Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Lys Sheet-baserede Fluorescence Microscopy af Leve- eller fikseres og farves Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Billeddannelse af morfogenese af insekt embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi er blevet stade. Denne protokol skitserer og sammenligner tre monteringsteknikker passende for Tribolium castaneum embryoner, indfører to hidtil ukendte skræddersyede transgene linier velegnede til billeddannelse, diskuterer væsentlige kvalitetskontrol og angiver de aktuelle eksperimentelle begrænsninger.

Abstract

Den røde mel bille Tribolium castaneum er blevet et vigtigt insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik og evolutionær udviklingsmæssige biologi. Observationen af Tribolium embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi har flere fordele i forhold til konventionel Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi. På grund af de unikke egenskaber af en lyspladen-baserede mikroskop, kan tredimensionelle billeder af levende prøver registreres med højt signal-støj-forhold og væsentligt reduceret foto-blegning samt foto-toksicitet langs flere retninger over perioder, der varer flere dage. Med mere end fire års metodeudvikling og en fortsat stigning af data, synes passende tid til at etablere standardprocedurer for brugen af lys ark teknologi i Tribolium samfund såvel som i insekt samfundet som helhed. Denne protokol beskrives tre monteringsteknikker egnede feller forskellige formål, præsenterer to nye skræddersyede transgene Tribolium linjer passende for langsigtet direkte billedvisning, foreslår fem fluorescerende farvestoffer at mærke intracellulære strukturer af faste embryoner og giver oplysninger om data efterbehandling til rettidig evaluering af de registrerede data. Repræsentative resultater koncentrere sig om langsigtet billeddannelse, optiske sektionering og observation af den samme embryo langs flere retninger. De respektive datasæt leveres som en download ressource. Endelig protokollen diskuterer kvalitetskontrol for lever imaging-analyser, aktuelle begrænsninger og anvendeligheden af ​​de skitserede procedurer til andre insektarter.

Denne protokol er primært beregnet til udviklingsmæssige biologer, der søger imaging-løsninger, der udkonkurrerer standard laboratorieudstyr. Det fremmer den kontinuerlige forsøg på at lukke hullet mellem de teknisk orienterede laboratorier / samfund, der udvikler og forfiner mikroerkopiere metodisk, og life science laboratorier / samfund, som kræver 'plug-and-play' løsninger på tekniske udfordringer. Desuden er det understøtter en aksiomatisk tilgang, der bevæger de biologiske spørgsmål i centrum for opmærksomhed.

Introduction

Den røde mel bille Tribolium castaneum, der hører til den store familie af skyggebiller (Tenebrionidae), har en lang historie inden for landbrugs- og biovidenskab og er den anden bedst undersøgte model insekt model organisme efter bananfluen Drosophila melanogaster. I løbet af de sidste fire årtier, blev det en kraftfuld og populær insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik, i evolutionær udviklingsmæssige biologi og i løbet af de sidste tyve år, i embryonale morfogenese for en række forskellige årsager:

Drosophila og Tribolium begge tilhører den Holometabola, men afveg ca. 300 millioner år siden 1, 2, 3, 4. Mens den embryoniske udvikling af Drosophila almindeligvis betragtes som særdeles afledt, Tribolium viser en mere nedarvet tilstand af udvikling, der findes i en væsentligt større andel af insektarter 5, 6, 7, 8, 9. For det første Tribolium udviser ikke-involuted hoved udvikling, dvs. dens munddele og antenner dukke allerede under embryogenese 10, 11, 12, 13, 14, 15. For det andet, Tribolium følger de principper for kortvarige kim udvikling, dvs. abdominal segmenter tilsættes sekventielt fra en posterior vækst zone i germband forlængelse 16, 17, 18, 19. For det tredje, Tribolium udvikler og senere nedbrydesto ekstra-embryonale membraner dvs. amnion, som dækker embryonet kun ventralt, og serosa, som indhyller embryonet helt 20, 21, 22. Begge membraner spiller en afgørende morfogenetiske 23 samt beskyttende rolle mod mikroorganismer 24, 25 og udtørring 26. For det fjerde har embryonically udviklingslandene ben er fuldt funktionelle i larvestadiet livsfase og tjene som primordier for de voksne ben under puppe metamorfose 27, 28, 29, 30, 31.

På grund af deres lille størrelse og beskedne krav, dyrkning af Tribolium i laboratoriet er forholdsvis ligetil. Kulturer af vildtype (WT) stammer eller transgene linjer består typisk af omkring 100-300 voksne og kan holdes inden for én-liters glasflasker (fodaftryk 80 cm2) fyldt tre til fire centimeter høje (ca. 50 g) med vækstmedium, som består af fuldnarvet hvede mel suppleret med inaktiv tørgær. En vandforsyning er ikke nødvendig. Dette tillader selv små laboratorier til at holde snesevis af beetle kulturer inden små eller mellemstore kommercielt tilgængelige insekt inkubatorer. Senere udviklingsstadier af Tribolium (larver efter ca. fjerde stadiums, pupper og voksne) adskilles let fra vækstmediet ved sigtning. Synkroniserede embryoner opnås ved at inkubere voksne i korte perioder på æglægning medium. For udvikling bliver beetle kulturer holdt ved 32 ° C (ca. fire uger pr generation), mens lagerføring udføres typisk ved 22-25 ° C (omkring ti uger om generation).

Inden for det sidste årti, mange standard techniques gradvist er blevet tilpasset og optimeret til Tribolium, som sammenfattet i det spirende modelorganismer bøger 32. Af stor betydning er avancerede genetiske metoder såsom embryoniske 33, larve- 34, 35 eller parental 36, 37 RNA-interferens-baserede gen knockdown, kimlinietransformation med enten piggyBac 38, 39 eller Minos 40 transposase-system og CRISPR / Cas9-baserede genom engineering 41. Desuden har Tribolium genomet blevet sekventeret omkring et årti siden 42, og er nu i den tredje runde af genom samling frigive 43, der muliggør effektiv og hele genomet identifikation og systematisk analyse af gener 44 45, 46. Derudover genomerne fra fire andre billelarver arter er tilgængelige til sammenlignende genetiske tilgange 47, 48, 49, 50. I association med den genom, har to store genetiske analyser udført, dvs. en insertionsmutagenese skærm 51 og en systematisk RNA-interferens-baserede gen knockdown skærm 52, 53.

Fluorescens billeddannelse med Vidvinklet, konfokal eller lys ark-baserede mikroskopi (LSFM) gør det muligt at observere det embryoniske morfologi Tribolium som funktion af tiden (dvs. den morfogenese) i et flerdimensionalt sammenhæng (tabel 1). I Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi, den Excitation og emission lys ledes gennem det samme objektiv. I begge tilgange er hele prøven belyst for hver registreret todimensionalt plan. Derfor er prøverne udsat for meget høje energiniveauer. I LSFM, kun fluoroforerne i brændplanet exciteres på grund af en afkobling af belysning og påvisning ved anvendelse af to vinkelret anbragte objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i to kanoniske implementeringer - den enkelt plan belysning mikroskop (SPIM) og de digitale scannede laserlys ark-baserede fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) - og giver flere vigtige fordele i forhold til traditionelle fremgangsmåder: (i) iboende optisk sektionering kapacitet, (ii) god aksial opløsning, (iii) kraftigt reduceret niveau af foto-blegning, (iv) meget lav foto-toksicitet, (v) højt signal-til-støj-forhold, (vi) relativt høj erhvervelse hastighed, (vii) afbildning langs flere retninger og (VIii) dybere vævspenetration grund af brugen af lav numerisk apertur belysningsobjektivsystem linser 54, 55, 56.

LSFM er allerede blevet anvendt med succes i Tribolium at dokumentere næsten hele embryonale morfogenese 57 og analysere principperne for ekstra-embryonale membran brud i begyndelsen af dorsale lukning 23. For at hæve tiltrækningskraft LSFM i Tribolium samfundet og for insekt videnskab i almindelighed, er det af stor betydning at etablere standardprocedurer og forbedre de metoder, protokoller og den pulje af ressourcer til et niveau, hvor mikroskopet bliver en lethed-i -Brug standardværktøj i udviklingsmæssige biologiske laboratorier, og de biologiske spørgsmål bo i centrum for opmærksomhed.

Denne protokol begynder med det grundlæggende i Tribolium </ em> dyrkning, dvs. vedligeholdelse, reproduktion og embryonindsamlingsteam. Derefter to eksperimentelle strategier illustreret: (i) levende billeddannelse af skræddersyede transgene linier og (ii) afbildning af faste embryoner, der blev farvet med fluorescerende farvestoffer (tabel 2). Efterfølgende tre monteringsteknikker med lidt forskellige formål forklaret detaljeret (figur 3 og tabel 3): (i) agarosesøjlen, (ii) agarose halvkugle og (iii) spindelvæv holder roman. Protokollen derefter forklarer proceduren for dataopsamling med LSFM. Billeddiagnostiske metoder og centrale overvejelser er skitseret. Endelig embryo hentning forklaret og forslag til grundlæggende databehandling leveres. I de repræsentative resultater, live billeddata fra to hidtil ukendte skræddersyede og Glia-blå 58 transgene linier er vist, og de respektive billeddannende datasæt er tilvejebragt som en downloades ressource. Derudover billededata af faste embryoner, der blev farvet med en række fluorescensfarvestoffer præsenteres. Diskussionen fokuserer på kvalitetskontrol, nuværende begrænsninger i direkte billedvisning tilgang og tilpasning af protokollen til andre arter.

Protokollen er skrevet til lette flade baseret fluorescensmikroskoper der er udstyret med et prøvekammer og en roterbar klemme mekanisme for standardiserede prøveholdere 54, 59, 60, der typisk er cylinderformede elementer fremstillet af metal, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollen er også velegnet til både kanoniske implementeringer, dvs. spim og DSLM samt for opstillinger med to eller flere belysning og afsløring arme 61, 62, 63. De repræsentative resultater viser data i to spektrale kanaler, grøn (illumination med en 488 nm laser, detektion gennem et 525/50 båndpasfilter) og rød (belysning med en 561 nm laser, detektion gennem et 607/70 båndpasfilter), men protokollen kan udvides til tre eller fire spektrale kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Husbandry af Tribolium Cultures

BEMÆRK: Standard betingelser er defineret som en inkubationstemperatur på 25 ° C og 70% relativ fugtighed i en 12 h lys / 12 timer mørke cyklus. For mere information om Tribolium dyrehold, respektive retningslinjer er tilgængelige 64. Denne protokol kræver to forskellige mel-baserede medier, som kan fremstilles i kilogram mængder og lagres i flere måneder.

  1. Før arbejde med mel og inaktiv tørgær, lagre de uåbnede pakker ved -20 ° C i 24 timer og derefter lade dem varme op til stuetemperatur. Denne procedure fjerner potentielle patogener.
  2. Passere fuld mel korn hvede og inaktiv tørgær gennem en sigte med 710 um maskestørrelse, derefter forberede vækstmedium ved at supplere den sigtede fuldnarv mel med 5% (vægt / vægt) sigtet inaktiv tørgær.
  3. Pass 405 fint hvedemel og inaktive tørgær gennem en sigte med 250 & #181; m maskestørrelse, derefter forberede æglægning medium ved at supplere den sigtede 405 mel fint hvede med 5% (vægt / vægt) sigtet inaktiv tørgær.
  4. Før respektive Tribolium kultur gennem en sigte med 800 um maskestørrelse. Kassere sidesten vækstmedium. Overfør larverne, pupper og voksne til et stort glas fad.
  5. Hvis der ikke findes afkom kultur, overføre omkring 80 larver og / eller pupper til en ny glasflaske at etablere et nyt afkom kultur. Hvis der ikke larver og / eller pupper er til stede, tage omkring 40 voksne i stedet. Tilsæt 50 g vækstmedium og inkuberes under standardbetingelser.
  6. Indsamle omkring 300 voksne (500-700 mg) i en anden ny glasflaske at etablere det billeddannende kultur. Tilsæt 50 g vækstmedium og inkuberes under standardbetingelser. Tillade billeddannelse kultur at bundfælde i mindst 24 timer i frisk vækstmedium før embryonindsamlings-.
  7. Udskift vækstmedium af den billeddannende kultur mindst hver to vieks, hvilket kan gøres i forbindelse med embryonindsamlings- (se 3.2). Efter to til tre måneder, udskifte billedtromlen kultur helt ved nye voksne fra efterkommerne kultur.
  8. Hvis der anvendes et ikke-homozygot transgen linje, kuratere afkom-kulturer ofte ved at fjerne ikke-transgene dyr. Ideelt set generere homozygote linier, hvis den respektive transgen er ikke dødelig eller forårsager sterilitet, når til stede på begge kromosomer. Homozygote kulturer typisk have en højere gennemsnitlig fluorescens niveau og de overordnede eksperimentelle betingelser er smallere, da kun en genotype er til stede.

2. Mikroskop Opsætning og kalibrering

BEMÆRK: Tribolium embryo har en anterior-posterior længde på ca. 600-660 um og en tværgående diameter på omkring 300-330 um. De fleste moderne CCD-kameraer har en sensorchip størrelse på ca. 9 mm x 7 mm, dvs. en diameter på 11,4 um og en pixel-pixelafstand på 6,45 um.Når det kombineres med en 10X forstørrelse objektivlinse, kan embryoet afbildes in toto med et pixel på 0,645 um. De fleste moderne sCMOS kameraer har en større sensor chip størrelse på ca. 16 mm x 14 mm, dvs. en diameter på 21,3 um og en pixel-pixel afstand på 6,5 um. Når det kombineres med en 20X forstørrelse objektivlinse, kan embryoet afbildes in toto med et pixel på 0,325 um.

  1. Fastgør belysning og detektion objektive linser til mikroskopet. Sikre, at lasere og fluorescens-filtre matcher fluoroforen absorption og emissionsspektre meget godt.
  2. Fastgør prøvekammeret til mikroskopet. Hans position prøvekammeret med PBS pH 7,4 eller ethvert andet passende billeddannelse puffer.
  3. Tænd og kalibrere mikroskopet. Omfattende kalibrering rutiner og retningslinjer fejlfinding for specialbyggede lys ark-baserede mikroskoper (mere specifikt for gennemførelsen DSLM) er blevet offentliggjort PReviously 65. For kommercielle enheder, skal du følge producentens anvisninger meget nøje. Forkert håndtering kan nedbryder prøvekammeret af mediet og skabe kaos til instrumentet samt prøven.

3. Indsamling af transgene eller WT Embryoner

  1. Passere det billeddannende koloni gennem en sigte med 800 um maskestørrelse. Indsamle voksne biller i en ny glasflaske og tilsættes 10 g æglægning medium. Inkubere æglægning kultur i 1 time ved 25 ° C og 70% relativ fugtighed i lys.
  2. Passere æglægning kultur gennem en sigte med 800 um maskestørrelse at adskille voksne fra æglægning medium, der indeholder omkring 30-100 embryoner. Overfør voksne til et nyt glas flaske og tilføje enten den gamle eller 50 g frisk vækstmedium.
  3. Hvis observation bør starte i den ensartede blastodermstadiet (eksempel datasæt DS0002), inkubere æglægning medium i 15 timer ved 25 ° C og 70% relativ fugtighed. To starte ved begyndelsen af ​​germband tilbagetrækning (f.eks datasæt DS0001 og DS0003), inkuber embryoner i 23 timer ved 32 ° C og 70% relativ fugtighed. Hvis der ønskes andre udviklingsstadier, henvises til de respektive litteratur 64, 65 og tilpasse inkubationstid og / eller temperatur efter behov.

4. Embryo Dechorionation

BEMÆRK: chorion er det ydre lag af æggeskallen og består af proteiner og polysaccharider. Det er stærkt lysabsorberende men ikke afgørende for korrekt udvikling og kan således fjernes kemisk.

  1. Passere æglægning medium gennem en sigte med 300 um maskestørrelse. Indsamle embryonerne i en celle si med 100 pm maskestørrelse og kassér efterladenskaber æglægning medium.
  2. Forberede en plade med 6 brønde som følger: hans position A1, A2, A3 og B3 brønde med 10 ml PBS pH 7,4, og B1 og B2 brønde med 9 ml PBS. Så tilsættes forsigtigt1 ml natriumhypochlorit til B1 og B2. Observere forløbet af trin 4.3 til 4.8 under stereomikroskop. ADVARSEL natriumhypochlorit er ætsende.
  3. Indsæt celle si i A1 godt (PBS pH 7,4) og vaske embryoner i et minut under forsigtig omrøring. Større mel partikler må frigøres fra embryonerne.
  4. Overfør cellefilter til B1 brønd (natriumhypochlorit i PBS pH 7,4) og ryst pladen kraftigt i 30 s. De resterende mel partikler må frigøres fuldstændigt fra embryonerne.
  5. Overfør cellefilter til A2 godt (PBS pH 7,4) og vaske embryoner i 1 minut under forsigtig omrøring.
  6. For dechorionation, overføre cellefilter til B2 brønd (natriumhypochlorit i PBS pH 7,4). Ryst pladen kraftigt, indtil chorion brister og frigøres fra embryoner. Chorion ligner en tynd, semi-transparent membran med sønderrevne kanter, mens dechorionated embryoer har en almindelig silhuet.
  7. Overfør the cellefilter til A3 godt (PBS pH 7,4) og vaske embryoner i 1 minut under forsigtig omrøring. Hvis der chorion fragmenter stadig er fastgjort til embryoner efter vask, gentag trin 4.6.
  8. Opbevare embryonerne i B3 brønd (PBS pH 7,4). Opbevaring i flere timer ikke skader de embryoner, men husk på, at udviklingen fortsætter.
  9. For ikke-homozygote transgene linier, fjerne eventuelle ikke-fluorescerende embryoer hvis muligt. Til fiksering og farvning af WT eller transgene embryoner, fortsætte med trin 5. For levende billeddannelse af transgene embryoner, fortsætte med trin 6.

5. vitellinmembranen Permeabilisering, Fiksering, og farvning

BEMÆRK: vitellinmembranen er det indre lag af æggeskallen. Det er uigennemtrængelig for fluorescerende farvestoffer og således skal kemisk permeabiliseret før farvning.

  1. Fylde et scintillationshætteglas med fiksering / permeabiliseringsopløsningen (1,5 ml 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd i PBS pH 6,9 ennd 1,5 ml n-heptan). Overfør embryoner med en pensel til hætteglassene. Cover hætteglas med aluminiumfolie for at beskytte fluoroforer mod lys og inkuberes i 30 minutter på en vippende platform ved 50 omdrejninger i minuttet. ADVARSEL paraformaldehyd er giftigt og ætsende, n-heptan er brændbart og giftigt.
  2. Fjerne fikseringsopløsning og behandle embryoner tre gange i 15 minutter i 3 ml 0,1% (volumen / volumen) Triton X-100 i PBS pH 7,4 og derefter en gang i 15 minutter i 3 ml 1% (volumen / volumen) Triton X-100 i PBS pH 7,4 på en vippende platform ved 50 omdrejninger i minuttet. PAS Triton X-100 er ætsende.
  3. Fjerne permeabiliseringsopløsningen og tilsæt 0,5 ml farveopløsning til hætteglasset. Eksempler farvningsopløsninger er tilvejebragt i tabel 2. Farv embryoner natten over ved 4 ° C på en vippende platform ved 50 omdrejninger i minuttet. For de foreslåede i tabel 2 farvestoffer, vask er ikke nødvendig.

6. Fremstilling af Montering Agarose

  1. Tilsæt 1 g lavtsmeltendeagarose til 100 ml PBS pH 7,4, og opvarm blandingen i 2-3 minutter i en mikrobølgeovn ved 800 W. Hvis små agarosepartikler stadig er til stede, gentages opvarmningen i 30 sekunds intervaller, indtil partiklerne opløses fuldstændigt. Monteringselementet agarose behøver ikke at fremstilles frisk hver gang, den størknede agarose kan genbruges flydende ved opvarmning som beskrevet ovenfor. Denne proces kan gentages 5-6 gange før for meget vand er fordampet.
  2. Tillade agarose at køle ned til ca. 40-45 ° C, derefter fylde to 1.5 ml reaktionsrør med den opvarmede agarose og holde disse rør ved 35 ° C i en termoblok.

7. Embryo Montering og indsættelse i prøvekammeret

  1. Mulighed 1: Agarose søjle (figur 3A-C, første søjle; tabel 3, anden kolonne)
    1. Fyld en 1,0 ml sprøjte med destilleret vand og sætte den på en af ​​de glas kapillaråbninger ved hjælp af en lille gummislange.Fyld den kapillære halvt op med destilleret vand.
    2. Pick et foster med en pensel og placere den på indersiden af ​​den anden glaskapillar åbning. Fortsæt hurtigt videre til næste trin, før fosteret tørrer ud.
    3. Holde kapillarrøret i den flydende agarose og langsomt trække et par pi flydende agarose siden af ​​embryonet ind i kapillarrøret. Derefter hurtigt øge trækkraften, således at embryoet trækkes sammen med agarosen. I sidste ende bør et par pi agarose være over og under embryoet. Sæt kapillær til side i et par minutter og lad agarose størkne.
    4. Afkort kapillar med en diamant glas cutter til en længde på omkring 5 mm. Det resterende fragment bør være helt fyldt med agarose og embryoet bør være inden for det andet kvartil.
    5. Sæt stålcylinderen med stiften i prøvekammeret, og derefter holde den kapillære fragment oven af ​​stiften. Den agarosesøjlen skal stikke et par millimeter from kapillarrøret fragmentet med den del, der indeholder embryoet.
  2. Mulighed 2: Agarose halvkugle (figur 3A-C, anden søjle; tabel 3, kolonne)
    1. Trække 200 pi flydende agarose i en 1,0 ml sprøjte, så brug det til at fylde stålrøret fra toppen med agarose indtil en halvkugle formularer på bundåbningen. Halvkuglens diameter bør være lig med rørdiameteren. Vent et par minutter, indtil agarosen er størknet.
    2. Pick et foster med en pensel og omarrangere det på spidsen af ​​børsten, så den forreste ende bliver tilgængelig. Dyp agarose halvkugle til væskeformige agarose at dække det med en tynd film.
    3. Placer foster med sin forreste ende oprejst på pol af agarose halvkugle. Drej stålrøret rundt og korrigere positionen af ​​embryoet med børsten. Om nødvendigt stabilisere embryo ved tilsætning af 2 pi agarose til embryo / halvkugle grænse. Ideelly, bør mindre end halvdelen af ​​embryonet overflade være dækket i agarose og flankerne skal være så stejl som mulig.
    4. Sæt stålrøret med halvkuglen og embryoet langsomt ind i prøvekammeret.
  3. Mulighed 3: Cobweb holder (figur 3A-C, tredje søjle; tabel 3, fjerde kolonne)
    1. Pick et foster med en pensel og sæt den til side.
    2. Dæk opslidsede hul i spindelvæv holder med 5-8 pi flydende agarose, derefter fjerne det meste af agarose, indtil kun en tynd agarose film tilbage.
    3. Placer embryo onto agarose film og justere dens position. Flyt forsigtigt embryonet til x-aksen midten af ​​det udskårne hul, og tilpasse sin langstrakte anteriore-posteriore akse med det langstrakte akse i langhullet.
    4. Indsæt spindelvæv holderen med den monterede embryo langsomt ind i prøvekammeret. Anbring holderen spindelvæv, så det ikke forstyrrer den excitation og emissionlys, dvs. 45 ° i forhold til x- og z-aksen.

8. Lys Sheet-baserede Fluorescens mikroskopi

  1. Beslutte langs hvor mange retninger (og langs hvilke orienteringer) embryonet bør afbildes. Fire retninger (sammen orienteringerne 0 °, 90 °, 180 ° og 270 °) giver typisk et godt kompromis mellem dækning og energi belastning.
  2. Opsætning af antallet af fluorescens-kanaler. De vigtigste parametre for hver kanal er laserlinjens, fluorescens filter, lasereffekten og behandlingstid. Ved længerevarende direkte billedvisning, er det vigtigt, at den integrerede energi belastning ikke overstiger tolerancen af ​​embryoet. En eksponeringstid på 25-50 ms sikrer hurtig billeddannelse, mens en lasereffekt mellem 100 og 300 pW ikke bør påvirke levedygtigheden af ​​embryoet. For faste prøver, eksponeringstid og lasereffekt kan mindst fordoblet.
  3. For levende imaging-analyser, konfigurere tidsforskydningen. den complete embryogenese af Tribolium tager cirka syv dage ved stuetemperatur (23 ± 1 ° C) og lidt mindre end tre dage ved 32-35 ° C 64. Definer den tidsmæssige interval efter de morfogenetiske begivenheder, der skal overholdes. For korte tidsmæssige intervaller, overveje at sænke eksponeringen tid og laser effekt (se 8.2).
  4. Placer embryo i lystransmission tilstand langs x- og y-akserne ind i midten af ​​synsfeltet uden at udsætte den for laseren. Rotere embryo ved 360 ° i 90 ° trin for at undersøge embryo for skader, der kunne have forekommet under monteringsprocessen.
  5. Rotere embryo passende omkring y-aksen at tilpasse embryoniske akser med mikroskopet akser, f.eks den laterale akse med x-aksen, dvs. dorsoventral akse med z-aksen. Ved brug af spindelvæv indehaveren teknik, måske tilpasning ikke mulig.
  6. I fluorescensen tilstanden definere z-stakken for hver retning. Tilføje 25-50 um som rumlig buffer foran og bagved embryoet. Herunder bufferen, den typiske z-stack dækker omkring 350-400 um for en Tribolium embryo. Også definere z-afstanden, som bør være fire gange den laterale afstand, dvs. afstanden langs x- og y-akserne 66.
  7. Hvis to eller flere fostre afbildes parallelt, genstart på 8,4 med den næste embryo.
  8. Til langvarig billeddannelse, sikres, at prøven kammeret er fyldt med tilstrækkeligt PBS pH 7,4 eller anden billeddannende puffer. dækker også prøvekammeret åbning.
  9. Start billeddannende proces. Ved længerevarende direkte billedvisning, overvåge den korrekte erhvervelse langs alle retninger i alle kanaler for alle embryoner. Lejlighedsvis tjek i løbet af de næste dage at embryonerne i live og i den korrekte position.

9. Embryo Retrieval og kvalitetskontrol

  1. Når billedbehandling er færdig, fjernes prøve holder med denembryonerne fra prøvekammeret. Kun embryoner fra live imaging-analyser er nødt til at blive hentet. Faste og farvede embryoner kan kasseres.
  2. Hvis et levende billeddannelse blev udført, overføre embryonet til et objekt slide. For agarosesøjle teknik, udtrække de embryoner fra det omgivende agarose med en skalpel, mikro-kniv eller barberblad. For agarose halvkugle teknik, overføre halvkugle med den flade side til objektet slide. Embryo fjernelse er ikke nødvendig. For spindelvæv indehaveren teknik, forsigtigt afmontere embryoner fra agarosen film med en pensel. Inkuber objektet dias i en lille glasskål i mættet fugtighed atmosfære under standardbetingelser indtil æggene klækkes.
  3. Efter udrugning, overføre larverne til individuelle brønde i en plade med 24 brønde, og der tilsættes 500 mg vækstmedium til hver brønd. Inkuber under standardbetingelser. Sammenligne den samlede udviklingstid og morfologi afbildet larver til ikke-afbildet WT og transgene Larvae (se diskussion). I analyser, der karakteriserer WT udvikling, bør ingen tydelige morfologiske afvigelser ideelt set være mærkbar.
  4. Når larverne udvikles til raske voksne, give dem passende WT partnere af samme baggrund stamme. Efter to uger, så tjek for afkom produktion. Overvej også at kontrollere frugtbarhed afkommet ved parring dem inter pares. Kun når det afbildede embryoner udvikler sig til frugtbare voksne, der producerer frugtbar afkom, kan den billeddannende fremgangsmåde betragtes som ikke-invasiv.

10. Image Data Processing

BEMÆRK: behandling billeddata, er open source billedbehandling software ImageJ 67 eller dets derivat FIJI 68 anbefales. Begge versioner samt omfattende dokumentation findes på www.imagej.net. Den standard filformat til LSFM data er den tiff (TIFF). Den iboende beholder indstilling kan storaseri af billedstakke såsom z-stakke eller tidsserier af z maksimale projektioner i en enkelt fil, der kan åbnes i ImageJ eller FIJI via træk-og-slip.

  1. Om nødvendigt dreje z-stakke at tilpasse den anteriore-posteriore akse af embryoet med y-aksen (Billede → Transform → Roter). Bemærk venligst, at rotation parametre skal indstilles individuelt for hver retning, men ikke for den tid bortfalder og fluorescenskanalerne.
  2. Beskære z-stakke langs x-, y- og z-akserne således at kun minimal baggrund (20 - 40 pixels langs x- og y-akserne, 5 - 10 planer langs z-aksen) forbliver (for x - og y-akserne, bruge Rectangular Selection Tool, derefter Billede → Crop, for z-aksen, bruge Image → Stacks → Funktioner → Slice Keeper). Bemærk venligst, at beskæring parametre skal indstilles individuelt for hver retning, men ikke for de tidspunkter og fluorescenskanalerne.
  3. Beregne z maksimale fremspring for hvert z-stak(Billede → Stacks → Z Project, vælg Max Intensitet). Intensitet projektion beregninger er data forenklingsprocedurer der fjerner en rumlig dimension.
  4. Ved længerevarende direkte billedvisning data, overveje at bruge en ImageJ eller FIJI script, der udfører behandlingen trin 10,1-10,3 for alle retninger, alle tidspunkter og alle fluorescens kanaler 65. Ideelt set sammenkæde alle z maksimale projektioner per kanal og retning og gemme dem som en tidsserie i en TIFF beholder. Alternativt kan BigDataViewer 69 plug-in til FIJI bruges til at navigere gennem Terabyte-store datasæt.
  5. Afhængigt af de transgene linjer og billeddannende modaliteter, kan justeringer af den tid stakke dynamiske intensitet være ønskelige på grund af foto-blegning og / eller fluorofor ekspressionssystemer udsving. Enten ImageJ- eller FIJI-iboende Bleach Korrektion funktion (Billede → Juster → Bleach Korrektion, vælg Histogram Matching) eller dediketed software 65 er foreslået.
  6. Hvis fosteret blev registreret, og / eller langs flere retninger og i multiple fluorescenskanaler, horisontal kombination af retningerne (Billede → Stacks → Funktioner → Kombiner) og kanal fletning (Billede → Color Merge → Kanaler) anbefales.
  7. Registrering og fusion af z-stakke erhvervet langs flere retninger 70, eventuelt i kombination med dekonvolution 71, giver mulighed for beregning af fineste tredimensionelle billeder af ensartet kvalitet og isotrop opløsning. Begge plug-ins er open source og formonteret FIJI, men de kræver tilstedeværelse af landmærker (fluorescerende mikrosfærer, fx perler) omkring prøven.
  8. Open source framework til storstilet kvantitativ dataudtræk og analyse er også tilgængelige, for eksempel til segmentering og sporing af cellekerner 72 eller cell form anerkendelse 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver en eksperimentel ramme for fluorescensafbildning af levende eller fikseret og farvet Tribolium embryoer med LSFM. På grund af de lave niveauer af foto-blegning og foto-toksicitet, en direkte konsekvens af dets optiske sektionering kapacitet, LSFM er særligt velegnet til langsigtede direkte billedvisning.

Den hidtil ukendte AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgen linje udtrykker et histone2B-mEmerald fusionsprotein under kontrol af alfa-tubulin 1 promoter 74. Det viser en enhancer trap-lignende ekspressionsmønster 51, eftersom fluorescenssignalet hovedsagelig opnås fra serosa, blommesækken og adskillige neuronale celleklynger. Under anvendelse af denne linie, blev 66 timers fosterudvikling ved stuetemperatur (23 ± 1 ° C) registreres, dækker germband tilbagetrækning og dorsale lukning (Supplerende Movie 1). Det herlinje kan anvendes til at visualisere neuronale klynger i hovedet vedhængene (figur 4A) og dynamik af serosa migration under dorsale lukning (figur 4B). Den hidtil ukendte AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linje bærer samme transgen som # 4 linje, men på et andet genomisk placering. Den viser ikke en indlysende enhancer trap mønster, men fluorescenssignalet er spatiotemporally ubikvitært påviselig som tidligere beskrevet for denne promotor 74. Denne linie blev afbildet ved overgangen fra gastrulation at germband forlængelse for at demonstrere den optiske sektionering kapacitet på to dybde niveauer (figur 4C). Et andet træk, især for billeddannelse, er erhvervelse af z-stakke langs flere retninger via prøve rotation, som er standard for LSFM opsætninger anvendes i udviklingsmæssige biologi. For eksempel i Glia-blå 58 linje, prøve rotation alleOWS observation af glia-celle reorganisering langs og omkring ventrale nerve ledningen samt spredning dynamik i venstre hoved lap, som kun kan ses ordentligt fra den dorsale side, i det samme embryo (figur 4D, Supplerende Movie 2). De levende billedbehandling datasæt forbundet med denne undersøgelse er givet som en download ressource, meta og få adgang til oplysninger findes i supplerende tabel 1.

Idet valget af transgene linjer for levende billeddannelse stadig er begrænset, kan små fluorescerende farvestoffer anvendes til specifikt at mærke intracellulære strukturer. SYTOX Green binder til cellekerner og kan visualiseres i den grønne kanal, mens YOYO-1 og BOBO-3 Iodide binde til kernekappen og kan visualiseres i det grønne eller røde kanal, henholdsvis (figur 5A). Disse farvestoffer kan bruges til at fremhæve bestemte embryonale structstaltninger, såsom serosa ar (figur 5B, første kolonne), de bageste ventrale serosa celler (figur 5B, anden kolonne) eller serosa-amnion-germband væv tri-lag, der opstår under serosa vindue lukket (figur 5B, tredje til femte kolonne). Tofarvet farvning muliggør visualisering af to intracellulære strukturer inden for samme embryo, f.eks kernekappen sammen med actincytoskelettet, som kan farves med Alexa Fluor-konjugerede phalloidin farvestoffer. For eksempel kan YOYO-1 Iodide kombineres med Phalloidin 546 (figur 5C), mens BOBO-3 kan kombineres med Phalloidin 488 (figur 5D).

Det er også praktisk at fastsætte og plette transgene embryoner, der allerede udtrykker et bestemt fluorescerende protein, idet fikseringsproceduren slukker den iboende fluorescence-signal kun marginalt. For eksempel kan embryoer fra AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 transgen linie, hvor kernerne detekteres i den grønne kanal, farves med Phalloidin 546, således at actincytoskelettet bliver synlig i den røde kanal (figur 6 ).

figur 1
Figur 1: Sammenligning af Konventionel Vidvinklet, Konfokal Laser Scanning og Light Sheet-baserede fluorescensmikroskopi. Konventionel Vidvinklet epi-fluorescensmikroskopi bruger xenon bue / kviksølv-damp lamper med passende filtre eller høj effekt lysdioder som lyskilder. For hver erhvervet todimensionalt billede, er hele prøven belyses med en ikke-diffraktionsbegrænset lyskeglen. I konfokal laser scanning fluorescensmikroskopi, et diffraktionsbegrænset Gauss laserstråle er scanned gennem emnet og fluorescens detekteres usammenhængende punkt for punkt. På lignende måde som konventionel Vidvinklet epi-fluorescensmikroskopi, er hele prøven belyses for hver erhvervet todimensionalt billede. I lyset ark-baserede fluorescensmikroskopi, et diffraktionsbegrænset Gauss laserstråle belyser prøven vinkelret på påvisning akse. Fluorescens detekteres enten plan-for-fly eller linje for linje. Under købet af et todimensionalt billede, kun en lille volumen centreret om brændplan påvisning målsætning oplever virkningerne af excitationslyset. Det resterende volumen af ​​prøven ikke lyser, ikke bidrager til ud-af-fokus sløre, lider ikke af foto-toksiske effekter og ikke mister fluoroforer grund af foto-blegning. Klik her for at se en større version af dette tal.

ep-together.within-side = "1"> figur 2
Figur 2: Princippet om Light Sheet-baserede fluorescensmikroskopi. I LSFM, er belysning og detektering opdeles i mindst to optiske veje. Mindst en belysning arm bruges til at generere lyspladen (cyan), mens mindst én detektion arm er udstyret med et passende filter og et kamera til den parallelle detektion af fluorescenssignalet (grøn). LSFM har to kanoniske implementeringer, den enkelte (eller selektiv) plan belysning mikroskop (blå baggrund) og den digitale scannede laserlys ark mikroskop (rød baggrund). Ved at flytte prøven og lys ark i forhold til hinanden, er tre-dimensionelle billeder erhvervet. Oplysninger sammen flere retninger opsamles ved at dreje modellen omkring y-aksen, som fortrinsvis er orienteret langs tyngdekraften.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Tre forskellige Montering teknikker, der anvendes i Optagelse af embryonale udvikling af Tribolium med lys Sheet-baserede fluorescensmikroskopi. (A) agarosesøjle henviser til en stålcylinder med en lille stift, der skubber den agarosesøjlen, hvori embryoet er indlejret, ud af en glaskapillar. Agarose halvkugle er monteret på et stålrør. Embryoet fastgjort til polen af ​​halvkugle med en lille mængde agarose. Indehaveren Spindelvævet er en metalplade med et opslidset hul monteret oven på stålcylinderen. Embryoet limet til en tynd agarose film, der spænder than slidsede hul. (B) Ordninger af de tre monteringsteknikker inde i en lys ark mikroskop. (C) De tre montering anvendte teknikker inden for en DSLM. (D) Eksempler billeder fra embryoner af Glia-blå transgen linje optaget med de tre monteringsteknikker. Embryonerne, der er ved begyndelsen af ​​germband tilbagetrækning er vist med deres bageste ende orienteret mod toppen for at matche transmission lyse billeder. FM, fluorescens-tilstand; ZA, z maksimal projektion med justering intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Levende Billeddannelse af Tribolium embryoer. (A </ Strong>) Et embryo af AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linje ved overgangen fra germband tilbagetrækning til dorsale lukning. Denne linje udviser en enhancer trap ekspressionsmønster. Fluorescenssignalet findes hovedsageligt i serosa, blommesækken og et par neuronale celleklynger. Fosteret vist over et tidsrum på 15 timer med et interval på 5 timer. De detaljerede billeder viser celleklynger i hovedet vedhæng. Indledningsvis er klyngerne stadig er omfattet af serøse celler (første spalte), ved serosa brud, cellerne følge med den drejende bevægelse af hovedet. (B) Samme embryo viser dorsale lukning for 1:30 timer med et interval på 0:30 timer. De detaljerede billeder viser migreringen af ​​den bristede serosa over blommesækken. (C) Øverste række: Et embryo af AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linje ved overgangen fra gastrulation at germband forlængelse. Midterste og nederste række: Enkelte fly er vist i to dybder over en periode på 10:30 timer med et interval på 1:30h. (D) Et embryo af Glia-blå linje under germband tilbagetrækning vist over et tidsrum på 50:30 timer med et interval 07:30 timer. De detaljerede billeder viser det morfogenetiske reorganisering af gliaceller i venstre hoved lap. ZA, z maksimal projektion med justering intensitet; PA enkelt plan med justering intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5: Fiksering, Farvning, og Iimaging af WT embryoer under Germband Forlængelse. (A) Embryoner farvet med enten SYTOX Green, dvs. en fuzzy nuklear plet, eller YOYO-1 iodid eller BOBO-3 iodid, dvs. to nuklear kappe pletter. (B) YOYO-1 Iodide-farvet Embryo. Detaljer viser serosa ar (første kolonne), kernekappen af ​​de store posterior-ventrale serosa celler (anden kolonne) eller tre lag væv organisering af serosa, amnion og den faktiske embryoniske væv (tredje til femte kolonne). (C) tofarvet farvning med YOYO-1 Iodide og Phalloidin 546. (D) tofarvet farvning med Phalloidin 488 og BOBO-3 Iodide. ZA, z maksimal projektion med justering intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 6
Figur 6: Billeder af fikseret og farvet Transgene Embryoer fra AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 linje. Dette transgen linje udtrykker mEmerald-labeled histone2B (H2B) under kontrol af alfa-tubulin 1-promotoren, som markerer kerner / kromatin ubikvitært i hele embryonisk udvikling. Embryonet blev yderligere farvet med Alexa Fluor 546 Phalloidin, hvilke etiketter actincytoskelettet / f-actin. ZA, z maksimal projektion med justering intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

kriterium fluorescensmikroskop typen
konventionel bredt konfokal laserscanning lys ark-baserede
objektiv opsætning en objektivlinse, medium-høj NA to vinkelret anbragte objektivlinser, belysning: lav NA, påvisning: høj NA
belysningslyskilden hvid lyskilde og egnede filtre (f.eks kviksølv kort buelamper)
eller LED-baseret med oprydning filtre 		laser med oprydning filter
(F.eks diode eller DPPS lasere) 		laser med oprydning filter
(F.eks diode eller DPPS lasere)
belysning pr todimensionalt billede hele prøve hele prøve
(Typisk todimensional Gaussisk stråle scanning) 		kun brændplan
(DSLM: endimensionalt gaussisk stråle scanning)
opdagelse parallel
(Typisk CCD eller sCMOS kamera) 		sekventiel
(Fotomultiplikatorrør) 		parallel
(Typisk CCD eller SCMOS kamera)
billeddannelseshastighed hurtige (millisekunder pr billede) langsom (sekunder pr billede) hurtige (millisekunder pr billede)
ud-af-fokus fluorescens nogen forskelsbehandling blokeret næsten fuldstændigt ved pinhole
(Afvisning effektivitet afhænger af diameter) 		næsten ikke-eksisterende
(Kun på grund af spredning)
rumlige dimensioner 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
yderligere frihedsgrader 2
(Tid, fluorescenskanal) 		2
(Tid, fluorescenskanal) 		3
(Tid, fluorescenskanal, retning)
lateral opløsning r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
optisk sektionering kapacitet Ingen Ja
(Diskrimination i detektionen pathway) 		Ja
(diskrimination i belysningen pathway 75)
tilgængelighed og pris overvejende kommercielle, lave omkostninger overvejende kommercielle, dyre kommerciel, dyre
specialbygget, moderat 54,59,60,75
levende imaging publikationer om Tribolium embryoner seks 44,76,77,78,79,80 syv 23,77,79,81,82,81
(spinning disk konfokal) 83,84,85 		fire 23,57,65,86

Tabel 1 - Karakteristik af fluorescerernce mikroskopiteknikker anvendes i Tribolium leve Imaging.

farvestof farvning fortynding
SYTOX Grøn kerner (fuzzy) 1: 10.000 (1: 100 i ddH2O og 1: 100 i 1% (vægt / volumen) BSA i PBS)
YOYO-1 Iodide nukleare kuvert 1: 10.000 (1: 100 i ddH2O og 1: 100 i 1% (vægt / volumen) BSA i PBS)
BOBO-3 Iodide nukleare kuvert 1: 10.000 (1: 100 i ddH2O og 1: 100 i 1% (vægt / volumen) BSA i PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin actincytoskelettet 1: 100 (i 1% (vægt / volumen) BSA i PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin actincytoskelettet

Tabel 2 - Farvning Solutions.

agarosesøjle
(valgmulighed 1) 		halvkugle
(mulighed 2) 		spindelvæv indehaver
(valgmulighed 3)
rationale embryo er indlejret i en agarosesøjle, der er skubbet ud af et kapillarrør bageste ende af embryo er limet til pol af en agarose halvkugle embryo er limet til tynd agarose film spænder over et opslidset hul
prøveholder stålcylinder med pin stålrør stålcylinder med
langhul
ubegrænset (enhver) ubegrænset (enhver) fire (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
kvalifikationsniveauet moderat høj lav
agarose omkring embryonet høj lav moderat
antal embryoner per session op til tre en op til seks
embryo hentning tricky let let
engangsudstyr glas kapillærer - -
anbefales til kortsigtede levende billedbehandling, farves embryoner langsigtet direkte billedvisning langsigtede levende billedbehandling, farves embryoner
<strong> referencer tre 23,87,88 to 57,65 denne publikation

Tabel 3 - Montering Metoder Fordele og ulemper.

aberrational fænotype induktion rationale trin reference (metodisk)
embryonisk RNA-interferens dobbeltstrenget RNA injiceres i embryoner under syncytiale blastodermstadiet at knock-down en eller flere specifikke gener injicere embryoner efter trin 4.8. to 33,81
parental RNA-interferens dobbeltstrenget RNA injiceres sideværts ind female pupper mellem de abdominale segmenter 3 og 4, hvilket fører til gen knock-down i afkommet tage pupperne fra trin 1.5. to 36,37
recessive embryonale letale mutante linjer æggelæggende kulturer, der bærer en recessiv embryonisk letal mutation heterozygot udbytte ca. 25% homozygot mutant afkom krydse mutant linje i tænkte linje under trin 1.5. tre 39,51,89
anvendelse af ydre faktorer visse bioaktive eller toksiske faktorer extrinsically påføres embryonerne ved at føje dem til det billeddannende puffer tilføj faktor til billeddannelse buffer under trin 2.2. to 83,85

Tabel 4 - LSFM Levende Imaging af Aberrational Fænotyper

Supplerende Tabel 1 - Metadata og parameter for Langsigtet live-imaging datasæt DS0001-0003. Klik her for at downloade filen.

Supplerende Movie 1 - Levende Imaging af en Tribolium Embryo fra AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgene Line.
Denne linje udviser en enhancer trap ekspressionsmønster. Fluorescenssignalet findes primært i serosa, blommesækken og en undergruppe af nerveceller. Fosteret vist langs fire orienteringer 00.00 h til 66:00 h med et interval på cirka 00:30 timer mellem tidspunkterne. Filmen starter i begyndelsen af ​​germband tilbagetrækning og slutter, når dorsale lukning er afsluttet. Billedhastigheden er fem billeder per sekund. ZA,z maksimale fremspring med justering intensitet. Klik her for at downloade filen.

Supplerende Movie 2 - Levende Imaging af en Tribolium Embryo fra Glia-blå Transgene Line.
Fosteret vist langs fire orienteringer 00.00 h til 66:00 h med et interval på cirka 00:30 timer mellem tidspunkterne. Filmen starter i begyndelsen af ​​germband tilbagetrækning og slutter, når dorsale lukning er afsluttet. Billedhastigheden er fem billeder per sekund. ZA, z maksimal projektion med justering intensitet. Klik her for at downloade filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitetskontrol

I levende imaging assays, skal proceduren forberedelse og optagelse være ikke-invasiv, dvs. hverken den mekaniske og kemiske håndtering (indsamling, dechorionation, montering på prøveholderen) eller integrerede energi belastning under observationen bør påvirke levedygtigheden af prøven. For undersøgelser, der karakteriserer WT udvikling, anbefales det kun at bruge data fra forsøg, hvor fosteret overlever optagelsen, hentes med succes og udvikler sig til en sund voksen. Den voksne skal ikke vise nogen morfologiske afvigelser, bør være frugtbar og dens afkom bør også være frugtbar. Der er tre væsentlige grunde til lave overlevelsesrater, især i de lange live-imaging-analyser:

Først blev embryo overflade dækket grundigt med agarose under trin 7, som sandsynligvis hindrer ion og gasudveksling og bremsende embryonet mechanmatisk. Berørte embryoner, især når afbildet under tidlig embryogenese, udvikler typisk diskret i flere timer, arrestere pludseligt og mister deres fluorescenssignal hurtigt. Med nogle erfaringer, kan overfladen fraktion, som er indlejret i agarose ved hjælp af halvkugle teknik holdes under en tredjedel, mens med spindelvæv indehaveren teknik, højst halvdelen af ​​overfladen er dækket af et meget tyndt agarose lag. For det andet, den integrerede energi belastning påføres embryoet overstiger tolerancen. Værdierne i trin 8.2 tjene som en tommelfingerregel, men følgende kriterier bør overvejes: (i) embryoner i den tidlige fosterudvikling ikke udholde laser bestråling samt embryoner i slutningen af ​​fosterudvikling, (ii), selv om den integrerede energi belastning kan være identiske, højere lasereffekt med enten lavere eksponeringstid eller længere tidsintervaller synes at være mere belastende end lavere lasereffekt med en høj eksponeringstid eller kortere tidsintervaller, (Iii) højere bølgelængder er typisk bedre tolereret og (iv) for transgene linier, vises tolerance at være line-specifik, hvorimod fluorofor udtryk styrke synes at være omvendt proportional med laserbestråling tolerance. Derudover er udformningen af ​​fusionsproteinet og / eller den intracellulære lokalisering spiller også en rolle. For det tredje er embryoet beskadiget under monteringsprocessen. Det mest afgørende faktor her er, at inkubationstiden i natriumhypochloritopløsning er så kort som nødvendigt at fjerne chorion. Længere inkubationstider kan skade fostrene. Man skal også tages til ikke punkteres eller klemme embryoer med børsten og holde montering agarose ved en omgivende temperatur. Beskadigede embryoner kan identificeres under Trin 8.4 før den egentlige billedbehandling processen begynder, så beskadigede embryoner kan erstattes med levedygtige virksomheder.

Ved at følge disse retningslinjer, typisk omkring 85-90% af EmbryOS overlever direkte billedvisning procedure og luge. Omkring 90% af de skraverede embryoner udvikler sig til sunde og frugtbare voksne. Overlevelsesforholdet synes at være uafhængig af billeddannelse temperatur og montering teknikker (når agarosesøjle anvendes til billeddannende perioder på mere end en halv dag), men lidt falder med forhøjede niveauer af laser bestråling. Som en yderligere kontrol, især i den indledende karakterisering af skræddersyede transgene linjer for fluorescens direkte billedvisning eller rammen oprettelse fase som precursor for en omfattende eksperimentel sekvens, anbefales det at køre ikke-afbildet WT og transgene embryoner parallelt med det afbildede embryoner, der inkuberes ved den samme temperatur som det afbildede embryo, og sammenlign deres udviklingstid og morfologi 65.

Endvidere bør undersøgelser, der karakteriserer aberrational fænotyper (tabel 4) via levende billedbehandling også køre en ikke-påvirket control embryo parallelt. Det anbefales at holde behandlingen af ​​begge fostre så ens som muligt, men det skal overvejes individuelt for hver eksperimentel strategi:

Knock-down via RNA-interferens.

For embryonisk RNA-interferens 33, 81, bør embryoner, der stammer fra den samme æglægning kultur enten injiceres med funktionel eller kontrollere dobbeltstrenget RNA. De forskelligt injicerede embryoner bør derefter afbildes samtidigt i samme LSFM ved hjælp af enten agarosesøjlen eller spindelvæv indehaveren teknik. Til parental RNA-interferens 36, 37, bør den billeddannende kultur opdeles i to subkulturer. Kvinde pupper af en subkultur bør injiceres med den funktionelle dobbeltstrenget RNA, mens den anden subkultur bør injiceres med kontrol dobbeltstrenget RNA. Embryo collfdeling bør udføres parallelt, og både den eksperimentelle og kontrol embryo kan afbildes samtidigt i samme mikroskop ved hjælp af agarose-kolonne eller spindelvæv holder teknik.

Recessive embryonale letale mutante linjer.

Når man arbejder med recessive embryonale letale mutanter 39, 89, 91, 92, 93, en æglæggende kultur af heterozygote mutanter, som normalt fænotypisk inconspicuous, udbytter teoretisk 25% homozygot mutant afkom (men nogle gange mindre på grund af praktiske håndtering udsteder 89) og 75% af fænotypisk inconspicuous afkom (50% heterozygote mutanter og 25% WTS). Det anbefales at bruge spindelvæv indehaveren teknik til at montere flere embryoner fra sådan et æg-æglæggende kultur. De homozygote mutanter kan være identified hele løbet af billeddannelse ved manifestationen af ​​fænotypen, mens de normalt udvikle embryoner tjener som kontroller. Genotypen af ​​de afbildede prøver kan bestemmes én gang billeddannelse og kvalitetskontrol er afsluttet.

Anvendelse af ydre faktorer.

Hvis indflydelse af ydre faktorer inden for imaging buffer 83, 85, f.eks bioaktive eller giftige stoffer, på udvikling undersøges, parallel billeddannelse sammen med en kontrol embryo i samme LSFM er typisk ikke mulig. , Billeddannelse skal derfor udføres sekventielt. Optimalt tiden mellem efterfølgende eksperimenter minimeres, og embryonerne stammer fra samme imaging kultur. Alternativt kan to identisk opbyggede og drives LSFMs kan anvendes. I dette tilfælde bør embryoner fra samme æglægning periode blive brugt, men det er af stor betydning, at the kalibrering af både mikroskop udføres omhyggeligt, så de billeddannende egenskaber er sammenlignelige. Ved anvendelse af spindelvæv indehaveren teknik kan flere embryoer til hver betingelse afbildes på en gang. Med agarosesøjle teknik, kan de ydre faktorer hindres fra at nå embryoer.

Nuværende begrænsninger i LSFM direkte billedvisning tilgang

LSFM er et kraftfuldt værktøj til at analysere embryonale morfogenese ikke-invasivt i flere brede-skaleret dimensioner. Standardprocedurer, som foreslået i denne protokol, vil støtte processen for at etablere lys blad teknologi som et standardværktøj i udviklingsmæssige biologi. Imidlertid er den tilgang, begrænset af en række faktorer på forskellige eksperimentelle og organisatoriske niveauer:

Oprindeligt var LSFM udviklet til at analysere én prøve ad gangen. Alt strøm nærmer sig billedet af to eller flere fostre samtidigt i den samme mikroskop b y 'stabling' prøven langs y-aksen i agarosesøjlen eller spindelvæv indehaveren dette spørgsmål taget kun til en vis grad. Multi-godt plade- og dækglas-baserede opsætninger er tilgængelige 94, 95, 96. Men de lider reduceret billedkvalitet og ofre nogle af de væsentlige fordele ved LSFM, såsom billedbehandling langs flere retninger. I øjeblikket er den bedste løsning er at arbejde med flere mikroskoper parallelt, som bliver rimeligt muligt, når dyre komponenter, såsom laser, deles 60.

Med EFA-nGFP 57, 65, 84, FNL 86 har Hjernemæssig 58, 86, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 og Glia-blå= "xref"> 58, kun seks skræddersyede transgene linier, der er egnede til langvarig direkte billedvisning findes i øjeblikket. Desuden HC079 (amnion), G12424 (serosa) og G04609 (hjerte) enhancer trap linier 51 er blevet karakteriseret med LSFM 23. Alternativt kan fluorescerende embryoer også genereres ved mRNA 81 eller farvestof injektion 79, disse tilgange er relativt ligetil, men også lider af begrænsninger 86. Adskillige flere standarder er stadig behov såsom cytoskeletal-, organelle- og membran-mærkede linjer eller linjer som udtrykker fluoroforer under visse ikke-allestedsnærværende promotorer til at observere kun visse organer eller væv. Ideelt set disse linjer er også tilgængelige med forskellige fluorescerende proteiner.

En anden udfordring er den datamængde genereret af LSFM. På grund af erhvervelse af oplysninger i tre rumlige dimensioner og mindst tre further frihedsgrader (tid, retning, fluorescens-kanal), kan størrelsen af ​​levende imaging datasæt nemt nå mange Gigabytes til et par terabyte. Selv efter tredimensionale beskæring og ZIP-baseret kompression i TIFF beholdere, de tre eksemplariske datasæt forbundet med denne undersøgelse har størrelser på 31,6, 12,6 og 45,1 gigabytes, dvs. 89.3 Gigabyte i alt. Når man arbejder med LSFM, er det nødvendigt at have den respektive infrastruktur til lagring og behandling 88, 97 data.

Den højeste billedkvalitet opnås ved overfladen af ​​embryonet, men med stigende dybde, bliver fluorescenssignalet mere og mere sløret. For eksempel bliver den bageste ende af germband omfattet af blommesækken gange under gastrulation og kan ikke ordentligt løst (figur 4C, første til femte kolonne). Imaging sammen flere retninger løser dette problem i det mindste en delially - høj kvalitet oplysninger fra overfladen hele vejen rundt om fosteret er tilgængelig, men de indre regioner forbliver fuzzy. I øjeblikket ingen tilfredsstillende løsninger er tilgængelige, men i det lange løb, infrarød fluorescerende proteiner 98, genetiske tilgange 99 eller mikroskop opsætninger med adaptiv optik 100 kunne overvejes.

Tilpasning til andre arter

Ved nu, har LSFM blevet brugt til at dokumentere fosterudvikling af tre insektarter, dvs. bananfluen Drosophila melanogaster 61, 62, 101, den scuttle flyve Megaselia abdita 102 og den røde mel bille Tribolium castaneum 57. Den eksperimentelle rammer, standardprocedurer og montage teknikker beskrevet her should være let at tilpasse til andre insektarter. Kimlinietransformation protokoller for mange insekter, der hører til forskellige ordener er tilgængelige 103, herunder arter af økonomisk og / eller medicinsk betydning, såsom honeybee 104, flere lepidopteraner 105, 106 eller flere myg arter 107, 108, 109. Med respektive transgene linier egnede til fluorescens billeddannelse, kan den embryoniske morfogenese af insekter karakteriseres, mens overvejer deres evolutionære slægter og / eller økologiske nicher. Omkring en million insektarter er blevet beskrevet og yderligere tyve millioner insekter arter sandsynligvis findes 110, der dækker mere end 400 millioner års evolution 2. Kun den komparative tilgang vil generere information, som til gengæld bestemdes indsigter, som ikke kan opnås ved at studere de udviklingsmæssige principper for kun en enkelt art.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

forfatter Bidrag

FS og EHKS udtænkt forskningen. FS genereret de transgene AGOC linjer. Lyspladen-baserede fluorescensimagografi blev udført ved FS og SK. FS og EHKS skrev manuskriptet med input fra SK.

Acknowledgments

Vi takker Sven Plath til teknisk support. Den Glia-blå transgene linje var en slags gave fra Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen blev støttet af Cluster of Excellence Frankfurt am Main til Makromolekylær Komplekser (CEF-MC, EXC 115, højttaler Volker Dötsch) givet delvist til EHKS på Buchmann Institut for Molekylær Life Sciences (BMLS, direktør Enrico Schleiff) på Goethe Universität Frankfurt am Main ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Developmental Biology leddyr insekt Coleoptera, Morfogenese embryogenese ikke-invasiv langsigtet fluorescens billeddannelse lys ark-baserede fluorescens mikroskopi tre-dimensionelle lysmikroskopi LSFM DSLM SPIM
Lys Sheet-baserede Fluorescence Microscopy af Leve- eller fikseres og farves<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter