65.

وعلاوة على ذلك، ينبغي أن الدراسات التي تميز الظواهر aberrational (الجدول 4) عن طريق التصوير الحي أيضا تشغيل غير المتأثرة ججنين ontrol في نفس الوقت. فمن المستحسن للحفاظ على علاج كل من الأجنة مماثلة قدر الإمكان، ولكن هذا لابد من النظر بشكل فردي لكل استراتيجية التجريبية:

تدق إلى أسفل عن طريق التدخل RNA.

لالجنينية تدخل RNA 33، 81، الأجنة التي تنبع من نفس الثقافة وضع البيض إما أن يكون حقن مع RNA المزدوج تقطعت بهم السبل وظيفية أو السيطرة عليها. وينبغي بعد ذلك تصوير الأجنة حقن مختلفة في وقت واحد في نفس LSFM باستخدام إما عمود الاغاروز أو تقنية صاحب بيت العنكبوت. لالوالدين التدخل RNA 36، 37، ينبغي تقسيم ثقافة التصوير في اثنين من ثقافات فرعية. وينبغي حقن الشرانق الإناث من ثقافة فرعية واحدة مع RNA المزدوج تقطعت بهم السبل وظيفية، في حين ينبغي حقن ثقافة فرعية أخرى مع التحكم RNA المزدوج تقطعت بهم السبل. جنين كوليجب أن يتم تنفيذ ection في موازاة ذلك، وعلى كل من التجريبية والجنين السيطرة ولا يمكن تصوير في وقت واحد في نفس المجهر باستخدام عمود الاغاروز أو تقنية صاحب بيت العنكبوت.

المتنحية الجنينية خطوط متحولة قاتلة.

عند العمل مع المسوخ المتنحية الجنينية قاتلة 39، 89، 91، 92، 93، ثقافة وضع البيض من المسوخ متخالف، التي عادة ما تكون غير واضحة ظاهريا، والمحاصيل نظريا 25٪ متماثل ذرية متحولة (ولكن في بعض الأحيان أقل بسبب طريقة تعامل العملي تصدر 89) و 75٪ من ذرية غير واضحة ظاهريا (50٪ المسوخ متخالف و 25٪ WTS). فمن المستحسن استخدام تقنية صاحب بيت العنكبوت لتركيب عدة أجنة من هذه الثقافة وضع البيض. يمكن للطفرات متماثل يكون طdentified طوال فترة التصوير التي كتبها مظهر من مظاهر النمط الظاهري، في حين تخدم الأجنة عادة النامية والضوابط. يمكن تحديد النمط الجيني من العينات تصويرها مرة واحدة يتم الانتهاء من تصوير ومراقبة الجودة.

تطبيق العوامل الخارجية.

إذا كان تأثير العوامل الخارجية في المخزن المؤقت التصوير 83، 85، على سبيل المثال المواد النشطة بيولوجيا أو السامة، على يتم التحقيق التنمية، التصوير مواز مع جنين تحكم في نفس LSFM هو عادة غير ممكن. لذلك، والتصوير لابد من تنفيذها بالتتابع. على النحو الأمثل، والتقليل من الوقت بين التجارب اللاحقة والأجنة مستمدة من ثقافة التصوير نفسها. بدلا من ذلك، وهما بناء مماثل وLSFMs تعمل يمكن استخدامها. في هذه الحالة، الأجنة من نفس فترة وضع البيض يجب استخدام، وإنما هو من الأهمية بمكان أن ثوأجرى ه معايرة كلا المجهر بعناية بحيث خصائص التصوير قابلة للمقارنة. باستخدام تقنية صاحب بيت العنكبوت، أجنة متعددة لكل حالة ويمكن تصويرها في آن واحد. مع تقنية عمود الاغاروز، قد أعاق العوامل الخارجية من الوصول إلى الأجنة.

القيود الحالية للنهج التصوير الحي LSFM

LSFM هو أداة قوية لتحليل التشكل الجنيني غير جراحية في عدة أبعاد تحجيم اسعة النطاق. الإجراءات العملية القياسية، كما هو مقترح في هذا البروتوكول، وسوف تدعم عملية إنشاء التكنولوجيا ورقة الخفيفة كأداة قياسية في البيولوجيا التطورية. ومع ذلك، يقتصر النهج الذي يتبعه عدد من العوامل على مستويات التجريبية والتنظيمية المختلفة:

في البداية، وقد وضعت LSFM لتحليل نموذج واحد في وقت واحد. نهج كل تيار صورة اثنين أو أكثر من الأجنة في وقت واحد في نفس المجهر ب ذ 'التراص "العينة على طول المحور الصادي في العمود الاغاروز أو عناوين صاحب بيت العنكبوت هذه المشكلة فقط إلى درجة معينة. تتوفر 94 و 95 و 96 على الاجهزة متعددة جيدا plate- والقائم على ساترة. ومع ذلك، فإنها تعاني من انخفاض جودة الصورة وتضحية بعض الفوائد الأساسية من LSFM، مثل التصوير على طول عدة اتجاهات. حاليا، فإن أفضل خيار هو العمل مع المجاهر متعددة في نفس الوقت، الذي يصبح ممكنا إلى حد معقول عندما يتم مشاركة مكونات مكلفة، مثل الليزر، 60.

مع EFA-nGFP 57، 65، 84، جبهة التحرير الوطني 86، وذكي 58، 86، وAGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1، وAGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 والدبقية الأزرقوتتوفر حاليا = "XREF"> 58، خطوط ستة فقط حسب الطلب المعدلة وراثيا مناسبة لتصوير حي على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك، HC079 (السلى)، وقد اتسمت G12424 (المصلية) وG04609 (القلب) محسن خطوط فخ 51 مع LSFM 23. بدلا من ذلك، الأجنة الفلورسنت يمكن أيضا أن تولدها مرنا 81 أو صبغ حقن 79، تلك المناهج هي واضحة نسبيا، ولكن أيضا تعاني من قيود 86. عدة مزيد من المعايير لا تزال هناك حاجة مثل خطوط cytoskeletal-، organelle- والمسمى غشاء أو خطوط التي تعبر عن fluorophores تحت بعض المروجين غير موجود في كل مكان لمراقبة فقط بعض الأعضاء أو الأنسجة. من الناحية المثالية، تلك الخطوط تتوفر مع البروتينات الفلورية مختلفة أيضا.

وهناك تحد آخر هو حجم البيانات التي تم إنشاؤها من قبل LSFM. بسبب الحصول على المعلومات في ثلاثة أبعاد مكانية ولا يقل عن ثلاثة فودرجة rther الحرية (الساعة والتوجيه، قناة مضان)، وحجم قواعد البيانات التصوير الحية يمكن أن تصل بسهولة إلى العديد غيغابايت إلى بضعة تيرابايت. حتى بعد الاقتصاص ثلاثي الأبعاد، وضغط على أساس ZIP من الحاويات TIFF، ومجموعات البيانات النموذجية الثلاثة المرتبطة بهذه الدراسة وأحجام 31.6، 12.6 و 45.1 غيغابايت، أي 89.3 جيجابايت في المجموع. عند العمل مع LSFM، فمن الضروري أن يكون البنية التحتية منها لتخزين البيانات ومعالجتها 88، 97.

يتم الحصول على أعلى جودة الصورة على سطح الجنين، ولكن مع زيادة العمق، إشارة مضان يصبح أكثر وأكثر ضبابية. على سبيل المثال، في نهاية الخلفي من germband يصبح تغطيها أضعاف الكيس المحي خلال المعيدة ولا يمكن حلها بشكل صحيح (الشكل 4C، أول من الطابور الخامس). التصوير على طول عدة اتجاهات يحل هذه المشكلة في جزء أقلially - معلومات عالية الجودة من على سطح الأرض في جميع أنحاء الجنين هو متاح، ولكن تبقى المناطق الداخلية غامض. حاليا، لا توجد حلول مرضية المتاحة، ولكن في المدى الطويل، والبروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء 98، والنهج الوراثية 99 أو الاجهزة المجهر مع البصريات التكيفية 100 يمكن اعتبارها.

التكيف مع الأنواع الأخرى

الآن، وقد استخدمت LSFM لتوثيق التطور الجنيني من ثلاثة أنواع الحشرات، أي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة 61، 62، 101، وإفشال يطير Megaselia abdita 102 والأحمر الدقيق خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء 57. الإطار التجريبي، وإجراءات التشغيل القياسية وتقنيات التركيب وصفها هنا شولد تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى أنواع الحشرات الأخرى. هي بروتوكولات التحول سلالة الجرثومية للعديد من الحشرات التي تنتمي إلى مختلف الأوامر المتوفرة 103، بما في ذلك الأنواع ذات الأهمية الاقتصادية و / أو الطبية، مثل النحل 104، عدة lepidopterans 105، 106 أو عدة أنواع البعوض 107، 108، 109. مع خطوط المعدلة وراثيا منها مناسبة لمضان التصوير الحي، والتشكل الجنيني للحشرات يمكن أن توصف حين النظر في الأنساب تطورها و / أو بيئات ايكولوجية. وقد وصفت ما يقرب من مليون نوع من الحشرات وعشرين مليون الحشرات نوعا آخر من المرجح وجود 110، التي تغطي أكثر من 400 مليون سنة من التطور 2. والمنهج المقارن فقط سوف تولد المعلومات التي في ال Ø بدورهقصر الأفكار التي لا يمكن الحصول عليها من خلال دراسة المبادئ التنموية فقط نوع واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الكاتب الاشتراكات

تصور FS وEHKS البحث. FS إنشاء خطوط AGOC المعدلة وراثيا. وقد أجريت خفيفة على أساس ورقة التصوير مضان التي كتبها FS وSK. كتب FS وEHKS المخطوطة مع مدخلات من SK.

Acknowledgments

نشكر سفين بلاث للدعم التقني. وكان خط المعدلة وراثيا، الدبقية الأزرق هدية عينية من جريجور بوشر (غوتنغن، ألمانيا). وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الكتلة التميز فرانكفورت للالمجمعات ضخم (CEF-MC، EXC 115، المتحدث فولكر دوتشش) الممنوحة في جزء منه إلى EHKS في معهد BUCHMANN لعلوم الحياة الجزيئية (BMLS، مدير إنريكو شليف) في Goethe UNIVERSITAT فرانكفورت قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 122، المفصليات، الحشرات، مغمدات الأجنحة،
مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em&gt; خنفساء الدقيق الحمراء</em&gt; الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter