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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Abstract

La farina di rosso coleottero Tribolium castaneum è diventato un importante organismo modello di insetti in genetica dello sviluppo e biologia evolutiva dello sviluppo. L'osservazione di embrioni Tribolium con luce microscopio a fluorescenza foglio a base ha molteplici vantaggi rispetto widefield convenzionale e microscopia a fluorescenza confocale. A causa delle proprietà uniche di un microscopio foglio a base di luce, immagini tridimensionali di campioni viventi possono essere registrati con elevati rapporti segnale-rumore e significativamente ridotto fotometabolismo nonché fototossicità lungo più direzioni per periodi che durano vari giorni. Con più di quattro anni di sviluppo metodologico e un continuo aumento dei dati, il tempo sembra opportuno stabilire procedure operative standard per l'uso della tecnologia foglio di luce nella comunità Tribolium così come nella comunità degli insetti in generale. Questo protocollo descrive tre tecniche di montaggio adatto fo diversi scopi, presenta due nuove linee transgeniche Tribolium misura appropriata per l'imaging in tempo reale a lungo termine, suggerisce cinque coloranti fluorescenti di etichettare strutture intracellulari di embrioni fissi e fornisce informazioni post-elaborazione dei dati per la valutazione puntuale dei dati registrati. Risultati rappresentativi concentrano su immagini dal vivo a lungo termine, sezionamento ottico e l'osservazione dello stesso embrione lungo molteplici direzioni. Rispettivi set di dati sono forniti come una risorsa scaricabile. Infine, il protocollo discute controlli di qualità per saggi di imaging vivi, attuali limitazioni e l'applicabilità delle procedure descritte ad altre specie di insetti.

Questo protocollo è destinato principalmente per i biologi dello sviluppo che cercano soluzioni per l'imaging che superano attrezzature di laboratorio standard. Promuove il continuo tentativo di colmare il divario tra i tecnicamente orientati laboratori / comunità, che si sviluppano e perfezionare microscopiare metodologicamente, ed i laboratori di scienze della vita / comunità, che richiedono soluzioni 'plug-and-play' a sfide tecniche. Inoltre, supporta un approccio assiomatico che muove le questioni biologiche al centro di attenzione.

Introduction

Il rosso di farina coleottero Tribolium castaneum, che appartiene alla grande famiglia dei coleotteri Darkling (Tenebrionidae), ha una lunga storia all'interno delle scienze agricole e la vita ed è il modello modello di insetto organismo secondo miglior studiata dopo la mosca della frutta Drosophila melanogaster. Nel corso degli ultimi quattro decenni, è diventato un potente e popolare organismo modello di insetti in genetica dello sviluppo, nella biologia evolutiva dello sviluppo e, nel corso degli ultimi venti anni, nella morfogenesi embrionale per una serie di motivi:

Drosophila e Tribolium entrambi appartengono alla Holometabola, ma divergevano circa 300 milioni di anni fa 1, 2, 3, 4. Mentre lo sviluppo embrionale di Drosophila è comunemente considerato come altamente derivato, Tribolium mostra una modalità più ancestrale di sviluppo che si trova in una proporzione considerevolmente più grande di specie di insetti 5, 6, 7, 8, 9. In primo luogo, Tribolium presenta sviluppo testa non involuta, cioè le sue boccale e antenne emergono già durante l'embriogenesi 10, 11, 12, 13, 14, 15. In secondo luogo, Tribolium segue i principi di sviluppo corto germe, cioè segmenti addominali vengono aggiunti in sequenza da una zona di crescita posteriore durante germband allungamento 16, 17, 18, 19. In terzo luogo, Tribolium sviluppa e degrada successivedue membrane extra-embrionali cioè l'amnion, che copre l'embrione unico ventrale, e sierose, che avvolge completamente l'embrione 20, 21, 22. Entrambe le membrane giocano un morfogenetica fondamentale 23 nonché ruolo protettivo contro i microrganismi 24, 25 e 26 essiccazione. In quarto luogo, le gambe embrione di sviluppo sono completamente funzionali durante la fase di vita larvale e servono come primordi per le gambe adulti durante la metamorfosi pupa 27, 28, 29, 30, 31.

A causa delle loro dimensioni e modeste esigenze di piccole dimensioni, la coltivazione del Tribolium in laboratorio è abbastanza semplice. Le colture di wild-type (WT) ceppi o linee transgeniche consistono tipicamente di circa 100-300 adulti e può essere mantenuto entro bottiglie da un litro in vetro (impronta 80 cm 2) riempito tre quattro centimetri alta (circa 50 g) con terreno di coltura costituito da frumento pieno fiore farina integrato con lievito secco attivo. Una fornitura di acqua non è necessaria. Questo permette anche piccoli laboratori di mantenere decine di culture beetle all'interno incubatori insetti disponibili commercialmente piccole o medie dimensioni. Successive fasi di sviluppo di larve Tribolium (dopo circa il quarto instar, pupe e adulti) sono facilmente separati dal mezzo di crescita mediante setacciatura. embrioni sincronizzati sono ottenuti incubando adulti per brevi periodi a medio deposizione delle uova. Per un rapido sviluppo, culture coleotteri sono mantenuti a 32 ° C (circa quattro settimane per generazione), mentre del magazzino viene tipicamente eseguita a 22-25 ° C (circa dieci settimane per generazione).

Negli ultimi dieci anni, molti tec di seriehniques sono stati gradualmente adattati e ottimizzati per Tribolium, come riassunto nei libri emergenti organismi modello 32. Di grande importanza sono avanzati metodi genetici come embrionale 33, larvale 34, 35 o parentale 36, 37 RNA interferenza basati silenziamento genico, trasformazione linea germinale sia con il piggyBac 38, 39 o il sistema trasposasi Minos 40 e CRISPR / genoma Cas9 basata ingegneria 41. Inoltre, il genoma è stato sequenziato Tribolium circa un decennio fa 42, ed è ora nel terzo turno di genoma gruppo di rilascio 43, che consente l'identificazione efficiente e genoma-larga e analisi sistematica dei geni 44 45, 46. Inoltre, i genomi di altre quattro specie di coleotteri sono disponibili per approcci genetici comparativi 47, 48, 49, 50. In associazione con il genoma sequenziato, due analisi genetiche su larga scala sono state eseguite, ossia uno schermo mutagenesi inserzionale 51 e uno schermo silenziamento genico basato RNA interferenza sistematica 52, 53.

Fluorescenza di imaging in tempo reale con widefield, confocale o la microscopia foglio a base di luce (LSFM) permette di osservare la morfologia embrionale di Tribolium in funzione del tempo (cioè la morfogenesi) in un contesto multidimensionale (Tabella 1). In widefield e confocale microscopia a fluorescenza, la excitzione e emissione di luce viene guidato attraverso la stessa lente obiettivo. In entrambi gli approcci, l'intero campione viene illuminato per ogni piano bidimensionale registrata. Quindi, i campioni vengono sottoposti a livelli energetici molto elevati. In LSFM, solo i fluorofori nel piano focale sono eccitati a causa di un disaccoppiamento di illuminazione e rilevazione utilizzando due lenti obiettivo perpendicolarmente disposti (figura 1). LSFM disponibile in due implementazioni canonici - il piano unico illuminazione microscopio (SPIM) e la luce laser digitalizzata foglio basata microscopio a fluorescenza digitale (DSLM, Figura 2) - e offre diversi vantaggi importanti rispetto agli approcci tradizionali: (i) capacità sezionamento ottico intrinseco, (ii) risoluzione buona assiale, (iii) fortemente ridotto livello di fotometabolismo, (iv) basso fototossicità, (v) alto rapporto segnale-rumore, (vi) relativamente elevata velocità di acquisizione, (vii) l'imaging lungo molteplici direzioni e (viii) la penetrazione nei tessuti più profondi grazie all'utilizzo di bassa apertura numerica illuminazione lenti obiettivo 54, 55, 56.

LSFM è già stato applicato con successo in Tribolium per documentare quasi tutta la morfogenesi embrionale 57 e di analizzare i principi di rottura della membrana extra-embrionali, all'inizio della chiusura dorsale 23. Per aumentare l'attrattiva del LSFM nella comunità Tribolium e per la scienza degli insetti in generale, è di grande importanza per stabilire procedure operative standard e per migliorare i metodi, protocolli e il pool di risorse ad un livello in cui il microscopio diventa una facilità d' -utilizzare strumento standard nei laboratori di biologia dello sviluppo, e le questioni biologiche rimangono al centro dell'attenzione.

Questo protocollo inizia con le basi del Tribolium </ em> coltivazione, cioè la manutenzione, la riproduzione e la raccolta degli embrioni. Successivamente, due strategie sperimentali sono illustrati: (i) l'imaging dal vivo di linee transgeniche misura e (ii) l'imaging di embrioni fissi che sono state colorate con coloranti fluorescenti (Tabella 2). Successivamente, tre tecniche di fissaggio con scopi leggermente diversi sono spiegati in dettaglio (Figura 3 e Tabella 3): (i) la colonna agarosio, (ii) l'emisfero agarosio e (iii) il titolare ragnatela romanzo. Il protocollo spiega poi la procedura di acquisizione dati con LSFM. modalità di imaging e considerazioni chiave sono delineati. Infine, il recupero degli embrioni è spiegato e sono forniti suggerimenti per l'elaborazione dei dati di base. Nei risultati rappresentativi, dati di immagini in diretta da due nuovi su misura e le 58 linee transgeniche Glia-blu sono mostrate e rispettivi set di dati di imaging sono forniti come una risorsa scaricabile. Inoltre, l'immagineDati di embrioni fisse che sono state colorate con una varietà di coloranti fluorescenti sono presentati. La discussione si concentra sul controllo della qualità, le attuali limitazioni dell'approccio di imaging dal vivo e l'adattamento del protocollo ad altre specie.

Il protocollo è scritto per microscopi a fluorescenza foglio a base di luce che sono dotati di una camera di campione e un meccanismo di serraggio girevole per i possessori standardizzati campione 54, 59, 60, che sono tipicamente elementi a forma di cilindro di metallo, plastica o vetro con un diametro nella gamma di millimetro. Il protocollo è adatto anche per entrambe le implementazioni canoniche, cioè SPIM e DSLM, nonché per configurazioni con due o più bracci di illuminazione e di rilevamento 61, 62, 63. I risultati rappresentativi mostrano dati in due canali spettrali, verde (illumination con un laser 488 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 525/50) e rosso (illuminazione con un laser 561 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 607/70), ma il protocollo può essere esteso a tre o quattro canali spettrali.

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Protocol

1. Husbandry delle Culture Tribolium

NOTA: condizioni standard sono definite come una temperatura di incubazione di 25 ° C e 70% di umidità relativa in 12 h luminose / 12 h ciclo scuro. Per ulteriori informazioni su Tribolium allevamento, rispettive linee guida sono disponibili 64. Questo protocollo richiede due supporti a base di farina diversi, che possono essere preparati in quantità chilogrammo e conservati per diversi mesi.

  1. Prima di lavorare con farina e lievito secco inattivo, memorizzare i pacchetti sigillati a -20 ° C per 24 ore e poi lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Questa procedura elimina potenziali patogeni.
  2. Passare pieno farina di frumento di grano e lievito secco attivo attraverso un setaccio a 710 micron di maglia, quindi preparare mezzo di crescita integrando la farina di grano integrale setacciata con il 5% (w / w) setacciata lievito secco inattivo.
  3. Passare 405 farina di grano fine e lievito secco attivo attraverso un setaccio a 250 & #181; m di maglia, poi preparare medio deposizione delle uova di completarlo 405 farina di grano raffinata setacciata con il 5% (w / w) setacciata lievito secco inattivo.
  4. Passare il rispettivo cultura Tribolium attraverso un setaccio con 800 micron dimensione delle maglie. Eliminare il terreno di coltura residuo. Trasferire le larve, pupe e gli adulti ad un grande piatto di vetro.
  5. Se non esiste la cultura progenie, trasferire circa 80 larve e / o pupe ad una nuova bottiglia di vetro per stabilire una nuova cultura progenie. Se nessun larve e / o pupe sono presenti, prendere invece circa 40 adulti. Aggiungere 50 g di mezzo di crescita e incubare in condizioni standard.
  6. Raccogliere circa 300 adulti (500-700 mg) in un'altra nuova bottiglia di vetro per stabilire la cultura di imaging. Aggiungere 50 g di mezzo di crescita e incubare in condizioni standard. Lasciare che la cultura di imaging di stabilirsi per almeno 24 h in mezzo di crescita fresco prima di raccolta degli embrioni.
  7. Sostituire il terreno di crescita della cultura di imaging almeno ogni due abbiamoeks, che può essere fatta in collaborazione con raccolta di embrioni (vedi 3.2). Dopo due o tre mesi, sostituire la cultura di imaging completamente dai nuovi adulti della cultura progenie.
  8. Se si usa una linea transgenico non omozigote, curare le culture progenie spesso rimuovendo animali non transgenici. Idealmente, generare linee omozigoti se il rispettivo transgene non è letale o cause di sterilità quando presenti su entrambi i cromosomi. culture omozigoti hanno tipicamente un livello di fluorescenza media superiore e le condizioni sperimentali generali sono più strette, poiché soltanto un genotipo è presente.

2. Setup Microscopio e calibrazione

NOTA: L'embrione Tribolium ha una lunghezza antero-posteriore di circa 600-660 micron e un diametro trasversale di circa 300-330 um. Maggior parte delle fotocamere CCD moderni hanno una dimensione del chip sensore di circa 9 mm x 7 mm, cioè un diametro di 11,4 micron, e una distanza di pixel-pixel di 6,45 um.Quando combinato con una lente obiettivo 10X ingrandimento, l'embrione può essere ripreso in toto con un passo dei pixel 0,645 um. Maggior parte delle fotocamere sCMOS moderni hanno una maggiore dimensione del chip del sensore di circa 16 mm x 14 mm, cioè un diametro di 21,3 micron, e una distanza di pixel-pixel di 6,5 micron. Quando combinato con una lente obiettivo 20 ingrandimenti, l'embrione può essere ripreso in toto con un passo dei pixel 0,325 um.

  1. Collegare le lenti illuminazione e oggettivi rilevazione al microscopio. Assicurarsi che laser e filtri fluorescenza corrispondono l'assorbimento fluoroforo e spettri di emissione molto bene.
  2. Collegare la camera del campione al microscopio. Riempire la camera campione con PBS pH 7,4 o qualsiasi altro tampone di imaging appropriato.
  3. Accendere e calibrare il microscopio. le routine e le linee guida per la risoluzione dei problemi microscopi foglio a base di luce custom-built (più precisamente per l'attuazione DSLM) calibrazione completa sono stati pubblicati previously 65. Per i dispositivi commerciali, seguire attentamente le istruzioni del produttore. Maltrattamento potrebbe esaurire la camera del campione del mezzo e provocare danni allo strumento, così come il campione.

3. Raccolta dei transgenici o WT Embrioni

  1. Passare la colonia di imaging attraverso un setaccio con 800 micron dimensioni delle maglie. Raccogliere coleotteri adulti in una nuova bottiglia di vetro e aggiungere 10 g di media deposizione delle uova. Incubare la cultura ovideposizione per 1 ha 25 ° C e 70% di umidità relativa in luce.
  2. Passare la cultura deposizione delle uova attraverso un setaccio a 800 micron dimensione delle maglie per separare gli adulti dal mezzo di deposizione delle uova, che contiene circa 30-100 embrioni. Trasferire gli adulti ad una nuova bottiglia di vetro e aggiungere sia il vecchio o 50 g di terreno di coltura fresco.
  3. Se osservazione dovrebbe iniziare nella fase blastoderma uniforme (esempio di dati DS0002), incubare il mezzo di deposizione delle uova per 15 ore a 25 ° C e 70% di umidità relativa. To iniziare all'inizio di retrazione germband (esempio set di dati DS0001 e DS0003), incubare embrioni per 23 ore a 32 ° C e 70% di umidità relativa. Se altri stadi di sviluppo sono desiderati, fare riferimento alla rispettiva letteratura 64, 65 e adattare il tempo di incubazione e / o temperatura secondo necessità.

4. Embrione dechorionation

NOTA: Il corion è lo strato esterno del guscio e si compone di proteine ​​e polisaccaridi. È fortemente la luce assorbente ma non essenziale per il corretto sviluppo e può quindi essere rimossa chimicamente.

  1. Passare il mezzo di deposizione delle uova attraverso un setaccio da 300 micron dimensione delle maglie. Raccogliere gli embrioni in un colino cella con 100 um dimensione di maglia e scartare il mezzo rimanente deposizione delle uova.
  2. Preparare una piastra da 6 pozzetti come segue: riempire la A1, A2, A3 e B3 pozzetti con 10 ml di PBS pH 7,4 e B1 e B2 pozzetti con 9 ml di PBS. Poi aggiungere con cautela1 mL di sodio ipoclorito al B1 e B2. Osservare lo stato di avanzamento dei passi 4.3 a 4.8 sotto il microscopio stereo. ipoclorito di sodio ATTENZIONE è corrosivo.
  3. Inserire il filtro cellula nel pozzetto A1 (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per un minuto sotto blanda agitazione. particelle di farina più grandi dovrebbero staccarsi dagli embrioni.
  4. Trasferire il filtro cella a pozzetto B1 (ipoclorito di sodio in PBS pH 7.4) e agitare la piastra energicamente per 30 s. Le particelle di farina rimanenti dovrebbero staccare completamente dagli embrioni.
  5. Trasferire il filtro cella alla A2 pozzo (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per 1 min sotto blanda agitazione.
  6. Per dechorionation, trasferire il filtro cella alla B2 pozzo (ipoclorito di sodio in PBS pH 7,4). Agitare la piastra energicamente fino a quando la rottura corion e stacca dagli embrioni. Il corion sembra una membrana sottile semitrasparente con bordi lacerati, mentre embrioni dechorionated hanno una sagoma piana.
  7. esimo di trasferimentocellule filtro e alla A3 pozzo (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per 1 min sotto blanda agitazione. Se eventuali frammenti corion sono ancora attaccati agli embrioni dopo il lavaggio, ripetere il punto 4.6.
  8. Memorizzare gli embrioni nel pozzo B3 (PBS pH 7,4). Bagagli per diverse ore non danneggia gli embrioni, ma di tenere presente che lo sviluppo continua.
  9. Per le linee transgeniche non omozigoti, rimuovere eventuali embrioni non fluorescenti se possibile. Per la fissazione e la colorazione dei WT o di embrioni transgenici, continuare con il passo 5. Per l'imaging dal vivo di embrioni transgenici, continuare con il passaggio 6.

5. Vitelline membrana permeabilizzazione, Fissazione e colorazione

NOTA: La membrana vitellina è lo strato interno del guscio. È impervia per coloranti fluorescenti e deve essere chimicamente permeabilizzate prima della colorazione così.

  1. Riempire una fiala di scintillazione con soluzione di fissaggio / permeabilizzazione (1,5 mL 4% (w / v) di paraformaldeide in PBS pH 6,9 aND 1.5 mL n-eptano). Trasferire gli embrioni con un pennello per le fiale. fiale coprire con un foglio di alluminio per proteggere fluorofori dalla luce e incubare per 30 min su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. ATTENZIONE paraformaldeide è tossico e corrosivo, n-eptano è infiammabile e tossico.
  2. Rimuovere la soluzione di fissaggio e trattare embrioni tre volte per 15 minuti in 3 mL 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 e successivamente una volta per 15 minuti in 3 mL 1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. ATTENZIONE Triton X-100 è corrosivo.
  3. Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e aggiungere 0,5 ml di soluzione colorante alla fiala. Soluzioni coloranti esemplificativi sono riportate nella Tabella 2. embrioni macchia overnight a 4 ° C su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. Per i coloranti proposti nella tabella 2, il lavaggio non è necessario.

6. Preparazione del montaggio Agarose

  1. Aggiungere 1 g low-meltagarosio a 100 ml di PBS pH 7,4 e scaldare la miscela per 2-3 minuti in un forno a microonde a 800 W. Se piccole particelle di agarosio sono ancora presenti, ripetere il processo di riscaldamento a intervalli di 30 sec fino a quando le particelle si dissolvono completamente. L'agarosio di montaggio non deve essere preparato fresco ogni volta, il solidificato agarosio può essere ri-liquefatti mediante riscaldamento come descritto sopra. Questo processo può essere ripetuto 5-6 volte prima troppa acqua è evaporata.
  2. Consentire l'agarosio raffreddare fino a circa 40-45 ° C, quindi riempire due provette da 1,5 ml con l'agarosio riscaldata e mantenere quei tubi a 35 ° C in un termoblocco.

7. Embrione di montaggio e inserimento nella camera del campione

  1. Opzione 1: colonna agarosio (Figura 3A -C, prima colonna, tabella 3, seconda colonna)
    1. Riempire una siringa da 1,0 ml con acqua distillata e collegarlo ad una delle aperture in vetro capillari utilizzando un tubo di gomma di piccole dimensioni.Riempire la metà capillare con acqua distillata.
    2. Scegliere un embrione con un pennello e posizionarlo sul lato interno dell'altra apertura capillare di vetro. Procedere rapidamente alla fase successiva prima che l'embrione si asciuga.
    3. Attaccare il capillare nel agarosio liquido e disegnare lentamente pochi ml di agarosio liquido a fianco l'embrione nel capillare. Quindi aumentare rapidamente la forza disegno in modo che l'embrione viene trascinata con l'agarosio. Alla fine, alcuni ml di agarosio deve essere sopra e sotto l'embrione. Impostare il capillare da parte per qualche minuto e lasciare che l'agarosio solidificare.
    4. Accorciare il capillare con un cutter vetro diamante per una lunghezza di circa 5 mm. Il frammento rimanente dovrebbe essere completamente riempito con agarosio e l'embrione dovrebbe essere entro il secondo quartile.
    5. Inserire il cilindro d'acciaio con il perno nella camera del campione, e poi attaccare il frammento capillare sulla parte superiore del perno. La colonna agarosio deve sporgere di alcuni millimetri fROM frammento capillare con la parte che contiene l'embrione.
  2. Opzione 2: emisfero Agarose (Figura 3A -C, seconda colonna, tabella 3, terza colonna)
    1. Disegnare 200 ml di agarosio liquido in una siringa ml 1,0, quindi utilizzarlo per riempire il tubo di acciaio dall'alto con agarosio fino a forma di emisfero all'apertura inferiore. Il diametro emisfero deve essere uguale al diametro del tubo. Attendere qualche minuto fino a che l'agarosio si è solidificato.
    2. Scegliere un embrione con un pennello e riorganizzare sulla punta del pennello in modo che l'estremità anteriore diventa accessibile. Immergere l'emisfero agarosio in agarosio liquidi di coprirlo con una pellicola sottile.
    3. Posizionare l'embrione con la sua estremità anteriore in posizione verticale sul palo dell'emisfero agarosio. Girare il tubo d'acciaio intorno e correggere la posizione di un embrione con il pennello. Se necessario, stabilizzare l'embrione aggiungendo 2 microlitri agarosio al confine embrione / emisfero. Idealely, meno della metà della superficie dell'embrione deve essere coperta in agarosio e fianchi dovrebbe essere il più ripido possibile.
    4. Inserire il tubo in acciaio con l'emisfero ed embrione lentamente nella camera del campione.
  3. Opzione 3: Cobweb fermo (Figura 3A -C, terza colonna, tabella 3, quarta colonna)
    1. Scegliere un embrione con un pennello e metterlo da parte.
    2. Coprire il foro asolato del supporto ragnatela con 5-8 ml di agarosio liquido, quindi rimuovere la maggior parte agarosio fino solo un sottile film di agarosio rimane.
    3. Posizionare l'embrione sulla pellicola agarosio e regolarne la posizione. spostare attentamente l'embrione al centro asse x del foro asolato, e allineare il suo asse anteriore-posteriore allungata con l'asse allungato del foro asolato.
    4. Inserire il porta ragnatela con l'embrione montato lentamente nella camera del campione. Posizionare il supporto ragnatela in modo che non interferisca con eccitazione e di emissioneluce, cioè 45 ° rispetto alla xe z.

A base di fogli 8. Luce microscopia a fluorescenza

  1. Decidere insieme quante direzioni (e lungo le quali orientamenti) l'embrione deve essere ripreso. Quattro direzioni (lungo gli orientamenti 0 °, 90 °, 180 ° e 270 °) tipicamente forniscono un buon compromesso tra la copertura e carico di energia.
  2. Impostare il numero di canali di fluorescenza. I parametri principali per ciascun canale sono la linea del laser, il filtro di fluorescenza, la potenza del laser e il tempo di esposizione. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, è importante che il carico energetico integrato non superi la tolleranza dell'embrione. Un tempo di esposizione di 25-50 ms garantisce una riproduzione veloce, mentre una potenza laser tra 100 e 300 uW non dovrebbe influenzare la vitalità dell'embrione. Per campioni fissati, tempo di esposizione e potenza del laser può essere almeno raddoppiata.
  3. Per i saggi di imaging dal vivo, configurare il lasso di tempo. il complete embriogenesi di Tribolium richiede circa sette giorni a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) ed un poco meno di tre giorni a 32-35 ° C 64. Definire l'intervallo temporale secondo gli eventi morfogenetici che devono essere osservate. Per gli intervalli temporali brevi, considera di riduzione del tempo di esposizione e potenza del laser (vedi 8.2).
  4. Posizionare l'embrione in modalità luce di trasmissione lungo gli assi x ed y al centro del campo di vista senza esporre al laser. Ruotare l'embrione di 360 ° a 90 ° per esaminare l'embrione per eventuali danni che potrebbero essersi verificati durante il processo di montaggio.
  5. Ruotare l'embrione opportunamente intorno all'asse y per allineare gli assi embrionali con il microscopio assi, ad esempio l'asse laterale con l'asse x, cioè l'asse dorsoventrale con l'asse z. Quando si utilizza la tecnica titolare ragnatela, allineamento potrebbe non essere possibile.
  6. Nella modalità fluorescenza, definire la z-stack for ogni direzione. Aggiungere 25-50 um come buffer spaziale davanti e dietro l'embrione. Compreso il buffer, il tipico z-stack copre circa 350-400 micron per un embrione Tribolium. Definire anche il z-spaziatura, che dovrebbe essere quattro volte la distanza laterale, cioè la distanza lungo gli assi X e Y. 66.
  7. Se due o più embrioni vengono esposte in parallelo, riavviare a 8.4 con il prossimo dell'embrione.
  8. Per l'imaging a lungo termine, assicurarsi che la camera del campione è riempita con sufficiente PBS pH 7,4 o altro buffer imaging. coprire anche l'apertura camera campione.
  9. Avviare il processo di imaging. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, monitorare la corretta acquisizione lungo tutte le direzioni in tutti i canali di tutti gli embrioni. controllare di tanto in tanto nel corso dei prossimi giorni che gli embrioni sono vivi e nella posizione appropriata.

9. Embrione Recupero e Controllo Qualità

  1. Una volta imaging è completata, rimuovere il portacampioni congli embrioni dalla camera campione. Solo embrioni da test di imaging dal vivo devono essere recuperate. embrioni fissate e colorate possono essere scartati.
  2. Se è stato eseguito un test di imaging dal vivo, trasferire l'embrione di uno scivolo oggetto. Per la tecnica colonna agarosio, estrarre gli embrioni dal agarosio circostante con un bisturi, micro-coltello o lama di rasoio. Per la tecnica emisfero agarosio, trasferire l'emisfero con la parte piatta alla slitta oggetto. la rimozione degli embrioni non è necessario. Per la tecnica titolare ragnatela, smontare delicatamente gli embrioni dal film agarosio con un pennello. Incubare il vetrino oggetto in un piatto di vetro in atmosfera satura di umidità in condizioni standard fino alla schiusa delle larve.
  3. Dopo la schiusa, trasferire le larve a singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 500 mg di mezzo di crescita a ciascun pozzetto. Incubare in condizioni standard. Confrontare il tempo di sviluppo totale e la morfologia delle larve ripreso a WT non ripreso e larv transgenicoAE (vedi la discussione). Nei saggi che caratterizzano lo sviluppo WT, senza aberrazioni morfologiche evidenti dovrebbero idealmente essere evidente.
  4. Una volta che le larve sviluppare per adulti sani, di fornire loro adeguati partner WT dello stesso ceppo di fondo. Dopo due settimane, controllare per la produzione di progenie. Considera anche per controllare la fertilità della progenie accoppiando loro inter pares. Solo quando gli embrioni imaged sviluppano in adulti fertili che producono progenie fertile, la procedura di imaging può essere considerato non invasivo.

10. Image Data Processing

NOTA: Per l'elaborazione dei dati di immagine, l'open-source software di elaborazione delle immagini ImageJ 67 o il suo derivato FIJI 68 sono raccomandati. Entrambe le versioni, nonché una documentazione completa si trovano a www.imagej.net. Il formato di file standard per i dati LSFM è il formato di file di immagine con tag (TIFF). L'opzione contenitore intrinseca consente storabbia di pile di immagine come z-stack o serie temporale di proiezioni massime z all'interno di un singolo file che possono essere aperti in ImageJ o FIJI tramite drag-and-drop.

  1. Se necessario, ruotare le z-stack per allineare l'asse anteriore-posteriore dell'embrione con l'asse y (Immagine → Trasforma → Ruota). Si ricorda che i parametri di rotazione devono essere impostati singolarmente per ciascuna direzione, ma non per il lasso di tempo ed i canali di fluorescenza.
  2. Ritagliare i z-stack lungo gli assi x, ye z assi in modo che solo sfondo minima (20 - 40 pixel lungo gli assi x ed y, 5 - 10 aerei lungo l'asse z) rimane (per x - ed y, utilizzare lo strumento di selezione rettangolare, quindi Immagine → Ritaglia, poiché l'asse z, utilizzo immagini → Pile → Strumenti → Fetta custode). Si prega di notare che i parametri di ritaglio devono essere impostati singolarmente per ciascuna direzione, ma non per i punti di tempo ed i canali di fluorescenza.
  3. Calcolare la massima sporgenza z per ogni z-stack(Immagine → pile → Z progetto, scegliere Max Intensity). calcoli proiezione intensità sono procedure dati semplificazione che rimuovere una dimensione spaziale.
  4. Per i dati di imaging dal vivo a lungo termine, è consigliabile utilizzare un ImageJ o uno script che esegue l'elaborazione FIJI passi 10,1-10,3 per tutte le direzioni, tutti i punti di tempo e tutti i canali di fluorescenza 65. Idealmente, concatenare i proiezioni massime z per canale e la direzione e salvarle come serie temporale in un contenitore TIFF. In alternativa, il plug-in BigDataViewer 69 per FIJI può essere utilizzato per navigare attraverso terabyte-dati di grandi dimensioni.
  5. A seconda della linea e di imaging transgeniche modalità, rettifiche dinamiche intensità delle pile di tempo potrebbe essere auspicabile per foto-candeggio e / o variazioni di espressione fluoroforo. O l'ImageJ- o FIJI-intrinseca funzione di correzione Bleach (Immagine → Regolare → Correzione Bleach, scegli Istogramma corrispondenza) oppure dedicasoftware ted 65 sono suggeriti.
  6. sono consigliate se l'embrione è stato registrato e / o lungo molteplici direzioni e in più canali di fluorescenza, la combinazione orizzontale delle direzioni (Immagine → Pile → Strumenti → Combina) e si fondono canale (Immagine → colori Merge → Canali).
  7. Registrazione e fusione di z-stack acquisiti lungo più direzioni 70, eventualmente in combinazione con deconvoluzione 71, permette il calcolo di immagini tridimensionali superiori di qualità uniforme e risoluzione isotropica. Entrambi i plug-in sono open source e preinstallato in FIJI, ma richiedono la presenza di punti di riferimento (microsfere fluorescenti, ad esempio perline) attorno al campione.
  8. Framework software open-source per larga scala estrazione dati quantitativi e di analisi sono anche disponibili, per esempio per la segmentazione e monitoraggio dei nuclei cellulari 72 o cell riconoscimento di figura 73.

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Representative Results

Questo protocollo descrive un quadro sperimentale per l'imaging di fluorescenza di vita o di embrioni Tribolium fissate e colorate con LSFM. A causa dei bassi livelli di fotometabolismo e foto-tossicità, una conseguenza diretta della sua capacità sezionamento ottico, LSFM è particolarmente adatto per l'imaging in tempo reale a lungo termine.

Il romanzo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linea transgenica esprime una proteina di fusione histone2B-mEmerald sotto il controllo del alfa-tubulina 1 promotore 74. Essa mostra una trappola simile espressione modello enhancer 51, poiché il segnale di fluorescenza è ottenuto principalmente dalla sierosa, il sacco vitellino e diversi gruppi di cellule neuronali. Usando questa linea, sono stati registrati 66 h di sviluppo embrionale a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C), che copre retrazione germband e chiusura dorsale (Film supplementare 1). Questolinea può essere utilizzato per visualizzare i cluster neuronali all'interno delle appendici testa (figura 4A) e le dinamiche delle migrazioni sierosa durante la chiusura dorsale (Figura 4B). La linea romanzo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 porta lo stesso transgene come la linea # 4, ma in una posizione genomica diversa. Non mostra uno schema enhancer trap ovvia, ma il segnale di fluorescenza è spatiotemporally ubiquitariamente rilevabile come descritto in precedenza per questo promotore 74. Questa linea è stato ripreso nel passaggio dal gastrulation a germband allungamento per dimostrare la capacità di sezionamento ottico a due livelli di profondità (Figura 4C). Un'altra caratteristica, specialmente per l'imaging in tempo reale, è l'acquisizione di z-stack lungo più direzioni tramite rotazione del campione, che è standard per configurazioni LSFM utilizzati in biologia dello sviluppo. Ad esempio, nella linea 58 Glia-blu, rotazione campione tuttiows l'osservazione di riorganizzazione cellule glia lungo e attorno al cordone nervoso ventrale nonché le dinamiche proliferazione nel lobo testa di sinistra, che possono essere visti correttamente solo dal sito dorsale, nello stesso embrione (Figura 4D, Film integrativa 2). I set di dati di imaging dal vivo associati a questo studio sono forniti come un scaricabile informazioni sulle risorse, meta e l'accesso si trovano nella Tabella 1 supplementare.

Poiché la scelta delle linee transgeniche per l'imaging in tempo reale è ancora limitata, coloranti fluorescenti piccoli possono essere utilizzati per etichettare specificamente strutture intracellulari. Sytox verde si lega ai nuclei delle cellule e possono essere visualizzati nel canale verde, mentre YOYO-1 e BOBO-3 ioduro legano alla membrana nucleare e può essere visualizzato nel canale verde o rosso, rispettivamente (Figura 5A). Questi coloranti possono essere utilizzati per evidenziare certi struct embrionaleUres, come sierose cicatrice (Figura 5B, prima colonna), le cellule posteriori ventrali sierosa (Figura 5B, seconda colonna) o tri-strato di tessuto sierosa-amnion-germband che emerge in chiusura finestra sierosa (Figura 5B, terzo quinta colonna). Due colori colorazione permette la visualizzazione di due strutture intracellulari nello stesso embrione, per esempio la membrana nucleare insieme con il citoscheletro actina, che può essere trattata con coloranti falloidina Alexa Fluor-coniugati. Ad esempio, YOYO-1 ioduro può essere combinato con falloidina 546 (Figura 5C), mentre BOBO-3 può essere combinato con falloidina 488 (Figura 5D).

E 'anche conveniente per fissare e macchiare embrioni transgenici che esprimono già una certa proteina fluorescente, poiché il procedimento di fissazione spegne il fluorescenc intrinsecaE Segnale solo marginalmente. Ad esempio, embrioni dal AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linea transgenica, in cui vengono rilevati i nuclei nel canale verde, possono essere colorati con falloidina 546 in modo che il citoscheletro actina diventa visibile nel canale rosso (Figura 6 ).

Figura 1
Figura 1: Confronto tra convenzionale grandangolare, confocale a scansione laser e sonore basata Luce microscopia in fluorescenza. Microscopia convenzionale widefield epi-fluorescenza utilizza lampade ad arco / vapori di mercurio e xeno con filtri appropriati o luce ad alta potenza diodi emettitori come sorgenti luminose. Per ogni immagine bidimensionale acquisita, l'intero campione viene illuminato con un cono di luce non diffrazione limitata. In confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza, un fascio laser gaussiano diffrazione limitata è scanned attraverso il campione e la fluorescenza viene rilevata incoerentemente punto per punto. Analogamente alla microscopia convenzionale widefield epi-fluorescenza, l'intero campione viene illuminato per ogni immagine bidimensionale acquisita. Alla luce microscopia a fluorescenza foglio a base, un fascio laser gaussiano diffrazione limitata illumina il campione perpendicolarmente all'asse di rilevamento. Fluorescenza viene rilevata sia plane-by-aereo o riga per riga. Durante l'acquisizione di un'immagine bidimensionale, solo un piccolo volume centrato sul piano focale dell'obiettivo rilevazione sperimenta gli effetti della luce di eccitazione. Il volume restante del campione non è illuminato, non contribuisce alla out-of-focus blur, non soffre di effetti fotografici tossico e non perde fluorofori a causa di foto-sbiancamento. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ep-together.within-page = "1"> figura 2
Figura 2: Il principio di basato foglio leggero microscopia in fluorescenza. In LSFM, illuminazione e rilevazione sono divise in almeno due percorsi ottici. Almeno un braccio illuminazione viene utilizzato per generare il foglio leggero (ciano), mentre almeno un braccio rivelazione è dotata di un filtro appropriato e una telecamera per la rilevazione parallela del segnale di fluorescenza (verde). LSFM ha due implementazioni canonici, il singolo (o selettiva) illuminazione piano microscopio (sfondo blu) e il microscopio digitalizzata foglio leggero laser digitale (sfondo rosso). Spostando il campione e il foglio leggero rispetto all'altro, immagini tridimensionali vengono acquisiti. Informazioni lungo più direzioni viene raccolto ruotando il campione intorno all'asse y, che è preferenzialmente orientata lungo gravità.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Tre tecniche di montaggio diversi utilizzati per la registrazione dello sviluppo embrionale di Tribolium con a base di tecnica LUCE microscopia a fluorescenza. (A) La colonna agarosio si riferisce ad un cilindro di acciaio con un piolino che spinge la colonna di agarosio, in cui l'embrione è incorporato, su un capillare di vetro. L'emisfero agarosio è montato su un tubo di acciaio. L'embrione è attaccato al polo dell'emisfero con una piccola quantità di agarosio. Il titolare ragnatela è un foglio di metallo con un foro asolato montato sulla parte superiore del cilindro in acciaio. L'embrione è incollata una sottile pellicola di agarosio che attraversa tha scanalato foro. (B) Schemi di tre tecniche di montaggio all'interno di un microscopio foglio leggero. (C) Le tre tecniche di montaggio applicate entro un DSLM. (D) immagini esemplificative da embrioni della linea transgenica Glia-blu registrato con i tre tecniche di montaggio. Gli embrioni, che sono al momento della comparsa di retrazione germband, sono indicati con la loro estremità posteriore orientato verso l'alto per abbinare le immagini chiare trasmissione. FM, la modalità di fluorescenza; ZA, sporgenza massima z con regolazione dell'intensità. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Imaging vivo di Tribolium embrioni. (A </ Strong>) Un embrione del AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linea al passaggio da retrazione germband alla chiusura dorsale. Questa linea presenta un modello enhancer trap espressione. Il segnale di fluorescenza si trova principalmente nel sierose, il sacco vitellino e alcuni gruppi di cellule neuronali. L'embrione è mostrato su un periodo di 15 ore con un intervallo di 5 ore. Le immagini mostrano dettaglio raggruppamenti cellulari nelle appendici testa. Inizialmente, i cluster sono ancora coperti dalle cellule sierose (prima colonna), al momento sierose rottura, le cellule seguire con il movimento di rotazione della testa. (B) stessa embrione mostrato durante la chiusura dorsale per 1:30 ore con un intervallo di 00:30 h. Le immagini di dettaglio mostrano la migrazione della sierosa rotto il sacco vitellino. (C) Top consecutive: Un embrione del AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linea nel passaggio da gastrulazione a germband allungamento. Medio e basso riga: aerei singole sono mostrati in due profondità per un periodo di 10:30 h con un intervallo 1:30h. (D) Un embrione della linea Glia-blu durante la retrazione germband mostrato un periodo di 50:30 h con un intervallo di 07:30 h. Le immagini di dettaglio mostrano la riorganizzazione morfogenetico delle cellule gliali nel lobo testa sinistra. ZA, sporgenza massima z con regolazione intensità; PA aereo singolo con regolazione dell'intensità. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: fissazione, colorazione, e Iimaging di WT embrioni durante Germband allungamento. Embrioni (A) colorati o con Sytox verde, cioè una macchia sfocata nucleare, o YOYO-1 ioduro o BOBO-3 ioduro, cioè due macchie busta nucleare. (B) YOYO-1 Embry ioduro macchiateo. Dettagli mostrano la cicatrice sierosa (prima colonna), l'involucro nucleare delle grandi cellule sierosa posteriori-ventrale (seconda colonna) o l'organizzazione del tessuto a tre strati del sierose, sacco amniotico e il tessuto embrionale effettivo (terzo al quinto colonna). (C) colorazione a due colori con YOYO-1 ioduro e falloidina 546. (D) colorazione a due colori con falloidina 488 e BOBO-3 ioduro. ZA, sporgenza massima z con regolazione dell'intensità. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Immagini di fissate e colorate transgenici embrioni dal AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 riga. Questa linea transgenica esprime mEmerald-labelEd histone2B (H2B) sotto il controllo del alfa-tubulina 1 promotore, che segna il nuclei / cromatina ubiquitariamente per l'intero sviluppo embrionale. L'embrione è stata ulteriormente trattata con Alexa Fluor 546 falloidina, che etichetta il citoscheletro actina / f-actina. ZA, sporgenza massima z con regolazione dell'intensità. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

criterio fluorescenza tipo microscopio
largo campo convenzionale scansione laser confocale luce foglio basati
configurazione lente obiettivo una lente obiettivo, medio-alto NA due lenti perpendicolarmente disposti oggettivi illuminazione: basso NA, rivelazione: elevata NA
la sorgente luminosa filtri sorgente di luce bianca e appropriate (ad esempio lampade a mercurio breve arco)
o LED-based con filtri puliti-up 		laser con filtro pulito-up
(Es diodo laser o DPPS) 		laser con filtro pulito-up
(Es diodo laser o DPPS)
illuminazione per immagine bidimensionale intero campione intero campione
(Scansione fascio gaussiano tipicamente bidimensionale) 		solo piano focale
(DSLM: scansione del fascio gaussiano monodimensionale)
rivelazione parallelo
(Tipicamente CCD o sCMOS fotocamera) 		sequenziale
(Tubo fotomoltiplicatore) 		parallelo
(Tipicamente CCD o SCMOS fotocamera)
velocità di esposizione veloci (millisecondi per immagine) lenti (secondi per immagine) veloci (millisecondi per immagine)
out-of-focus di fluorescenza nessuna discriminazione bloccato quasi completamente dal pinhole
(Efficienza rifiuto dipende dal diametro) 		quasi inesistente
(Solo per scattering)
dimensioni spaziali 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
ulteriori gradi di libertà 2
(Tempo, canale di fluorescenza) 		2
(Tempo, canale di fluorescenza) 		3
(Tempo, canale di fluorescenza, direzione)
risoluzione laterale r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0.4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
capacità sezionamento ottico No sì
(Discriminazione nel percorso di rilevamento) 		sì
(discriminazione nell'illuminazione percorso 75)
disponibilità e prezzo prevalentemente commerciale, a basso costo prevalentemente commerciale, costoso commerciale, costoso
custom-built, 54,59,60,75 moderata
pubblicazioni di imaging dal vivo che coprono embrioni Tribolium sei 44,76,77,78,79,80 sette 23,77,79,81,82,81
(spinning confocale disco) 83,84,85 		quattro 23,57,65,86

Tabella 1 - Caratteristiche dei FluorescenteLe tecniche nce Microscopia utilizzati in Tribolium vivono Imaging.

colorante colorazione diluizione
Sytox verde nuclei (sfocato) 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O e 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
YOYO-1 ioduro membrana nucleare 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O e 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
BOBO-3 ioduro membrana nucleare 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O e 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 488 falloidina actina citoscheletro 1: 100 (in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 546 falloidina actina citoscheletro

Tabella 2 - Colorazione Solutions.

colonna di agarosio
(opzione 1) 		emisfero
(opzione 2) 		titolare ragnatela
(opzione 3)
fondamento logico embrione viene incorporato in una colonna di agarosio che viene spinto fuori da un capillare estremità posteriore dell'embrione è incollata polo di un emisfero agarosio embrione viene incollato al film sottile agarosio attraversa un'asola
portacampioni cilindro di acciaio con perno tubo d'acciaio cilindro di acciaio con
asola
illimitata (qualsiasi) illimitata (qualsiasi) quattro (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
livello di abilità richiesto moderare alto Basso
agarosio intorno all'embrione alto Basso moderare
numero di embrioni per sessione fino a tre uno fino a sei
il recupero degli embrioni difficile facile facile
materiale monouso capillari di vetro - -
consigliato per immagini dal vivo a breve termine, embrioni macchiati A lungo termine immagini dal vivo immagini dal vivo a lungo termine, gli embrioni macchiati
<strong> Riferimenti tre 23,87,88 due 57,65 questa pubblicazione

Tabella 3 - Montaggio Metodi vantaggi e svantaggi.

aberrante induzione fenotipo fondamento logico passo riferimento (metodologica)
RNA interferenza embrionale RNA a doppio filamento viene iniettato in embrioni nella fase blastoderma sinciziale di knock-down uno o più geni specifici iniettare gli embrioni dopo la fase 4.8. due 33,81
RNA interferenza dei genitori RNA a doppio filamento viene iniettato lateralmente in femaLe pupe tra i segmenti addominali 3 e 4, che porta a gene knock-down nella progenie prendere le pupe dal punto 1.5. due 36,37
recessive embrionali linee mutanti letali culture ovaiole che portano una mutazione letale resa eterozigote embrionale recessiva circa il 25% omozigote mutante progenie attraversare la linea mutante in linea di imaging durante il Passo 1.5. tre 39,51,89
applicazione di fattori estrinseci alcuni fattori bioattivi o tossici estrinsecamente applicate agli embrioni aggiungendoli al buffer di imaging aggiungi fattore da buffer di immagini durante il Passo 2.2. due 83,85

Tabella 4 - LSFM Immagini dal vivo di aberrate Phenotypes

Tabella supplementare 1 - Metadati e dei parametri per il lungo termine i set di dati dal vivo imaging DS0001-0003. Cliccate qui per scaricare il file.

Film supplementare 1 - Imaging in diretta di un embrione Tribolium dal AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgenica Linea.
Questa linea presenta un modello enhancer trap espressione. Il segnale di fluorescenza si trova principalmente nel sierosa, il sacco vitellino e un sottogruppo di cellule neuronali. L'embrione è mostrata lungo quattro orientamenti da 00:00 a 66:00 h con un intervallo di 00:30 h tra i punti temporali. Il film comincia all'inizio di retrazione germband e termina una volta la chiusura dorsale è completato. Frame rate è di cinque fotogrammi al secondo. ZA,sporgenza massima z con regolazione dell'intensità. Cliccate qui per scaricare il file.

Film integrativa 2 - Imaging in diretta di un embrione Tribolium dal transgenico Linea Glia-blu.
L'embrione è mostrata lungo quattro orientamenti da 00:00 a 66:00 h con un intervallo di 00:30 h tra i punti temporali. Il film comincia all'inizio di retrazione germband e termina una volta la chiusura dorsale è completato. Frame rate è di cinque fotogrammi al secondo. ZA, sporgenza massima z con regolazione dell'intensità. Cliccate qui per scaricare il file.

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Discussion

Controllo di qualità

In saggi di imaging dal vivo, la procedura di preparazione e la registrazione deve essere non invasiva, ossia né la meccanica e manipolazione chimica (raccolta, dechorionation, il montaggio sul supporto del campione), né il carico energetico integrato durante l'osservazione dovrebbe influenzare la vitalità del campione. Per gli studi che caratterizzano lo sviluppo WT, si consiglia di utilizzare i dati solo da esperimenti in cui l'embrione sopravvive il processo di registrazione, viene recuperato con successo e si sviluppa in un adulto sano. L'adulto non deve presentare aberrazioni morfologiche, dovrebbe essere fertile e la sua progenie dovrebbe anche essere fertile. Ci sono tre ragioni principali per basso tasso di sopravvivenza, specialmente nei test di imaging dal vivo a lungo termine:

In primo luogo, la superficie embrione è stato trattato ampiamente con agarosio durante passaggio 7, che probabilmente ostacola ioni e gas scambio e costringe l'embrione meccancamente. embrioni affetti, soprattutto quando ripreso durante l'embriogenesi precoce, di solito sviluppano poco appariscente per diverse ore, arrestano improvvisamente e perdono il loro segnale di fluorescenza in fretta. Con una certa esperienza, la frazione superficie che è incorporato in agarosio utilizzando la tecnica emisfero può essere mantenuta al di sotto di un terzo, mentre con la tecnica titolare ragnatela, al massimo metà della superficie è ricoperta da un sottile strato di agarosio. In secondo luogo, il carico energetico integrato applicato al embrione supera la tolleranza. I valori indicati al punto 8.2 servire come regola generale, ma i seguenti criteri devono essere considerati: (i) gli embrioni durante lo sviluppo embrionale precoce non durano irradiazione del laser, così come gli embrioni durante lo sviluppo in ritardo embrionale, (ii) anche se l'energia integrata carico potrebbe essere identiche, maggiore potenza laser sia con tempo di esposizione inferiore o intervalli temporali più lunghi sembra essere più stressante di potenza del laser inferiore con un elevato tempo di esposizione o intervalli temporali più brevi, Lunghezze d'onda (iii) più elevati sono tipicamente meglio tollerati e (iv) per le linee transgeniche, il limite di tolleranza sembra essere linea-specifico, mentre la forza di espressione fluoroforo sembra essere inversamente proporzionale alla tolleranza irradiazione laser. Inoltre, il design della proteina di fusione e / o la localizzazione intracellulare anche svolgere un ruolo. In terzo luogo, l'embrione viene danneggiato durante il processo di montaggio. Il fattore più importante è che il tempo di incubazione nella soluzione di ipoclorito di sodio è breve come necessario per rimuovere completamente i corion. tempi di incubazione più lungo potrebbe danneggiare gli embrioni. Si deve anche fare attenzione a non forare o schiacciare gli embrioni con il pennello e per mantenere il supporto di agarosio ad una temperatura ambiente. embrioni danneggiati possono essere identificati durante il Passo 8.4 prima che il processo di imaging effettivo inizio, in modo che gli embrioni danneggiati possono essere sostituiti con quelli vitali.

Seguendo tali linee guida, tipicamente intorno 85-90% della Embryos sopravvivono la procedura di imaging dal vivo e si schiudono. Circa il 90% degli embrioni nati sviluppano in adulti sani e fertili. Il rapporto di sopravvivenza sembra essere indipendente dalla temperatura di imaging e tecniche di montaggio (quando la colonna di agarosio viene utilizzato per periodi di imaging di non più di mezza giornata), ma leggermente diminuisce con livelli elevati di irraggiamento laser. Come ulteriore controllo, in particolare durante la prima caratterizzazione delle linee transgeniche misura per fluorescenza imaging dal vivo o quadro istituisce fase come precursore per una sequenza sperimentale completo, si raccomanda di eseguire non immagini formate WT e embrioni transgenici in parallelo al ripreso embrioni, che vengono incubate alla stessa temperatura come l'embrione immaginata, e confronta il tempo di sviluppo e morfologia 65.

Inoltre, studi che caratterizzano fenotipi aberranti (Tabella 4) tramite imaging dal vivo dovrebbero eseguire una c non interessatoontrol embrione in parallelo. Si raccomanda di mantenere il trattamento di entrambi embrioni più possibile simili, ma questo deve essere considerato singolarmente per ogni strategia sperimentale:

Knock-down tramite RNA interference.

Interferenze RNA embrionale 33, 81, embrioni che derivano dalla stessa cultura ovodeposizione devono essere o iniettati con funzionale o controllare RNA a doppio filamento. Gli embrioni diversamente iniettati dovrebbero quindi essere ripreso contemporaneamente nella stessa LSFM utilizzando il colonna di agarosio o la tecnica titolare ragnatela. Interferenze RNA parentale 36, 37, la coltura di imaging dovrebbe essere diviso in due subcolture. pupe femmina di una subcoltura deve essere iniettato con il funzionale RNA a doppio filamento, mentre l'altra subcultura deve essere iniettato con controllo RNA a doppio filamento. embrione Collezione deve essere eseguita in parallelo, ed entrambi sperimentale e l'embrione controllo può essere ripreso contemporaneamente nello stesso microscopio utilizzando la colonna di agarosio o tecnica titolare ragnatela.

Recessivi embrionali linee mutanti letali.

Quando si lavora con recessive mutanti embrionali letali 39, 89, 91, 92, 93, una cultura deposizione delle uova di mutanti eterozigoti, normalmente fenotipicamente appariscente, produce teoricamente 25% di progenie omozigote mutante (ma a volte meno dovuti alla manipolazione pratica emette 89) e il 75% della progenie fenotipicamente nell'occhio (50% mutanti eterozigoti e 25% WT). Si raccomanda di utilizzare la tecnica titolare ragnatela montare diversi embrioni da tale coltura deposizione delle uova. I mutanti omozigoti possono essere identified tutto il corso delle immagini dalla manifestazione del fenotipo, mentre gli embrioni in via di sviluppo normalmente servono come controlli. Il genotipo dei campioni imaged può essere determinata una volta imaging e controllo di qualità sono completati.

L'applicazione di fattori estrinseci.

Se l'influenza di fattori estrinseci all'interno del buffer delle immagini 83, 85, ad esempio sostanze bioattive o tossiche, sullo sviluppo è indagato, imaging parallelo insieme con un embrione di controllo nella stessa LSFM non è tipicamente possibile. Pertanto, l'imaging deve essere effettuata sequenzialmente. In modo ottimale, il tempo tra esperimenti successivi al minimo e gli embrioni derivano dalla stessa cultura imaging. In alternativa, due identico costruito e LSFMs operati possono essere utilizzati. In questo caso, gli embrioni dello stesso periodo di deposizione delle uova devono essere utilizzati, ma è di grande importanza che the calibratura di entrambe microscopio viene condotta con cura in modo che le proprietà di imaging sono comparabili. Usando la tecnica titolare ragnatela, più embrioni per ciascuna condizione possono essere esposte in una volta. Con la tecnica della colonna agarosio, i fattori estrinseci potrebbero essere ostacolati dal raggiungere gli embrioni.

Limitazioni attuali della LSFM approccio di imaging dal vivo

LSFM è un potente strumento per analizzare morfogenesi embrionale non invasivo in molteplici dimensioni ampie scaglie. procedure operative standard, come proposto in questo protocollo, sosterranno il processo per stabilire la tecnologia foglio di luce come strumento standard nella biologia dello sviluppo. Tuttavia, l'approccio è limitato da una serie di fattori su diversi livelli sperimentali e organizzativi:

Inizialmente, LSFM stato sviluppato per analizzare un esemplare alla volta. Tutti gli attuali approcci quell'immagine due o più embrioni contemporaneamente nello stesso microscopio b y 'accatastamento' il campione lungo l'asse y sulla colonna di agarosio o gli indirizzi titolare ragnatela questo problema solo in una certa misura. Configurazioni multi-bene Plate e coprioggetto-based sono disponibili 94, 95, 96. Tuttavia, essi soffrono di una ridotta qualità d'immagine e sacrificano alcuni dei vantaggi essenziali da LSFM, come l'imaging lungo molteplici direzioni. Attualmente, la soluzione migliore è quella di lavorare con più microscopi in parallelo, che diventa ragionevolmente fattibile quando i componenti costosi, come il laser, sono condivisi 60.

Con l'EFA-nGFP 57, 65, 84, il FNL 86, il Brainy 58, 86, l'AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, l'AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 e la Glia-blu= "xref"> 58, solo sei linee transgeniche su misura adatte per l'imaging dal vivo a lungo termine sono attualmente disponibili. Inoltre, la HC079 (amnion), G12424 (sierosa) e G04609 (cuore) enhancer trap linee 51 sono state caratterizzate con LSFM 23. In alternativa, gli embrioni fluorescenti possono anche essere generati da mRNA 81 o tintura iniezione 79, questi approcci sono relativamente semplici, ma anche soffrono di limitazioni 86. Diversi altri standard sono ancora necessari quali linee cytoskeletal-, organelle- e membrana marcati o linee che esprimono fluorofori in determinate promotori non onnipresenti per osservare solo alcuni organi o tessuti. Idealmente, tali linee sono disponibili con proteine ​​fluorescenti differenti anche.

Un'altra sfida è il volume di dati generato da LSFM. A causa di acquisizione di informazioni in tre dimensioni spaziali e almeno tre fugradi di libertà rther (tempo, direzione, canale di fluorescenza), la dimensione del set di dati di imaging vivi possono raggiungere facilmente molti gigabyte a qualche terabyte. Anche dopo ritaglio tridimensionale e compressione ZIP basata dei contenitori TIFF, i tre gruppi di dati esemplificative associati a questo studio hanno dimensioni di 31,6, 12,6 e 45,1 gigabyte, cioè 89,3 Gigabyte in totale. Quando si lavora con LSFM, è necessario disporre la rispettiva infrastruttura di memorizzazione e trattamento 88, 97 di dati.

La qualità dell'immagine massimo è ottenuto sulla superficie dell'embrione, ma con l'aumentare della profondità, il segnale di fluorescenza diventa sempre più sfocata. Ad esempio, l'estremità posteriore della germband viene coperto dal sacco vitellino volte durante gastrulazione e non possono essere adeguatamente risolto (Figura 4C, prima alla quinta colonna). Imaging lungo più direzioni risolve questo problema almeno partebuona resa - informazioni di alta qualità dalla superficie tutto l'embrione è disponibile, ma le regioni interne rimangono sfocato. Attualmente, esistono soluzioni soddisfacenti sono disponibili, ma a lungo andare, proteine fluorescenti infrarossi 98, approcci genetici 99 o sistemazioni microscopio con ottica adattativa 100 potrebbero essere considerati.

Adattamento per altre specie

Ormai, LSFM è stato usato per documentare lo sviluppo embrionale di tre specie di insetti, cioè il frutto Drosophila melanogaster 61, 62, 101, la presa d'aria volare Megaselia abdita 102 e il rosso farina coleottero Tribolium castaneum 57. Il quadro sperimentale, le procedure operative standard e tecniche di montaggio qui descritte Should essere facilmente adattabile ad altre specie di insetti. Protocolli di trasformazione germinali per molti insetti appartenenti a vari ordini sono disponibili 103, comprese le specie di importanza economica e / o medica, come l'ape 104, diversi lepidotteri 105, 106 o più specie di zanzara 107, 108, 109. A rispettive linee transgeniche adatti per fluorescenza imaging dal vivo, la morfogenesi embrionale di insetti può essere caratterizzata pur considerando loro linee evolutive e / o nicchie ecologiche. Circa un milione di specie di insetti sono stati descritti e altri venti milioni di specie di insetti molto probabilmente esistono 110, che copre più di 400 milioni di anni di evoluzione 2. Solo l'approccio comparativo genera informazioni che a loro volta provides intuizioni che non possono essere ottenuti attraverso lo studio dei principi di sviluppo del solo una singola specie.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Autore Contributi

FS e EHKS concepito la ricerca. FS generato delle linee transgeniche AGOC. imaging di fluorescenza fogli a base di luce è stato eseguito da FS e SK. FS e EHKS ha scritto il manoscritto con il contributo di SK.

Acknowledgments

Ringraziamo Sven Plath per il supporto tecnico. La linea transgenica Glia-blu era un gentile dono da Gregor Bucher (Göttingen, Germania). La ricerca è stata finanziata dal Cluster of Excellence Francoforte sul Meno per complessi macromolecolari (CEF-MC, EXC 115, altoparlante Volker Dötsch) concesso in parte alla EHKS presso l'Istituto Buchmann molecolare Scienze della Vita (BMLS, direttore Enrico Schleiff) presso il Goethe Universität Frankfurt am Main dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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Biologia dello Sviluppo Numero 122 Artropode insetti coleotteri, Morfogenesi embriogenesi non invasivo lungo termine fluorescenza imaging dal vivo foglio basata luce microscopia a fluorescenza microscopia ottica tridimensionale LSFM DSLM SPIM
Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni
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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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