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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Abstract

Le coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum est devenu un important organisme modèle d'insectes en génétique du développement et de la biologie évolutive du développement. L'observation des embryons Tribolium par microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière présente de multiples avantages par rapport à grand champ classique et la microscopie par fluorescence confocale. En raison des propriétés uniques d'un microscope à base de feuille de lumière, images en trois dimensions de spécimens vivants peuvent être enregistrés avec des taux élevés de signal sur bruit et considérablement réduit photo-blanchiment, ainsi que la photo-toxicité ainsi que de multiples directions sur des périodes qui durent plusieurs journées. Avec plus de quatre années de développement méthodologique et une augmentation continue des données, le temps semble approprié d'établir des procédures normalisées d'exploitation pour l'utilisation de la technologie de feuille de lumière dans la communauté Tribolium, ainsi que dans la communauté des insectes en général. Ce protocole décrit trois techniques de fixation appropriées fou des buts différents, présente deux nouveaux faits sur mesure lignes Tribolium transgéniques approprié pour l' imagerie en temps réel à long terme, suggère cinq colorants fluorescents pour étiqueter les structures intracellulaires d'embryons fixe et fournit des informations sur le post-traitement de données pour l'évaluation en temps opportun des données enregistrées. Les résultats représentatifs se concentrent sur l'imagerie en temps réel à long terme, le sectionnement optique et l'observation de l'embryon même le long de multiples directions. Les ensembles de données respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. Enfin, le protocole discute des contrôles de qualité pour les tests d'imagerie en direct, les limites actuelles et l'applicabilité des procédures décrites à d'autres espèces d'insectes.

Ce protocole est principalement destiné aux biologistes du développement qui cherchent des solutions d'imagerie qui surclassent matériel de laboratoire standard. Elle favorise la tentative continue de combler l'écart entre les laboratoires de type technique / communautés, qui se développent et affinent micro-ordinateurscopier méthodologiquement, et les laboratoires de sciences de la vie / communautés, qui exigent des solutions « plug-and-play » aux défis techniques. En outre, il soutient une approche axiomatique qui déplace les questions biologiques dans le centre d'attention.

Introduction

Le tribolium rouge Tribolium castaneum, qui appartient à la grande famille des ténébrions (Tenebrionidae), a une longue histoire dans les sciences agricoles et de la vie et est le deuxième meilleur étudié organisme modèle d'insecte modèle après la mouche Drosophila melanogaster. Au cours des quatre dernières décennies, il est devenu un organisme modèle d'insecte puissant et populaire en génétique du développement, en biologie du développement et de l'évolution, au cours des vingt dernières années, dans la morphogenèse embryonnaire pour diverses raisons:

Drosophile et Tribolium appartiennent tous deux à la Holometabola, mais il y a divergé environ 300 millions d' années 1, 2, 3, 4. Alors que le développement embryonnaire de la drosophile est généralement considérée comme hautement dérivée, Tribolium montre un mode plus ancestral develpement qui se trouve dans une proportion beaucoup plus importante d'espèces d' insectes 5, 6, 7, 8, 9. Tout d' abord, Tribolium présente le développement de tête non involution, à savoir ses pièces buccales et des antennes apparaissent déjà pendant l' embryogenèse 10, 11, 12, 13, 14, 15. En second lieu , Tribolium suit les principes de développement à court germe, à savoir les segments abdominaux sont ajoutés séquentiellement à partir d' une zone de croissance postérieure au cours de l' élongation de germband 16, 17, 18, 19. Troisièmement, Tribolium se développe et plus tard se dégradedeux membranes extra-embryonnaires à savoir l'amnios, qui couvre seulement l'embryon ventralement et la séreuse, qui enveloppe complètement l'embryon 20, 21, 22. Les deux membranes jouent un morphogénétique essentiel 23 ainsi que le rôle de protection contre les micro - organismes 24, 25 et 26 dessication. En quatrième lieu , les jambes en développement sont pleinement fonctionnelles embryonnairement au cours de la phase de la vie larvaire et servent de primordia pour les jambes des adultes pendant la métamorphose des chrysalides 27, 28, 29, 30, 31.

En raison de leur petite taille et modestes exigences, la culture de Tribolium dans le laboratoire est assez simple. Les cultures de type sauvage (WT) des souches ou des lignées transgéniques se composent typiquement d'environ 100 à 300 adultes et peut être maintenue dans des bouteilles en verre d' un litre (empreinte 80 cm 2) remplie de trois à quatre centimètres (environ 50 g) avec un milieu de croissance qui se compose de blé pleine fleur la farine complétée par la levure sèche inactive. Un approvisionnement en eau n'est pas nécessaire. Cela permet même de petits laboratoires de garder des dizaines de cultures de coléoptère dans les petites ou moyennes pépinières d'insectes disponibles dans le commerce. Stades de développement ultérieurs de Tribolium (larves après environ le quatrième stade, les nymphes et les adultes) sont facilement séparées du milieu de croissance par tamisage. embryons synchronisés sont obtenus en incubant les adultes pour une courte période sur un milieu de ponte. Pour un développement rapide, les cultures de dendroctones sont maintenus à 32 ° C (environ quatre semaines par génération), tout en maintenant des actions est généralement réalisée à 22-25 ° C (environ dix semaines par génération).

Dans la dernière décennie, de nombreux tec standardsLes techniques ont été progressivement adaptées et optimisées pour Tribolium , résumées dans les livres des Organismes Emergents 32 . Les méthodes génétiques avancées, telles que les cellules embryonnaires 33 , les larves 34 , 35 ou les générations parentales 36 , 37 , les anomalies à l'ARN, la transformation de la ligne germinale avec le système PiggyBac 38 , 39 ou Minos 40 transposase et le génome CRISPR / Cas9 Ingénierie 41 . En outre, le génome de Tribolium a été séquencé il y a environ une décennie 42 , et est maintenant dans la troisième version de l' assemblage du génome 43 , qui permet une identification efficace et génomique et une analyse systématique des gènes 44 45, 46. De plus, les génomes de quatre autres espèces de Coléoptères sont disponibles pour les approches génétiques comparatives 47, 48, 49, 50. En association avec le génome séquencé, deux analyses génétiques à grande échelle ont été réalisées, à savoir un écran de mutagenèse insertionnelle 51 et un écran knockdown de gène à base d' interférence d'ARN systématique 52, 53.

Imagerie en temps réel de la fluorescence avec grand champ, ou la microscopie confocale à base de feuille de lumière (LSFM) permet d'observer la morphologie embryonnaire de Tribolium en fonction du temps ( par exemple la morphogenèse) dans un contexte multi-dimensionnelle (Tableau 1). En microscopie Widefield et fluorescence confocale, la EXCITation et de la lumière d'émission est guidé par la même lentille d'objectif. Dans les deux approches, l'échantillon entier est éclairé pour chaque enregistrement plan en deux dimensions. Par conséquent, les échantillons sont soumis à des niveaux d'énergie très élevés. Dans LSFM, seuls les fluorophores dans le plan focal sont excités en raison d'un découplage de l' éclairage et la détection à l'aide de deux lentilles d' objectif disposées perpendiculairement (figure 1). LSFM est disponible en deux implémentations canoniques - le microscope d'éclairage seul plan (SPIM) et le microscope de fluorescence à base de feuille de lumière laser balayé numérique (DSLM, Figure 2) - et offre plusieurs avantages essentiels par rapport aux approches traditionnelles: (i) la capacité de sectionnement optique intrinsèque, (ii) une bonne résolution axiale, (iii) a fortement réduit le niveau de photo-blanchiment, (iv) une très faible photo-toxicité, (v) rapport signal-bruit, (vi) la vitesse d'acquisition relativement élevée, (vii) imagerie le long de multiples directions et (viii) la pénétration des tissus plus profonds en raison de l'utilisation de lentilles d' objectif d'illumination faible ouverture numérique 54, 55, 56.

LSFM a déjà été appliquée avec succès dans Tribolium pour documenter presque toute la morphogenèse embryonnaire 57 et d'analyser les principes de la rupture de la membrane extra-embryonnaire au début de la fermeture dorsale 23. Pour augmenter l'attractivité de LSFM dans la communauté Tribolium et pour la science des insectes en général, il est d' une grande importance d'établir des procédures normalisées d'exploitation et d'améliorer les méthodes, les protocoles et le bassin de ressources à un niveau où le microscope devient une facilité de -utiliser outil standard dans les laboratoires de biologie du développement, et les questions biologiques restent au centre de l'attention.

Ce protocole commence par les bases de Tribolium </ em> la culture, à savoir l' entretien, la reproduction et la collecte d'embryons. Ensuite, deux stratégies expérimentales sont illustrées: (i) de formation d'image en direct de lignées transgéniques sur mesure et (ii) l' imagerie d'embryons fixes qui ont été colorées avec des colorants fluorescents (tableau 2). Par la suite, trois techniques de montage avec des fins légèrement différentes sont expliqués en détail (figure 3 et tableau 3): (i) la colonne d' agarose, (ii) l'hémisphère agarose et (iii) le nouveau support de toile d' araignée. Le protocole explique ensuite la procédure d'acquisition de données avec LSFM. modalités d'imagerie et considérations clés sont décrites. Enfin, la recherche sur l'embryon est expliqué et suggestions pour le traitement des données de base sont fournis. Dans les résultats représentatifs, les données d'imagerie en direct de deux nouveaux faits sur mesure et les lignées transgéniques Glie bleu 58 sont représentés et les ensembles de données d'imagerie respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. De plus, l'imagedonnées d'embryons fixes qui ont été colorés avec une variété de colorants de fluorescence sont présentés. La discussion porte sur le contrôle de la qualité, les limites actuelles de l'approche d'imagerie en direct et l'adaptation du protocole à d'autres espèces.

Le protocole est écrit pour microscopes à fluorescence à base de feuilles de lumière qui sont équipés d'une chambre d'échantillon et un mécanisme de serrage pouvant tourner pour les détenteurs normalisés d'échantillons 54, 59, 60, qui sont typiquement des éléments en forme de cylindre en métal, en plastique ou en verre ayant un diamètre dans l'ordre du millimètre. Le protocole est également approprié pour les deux implémentations canoniques, soit SPIM et DSLM, ainsi que pour une configuration avec deux ou plusieurs bras d'illumination et de détection 61, 62, 63. Les résultats représentatifs montrent les données dans deux canaux spectraux, vert (illumination avec un laser de 488 nm, la détection à travers un filtre passe-bande 525/50) et rouge (illumination avec un laser 561 nm, détection à travers un filtre passe-bande 607/70), mais le protocole peut être étendu à trois ou quatre canaux spectraux.

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Protocol

1. Élevage des cultures Tribolium

REMARQUE: Les conditions standard sont définies comme une température d'incubation de 25 ° C et 70% d'humidité relative dans un 12 h / 12 h lumineux de cycle sombre. Pour plus d' informations sur l' élevage Tribolium, les lignes directrices respectives sont disponibles 64. Ce protocole nécessite deux supports à base de farine différentes, qui peuvent être préparées en quantités de kilogramme et stockées pendant plusieurs mois.

  1. Avant de travailler avec de la farine et la levure sèche inactive, stocker les paquets non ouverts à -20 ° C pendant 24 h, puis laissez-les réchauffer à la température ambiante. Cette procédure élimine les agents pathogènes potentiels.
  2. Passer la farine complète de blé de grain et inactive levure sèche à travers un tamis avec une taille de maille de 710 pm, puis préparer un milieu de croissance en complétant la farine de grain entière tamisée avec 5% (p / p) de levure sèche inactive tamisée.
  3. Passer 405 farine de blé et la levure sèche inactive à travers un tamis de 250 & #181; m taille de maille, puis préparer le milieu de ponte en complétant la tamisé 405 farine de blé avec 5% (p / p) de levure sèche inactive tamisée.
  4. Passez la culture Tribolium respective par un tamis avec 800 pm de taille de maille. Jeter le milieu de croissance restant. Transfert des larves, pupes et adultes dans un grand plat en verre.
  5. Si aucune culture de la descendance existe, transférer environ 80 larves et / ou pupes à une nouvelle bouteille en verre pour établir une nouvelle culture de la descendance. Si aucune larves et / ou chrysalides sont présents, prendre environ 40 adultes à la place. Ajouter 50 g de milieu de croissance et laisser incuber dans des conditions normales.
  6. Recueillir environ 300 adultes (500-700 mg) dans un nouveau flacon de verre pour établir la culture de formation d'image. Ajouter 50 g de milieu de croissance et laisser incuber dans des conditions normales. Permettre à la culture de formation d'image à régler pendant au moins 24 h dans le milieu de croissance frais avant le prélèvement de l'embryon.
  7. Remplacez le milieu de croissance de la culture d'imagerie au moins tous les deux nousEKS, qui peut être fait conjointement avec la collecte d'embryons (voir 3.2). Après deux à trois mois, remplacer la culture d'imagerie complètement par les nouveaux adultes de la culture de la descendance.
  8. Si une lignée transgénique non homozygote est utilisé, souvent les cultures curate de descendance en supprimant les animaux non transgéniques. Idéalement, générer des lignes homozygotes si le transgène respectif n'est pas mortelle ou provoque la stérilité quand elle est présente sur les deux chromosomes. cultures homozygotes ont généralement un niveau de fluorescence moyenne plus élevée et les conditions expérimentales globales sont plus étroites, car un seul génotype est présent.

2. Configuration de microscope et d'étalonnage

NOTE: L'embryon Tribolium a une longueur antérieure-postérieure de l' ordre de 600 à 660 um et un diamètre transversal d'environ 300-330 um. La plupart des caméras CCD modernes ont une taille de puce de capteur d'environ 9 mm x 7 mm, soit un diamètre de 11,4 um, et d' une distance de pixels de pixels de 6,45 um.Lorsqu'il est combiné avec une lentille d' objectif de grossissement 10X, l'embryon peut être imagé in toto avec un pas de pixel de 0,645 um. La plupart des appareils de sCMOS modernes ont une taille de puce de capteur plus grand d'environ 16 mm x 14 mm, soit un diamètre de 21,3 um, et d' une distance de pixels de pixels de 6,5 um. Lorsqu'il est combiné avec une lentille d' objectif de grossissement 20X, l'embryon peut être imagé in toto avec un pas de pixel de 0,325 um.

  1. Fixer les lentilles d'éclairage et objectifs de détection au microscope. Assurez-vous que les lasers et les filtres de fluorescence correspondent à l'absorption des fluorophores et des spectres d'émission très bien.
  2. Attacher la chambre d'échantillon au microscope. Remplir la chambre d'échantillon avec du PBS pH 7,4 ou tout autre tampon d'imagerie approprié.
  3. Allumer et calibrer le microscope. routines d'étalonnage complète et les directives de dépannage pour microscopes à base de feuilles de lumière sur mesure (plus particulièrement pour la mise en œuvre de DSLM) ont été publiés pr65 ans . Pour les appareils commerciaux, suivez attentivement les instructions du fabricant. Une mauvaise manipulation pourrait épuiser l'échantillon de la chambre du milieu et provoquer des ravages sur l'instrument ainsi que sur l'échantillon.

3. Collection d'embryons transgéniques ou WT

  1. Passez la colonie d'imagerie à travers un tamis avec une maille de 800 μm. Recueillir des coléoptères adultes dans une nouvelle bouteille en verre et ajouter 10 g de milieu de ponte. Incuber la culture de ponte d'oeufs pendant 1 h à 25 ° C et 70% d'humidité relative dans la lumière.
  2. Passez la culture d'oeufs à travers un tamis avec un maillage de 800 μm pour séparer les adultes du milieu de ponte, qui contient environ 30 à 100 embryons. Transférer les adultes dans une nouvelle bouteille en verre et ajouter soit l'ancien soit 50 g de milieu de croissance frais.
  3. Si l'observation commence à l'étape blastoderme uniforme (exemple de base de données DS0002), incuber le milieu de ponte pour 15 h à 25 ° C et 70% d'humidité relative. To commencer au début de la rétraction germband (par exemple des jeux de données de DS0001 et DS0003), incuber les embryons pendant 23 h à 32 ° C et 70% d'humidité relative. Si d' autres stades de développement sont souhaitées, se référer à la littérature respective 64, 65 et d' adapter le temps d'incubation et / ou la température selon les besoins.

4. Embryon dechorionation

NOTE: Le chorion est la couche externe de la coquille et est composée de protéines et de polysaccharides. Il est fortement absorbant la lumière, mais pas indispensable pour le bon développement et peut donc être éliminée chimiquement.

  1. Passer le moyen de ponte à travers un tamis d'ouverture de maille de 300 pm. Recueillir les embryons dans un tamis cellulaire avec une taille de maille de 100 um et jeter le moyen de ponte restant.
  2. Préparer une plaque à 6 puits de la manière suivante: remplir le A1, A2, A3 et B3 puits avec du PBS pH 7,4 10 ml et les puits B1 et B2 avec 9 ml de PBS. Ensuite, ajoutez soigneusement1 ml d'hypochlorite de sodium à B1 et B2. Observez les progrès des étapes 4.3 à 4.8 au microscope stéréo. ATTENTION hypochlorite de sodium est corrosif.
  3. Insérez le filtre cellulaire dans l'A1 et (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant une minute sous agitation douce. De plus grandes particules de farine devraient détacher des embryons.
  4. Transférer le tamis cellulaire au puits B1 (hypochlorite de sodium dans du PBS pH 7,4) et agiter vigoureusement la plaque pendant 30 s. Les particules de farine restantes devraient se détacher complètement des embryons.
  5. Transférer le tamis cellulaire à A2 puits (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant 1 min sous agitation douce.
  6. Pour dechorionation, transférer le tamis cellulaire au puits B2 (hypochlorite de sodium dans du PBS pH 7,4). Agiter la plaque vigoureusement jusqu'à ce que les ruptures de chorion et se détache des embryons. Le chorion ressemble à une fine membrane semi-transparente avec des bords lacérés, tandis que les embryons dechorionated ont une silhouette simple.
  7. transfert epassoire e cellulaire au A3 puits (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant 1 min sous agitation douce. Si des fragments de chorion sont encore attachés aux embryons après le lavage, répétez l'étape 4.6.
  8. Conserver les embryons dans le puits B3 (pH 7,4 PBS). Stockage pendant plusieurs heures ne nuit pas aux embryons, mais gardez à l'esprit que le développement se poursuit.
  9. Pour les lignées transgéniques non homozygotes, éliminer les embryons non fluorescents si possible. Pour la fixation et la coloration des embryons transgéniques ou WT, passez à l'étape 5. Pour l'imagerie en direct d'embryons transgéniques, passez à l'étape 6.

5. Vitelline perméabilisation de la membrane, la fixation et Staining

NOTE: La membrane vitelline est la couche interne de la coquille d'oeuf. Il est imperméable à des colorants fluorescents et doit donc être chimiquement perméabilisées avant la coloration.

  1. Remplir un flacon de scintillation avec fixation / solution de perméabilisation (1,5 ml de 4% (p / v) de paraformaldehyde dans du PBS pH 6,9 unend n-heptane 1,5 ml). Transfert des embryons avec un pinceau aux flacons. des flacons de couvrir de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et incuber pendant 30 minutes sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. ATTENTION paraformaldehyde est toxique et corrosif, le n-heptane est inflammable et toxique.
  2. Éliminer la solution de fixation et de traiter les embryons trois fois pendant 15 minutes dans 3 ml de 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans du PBS pH 7,4, puis une fois pendant 15 minutes dans 3 ml de 1% (v / v) de Triton X-100 dans PBS pH 7,4 sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. ATTENTION Triton X-100 est corrosif.
  3. Enlever la solution de perméabilisation et ajouter la solution de coloration de 0,5 ml dans le flacon. Des exemples de solutions de coloration sont fournies dans le tableau 2. embryons de taches pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. Pour les colorants proposés dans le tableau 2, le lavage n'est pas nécessaire.

6. Préparation de montage Agarose

  1. Ajouter 1 g faible point de fusionagarose à pH 7,4 100 ml de PBS et on chauffe le mélange pendant 2-3 min dans un four à micro-ondes à 800 W. Si de petites particules d'agarose sont encore présentes, répéter le processus de chauffage en intervalles de 30 secondes jusqu'à ce que les particules se dissolvent complètement. L'agarose de montage n'a pas besoin d'être fraîchement préparé chaque fois, peut être re-liquéfier l'agarose solidifiée par chauffage comme décrit ci-dessus. Ce processus peut être répété 5-6 fois avant de trop d'eau se soit évaporée.
  2. Laisser l'agarose à refroidir à environ 40 à 45 ° C, puis remplir deux tubes de réaction de 1,5 ml avec de l'agarose chauffée et maintenir les tubes à 35 ° C dans un thermobloc.

7. Embryon de montage et l'insertion dans la chambre d'échantillon

  1. Option 1: colonne d' agarose (figure 3A à C, première colonne, le tableau 3, deuxième colonne)
    1. Remplir une seringue 1,0 ml d'eau distillée et l'attacher à l'une des ouvertures capillaires en verre à l'aide d'un petit tuyau en caoutchouc.Remplissez le capillaire à mi-chemin avec de l'eau distillée.
    2. Choisir un embryon avec un pinceau et le placer sur le côté intérieur de l'autre ouverture capillaire en verre. Procéder rapidement à l'étape suivante avant que l'embryon se dessèche.
    3. Coller le capillaire dans l'agarose liquide et tirer lentement quelques ul d'agarose liquide le long de l'embryon dans le capillaire. Puis rapidement augmenter la force de traction de telle sorte que l'embryon est traîné en même temps que l'agarose. En fin de compte, quelques ul d'agarose doit être au-dessus et au-dessous de l'embryon. Réglez le capillaire de côté pendant quelques minutes et laisser l'agarose se solidifie.
    4. Raccourcir le capillaire avec un dispositif de coupe de verre de diamant à une longueur d'environ 5 mm. Le fragment restant doit être complètement rempli avec de l'agarose et l'embryon doit être comprise dans le deuxième quartile.
    5. Insérez le cylindre en acier avec la goupille dans la chambre d'échantillon, puis coller le fragment capillaire au-dessus de la broche. La colonne d'agarose doit dépasser quelques millimètres fROM Le fragment capillaire avec la partie qui contient l'embryon.
  2. Option 2: hémisphère Agarose (figure 3A à C, deuxième colonne, le tableau 3, troisième colonne)
    1. Tracer 200 ul d'agarose liquide dans une seringue de 1,0 ml, puis l'utiliser pour remplir le tube d'acier à partir du dessus avec de l'agarose jusqu'à formation d'un hémisphère à l'ouverture de fond. Le diamètre de l'hémisphère doit être égal au diamètre du tuyau. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que l'agarose solidifiée.
    2. Choisir un embryon avec un pinceau et réarranger à l'extrémité de la brosse de telle sorte que l'extrémité antérieure devient accessible. Tremper l'hémisphère agarose en agarose liquide à recouvrir d'un film mince.
    3. Placez l'embryon avec son extrémité antérieure droite sur le poteau de l'hémisphère agarose. Tourner le tube d'acier autour et corriger la position de l'embryon avec la brosse. Si nécessaire, stabiliser l'embryon en ajoutant 2 ul d'agarose à la frontière embryon / hémisphère. Idéally, à moins de la moitié de la surface de l'embryon doit être recouverte d'agarose et les flancs doit être aussi raide que possible.
    4. Insérer le tube d'acier à l'hémisphère et de l'embryon lentement dans la chambre d'échantillon.
  3. Option 3: Cobweb support (figure 3A à C, troisième colonne, le tableau 3, quatrième colonne)
    1. Choisissez un embryon avec un pinceau et le mettre de côté.
    2. Couvrir le trou oblong du support de toile d'araignée avec de l'agarose liquide 5-8 ul, puis éliminer la majeure partie de l'agarose jusqu'à ce que seule une couche mince d'agarose reste.
    3. Placer l'embryon sur le film d'agarose et d'ajuster sa position. Déplacez doucement l'embryon au centre x axe du trou à fente, et aligner son axe allongé antéro-postérieur à l'axe longitudinal du trou fendu.
    4. Insérez le support de toile d'araignée avec l'embryon monté lentement dans la chambre d'échantillon. Placez le support de toile d'araignée afin qu'il ne gêne pas l'excitation et d'émissionla lumière, à savoir 45 ° par rapport à l'axe des x et l' axe z.

8. Microscopie Fluorescence base Fiche-Light

  1. Décider combien de directions le long (et le long duquel des orientations) l'embryon doit être imagé. Quatre directions (le long des orientations 0 °, 90 °, 180 ° et 270 °) fournissent généralement un bon compromis entre la couverture et la charge énergétique.
  2. Mettre en place le nombre de canaux de fluorescence. Les principaux paramètres pour chaque canal sont la ligne de laser, le filtre de fluorescence, la puissance du laser et le temps d'exposition. Pour l'imagerie en direct à long terme, il est important que la charge énergétique intégrée ne dépasse pas la tolérance de l'embryon. Un temps d'exposition de 25 à 50 ms assure imagerie rapide, tandis qu'une puissance laser comprise entre 100 et 300 uW ne devrait pas affecter la viabilité de l'embryon. Pour les échantillons fixes, le temps d'exposition et la puissance du laser peut être au moins doublé.
  3. Pour les tests d'imagerie en direct, configurer le laps de temps. le compLete embryogenèse de Tribolium prend environ sept jours à température ambiante (23 ± 1 ° C) et un peu moins de trois jours à 32-35 ° C 64. Définir l'intervalle temporel en fonction des événements morphogénétiques qui doivent être observées. Pour les courts intervalles de temps, envisager d'abaisser le temps d'exposition et la puissance du laser (voir 8.2).
  4. Positionner l'embryon en mode de transmission de lumière le long de la x et y axes dans le centre du champ de vision sans l'exposer au laser. Faire pivoter l'embryon de 360 ​​° à 90 ° pour examiner l'embryon de tout dommage qui pourrait avoir eu lieu au cours du processus de montage.
  5. Faire pivoter l'embryon de manière appropriée autour de l'axe Y afin d' aligner les axes embryonnaires avec les axes microscope, par exemple l'axe latéral de l'axe des x, à savoir l'axe dorso - ventral avec l'axe z. Lorsque vous utilisez la technique du porte-toile d'araignée, l'alignement pourrait ne pas être possible.
  6. Dans le mode de fluorescence, définir le z-stack for chaque direction. Ajouter 25-50 um comme tampon spatial devant et derrière l'embryon. Y compris la mémoire tampon, le z-stack typique couvre environ 350 à 400 pm pour un embryon Tribolium. Définir également le z-espacement, qui doit être quatre fois l'espacement latéral, à savoir la distance le long de l'axe des x et des y des axes 66.
  7. Si deux ou plusieurs embryons sont imagés en parallèle, redémarrez à 8.4 avec l'embryon suivant.
  8. Pour l'imagerie à long terme, en sorte que la chambre d'échantillon est rempli avec du PBS pH 7,4 suffisant ou un autre tampon d'imagerie. couvrir également l'ouverture de la chambre d'échantillon.
  9. Démarrez le processus d'imagerie. Pour l'imagerie en direct à long terme, surveiller l'acquisition correcte ainsi que toutes les directions dans tous les canaux pour tous les embryons. vérifier de temps en temps au cours des prochains jours que les embryons sont vivants et dans la position appropriée.

9. Embryon et contrôle de la qualité de récupération

  1. Une fois l'imagerie terminée, retirez le porte-échantillon avecles embryons à partir de la chambre d'échantillon. Seuls les embryons provenant de tests d'imagerie en direct doivent être récupérées. embryons fixes et colorés peuvent être mis au rebut.
  2. Si un essai de formation d'image en temps réel a été effectuée, le transfert de l'embryon à un porte-objet. Pour la technique de la colonne d'agarose, extrait les embryons à partir du périphérique d'agarose avec un scalpel, micro-couteau ou d'une lame de rasoir. Pour la technique de l'hémisphère agarose, transfert de l'hémisphère avec le côté plat de la lame d'objet. l'enlèvement de Embryo n'est pas nécessaire. Pour la technique de support de toile d'araignée, descendre doucement les embryons à partir du film d'agarose avec un pinceau. Incuber la lame d'objet dans un petit plat en verre dans une atmosphère saturée d'humidité dans des conditions normales jusqu'à ce que l'éclosion des larves.
  3. Après l'éclosion, les larves transférer à des puits individuels d'une plaque à 24 puits et ajouter 500 mg de milieu de croissance dans chaque puits. Incuber dans des conditions normales. Comparez le temps total de développement et de la morphologie des larves imagé à WT non imagé et larv transgéniqueae (voir la discussion). Dans des essais qui caractérisent le développement du WT, pas des aberrations morphologiques évidentes devraient idéalement être perceptible.
  4. Une fois que les larves se développent à des adultes en bonne santé, leur fournir des partenaires appropriés WT de la même souche de fond. Au bout de deux semaines, vérifier la production de la descendance. Voir également vérifier la fertilité de la descendance en les accouplant inter pares. Seulement lorsque les embryons imagées se transforment en adultes fertiles qui produisent une descendance fertile, la procédure d'imagerie peut être considérée comme non-invasive.

10. Traitement de l'image de données

REMARQUE: Pour le traitement des données d'image, le logiciel de traitement d'image open source ImageJ 67 ou son dérivé FIDJI 68 sont recommandées. Les deux versions ainsi que la documentation complète se trouvent à www.imagej.net. Le format de fichier standard pour les données LSFM est le format de fichier image étiquetée (TIFF). L'option conteneur intrinsèque permet storage des piles d'images telles que des piles z ou série temporelle de projections maximales z dans un fichier unique qui peut être ouvert dans ImageJ ou FIJI par glisser-déposer.

  1. Si nécessaire, faites pivoter les piles z pour aligner l'axe antéro-postérieur de l'embryon avec l'axe des y (image → Transformer → Rotation). S'il vous plaît noter que les paramètres de rotation doivent être réglés individuellement pour chaque direction, mais pas pour le laps de temps et les canaux de fluorescence.
  2. Recadrer les piles z le long de la direction x, y et z axes de sorte que seul fond minimal (20 - 40 pixels le long des axes x et y, les axes 5 - 10 plans le long de l'axe z) reste (pour x - et y-axes, en utilisant l'outil de sélection rectangulaire, puis l'image → Crop, pour l'axe z, on utilise l'image → Piles → Outils → Slice garde). S'il vous plaît noter que les paramètres de culture doivent être réglés individuellement pour chaque direction, mais pas pour les points de temps et les canaux de fluorescence.
  3. Calculer la projection z maximale pour chaque z-stack(Image → → Z Stacks Projet, choisissez l'intensité maximum). des calculs de projection d'intensité sont des procédures de simplification des données qui éliminent une dimension spatiale.
  4. Pour les données d'imagerie en direct à long terme, envisager d' utiliser un ImageJ ou d'un script FIDJI qui effectue les étapes de traitement 10.1 à 10.3 pour toutes les directions, tous les points de temps et tous les canaux de fluorescence 65. Idéalement, concaténer les projections maximales z par canal et de la direction et les enregistrer sous forme d'une série temporelle dans un récipient TIFF. En variante, le plug-in BigDataViewer 69 pour FIJI peut être utilisé pour naviguer à travers des jeux de données téraoctets-large.
  5. Selon les modalités de ligne transgéniques et d'imagerie, des ajustements d'intensité dynamique des piles de temps pourraient être souhaitables en raison de photo-blanchiment et / ou les fluctuations d'expression de fluorophores. Soit la ImageJ- ou la fonction FIDJI intrinsèque Correction de blanchiment (image → Ajuster → Correction de l'eau de Javel, choisissez Concordance Histogramme) ou dedicalogiciel ted 65 sont proposées.
  6. Si l'embryon a été enregistré et / ou le long de plusieurs directions et dans plusieurs canaux de fluorescence, combinaison horizontale des directions (image → Stacks → Outils → Combiner) et fusion de canal (image → couleur Fusionner → canaux) sont recommandés.
  7. L' inscription et la fusion des piles z acquises le long de plusieurs directions 70, éventuellement en combinaison avec déconvolution 71, permet le calcul des images de qualité supérieure en trois dimensions d' une qualité uniforme et une résolution isotrope. Les deux plug-ins sont ouverts source et pré-installé en FIJI, mais ils nécessitent la présence de points de repère (microsphères fluorescentes, par exemple des billes) autour de l'échantillon.
  8. Cadres de logiciels open-source pour l' extraction de données quantitatives à grande échelle et d' analyse sont également disponibles, par exemple pour la segmentation et le suivi des noyaux cellulaires 72 ou cell reconnaissance de forme 73.

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Representative Results

Ce protocole décrit un cadre expérimental pour l' imagerie de fluorescence de la vie ou fixées et colorées avec des embryons Tribolium LSFM. En raison des faibles niveaux de photo-blanchiment et photo-toxicité, une conséquence directe de sa capacité de sectionnement optique, LSFM est particulièrement bien adapté pour l'imagerie en direct à long terme.

Le nouveau AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 lignée transgénique exprimant une protéine de fusion histone2B-mEmerald sous le contrôle du promoteur alpha-tubuline 1 74. Elle montre un profil d'expression de piégeage de type amplificateur 51, étant donné que le signal de fluorescence est obtenue principalement à partir de la séreuse, le sac vitellin et de plusieurs groupes de cellules neuronales. En utilisant cette ligne, 66 h du développement embryonnaire à la température ambiante (23 ± 1 ° C) ont été enregistrés, couvrant la rétraction germband et la fermeture dorsale (film supplémentaire 1). Cela ligne peut être utilisée pour visualiser des grappes de neurones dans les appendices de tête (Figure 4A) et la dynamique de migration de la séreuse pendant la fermeture dorsale (figure 4B). Le roman AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 ligne porte le même transgène que la ligne n ° 4, mais à un emplacement génomique différent. Il ne montre pas un modèle de piège amplificatrice évident, mais le signal de fluorescence est spatiotemporelle ubiquitaire détectable comme décrit précédemment pour ce promoteur 74. Cette ligne a été imagé à la transition de la gastrulation à germband allongement de démontrer la capacité de sectionnement optique à deux niveaux de profondeur (Figure 4C). Une autre caractéristique, en particulier pour l'imagerie en temps réel, est l'acquisition de piles z le long de multiples directions par rotation de l'échantillon, qui est standard pour les configurations LSFM utilisées dans la biologie du développement. Par exemple, dans la ligne glie-bleu 58, rotation de l' échantillon tousOWS l'observation de la réorganisation des cellules gliales le long et autour du cordon nerveux ventral ainsi que la dynamique de prolifération dans le lobe de la tête à gauche, ce qui ne peut être vu correctement à partir du site dorsal, dans le même embryon (figure 4D, film 2 supplémentaire). Les ensembles de données d'imagerie en direct associés à cette étude sont fournis comme une ressource téléchargeable, des informations de méta et l' accès se trouvent dans le tableau 1 supplémentaire.

Depuis le choix des lignées transgéniques pour l'imagerie en direct est encore limitée, les petits colorants fluorescents peuvent être utilisés pour étiqueter spécifiquement les structures intracellulaires. SYTOX vert se lie à des noyaux cellulaires et peut être visualisé dans le canal vert, tandis que l' iodure de YOYO-1 et BOBO-3 se lient à l'enveloppe nucléaire et peut être visualisé dans le canal vert ou rouge, respectivement (Figure 5A). Ces colorants peuvent être utilisés pour mettre en évidence certains struct embryonnairesures, tels que la cicatrice de la séreuse (figure 5B, la première colonne), les cellules séreuse ventrales postérieures (Figure 5B, deuxième colonne) ou la séreuse-amnios-germband tissu tri-couche qui se dégage lors de la fermeture de la fenêtre de la séreuse (Figure 5B, troisième à cinquième colonne). coloration à deux couleurs permet de visualiser deux structures intracellulaires dans le même embryon, par exemple l'enveloppe nucléaire ainsi que le cytosquelette d'actine, qui peut être teinté avec Alexa Fluor conjugués colorants phalloidin. Par exemple, l' iodure de YOYO-1 peut être combiné avec phalloïdine 546 (Figure 5C), tandis que BOBO-3 peut être combiné avec phalloïdine 488 (figure 5D).

Il est également pratique pour fixer et colorer les embryons transgéniques qui expriment déjà une certaine protéine fluorescente, car la procédure de fixation du désaltère fluorescenc intrinsèquesignal e que de façon marginale. Par exemple, des embryons provenant d' AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 ligne transgénique, dans laquelle les noyaux sont détectés dans le canal vert, peuvent être colorées avec phalloïdine 546 de sorte que le cytosquelette d'actine est visible dans le canal rouge (Figure 6 ).

Figure 1
Figure 1: Comparaison des classiques Widefield, confocale à balayage laser et microscopie à fluorescence à base de feuille-Light. Conventionnel microscopie épifluorescence grand champ utilise des lampes à arc au xénon / à vapeur de mercure avec des filtres appropriés ou de la lumière à haute puissance des diodes électroluminescentes comme sources lumineuses. Pour chaque image acquise à deux dimensions, l'échantillon entier est éclairé avec un cône de lumière limitée de non-diffraction. Dans la microscopie par fluorescence à balayage laser confocal, un faisceau laser gaussien à diffraction limitée est scanned à travers l'échantillon et la fluorescence est détectée point par point de manière incohérente. De manière similaire à la microscopie conventionnelle épifluorescence à grand champ, l'échantillon entier est éclairé pour chaque image acquise à deux dimensions. En microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière, un faisceau laser gaussien à diffraction limitée illumine l'échantillon perpendiculairement à l'axe de détection. La fluorescence est détectée soit plan par plan ou ligne par ligne. Lors de l'acquisition d'une image à deux dimensions, seul un petit volume centré sur le plan focal de l'objectif de détection subit les effets de la lumière d'excitation. Le volume restant de l'échantillon n'est pas allumé, ne contribue pas à l'extérieur de mise au point flou, ne souffre pas d'effets photo-toxiques et ne perd pas fluorophores en raison de photo-blanchiment. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

ep-together.within page = "1"> Figure 2
Figure 2: Le principe de base Microscopie Fluorescence Fiche-Light. Dans LSFM, illumination et de détection sont divisés en deux chemins optiques au moins. Au moins un bras d'éclairage est utilisé pour générer la feuille lumineuse (cyan), tandis qu'au moins un bras de détection est équipé d'un filtre approprié et un appareil pour la détection parallèle du signal de fluorescence (vert). LSFM a deux implémentations canoniques, le microscope à éclairage plan unique (ou sélective) (fond bleu) et le microscope à feuille de lumière laser balayée numérique (fond rouge). En déplaçant le spécimen et la feuille de lumière par rapport à l'autre, des images en trois dimensions sont acquises. L'information le long de multiples directions sont recueillis par rotation de l'échantillon autour de l'axe y, qui est orienté de manière préférentielle le long de la gravité.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Trois différentes techniques de montage utilisées dans l'enregistrement du développement embryonnaire de Tribolium avec Fluorescence Microscopy base Fiche-Light. (A) La colonne d' agarose se rapporte à un cylindre en acier avec une petite tige qui pousse la colonne d' agarose, dans lequel l'embryon est incorporé, à partir d'un capillaire en verre. L'hémisphère agarose est monté sur un tuyau en acier. L'embryon est fixé sur le pôle de l'hémisphère avec une petite quantité d'agarose. Le support de toile d'araignée est une feuille de métal avec un trou oblong monté sur le dessus du cylindre en acier. L'embryon est collé à un film mince d'agarose qui couvre til fendu trou. (B) les plans des trois techniques de montage à l' intérieur d' un microscope à nappe de lumière. (C) Les trois techniques de montage appliquées à l' intérieur d' un DSLM. (D) des images à partir d' embryons exemples de la lignée transgénique Glia bleu enregistré avec les trois techniques de montage. Les embryons qui sont au début de la rétraction germband, sont représentés avec leur extrémité postérieure orientée vers le dessus pour faire correspondre les images de lumière de transmission. FM, le mode de fluorescence; ZA, z projection maximale avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Imagerie en direct de Tribolium Embryons. (A </ Strong>) Une ligne de l'embryon AGOC {ATub'H2B-mEmerald} n ° 1 à la transition de rétraction germband à la fermeture dorsale. Cette ligne présente un motif d'expression d'activateur piège. Le signal de fluorescence se trouve principalement dans la séreuse, le sac jaune et quelques amas de cellules neuronales. L'embryon est représentée sur une période de 15 h avec un intervalle de 5 h. Les images détaillées montrent des amas de cellules dans les appendices de la tête. Dans un premier temps, les grappes sont encore couvertes par les cellules séreuses (première colonne), lors de la rupture de la séreuse, les cellules suivre avec le mouvement de rotation de la tête. (B) d'embryons de la même montré lors de la fermeture dorsale de 01:30 h avec un intervalle de 00:30 h. Les images détaillées montrent la migration de la séreuse brisée au-dessus du sac jaune. (C) Rangée supérieure: Un embryon de la AGOC {ATub'H2B-mEmerald} ligne n ° 4 à la transition de la gastrulation à germband allongement. Moyen et la ligne inférieure: plans simples sont présentés dans deux profondeurs sur une période de 10 heures 30 h avec un intervalle de 1:30h. (D) Un embryon de la ligne de Glia bleu pendant la rétraction germband montré sur une période de 50:30 h avec un intervalle de 07:30 h. Les images détaillées montrent la réorganisation morphogénétique des cellules gliales dans le lobe gauche de la tête. ZA, z projection maximale avec réglage de l'intensité; PA seul plan avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Fixation, tachant et Iimaging de WT Embryons pendant Germband Allongement. (A) Embryons colorées avec soit SYTOX vert, soit un colorant nucléaire floue, ou YOYO-1 iodure ou BOBO-3 iodure, soit deux taches d'enveloppe nucléaire. (B) YOYO-1 embry teinté Iodideo. Détails montrer la cicatrice séreuse (première colonne), l'enveloppe nucléaire des grandes cellules séreuses-ventrale postérieure (deuxième colonne) ou l'organisation de tissus à trois couches de la séreuse, l'amnios et le tissu embryonnaire réel (troisième à la cinquième colonne). (C) de coloration à deux couleurs avec YOYO-1 Iodide et phalloïdine 546. (D) coloration à deux couleurs avec phalloïdine 488 et BOBO-3 Iodure. ZA, z projection maximale avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: Images fixes et de Stained Transgenic de la Embryons AGOC { 'ATub H2B-mEmerald} # 1 ligne. Cette lignée transgénique exprime mEmerald-labeled histone2B (H2B) sous le contrôle du promoteur de l' alpha-tubuline 1, qui marque les noyaux / chromatine ubiquitaire dans l'ensemble du développement embryonnaire. L'embryon a en outre été coloré avec Alexa Fluor 546 phalloïdine, qui marque le cytosquelette d'actine / f-actine. ZA, z projection maximale avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

critère type de microscope à fluorescence
champ large classique confocale à balayage laser à base de feuille de lumière
configuration de l' objectif une lentille d'objectif, NA moyen-élevé deux lentilles d'objectif disposées perpendiculairement, illumination: faible NA, détection: NA élevé
illumination source de lumière Filtres source de lumière blanche et appropriés (par exemple des lampes à arc court de mercure)
ou à base de LED avec des filtres de nettoyage 		laser avec filtre-nettoyage
(Par exemple , diode ou laser DPPS) 		laser avec filtre-nettoyage
(Par exemple , diode ou laser DPPS)
éclairage par image en deux dimensions ensemble de l'échantillon ensemble de l'échantillon
(Typiquement de balayage du faisceau gaussien à deux dimensions) 		seul plan focal
(DSLM: balayage de faisceau gaussien à une dimension)
détection parallèle
(Typiquement une caméra CCD ou sCMOS) 		séquentiel
(Tube photomultiplicateur) 		parallèle
(Typiquement CCD ou Scmappareil photo OS)
la vitesse de formation d'image rapide (millisecondes par image) lentes (secondes par image) rapide (millisecondes par image)
out-of-focus fluorescence pas de discrimination bloqué presque complètement par le sténopé
(Efficacité de rejet dépend du diamètre) 		presque inexistante
(Uniquement due à la diffusion)
dimensions spatiales 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
d' autres degrés de liberté 2
(Temps, le canal de fluorescence) 		2
(Temps, le canal de fluorescence) 		3
(Temps, le canal de fluorescence, direction)
résolution latérale r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
capacité de sectionnement optique Non Oui
(Discrimination dans la voie de détection) 		Oui
(discrimination dans la voie d'illumination 75)
disponibilité et le prix principalement commerciale, à faible coût essentiellement commercial, cher commercial, cher
construit sur mesure, 54,59,60,75 modérée
publications d'imagerie en direct couvrant les embryons Tribolium six 44,76,77,78,79,80 sept 23,77,79,81,82,81
(confocal à disque rotatif) 83,84,85 		quatre 23,57,65,86

Tableau 1 - Caractéristiques des fluorescence techniques utilisées dans Microscopie Tribolium imagerie active .

colorant tachant dilution
SYTOX vert noyaux (fuzzy) 1: 10 000 (1: 100 dans ddH 2 O et 1: 100 à 1% (p / v) de BSA dans du PBS)
YOYO-1 Iodide enveloppe nucléaire 1: 10 000 (1: 100 dans ddH 2 O et 1: 100 à 1% (p / v) de BSA dans du PBS)
BOBO-3 Iodide enveloppe nucléaire 1: 10 000 (1: 100 dans ddH 2 O et 1: 100 à 1% (p / v) de BSA dans du PBS)
Alexa Fluor 488 phalloïdine cytosquelette d'actine 1: 100 (à 1% (p / v) de BSA dans du PBS)
Alexa Fluor 546 phalloïdine cytosquelette d'actine

Tableau 2 - Solutions de coloration.

colonne d' agarose
(Option 1) 		hémisphère
(Option 2) 		Porte-cobweb
(option 3)
raisonnement embryon est noyé dans une colonne d'agarose qui est poussé sur un capillaire extrémité postérieure de l'embryon est collé à un pôle d'agarose hémisphère embryon est collé à un film mince d'agarose couvrant un trou oblong
Porte-échantillon cylindre en acier avec la broche tuyaux en acier cylindre en acier avec
trou rainuré
illimité (tout) illimité (tout) quatre (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
niveau de compétence requis modérer haute faible
agarose autour de l'embryon haute faible modérer
nombre d'embryons par session jusqu'à trois un jusqu'à six
récupération d'embryons rusé facile facile
matériel jetable capillaires en verre - -
recommandé pour imagerie en direct à court terme, des embryons colorés imagerie en temps réel à long terme imagerie en direct à long terme, des embryons colorés
<strong> références trois 23,87,88 deux 57,65 cette publication

Tableau 3 - Méthodes de montage Avantages et inconvénients.

induction phénotype aberrants raisonnement étape référence (méthodologique)
L'interférence ARN embryonnaire ARN double brin est injecté dans des embryons au cours de l'étape de blastoderme syncytial de knock-down d'un ou plusieurs gènes spécifiques injecter des embryons après l'étape 4.8. deux 33,81
L'interférence ARN parental L'ARN double brin est injecté latéralement dans la FEMAle pupes entre les segments abdominaux 3 et 4, ce qui conduit à knock-down de gènes dans la descendance prendre la pupes de l'étape 1.5. deux 36,37
récessifs lignes de mutants létaux embryonnaires cultures de ponte qui portent une mutation létale embryonnaire récessif hétérozygote rendement d'environ 25% descendance mutante homozygote traverser lignée mutante en ligne de formation d'image au cours de l'étape 1.5. trois 39,51,89
application de facteurs extrinsèques certains facteurs bioactifs ou toxiques sont extrinsèquement appliqués aux embryons en les ajoutant à la mémoire tampon d'image facteur ajouter au tampon de formation d'image au cours de l'étape 2.2. deux 83,85

Tableau 4 - LSFM Imagerie en direct de aberrants Phenotypes

Tableau supplémentaire 1 - métadonnées et des paramètres pour le long terme en direct-imagerie datasets DS0001-0003. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger le fichier.

Film supplémentaire 1 - Imagerie en direct d'un Embryon Tribolium de la AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgenic ligne.
Cette ligne présente un motif d'expression d'activateur piège. Le signal de fluorescence est principalement trouvé dans la séreuse, le sac vitellin et un sous-ensemble des cellules neuronales. L'embryon est représentée le long de quatre orientations de 00:00 h à 66:00 h avec un intervalle de 00:30 h entre les points de temps. Le film commence au début de la rétraction germband et se termine une fois la fermeture dorsale est terminée. Frame rate est de cinq images par seconde. ZA,z projection maximale avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger le fichier.

Film supplémentaire 2 - Imagerie en direct d'un Embryon Tribolium de la glie-Transgenic ligne bleue.
L'embryon est représentée le long de quatre orientations de 00:00 h à 66:00 h avec un intervalle de 00:30 h entre les points de temps. Le film commence au début de la rétraction germband et se termine une fois la fermeture dorsale est terminée. Frame rate est de cinq images par seconde. ZA, z projection maximale avec réglage de l'intensité. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger le fichier.

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Discussion

Contrôle de qualité

Dans des essais de formation d'image en direct, la préparation et la procédure d' enregistrement doit être non invasive, à savoir ni la mécanique et la manipulation chimique (collecte, dechorionation, le montage sur le porte-échantillon) , ni la charge énergétique intégrée pendant l'observation devrait affecter la viabilité de l'échantillon. Pour les études qui caractérisent le développement WT, il est recommandé de ne utiliser des données d'expériences dans lesquelles l'embryon survit au processus d'enregistrement, est récupéré avec succès et se transforme en un adulte en bonne santé. L'adulte ne doit pas montrer des aberrations morphologiques, doit être fertile et sa descendance doit aussi être fertile. Il y a trois principales raisons pour un faible taux de survie, en particulier dans des tests d'imagerie en direct à long terme:

Tout d'abord, la surface de l'embryon a été largement couverte avec de l'agarose au cours de l'étape 7, ce qui empêche probablement l'échange d'ions et de gaz et resserre le mécan embryonnairequement. embryons touchés, en particulier lorsque imagé au début de l'embryogenèse, se développent généralement pendant plusieurs heures discrètement, arrêter soudainement et perdent leur signal de fluorescence rapidement. Avec une certaine expérience, la fraction de surface qui est incorporé dans de l'agarose en utilisant la technique de l'hémisphère peut être maintenue au-dessous d'un tiers, alors que la technique de support de toile d'araignée, au plus la moitié de la surface est recouverte d'une couche d'agarose très mince. En second lieu, la charge énergétique intégrée appliquée à l'embryon est supérieure à la tolérance. Les valeurs indiquées à l'étape 8.2 servent en règle générale, mais les critères suivants doivent être pris en considération: (i) des embryons au cours du développement embryonnaire précoce ne durent pas un rayonnement laser ainsi que des embryons lors de la fin du développement embryonnaire, (ii) bien que l'énergie intégrée la charge peut être identique, la puissance laser supérieure soit avec le temps d'exposition plus faible ou des intervalles temporels plus longs semble être plus stressant que la puissance laser inférieure avec un temps d'exposition élevée ou des intervalles de temps plus courts, (Iii) des longueurs d'ondes plus élevées sont généralement mieux tolérée et (iv) pour les lignées transgéniques, la limite de tolérance semble être spécifique à la ligne, tandis que la force d'expression fluorophore semble être inversement proportionnelle à la tolérance d'irradiation par laser. De plus, la conception de la protéine de fusion et / ou la localisation intracellulaire jouent également un rôle. En troisième lieu, l'embryon est endommagé au cours du processus de montage. Le facteur le plus important est que le temps d'incubation dans la solution d'hypochlorite de sodium est aussi courte que nécessaire pour éliminer complètement le chorion. Plus des temps d'incubation pourrait nuire aux embryons. Des précautions doivent également être prises pour ne pas percer ou presser les embryons avec la brosse et de maintenir le support d'agarose à une température ambiante. embryons endommagés peuvent être identifiés au cours de l'étape 8.4 avant que le processus d'imagerie réelle commence, de sorte que les embryons endommagés peuvent être remplacés par des viables.

En suivant ces directives, généralement autour de 85-90% de la Embryos survivre à la procédure d'imagerie en temps réel et la trappe. Environ 90% des embryons éclos se transforment en adultes sains et fertiles. Le taux de survie semble être indépendante de la température d'imagerie et les techniques de montage (lorsque la colonne d'agarose est utilisé pendant des périodes de formation d'image d'au plus une demi-journée), mais diminue légèrement avec des niveaux élevés de rayonnement laser. En tant que contrôle supplémentaire, notamment lors de la caractérisation initiale de l'imagerie en temps réel lignées transgéniques sur-mesure pour la fluorescence ou le cadre établissant la phase en tant que précurseur pour une séquence expérimentale étendue, il est recommandé d'exécuter les embryons WT et transgéniques non imagé en parallèle à la imagée des embryons, qui sont incubées à la même température que l'embryon imagé, et de comparer leurs temps de développement et de la morphologie 65.

De plus, les études qui caractérisent phénotypes aberrants (tableau 4) par l' imagerie en direct doivent également disposer d' un c non affectéembryon de ontrol en parallèle. Il est recommandé de maintenir le traitement des deux embryons aussi semblables que possible, mais cela doit être considéré individuellement pour chaque stratégie expérimentale:

Knock-down par interférence ARN.

Pour l' interférence ARN embryonnaire 33, 81, les embryons qui en dérivent soit doit être injecté de la même culture de ponte avec de l' ARN double brin fonctionnel ou de contrôle. Les embryons injectés différemment doivent ensuite être imagées simultanément dans le même LSFM à l'aide de la colonne d'agarose ou de la technique de support de toile d'araignée. Pour l' interférence ARN parental 36, 37, la culture de formation d'image doit être scindée en deux sous - cultures. pupes femelle d'une sous-culture doit être injecté avec l'ARN double brin fonctionnel, tandis que l'autre sous-culture doit être injecté avec un contrôle de l'ARN double brin. embryon collection doit être réalisée en parallèle, et à la fois l'expérimentation et l'embryon de commande peut être imagée simultanément dans le même microscope en utilisant la colonne d'agarose ou de la technique de support de toile d'araignée.

Des lignes de mutants létaux embryonnaires récessif.

Lorsque l'on travaille avec récessifs mutants létaux embryonnaires 39, 89, 91, 92, 93, une culture de ponte des mutants hétérozygotes, qui sont normalement phénotypiquement discrète, donne théoriquement 25% de la descendance mutante homozygote (mais parfois moins en raison de problèmes de manutention pratique 89) et 75% de la progéniture phénotypiquement discrète (50% mutants hétérozygotes et 25% WT). Il est recommandé d'utiliser la technique du porte-toile d'araignée pour monter plusieurs embryons d'une telle culture de ponte. Les mutants homozygotes peuvent être identified tout au long de l'imagerie par la manifestation du phénotype, alors que les embryons en développement normalement servent de témoins. Le génotype des échantillons imagés peut être déterminée une fois l'imagerie et le contrôle de la qualité sont terminés.

Application des facteurs extrinsèques.

Si l'influence de facteurs extrinsèques dans le tampon d'imagerie 83, 85, par exemple des substances bioactives ou toxiques, sur le développement est étudiée, l' imagerie parallèle avec un embryon de contrôle dans le même LSFM est généralement pas possible. Par conséquent, l'imagerie doit être effectuée de manière séquentielle. Idéalement, le temps entre les expériences ultérieures est réduite au minimum et les embryons dérivent de la même culture d'imagerie. En variante, deux identiquement construites et exploitées LSFMs peuvent être utilisés. Dans ce cas, les embryons de la même période de ponte devraient être utilisés, mais il est d'une grande importance que thcalibration électronique des deux microscope est réalisée avec soin afin que les propriétés d'imagerie sont comparables. En utilisant la technique de support de toile d'araignée, de multiples embryons pour chaque condition peut être imagée à la fois. Avec la technique de la colonne d'agarose, les facteurs extrinsèques pourraient être empêchés d'atteindre les embryons.

Les limites actuelles de l'approche d'imagerie en direct LSFM

LSFM est un outil puissant pour analyser la morphogenèse embryonnaire non invasive dans de multiples dimensions larges à l'échelle. procédures de fonctionnement standard, tel que proposé dans le présent protocole, soutiendront le processus visant à établir la technologie de feuille de lumière comme outil standard en biologie du développement. Cependant, l'approche est limitée par un certain nombre de facteurs sur les niveaux d'expérimentation et d'organisation diverses:

Dans un premier temps, LSFM a été développé pour analyser un échantillon à la fois. Toutes les approches actuelles de cette image deux ou plusieurs embryons en même temps dans le même microscope b « Empilage » y les spécimen le long de l'axe y dans la colonne d'agarose ou les adresses de support de toile d'araignée ce émettent seulement jusqu'à un certain degré. Configurations multi-puits et Plate- à base sont disponibles, lamelle 94, 95, 96. Cependant, ils souffrent d'une qualité d'image réduite et sacrifient quelques-uns des avantages essentiels de LSFM, telles que l'imagerie le long de multiples directions. À l' heure actuelle, la meilleure option est de travailler avec plusieurs microscopes en parallèle, ce qui devient raisonnablement possible lorsque les composants coûteux, tels que le laser, sont partagés 60.

Avec l'EFA-NGFP 57, 65, 84, les FNL 86, le Brainy 58, 86, le AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, le AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 et la glie bleu= « xref »> 58, seulement six lignées transgéniques sur mesure adaptées à l' imagerie en direct à long terme sont actuellement disponibles. En outre, le HC079 (amnios), G12424 (séreuse) et G04609 (coeur) lignes de piégeage amplificateurs 51 ont été caractérisés avec LSFM 23. Alternativement, les embryons fluorescents peuvent également être générés par l' ARNm 81 ou injection de colorant 79, ces approches sont relativement simples, mais souffrent aussi de limitations 86. Plusieurs autres normes sont encore nécessaires telles que des lignes ou des lignes cytoskeletal-, organelle- et étiquetés membrane qui expriment fluorophores sous certains promoteurs non omniprésents d'observer que certains organes ou tissus. Idéalement, ces lignes sont également disponibles avec différentes protéines fluorescentes.

Un autre défi est le volume de données généré par LSFM. En raison de l'acquisition d'informations en trois dimensions spatiales et au moins trois fudegrés de liberté complémen taires (temps, direction, canal de fluorescence), la taille des ensembles de données d'imagerie en direct peuvent facilement atteindre plusieurs giga-octets à quelques téraoctets. Même après culture en trois dimensions et la compression par ZIP des conteneurs TIFF, les trois ensembles de données exemplaires associés à cette étude ont des tailles de 31,6, 12,6 et 45,1 Gigaoctets, soit 89,3 Gigabyte au total. Lorsque l'on travaille avec LSFM, il est nécessaire de disposer d' une infrastructure respective pour le stockage et le traitement des données 88, 97.

On obtient une qualité d'image la plus élevée à la surface de l'embryon, mais avec la profondeur, le signal de fluorescence devient de plus en plus floue. Par exemple, l'extrémité postérieure du germband devient couvert par le pli du sac jaune pendant la gastrulation et ne peut pas être correctement résolu (figure 4C, première à la cinquième colonne). L'imagerie le long de multiples directions résout ce problème au moins une partieially - des informations de haute qualité de la surface autour de l'embryon est disponible, mais les régions intérieures restent floues. À l' heure actuelle, aucune solution satisfaisante sont disponibles, mais à long terme, les protéines fluorescentes infrarouges 98, 99 approches génétiques ou des configurations de microscope optique adaptative 100 pourrait être envisagée.

Adaptation pour d' autres espèces

A l'heure actuelle, LSFM a été utilisé pour documenter le développement embryonnaire de trois espèces d' insectes, à savoir la mouche Drosophila melanogaster 61, 62, 101, saborder la mouche Megaselia abdita 102 et le tribolium rouge Tribolium castaneum 57. Le cadre expérimental, les procédures de fonctionnement standard et les techniques de montage décrites ici ShoulD est facilement adaptable à d'autres espèces d'insectes. Protocoles de transformation pour de nombreux insectes germinaux qui appartiennent à diverses commandes sont disponibles 103, y compris les espèces de économique et / ou de l' importance médicale, comme l'abeille domestique 104, plusieurs lépidoptères 105, 106 ou plusieurs espèces de moustiques 107, 108, 109. Avec des lignées transgéniques respectifs appropriés pour l'imagerie de fluorescence en temps réel, la morphogenèse embryonnaire des insectes peut être caractérisé en considérant leurs lignées évolutives et / ou des niches écologiques. Environ un million d' espèces d' insectes ont été décrits et une espèce plus de vingt millions d'insectes les plus existent probablement 110, couvrant plus de 400 millions d' années d'évolution 2. Seule l'approche comparative générera des informations qui, à son tour provides idées qui ne peuvent être obtenues en étudiant les principes de développement de seulement une seule espèce.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Contributions Auteur

FS et EHKS conçu la recherche. FS généré les lignes de AGOC transgéniques. imagerie de fluorescence à base de feuille de lumière a été effectuée par FS et SK. FS et EHKS écrit le manuscrit avec la participation de SK.

Acknowledgments

Nous remercions Sven Plath pour le support technique. La lignée transgénique glie bleu était un cadeau genre de Gregor Bucher (Göttingen, Allemagne). La recherche a été financée par le Pôle d'excellence Frankfurt am Main complexes macromoléculaires (CEF-MC, EXC 115, Président Volker Dötsch) accordé en partie à EHKS à l'Institut Buchmann for Life Sciences moléculaires (BMLS, directeur Enrico Schleiff) au Goethe Universität Frankfurt am Main par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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