Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Lys Sheet-basert Fluorescensmikroskopi of Living eller fikseres og farges Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Avbilde morfogenesen av insekt embryoer med lys ark-baserte fluorescens mikroskopi har blitt state of the art. Denne protokollen skisserer og sammenligner tre monterings teknikker som passer for Tribolium castaneum embryoer, introduserer to nye spesiallagde transgene linjer godt egnet for direkte avbildning, diskuterer vesentlige kvalitetskontroller og viser nåværende eksperimentelle begrensninger.

Abstract

Den røde mel bille Tribolium castaneum har blitt en viktig insekt modellorganisme i utviklings genetikk og evolusjonær utviklingsbiologi. Observasjonen av Tribolium embryoer med lys ark-baserte fluorescens mikroskopi har flere fordeler fremfor konvensjonelle vidfelt og konfokal fluorescens mikroskopi. På grunn av de unike egenskapene til en lett platebasert mikroskop, kan tredimensjonale bilder av levende eksemplarer tas opp med høye signal-til-støy-forhold og betydelig redusert foto-bleking, så vel som fototoksisitet langs flere retninger over perioder som varer flere dager. Med mer enn fire år med metodeutvikling og en kontinuerlig økning av data, synes tiden hensiktsmessig å etablere standard driftsprosedyrer for bruk av lys ark teknologi i Tribolium samfunnet så vel som i insektet samfunnet for øvrig. Denne protokollen beskriver tre monteringsteknikker som er egnet feller ulike formål, presenterer to nye spesiallagde transgene linjer Tribolium egnet for langvarig direkte avbildning, antyder fem fluorescerende fargestoffer å merke intracellulære strukturer av faste embryoer og gir informasjon om dataetterbehandling for rettidig evaluering av de registrerte data. Representative resultater konsentrere seg om langtids direkte avbildning, optisk seksjonering og observasjon av den samme embryoet langs flere retninger. De respektive datasettene blir tilveiebragt som et nedlastbart ressurs. Endelig omhandler den protokoll kvalitetskontroller for levende billeddannende analyser, nåværende begrensninger og anvendeligheten av de skisserte fremgangsmåter til andre insektarter.

Denne protokollen er primært beregnet for utviklings biologer som søker bildeløsninger som overgår standard laboratorieutstyr. Det fremmer den kontinuerlige forsøk på å lukke gapet mellom de teknisk orientert laboratorier / samfunn, som utvikler og raffinere mikrokopiere metodisk, og life science laboratorier / lokalsamfunn, som krever 'plug-and-play' løsninger på tekniske utfordringer. Videre støtter det et aksiomatisk tilnærming som beveger de biologiske spørsmålene i sentrum for oppmerksomheten.

Introduction

Den røde mel bille Tribolium castaneum, som tilhører den store familien av Darkling biller (Tenebrionidae), har en lang historie innenfor landbruket og biovitenskap, og er den nest beste studerte modellen insekt modellorganisme etter bananflue Drosophila melanogaster. I løpet av de siste fire tiår, ble det et kraftig og populært insekt modellorganisme i utviklingsgenetikk, i evolusjonær utviklingsbiologi, og i løpet av de siste tjue årene, i embryonale morphogenesis for en rekke årsaker:

Drosophila og Tribolium begge tilhører Holometabola, men splittet omtrent 300 millioner år siden 1, 2, 3, 4. Mens den embryoutvikling av Drosophila blir vanligvis betraktet som høyt avledet viser Tribolium en mer anen måte utviklling som er funnet i en betydelig større andel av insektarter 5, 6, 7, 8, 9. For det første oppviser Tribolium ikke-involusjon hode utvikling, det vil si dens munn og antenner oppstår allerede i løpet av embryogenesen 10, 11, 12, 13, 14, 15. Dernest følger Tribolium prinsippene for kort-bakterie utvikling, det vil si mage segmenter legges sekvensielt fra en bakre vekst sone under germband forlengelse 16, 17, 18, 19. For det tredje, utvikler Tribolium og senere degraderesto ekstra-embryonale membraner dvs. amnion, som dekker embryo bare ventrally, og serosa, som omslutter fosteret helt 20, 21, 22. Begge membraner spille en avgjørende morfogenetisk 23, så vel som beskyttende rolle mot mikroorganismer 24, 25 og 26 uttørking. For det fjerde, de embryonically utviklings beina er fullt funksjonell under larve livsfase og tjene som primordia for voksne bena under pupal metamorfose 27, 28, 29, 30, 31.

På grunn av sin lille størrelse og beskjedne krav, dyrking av Tribolium i laboratoriet er ganske grei. Kulturer av villtype (WT) stammer eller transgene linjer vil typisk bestå av rundt 100 til 300 voksne og kan holdes innenfor en-liters glassflasker (footprint 80 cm2) fylt tre til fire centimeter høye (ca. 50 g) med vekstmedium som består av hel hvete mel supplert med inaktive tørrgjær. En vanntilførsel er ikke nødvendig. Dette gjør at selv små laboratorier for å holde dusinvis av bille kulturer innen små- eller mellomstore kommersielt tilgjengelige insekt inkubatorer. Senere utviklingsstadier av Tribolium (larver etter omtrent fjerde stadium, puppe og voksne) er lett skilles fra vekstmediet ved sikting. Synkroniserte embryoer blir oppnådd ved å inkubere voksne for korte perioder på egg-leggende medium. For rask utvikling, blir bille kulturene holdt ved 32 ° C (ca. fire uker per generasjon), mens lagerholdet blir typisk utført ved 22-25 ° C (omtrent ti uker pr generasjon).

Innenfor det siste tiåret, mange standard techniques er blitt tilpasset gradvis og optimalisert for Tribolium, som oppsummert i vekstmodellorganismer bøker 32. Av stor betydning er avanserte genetiske fremgangsmåter så som embryonal 33, larve- 34, 35 eller foreldre 36, 37 RNA interferens-baserte gen knockdown, kimlinje transformasjon med enten piggyBac 38, 39 eller den Minos 40 transposase system og CRISPR / Cas9-baserte genom ingeniør 41. Videre er Tribolium genomet blitt sekvensert omtrent ti år siden 42, og er nå i den tredje runden av genomet sammenstillingen frigjøre 43, som tillater effektiv og genom-bred identifikasjon og systematisk analyse av gener 44 45, 46. I tillegg genomene til fire andre billearter er tilgjengelige for sammenlignings genetiske tilnærminger 47, 48, 49, 50. I forbindelse med det sekvenserte genomet, har to store genetiske analyser er utført, det vil si en innskuddsmutagenese skjerm 51 og en systematisk RNA interferens-baserte gen knockdown skjerm 52, 53.

Fluorescens direkte avbildning med Vidfelt, konfokalt eller lys platebasert mikroskopi (LSFM) gjør det mulig å observere den embryoniske morfologien til Tribolium som en funksjon av tid (dvs. morphogenesis) i en flerdimensjonal sammenheng (tabell 1). I Vidfelt og konfokal fluorescens mikroskopi, den Excitasjon og emisjon lys blir ledet gjennom den samme objektivlinsen. I begge tilnærminger, er hele prøven opplyst for hver registrert todimensjonalt plan. Derfor blir prøvene utsettes for meget høyt energinivå. I LSFM, bare fluoroforene i fokalplanet er spent på grunn av frakobling av belysning og deteksjon ved hjelp av to perpendikulært anordnede objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i to canonic implementeringer - den eneste plan belysning mikroskop (SPIM) og det digitale skannede laserlys platebasert fluorescens mikroskop (DSLM, figur 2) - og gir flere viktige fordeler i forhold til tradisjonelle fremgangsmåter: (i) indre optisk seksjonering evne, (ii) god aksiell oppløsning, (iii) sterkt redusert nivå av foto-bleking, (iv) svært lav bilde-toksisitet, (v) høyt signal-til-støy-forhold, (vi) relativt høye anskaffelses hastighet, (vii) avbildning langs flere retninger, og (ivii) dypere vev penetrering på grunn av bruken av lave numeriske apertur belysningsobjektivlinser 54, 55, 56.

LSFM har allerede blitt brukt i Tribolium å dokumentere nesten hele den embryoniske morphogenesis 57 og for å analysere prinsippene for ekstra-embryonale membranen briste ved begynnelsen av dorsal lokket 23. For å heve attraktivitet LSFM i Tribolium samfunnet og for insekt vitenskap generelt, er det av stor betydning å etablere standard operasjonsprosedyrer og forbedre metoder, protokoller og pool av ressurser til et nivå hvor mikroskop blir en ease-of -Bruke standard verktøy i utviklingsbiologi laboratorier, og de biologiske spørsmål bo i sentrum for oppmerksomheten.

Denne protokollen begynner med det grunnleggende Tribolium </ em> dyrking, dvs. vedlikehold, reproduksjon og embryo samlingen. Deretter ble to eksperimentelle strategier vist nedenfor: (i) levende avbildning av skreddersydde transgene linjer og (ii) bildedannelse av faste embryoer som var farget med fluorescerende fargestoffer (tabell 2). Deretter blir tre monteringsteknikker med litt forskjellige formål forklart i detalj (Figur 3 og Tabell 3): (i) agarose kolonne, (ii) den agarose halvkule og (iii) den nye spindelvev holderen. Protokollen forklarer deretter datainnhentingsprosedyre med LSFM. Bildediagnostikk og viktige hensyn er skissert. Til slutt blir embryo gjenfinning forklart og forslag til basisdatabehandlings er gitt. I de representative resultater, direkte avbildning av data fra to nye skreddersydd og glia-blå 58 transgene linjer er vist og de respektive avbildningsdatasett er tilveiebragt som et nedlastbart ressurs. I tillegg imagedata for faste embryoer som var farget med en rekke av fluorescens-fargestoffer er angitt. Diskusjonen fokuserer på kvalitetskontroll, aktuelle begrensningene ved direkte avbildning tilnærming og tilpasning av protokollen til andre arter.

Protokollen er skrevet for å lette ark-baserte fluorescensmikroskoper som er utstyrt med et prøvekammer og en roterbar klemmeinnretning for standardiserte prøveholdere 54, 59, 60, som er typisk sylinderformede elementer fremstilt av metall, plast eller glass med en diameter i millimeterområdet. Protokollen er også egnet for både canonic implementeringer, dvs. SPIM og DSLM, så vel som for oppsett med to eller flere belysnings og deteksjonsarmene 61, 62, 63. De representative resultater viser data i to spektrale kanaler, grønn (illumination med en 488 nm laser, deteksjon gjennom et båndpassfilter 525/50) og rød (belysning med en 561 nm laser, deteksjon gjennom et båndpassfilter 607/70), men protokollen kan utvides til tre eller fire spektralkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Husbandry av Tribolium kulturer

MERK: Standard betingelser er definert som en inkubasjonstemperatur på 25 ° C og 70% relativ fuktighet i en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus. For mer informasjon om Tribolium reindrift, respektive retningslinjer er tilgjengelige 64. Denne protokollen krever to forskjellige mel baserte medier, som kan fremstilles i kilogrammengder, og som er lagret i flere måneder.

  1. Før arbeid med mel og inaktive tørrgjær, lagre de uåpnede pakkene ved -20 ° C i 24 timer og deretter la dem varmes opp til romtemperatur. Denne prosedyren eliminerer potensielle patogener.
  2. Passere hele korn hvetemel og aktiv tørrgjær gjennom en sikt med 710 um maskestørrelse, deretter fremstille vekstmedium ved å supplere det siktede hele korn mel med 5% (vekt / vekt) siktet aktiv tørrgjær.
  3. Pass 405 fint hvetemel og inaktive tørrgjær gjennom en sil med 250 & #181; m maskevidde, og deretter fremstille egg-leggende medium ved å supplere det siktede 405 fint hvetemel med 5% (vekt / vekt) siktet aktiv tørrgjær.
  4. Passere den respektive Tribolium kulturen igjennom en sikt med maskevidde 800 pm maskevidde. Kast leftvekstmediet. Overfør larver, puppe og voksne til et stort glassfat.
  5. Hvis ingen avkom kultur eksisterer, overføre rundt 80 larver og / eller puppe til en ny glassflaske for å etablere et nytt avkom kultur. Hvis ingen larver og / eller puppe er til stede, ta rundt 40 voksne i stedet. Tilsett 50 g av vekstmedium og inkuberes under standardbetingelser.
  6. Samle rundt 300 voksne (500-700 mg) i en annen ny glassflaske for å etablere den billeddannende kultur. Tilsett 50 g av vekstmedium og inkuberes under standardbetingelser. Tillat den billeddannende kultur for å sedimentere i minst 24 timer i friskt vekstmedium før fosteret samling.
  7. Erstatte vekstmediet på bildekulturen minst hver to vieks, noe som kan gjøres i forbindelse med embryo samlingen (se 3.2). Etter to-tre måneder, bytt bildekulturen helt med nye voksne fra avkom kultur.
  8. Hvis en ikke-homozygot transgen linje anvendes, bearbeide etterkommer kulturene ofte ved å fjerne ikke-transgene dyr. Ideelt sett generere homozygote linjer hvis det respektive transgenet ikke er dødelig eller forårsaker sterilitet når de er tilstede på begge kromosomer. Homozygot kulturer har typisk en høyere gjennomsnittlig fluorescens nivå og den samlede forsøksbetingelsene er smalere, da bare en genotype er til stede.

2. Mikroskop Kalibrerings

MERK: Tribolium embryo har en anterior-posterior lengde på omtrent 600 til 660 um og en tverrgående diameter på omkring 300-330 pm. De fleste moderne CCD-kameraer har en sensorbrikke størrelse på ca. 9 mm x 7 mm, dvs. en diameter på 11,4 mikrometer, og en piksel-pixel avstand på 6,45 um.Når kombinert med en 10X forstørrelse objektivlinsen, kan embryoet avbildes in toto med en piksel stigning på 0,645 um. De fleste moderne sCMOS kameraer har en større sensorbrikke størrelse på omtrent 16 mm x 14 mm, dvs. en diameter på 21,3 mikrometer, og en piksel-pixel avstand på 6,5 pm. Når kombinert med en 20X forstørrelse objektivlinsen, kan embryoet avbildes in toto med en piksel stigning på 0,325 um.

  1. Fest belysning og deteksjon objektivlinser til mikroskopet. Sikre at lasere og fluorescens filtrert ut fluoroforen absorpsjons- og emisjonsspektra meget godt.
  2. Fest prøvekammeret til mikroskopet. Fylle prøvekammeret med PBS pH 7,4 eller en hvilken som helst annen passende avbildnings buffer.
  3. Slå på og kalibrere mikroskop. Omfattende kalibrering rutiner og retningslinjer for feilsøking for spesialbygde lys ark-basert mikroskoper (mer spesifikt for DSLM implementering) har blitt publisert previously 65. For kommersielle enheter, følger produsentens anvisninger nøye. Mishandling kan utarme prøvekammeret av mediet og føre til ødeleggelse til instrumentet så vel som prøven.

3. Innsamling av transgene eller WT Embryoet

  1. Bestå avbildning kolonien gjennom en sikt med 800 um maskevidde. Samle voksen biller i en ny glassflaske og tilsett 10 g av eggleggingen medium. Inkuber eggleggingen kultur i 1 time ved 25 ° C og 70% relativ fuktighet i lys.
  2. Bestå eggleggingen kulturen gjennom en sikt med 800 um maskestørrelse for å skille voksne fra eggleggingen medium, som inneholder rundt 30 til 100 embryoer. Overfør voksne til en ny glassflaske og legge til enten den gamle eller 50 g friskt vekstmedium.
  3. Ved observasjon skulle starte med uniform blastoderm trinnet (eksempel datasett DS0002), inkuber eggleggingen medium i 15 timer ved 25 ° C og 70% relativ fuktighet. To starter ved begynnelsen av germband tilbaketrekkings (f.eks datasett DS0001 og DS0003), inkuber embryoer i 23 timer ved 32 ° C og 70% relativ fuktighet. Hvis andre utviklingsstadier er ønsket, refereres til de respektive litteraturen 64, 65 og tilpasse inkubasjonstid og / eller temperaturen som er nødvendig.

4. Embryo Dechorionation

MERK: chorion er det ytre laget av eggeskallet og består av proteiner og polysakkarider. Det er sterkt lys absorberende, men ikke avgjørende for riktig utvikling og kan dermed være kjemisk fjernet.

  1. Bestå eggleggingen medium gjennom en sikt med 300 pm maskevidde. Samle embryoene i et cellefilter med 100 pm maskevidde og kast left eggleggingen medium.
  2. Fremstill en 6-brønns plate som følger: fyll A1, A2, A3 og B3 brønner med 10 ml PBS, pH 7,4, og B1 og B2 brønner med 9 ml PBS. Deretter legger nøye1 ml natriumhypokloritt til B1 og B2. Observere utviklingen av trinn 4,3 til 4,8 under stereomikroskop. FORSIKTIG natriumhypokloritt er etsende.
  3. Sett cellefilter inn i A1 brønn (PBS, pH 7,4) og vaskes embryoene i ett minutt under forsiktig omrøring. Større mel partikler skal løsne fra embryoer.
  4. Overfør celle sil til den B1 brønn (natriumhypokloritt i PBS pH 7,4) og rist platen kraftig i 30 sekunder. De resterende mel-partiklene skal løsne helt fra embryoer.
  5. Overfør celle sil til A2 brønn (PBS, pH 7,4) og vaskes embryoene i 1 minutt under forsiktig omrøring.
  6. For dechorionation, overføre celle sil til B2 brønn (natriumhypokloritt i PBS pH 7,4). Rist platen kraftig til chorion brister og løsner fra embryoer. Chorion ser ut som en tynn, semi-transparent membran med Opprevne kanter, mens dechorionated embryoer har en vanlig silhuett.
  7. Overfør the celle sil til A3 brønn (PBS, pH 7,4) og vaskes embryoene i 1 minutt under forsiktig omrøring. Dersom noen Chorion fragmentene blir fortsatt festet til embryoene etter vaskingen, gjenta trinn 4.6.
  8. Oppbevar embryoene i B3 brønn (PBS, pH 7,4). Lagring i flere timer ikke skader embryoene, men husk at utviklingen fortsetter.
  9. For ikke-homozygote transgene linjer, fjerne alle ikke-fluorescerende embryoer hvis mulig. For fiksering og farging av WT eller transgene embryoer, fortsett med trinn 5. direkte avbildning av transgene embryoer, fortsett med trinn 6.

5. vitelline membran Permeabilization, Fiksering og farging

MERK: vitelline Membranen er det indre laget av eggeskallet. Det er ugjennomtrengelig for fluorescerende fargestoffer og således må være kjemisk permeabilisert før farging.

  1. Fyll en scintillasjonskyvette med fiksering / permeabilisering-løsning (1,5 ml 4% (w / v) paraformaldehyd i PBS, pH 6,9 ennd 1,5 ml n-heptan). Overfør embryoer med en malerkost til ampullene. Dekk til ampuller med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys fluoroforer og inkuber i 30 minutter på en risteplattform 50 omdreininger i minuttet. FORSIKTIG paraformaldehyd er giftig og etsende, n-heptan er brennbart og giftig.
  2. Fjern fikseringsløsning og behandle embryoer tre ganger i 15 minutter i 3 ml 0,1% (v / v) Triton X-100 i PBS, pH 7,4, og deretter en gang i 15 minutter i 3 ml 1% (v / v) Triton X-100 i PBS, pH 7,4 på en gyngende plattform ved 50 omdreininger i minuttet. FORSIKTIG Triton X-100 er etsende.
  3. Fjern permeabiliseringen løsning og tilsett 0,5 ml farvestoff oppløsning til flasken. Eksempelvise, fargeløsninger er gitt i tabell 2. Flekk-embryoer over natten ved 4 ° C på en risteplattform 50 omdreininger i minuttet. For de fargestoffer som foreslås i tabell 2, er vasking ikke er nødvendig.

6. Fremstilling av Montering Agarose

  1. Tilsett 1 g lavt smelteagarose i 100 ml PBS, pH 7,4, og blandingen oppvarmes i 2-3 min i en mikrobølgeovn ved 800 W. Hvis små partikler agarose er fortsatt til stede, gjentar oppvarmingsprosessen i 30 sek intervaller inntil partiklene oppløses fullstendig. Monterings agarose trenger ikke å fremstilles friskt hver gang, den størknede agarose kan gjen gjort flytende ved oppvarming som beskrevet ovenfor. Denne prosessen kan gjentas 5-6 ganger før for mye vann har fordampet.
  2. Tillat den agarose for å kjøle seg ned til ca. 40-45 ° C, og deretter fylle to 1,5 ml reaksjonsrørene med den oppvarmede agarose og holde disse rør ved 35 ° C i en termo.

7. Embryo Montering og innsetting inn i prøvekammeret

  1. Alternativ 1: agarosekolonnen (figur 3A-C, første kolonne, tabell 3, andre kolonne)
    1. Fyll en 1,0 ml sprøyte med destillert vann og feste den til en av glass-kapillarelementene åpningene ved hjelp av en liten gummislange.Fyll kapillær halvveis med destillert vann.
    2. Pick et embryo med en pensel og plassere den på den indre siden av den andre glass kapillær åpning. Gå raskt til neste trinn før embryoet tørker ut.
    3. Stikk kapillær i væsken agarose og langsomt trekke noen ul av væske agarose langs embryoet inn i kapillaren. Deretter raskt øke den trekkraft, slik at embryoet er dratt sammen med agarose. Til slutt skal noen få mL av agarose være over og under embryo. Sett kapillær side for et par minutter og la agarose stivne.
    4. Forkorte kapillar med en diamantkutter glass til en lengde på omtrent 5 mm. Det gjenværende fragment skal bli helt fylt med agarose og embryoet bør være innenfor det andre kvartil.
    5. Sett stålsylinder med tappen inn i prøvekammeret, og så holde den kapillære fragmentet på toppen av tappen. Den agarosekolonne skal stikke noen få millimeter fROM-kapillæret fragmentet med den delen som inneholder embryo.
  2. Alternativ 2: Agarose halvkule (figur 3A-C, andre kolonne, tabell 3, tredje kolonne)
    1. Tegn 200 ul væske agarose inn i en 1,0 ml sprøyte, og deretter bruke den til å fylle stålrøret fra toppen med agarose til en halvkule former i bunnåpningen. Den halvkule diameter bør være lik rørdiameteren. Vent noen minutter før agarose har størknet.
    2. Plukk et embryo med en pensel og omorganisere det på spissen av penselen slik at fremre enden blir tilgjengelig. Dypp agarose halvkule inn i væske agarose for å dekke den med en tynn film.
    3. Plasser embryo med sin fremre ende oppreist på polen på agarose halvkule. Snu stålrør rundt og korrigere plasseringen av embryo med børsten. Hvis det er nødvendig, å stabilisere embryo ved å tilsette 2 ul agarose til embryoet / halvkule grensen. Ideally, bør mindre enn halvparten av embryoet flaten dekkes i agarose, og kantene bør være så bratt som mulig.
    4. Sett stålrøret med den halvkule og embryoet sakte inn i prøvekammeret.
  3. Alternativ 3: spindelvev holderen (figur 3A-C, tredje kolonne, tabell 3, fjerde kolonne)
    1. Plukk et embryo med en pensel og sett den til side.
    2. Dekk slissede hull av den spindelvev holderen med 5-8 ul væske agarose, deretter fjerne det meste av agarose til bare en tynn film agarose gjenstår.
    3. Plasser embryoet på agarose film og justere sin posisjon. Flytt forsiktig embryoet på x-aksen midten av det avlange hull, og justere dens langstrakte anterior-posterior-aksen med den langstrakte aksen til det slissede hull.
    4. Sett spindelvev holderen med montert embryo sakte inn i prøvekammeret. Plasser spindelvev holderen slik at den ikke kommer i konflikt med eksitasjon og emisjonlys, det vil si 45 ° i forhold til x- og z-aksen.

8. Lys Sheet baserte Fluorescensmikroskopi

  1. Bestemmer sammen hvor mange retninger (og langs hvilke retninger) embryoet skal avbildes. Fire retninger (langs retningene 0 °, 90 °, 180 ° og 270 °) gir vanligvis en god avveining mellom dekning og energi belastning.
  2. Sett opp antall fluorescens kanaler. De viktigste parametere for hver kanal er laserlinjen, fluorescens filter, lasereffekten og eksponeringstiden. For langsiktig levende bildediagnostikk, er det viktig at den integrerte energibelastning ikke overskrider toleransen av embryoet. En eksponeringstid på 25-50 ms sikrer hurtig avbildning, mens en lasereffekten mellom 100 og 300 pW ikke påvirker levedyktigheten av embryoet. For faste prøver, eksponeringstid og lasereffekten kan i det minste fordoblet.
  3. For live bildeanalyser, konfigurere tid forfalle. komplete embryogenese av Tribolium tar omtrent syv dager ved romtemperatur (23 ± 1 ° C) og et litt mindre enn tre dager ved 32-35 ° C 64. Definere den tidsbestemte intervallet i henhold til de morfogenetiske hendelsene som skal følges. For korte tidsbestemte intervaller, vurdere å senke eksponeringstid og lasereffekt (se 8.2).
  4. Plasser embryo i sendemodus lys langs x- og y-aksen inn i sentrum av synsfeltet uten å utsette det for laseren. Roter embryo ved 360 ° i trinn på 90 ° for å undersøke embryo for skader som kunne ha forekommet i løpet av monteringsprosessen.
  5. Roter embryo hensiktsmessig rundt y-aksen for å justere embryoniske aksene med mikroskopet akser, for eksempel tverraksen med x-aksen, det vil si dorsoventral akse med z-aksen. Ved bruk av spindelvev holder teknikken, kan justeringen ikke være mulig.
  6. definere den z-stabelen fo i fluorescens modusr hver retning. Legg 25-50 um som romlig buffer foran og bak embryoet. Inkludert buffer, typisk z-stabel dekker ca. 350-400 mikrometer for en Tribolium embryo. Også definere den z-avstand, som bør være fire ganger den sideveis avstand, dvs. avstanden langs x- og y-aksene 66.
  7. Hvis to eller flere embryoer er avbildet i parallell, starter på 8,4 med neste embryo.
  8. For langtids avbildning, sikre at prøvekammeret er fylt med tilstrekkelig PBS pH 7,4 eller annet bildebuffer. dekker også prøvekammeråpningen.
  9. Start bildeprosessen. For langvarig direkte avbildning, å overvåke den korrekte anskaffelses langs alle retninger i alle kanaler for alle embryoer. Av og sjekke i løpet av de neste dagene at embryoene er i live og i riktig posisjon.

9. Embryo henting og kvalitetskontroll

  1. Når avbildning er fullført, fjernes prøveholderen medembryoene fra prøvekammeret. Bare embryoer fra levende billeddannende analyser må hentes. Faste og farget embryo kan bli forkastet.
  2. Hvis en direkte avbildning analysen ble utført, overfører den embryo til en gjenstand lysbilde. For agarosekolonne teknikk, trekke ut embryoene fra den omgivende agarose med en skalpell, mikro-kniv eller barberblad. For agarosen halvkule teknikk, overføre halvkule med den flate siden til objektet lysbildet. Embryo fjerning er ikke nødvendig. For spindelvev holderen teknikk, forsiktig demontere embryoene fra agarosen film med en pensel. Inkuber objekt sleiden i et lite glass skål i mettet fuktig atmosfære under standardbetingelser før larvene luke.
  3. Etter klekking, overføre larvene til individuelle brønner i en 24-brønners plate og tilsett 500 mg av vekstmedium til hver brønn. Inkuber under standardbetingelser. Sammenligne den totale utviklingstiden og morfologi avbildes larvene til ikke-avbildes WT og transgene Larvae (se diskusjon). I analysene som karakteriserer WT utvikling, bør ingen åpen morfologiske avvik ideelt sett være merkbar.
  4. Når larvene utvikle seg til friske voksne, gi dem passende WT partnere av samme bakgrunn belastning. Etter to uker, sjekk for etterkommerproduksjon. Vurder også for å kontrollere fruktbarhet av avkommet ved å parre dem inter pares. Bare når de avbildes embryoene utvikle seg til voksne frukt som produserer frukt avkom, kan avbildningsprosedyren bli betraktet som ikke-invasiv.

10. Image Data Processing

MERK: For bilde databehandling, er open-source bildebehandling ImageJ 67 eller dens deriverte FIJI 68 anbefales. Begge versjoner samt omfattende dokumentasjon finnes på www.imagej.net. Den standard filformat for LSFM data er Tagged Image File Format (TIFF). Den indre beholder alternativet kan storage av bildestakker som z-stabler eller tidsserie av z maksimale fremspringene i en enkelt fil som kan åpnes i ImageJ eller fiji via dra-og-slipp.

  1. Hvis det er nødvendig, dreie z-stabler for å justere anterior-posterior aksen av embryoet med y-aksen (bilde → Transformer → Roter). Vær oppmerksom på at rotasjonsparametre må innstilles individuelt for hver retning, men ikke for tidsforløpet og fluorescens kanaler.
  2. Beskjære z-stabler langs x-, y- og z-akser, slik at bare minimal bakgrunns (20 - 40 piksler langs x- og y-aksene, 5 - 10 plan langs z-aksen) forblir (for x- - og y-aksene, bruker rektangulær markering verktøyet, kan bilde → avlingen, for z-aksen, bruke Bilde → Søyler → Verktøy → Slice keeper). Vær oppmerksom på at beskjærings parametre må settes individuelt for hver retning, men ikke for de tidspunkter og fluorescens kanaler.
  3. Beregn z maksimalt fremspring for hver z-stabel(Bilde → Stabler → Z Project, velger Max intensitet). Intensitet projeksjons beregninger er data forenklingsfremgangsmåter som fjerner en romlig dimensjon.
  4. For langtids direkte avbildning av data, vurdere å bruke en ImageJ eller fiji skript som utfører prosessering trinnene 10,1 til 10,3 i alle retninger, alle tidspunkter og alle fluorescens kanaler 65. Ideelt sett, sette sammen alle z maksimale fremspring per kanal og retning, og lagre dem som en tidsserie i en TIFF beholder. Alternativt kan BigDataViewer 69 plug-in for fiji brukes til å navigere gjennom Terabyte-store datasett.
  5. Avhengig av de transgene linjer og bildediagnostikk, kan dynamiske intensitets justering av tidsstablene være ønskelig på grunn av foto-bleking og / eller fluoroforen uttrykk svingninger. Enten ImageJ- eller FIJI-iboende Bleach Correction-funksjonen (Bilde → Juster → Bleach Correction, velg Histogram Matching) eller Dedicated programvare 65 er foreslått.
  6. Hvis embryo ble registrert og / eller langs flere retninger, og i flere kanaler fluorescens, horisontal kombinasjon av retningene (bilde → Søyler → Verktøy → Kombiner) og kanal flettingen (bilde → fargeFlette → Kanaler) anbefales.
  7. Registrering og sammensmelting av z-stabler ervervet langs flere retninger 70, eventuelt i kombinasjon med dekonvolvering 71, tillater beregning av overlegne tredimensjonale bilder med ensartet kvalitet og isotrop oppløsning. Begge plug-ins er åpen kilde og forhåndsinstallert i Fiji, men de krever tilstedeværelse av landemerker (fluorescerende mikrosfærer, f.eks perler) rundt prøven.
  8. Åpen programvare rammer for stor-skala kvantitative data utvinning og analyse er også tilgjengelige, for eksempel for segmentering og sporing av cellekjerner 72 eller cell form anerkjennelse 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver en eksperimentell rammeverk for fluorescensavbildning av levende eller fiksert og farget Tribolium embryoer med LSFM. På grunn av de lave nivåer av foto-bleking og fototoksisitet, en direkte konsekvens av den optiske snitting evne, er LSFM spesielt godt egnet for langvarig direkte avbildning.

Den nye AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 1 transgen linje uttrykker en histone2B-mEmerald fusjonsprotein under kontroll av alfa-tubulin en promoter 74. Det viser en enhancer felle-lignende uttrykk mønster 51, idet fluorescens-signalet oppnås hovedsakelig fra serosa, plommesekken og flere neuronale cellegrupper. Ved hjelp av denne linje, ble det 66 timer av embryonal utvikling ved romtemperatur (23 ± 1 ° C) som er registrert, som dekker germband tilbaketrekkingen og dorsal lukkeanordning (Supplementary Film 1). DetteLinjen kan brukes til å visualisere nevronale klynger i hodet vedheng (figur 4a) og dynamikken i serosa migrering under rygg lukning (figur 4B). Den nye AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linjen bærer den samme transgenet som # 4 linje, men på et annet genomisk sted. Den viser ikke en åpenbar enhancer felle mønster, men det fluorescens-signalet er spatiotemporally ubiquitously detekterbar som tidligere beskrevet for denne promoter 74. Denne linjen ble fotografert ved overgangen fra gastrulation til germband forlengelse for å demonstrere den optiske snitte evne ved to dybdenivåer (figur 4C). En annen funksjon, spesielt for direkte avbildning, er anskaffelsen av z-stabler langs flere retninger via sample rotasjon, som er standard for LSFM oppsett som anvendes i utviklingsbiologi. For eksempel, i den Glia-blå 58 linje, prøve rotasjon allestrømmer observasjon av gliaceller celle omstilling langs og rundt det ventrale nervesystemet, så vel som formerings dynamikken i den venstre hode flik, som bare kan sees på riktig måte fra den dorsale området, på samme embryo (figur 4D, Supplementary Film 2). Det levende avbildning datasett forbundet med denne studien er gitt som et nedlastbart ressurs, meta- og aksessinformasjon finnes i Tabell 1 Tilsetnings.

Siden valget av transgene linjer for direkte avbildning er fremdeles begrenset, kan små fluorescerende fargestoffer brukes for å spesifikt merke intracellulære strukturer. SYTOX Grønn binder seg til cellekjerner, og kan visualiseres i den grønne kanalen, mens YOYO-1 og BOBO-3 odid bindes til kjerne konvolutt og kan visualiseres i den grønne eller røde kanal, henholdsvis (figur 5A). Disse fargestoffer kan brukes til å fremheve visse embryonale structmed figurene, slik som serosa arr (figur 5B, første kolonne), de bakre ventrale serosa-celler (Figur 5B, andre kolonne) eller serosa-amnion-germband vevet med tre lag som oppstår under serosa vindu lukkeanordning (figur 5B, tredje til femte kolonne). Dual-misfarging tillater visualisering av to intracellulære strukturer i samme embryo, for eksempel atom konvolutt sammen med aktin cytoskjelettet, som kan farges med Alexa Fluor-konjugerte phalloidin fargestoffer. For eksempel, kan YOYO-1 odid kombineres med Phalloidin 546 (figur 5C), mens BOBO-3 kan kombineres med Phalloidin 488 (figur 5D).

Det er også praktisk å fikse og beis transgene embryoer som allerede uttrykker en viss fluorescerende protein, siden fiksering prosedyren slukker den iboende fluorescence signal bare marginalt. For eksempel kan embryoer fra AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 transgen linje, i hvilken kjernen blir detektert i den grønne kanalen, farges med Phalloidin 546, slik at aktin cytoskjelettet blir synlig i den røde kanal (Figur 6 ).

Figur 1
Figur 1: Sammenligning av konvensjonell Widefield, Confocal Laser Scanning og lys Sheet baserte Fluorescensmikroskopi. Konvensjonell Vidfelt epi-fluorescensmikroskopi benytter xenonbue / kvikksølv-damplamper med egnede filtre eller høyeffekts lysemitterende dioder som lyskilder. For hver mottatt to-dimensjonalt bilde, blir hele prøven belyses med en ikke-diffraksjonsbegrenset lyskjeglen. I konfokal laser scanning fluorescens mikroskopi, er en diffraksjonsbegrenset Gaussian laserstråle scanned gjennom prøven og fluorescens blir detektert usammenhengende punkt-for-punkt. I likhet med konvensjonelle vidfelt epi-fluorescens mikroskopi, er hele prøven opplyst for hver innhentet to-dimensjonalt bilde. I lys av platebasert fluorescens mikroskopi, tennes en diffraksjonsbegrenset Gaussian laserstråle prøven vinkelrett på påvisningsakse. Fluorescens blir detektert enten plan-til-plan eller linje-for-linje. Ved kjøp av et to-dimensjonalt bilde, bare et lite volum sentrert på fokalplanet for påvisning objektiv opplever effekten av eksitasjonslyset. De resterende volumet av prøven er ikke opplyst, bidrar ikke til ut-av-fokus uskarphet, lider ikke av foto giftige effekter og mister ikke fluorophorer grunn av foto-bleking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ep-together.within-page = "1"> Figur 2
Figur 2: Prinsippet of Light Sheet baserte Fluorescensmikroskopi. I LSFM, er belysning og deteksjon delt i minst to optiske baner. Minst en belysning arm brukes til å generere lys ark (cyan), mens minst ett deteksjons arm er utstyrt med et passende filter og et kamera for parallell deteksjon av fluorescens signalet (grønn). LSFM har to canonic implementeringer, den ene (eller selektiv) planet belysning mikroskop (blå bakgrunn) og den digitale skannede laserlyset ark mikroskop (rød bakgrunn). Ved å bevege prøven og lyset ark i forhold til hverandre, blir tre-dimensjonale bilder anskaffet. Informasjon langs flere retninger samles opp ved å dreie prøven rundt y-aksen, som fortrinnsvis er orientert langs tyngdekraften.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Tre ulike monterings Teknikker som brukes i innspillingen av embryoutvikling av Tribolium med lys Ark-baserte Fluorescensmikroskopi. (A) agarose kolonne refererer seg til en stålsylinder med en liten tapp som skyver agarose kolonne, i hvilken embryoet er innleiret, ut fra et glasskapillær. Agarose halvkule er montert på et stålrør. Embryoet er festet til den pol av halvkulen med en liten mengde av agarose. Den spindelvev holderen er en metallplate med et avlangt hull som er montert på toppen av stålsylinder. Embryoet er limt til en tynn film agarose som spenner than slotted hullet. (B) reaksjonsskjemaene for de tre monteringsteknikker inne i et lett mikroskop ark. (C) De tre feste teknikker som brukes innenfor et DSLM. (D) Eksempler på bildene fra embryoer fra den Glia-blå transgen linje opp med de tre monteringsteknikker. Embryoene som er ved begynnelsen av tilbaketrekkingen germband, er vist med sin bakre ende orientert mot toppen for å passe til overføring lys bilder. FM, fluorescens modus; ZA, z maksimalt fremspring med intensitet justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Levende Imaging av Tribolium embryoer. (A </ Strong>) Et embryo av den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linje ved overgangen fra germband tilbaketrekkings til dorsal lukking. Denne linje viser en forsterker felle uttrykksmønster. Fluorescenssignalet er hovedsakelig funnet i serosa, plommesekken og et par neuronale cellegrupper. Embryoet er vist over en periode på 15 timer med et intervall på 5 timer. De detaljbilder viser cellegrupper i hodet vedheng. I første omgang er klyngene fremdeles er dekket av serøse celler (første kolonne), ved serosa brudd, cellene følge sammen med dreiebevegelsen av hodet. (B) Samme embryo vist på dorsal lukning for 1:30 timer med et intervall på 0:30 timer. De detaljerte bildene viser at migrasjonen av de sprengte serosa over plommesekken. (C) Den øverste raden: en embryo av AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linje ved overgangen fra gastrulation til germband forlengelse. Midterste og nederste rad: Enkeltplanene er vist i to dybder i løpet av en periode på 10:30 timer med et intervall på 01:30h. (D) Et embryo av den Glia-blå linje under germband tilbaketrekking vist over en periode på 50:30 timer med et intervall på 7:30 timer. De detaljbilder viser morfogenetiske omorganisering av glialceller i det venstre hodet lobe. ZA, z maksimalt fremspring med intensitet justering; PA enkelt plan med intensitet justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: fiksering, beising, og Iimaging av WT embryoer under Germband Forlengelse. (A) embryoer farget med enten SYTOX grønne, det vil si en fuzzy atom beis, eller YOYO-1-jodid eller BOBO-3-jodid, dvs. to kjernekonvolutt flekker. (B) YOYO-1 odid-farget Embryo. Detaljer viser serosa arr (første kolonne), den nukleære konvolutten av de store bakre-ventral serosa-celler (andre kolonne) eller tre-lags vev organisering av serosa, amnion og selve embryonale vev (tredje til femte kolonne). (C) To-farge farging med YOYO-1 odid og Phalloidin 546. (D) To-farge farging med Phalloidin 488 og BOBO-3 odid. ZA, z maksimalt fremspring med intensitet justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Bilder av fiksert og farget transgene embryoer fra AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} 1 linje. Denne transgene linjen uttrykker mEmerald-labeled histone2B (H2B) under kontroll av alfa-tubulin en promoter, som markerer kjerne / kromatin overalt i hele embryoutvikling. Embryoet ble videre farget med Alexa Fluor 546 Phalloidin, hvilke etiketter aktin cytoskjelettet / f-aktin. ZA, z maksimalt fremspring med intensitet justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

kriterium fluorescens mikroskop typen
konvensjonell bredt felt konfokal laser scanning lys ark-baserte
objektivlinse oppsett en objektivlinse, middels høy NA to perpendikulært anordnede objektivlinser, lys: lav NA, deteksjon: høy NA
belysning lyskilden hvit lyskilde og passende filtre (f.eks kvikksølv korte buelamper)
eller LED-basert med oppryddings filtre 		laser med rensefilter
(F.eks diode eller DPPS lasere) 		laser med rensefilter
(F.eks diode eller DPPS lasere)
belysning pr todimensjonalt bilde hele prøven hele prøven
(Typisk to-dimensjonal Gaussisk bjelke scan) 		bare fokalplan
(DSLM: endimensjonal Gaussisk bjelke scan)
gjenkjenning parallell
(Typisk CCD-kamera eller sCMOS) 		sekvensiell
(Fotomultiplikatorrør) 		parallell
(Typisk CCD eller SCMOS kamera)
bildehastighet fastende (millisekunder per bilde) sakte (sekunder per bilde) fastende (millisekunder per bilde)
ut av fokus fluorescens ingen diskriminering blokkert nesten fullstendig ved pinhole
(Avvisning effektivitet avhenger av diameteren) 		nesten ikke-eksisterende
(Bare på grunn av spredning)
romlige dimensjoner 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
ytterligere grader av frihet 2
(Tid, fluorescens kanal) 		2
(Tid, fluorescens kanal) 		3
(Tid, fluorescerende kanalen, retning)
lateral oppløsning r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
optisk seksjonering evne Nei Ja
(Diskriminering i deteksjonen reaksjonsveien) 		Ja
(diskriminering i belysningsveien 75)
tilgjengelighet og pris overveiende kommersielle, lav kostnad overveiende kommersielle, dyre kommersielle, dyrt
spesialbygde, moderat 54,59,60,75
levende bilde publikasjoner dekker Tribolium embryoer seks 44,76,77,78,79,80 syv 23,77,79,81,82,81
(roterende skive konfokal) 83,84,85 		fire 23,57,65,86

Tabell 1 - Egenskaper av fluorNCE mikroskopi teknikker som brukes i Tribolium leve Imaging.

farge farging fortynning
SYTOX Grønn kjerner (fuzzy) 1: 10.000 (1: 100 i DDH 2 O og 1: 100 i 1% (w / v) BSA i PBS)
YOYO-en Iodide kjernefysisk konvolutt 1: 10.000 (1: 100 i DDH 2 O og 1: 100 i 1% (w / v) BSA i PBS)
BOBO-3 Iodide kjernefysisk konvolutt 1: 10.000 (1: 100 i DDH 2 O og 1: 100 i 1% (w / v) BSA i PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin aktin cytoskjelettet 1: 100 (i 1% (w / v) BSA i PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin aktin cytoskjelettet

Tabell 2 - Fargeløsninger.

agarosekolonne
(valg 1) 		halvkule
(alternativ 2) 		spindelvev holder~~POS=HEADCOMP
(alternativ 3)
begrunnelsen embryo er innebygd i en agarose-kolonne som er skjøvet ut av et kapillar bakre ende av embryoet er limt til polen til en agarose halvkule embryo er limt til tynn film agarose som spenner over et slisset hull
prøveholder stålsylinder med tapp stålrør stålsylinder med
slotted hull
ubegrenset (noen) ubegrenset (noen) fire (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
kreves ferdighetsnivå moderat høy lav
agarose rundt embryoet høy lav moderat
antall embryoer per økt opp til tre en opp til seks
embryo gjenfinning vanskelig lett lett
engangsutstyr glasskapillærer - -
anbefales for kortsiktige levende bilde, farget embryoer langsiktig levende avbildning langsiktige levende bilde, farget embryoer
<strong> referanser tre 23,87,88 to 57,65 denne publikasjonen

Tabell 3 - monteringsmetoder fordeler og ulemper.

avvikelses fenotype induksjon begrunnelsen skritt referanse (metodisk)
embryonale RNA interferens dobbelt-trådet RNA injiseres i embryoer under syncytial blastoderm trinnet til knock-down ett eller flere spesifikke gener injisere embryoer etter trinn 4.8. to 33,81
foreldre RNA interferens dobbelt-trådet RNA injiseres lateralt inn kvile puppe mellom mage segmentene 3 og 4, noe som fører til gene knock-down i avkommet ta puppe fra trinn 1.5. to 36,37
recessive embryonale dødelige mutant linjer egg-leggende kulturer som bærer en recessiv embryonisk dødelig mutasjon heterozygot utbytte ca. 25% homozygot mutant avkom krysse mutantlinjen inn i avbildnings linje under trinn 1.5. tre 39,51,89
påføring av ytre faktorer visse bioaktive eller toksiske faktorer er extrinsically påføres embryoene ved å tilsette dem til bildebufferen legge faktor til avbildningsbufferen under trinn 2.2. to 83,85

Tabell 4 - LSFM Levende Imaging av avvikelses fenotyper

Supplerende Tabell 1 - Metadata og Parameter for langsiktige live-bilde datasett DS0001-0003. Klikk her for å laste ned filen.

Supplerende Movie 1 - Levende Imaging av en Tribolium Embryo fra AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgene Line.
Denne linje viser en forsterker felle uttrykksmønster. Fluorescenssignalet først og fremst finnes i serosa, plommesekken og en undergruppe av nerveceller. Embryoet er vist langs fire orienteringene fra 00:00 til 66:00 h h med et intervall på 00:30 h mellom de tidspunkter. Filmen starter i begynnelsen av germband tilbaketrekking og slutter når rygg nedleggelsen er fullført. Frame rate er fem bilder per sekund. ZA,z maksimalt fremspring med intensitet justering. Klikk her for å laste ned filen.

Supplerende Movie 2 - Levende Imaging av en Tribolium Embryo fra Glia-blå Transgene Line.
Embryoet er vist langs fire orienteringene fra 00:00 til 66:00 h h med et intervall på 00:30 h mellom de tidspunkter. Filmen starter i begynnelsen av germband tilbaketrekking og slutter når rygg nedleggelsen er fullført. Frame rate er fem bilder per sekund. ZA, z maksimalt fremspring med intensitet justering. Klikk her for å laste ned filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitetskontroll

I levende billeddannende analyser, må preparatet og opptaksprosedyren være ikke-invasiv, dvs. verken den mekaniske og kjemiske håndtering (samling, dechorionation, montering på prøveholderen) og heller ikke den integrerte energi belastning i løpet av observasjons skal påvirke levedyktigheten til prøvestykket. For studier som karakteriserer WT utvikling, anbefales det å kun bruke data fra eksperimenter der embryoet overlever innspillingsprosessen, hentes vellykket og utvikler seg til en sunn voksen. Den voksne skal ikke vise noen morfologiske avvik, skal være fruktbare og dens avkom bør også være fruktbar. Det er tre viktigste årsakene til lav overlevelse, spesielt i langtids levende bildeanalyser:

For det første ble embryoet overflaten dekket med agarose i stor utstrekning i trinn 7, som sannsynligvis hindrer ion og gassutveksling og innsnevrer embryo mechanically. Berørte embryoer, spesielt når avbildet under tidlig embryogenese, typisk utvikle ubemerka i flere timer, arrestere plutselig og mister sin fluorescens signal raskt. Med noen erfaring kan overflaten fraksjonen som er innebygd i agarose ved hjelp av halvkule teknikk holdes under en tredjedel, mens med den spindelvev holderen teknikk, høyst halvparten av overflaten er dekket av et meget tynt lag agarose. For det andre, den integrerte energi belastning som påføres embryoet overskrider toleranse. De oppgitte i trinn 8,2 verdier tjene som en tommelfingerregel, men følgende kriterier bør vurderes: (i) embryo under tidlig embryoutvikling ikke tåle laser stråling samt embryoer i slutten av embryonal utvikling, (ii) selv om integrert energi lasten kan være identiske, høyere lasereffekt med enten lavere eksponeringstiden eller lengre tidsbestemte intervaller synes å være mer belastende enn lavere lasereffekt med en høy eksponeringstid eller kortere tidsmessige intervaller, (Iii) høyere bølgelengder er vanligvis tolereres bedre og (iv) for transgene linjer, vises toleransegrense til å være linjespesifikke, mens fluoroforen uttrykk styrke synes å være omvendt proporsjonal med laserbestråling toleranse. I tillegg er konstruksjonen av fusjonsproteinet og / eller de intracellulære lokalisering spiller også en rolle. For det tredje er embryoet skadet under monteringsprosessen. Den mest avgjørende faktor her er at inkubasjonstiden i den natriumhypokloritt-løsning er så kort som er nødvendig for fullstendig å fjerne chorion. Lengre inkubasjonstider kan skade fostre. Forsiktighet bør også tas for å ikke punktere eller klemme embryoene med børsten og for å holde monterings agarose ved en omgivelsestemperatur. Skadede embryo kan bli identifisert i løpet Trinn 8,4 før selve bildeprosessen starter, slik at skadede embryoer kan erstattes med levedyktige seg.

Ved å følge disse retningslinjene, typisk rundt 85-90% av Embryos overleve levende avbildning prosedyre og luke. Rundt 90% av de klekket fostre utvikler seg til sunne og frukt voksne. Overlevelsen forholdet ser ut til å være uavhengig av avbilding av temperatur og monteringsteknikker (når agarose kolonne brukes til avbildning perioder på ikke mer enn en halv dag), men litt avtar med forhøyede nivåer av laser-irradians. Som en ytterligere kontroll, spesielt under den innledende karakterisering av skreddersydde transgene linjer for fluorescens direkte avbildning eller rammeverket etableringsfasen som forløper for en omfattende eksperimentell sekvens, er det anbefalt å kjøre ikke-avbildet WT og transgene embryoer i parallell til den avbildede embryoer, som blir inkubert ved den samme temperatur som den avbildede embryo, og sammenligne deres utviklingstiden og morfologi 65.

Videre bør studier som karakteriserer avvikelses fenotyper (tabell 4) via direkte avbildning også kjøre en ikke-påvirket c-regulering embryo i parallell. Det anbefales å holde behandling av både embryo så like som mulig, men dette må vurderes individuelt for hver eksperimentell strategi:

Knock-down via RNA-interferens.

For embryonale RNA-interferens 33, 81, bør embryoer som stammer fra den samme eggleggingen kultur enten injiseres med funksjonell eller kontrollere dobbelt-trådet RNA. De forskjellig injiserte embryoer bør deretter avbildes samtidig i samme LSFM ved å bruke enten agarose kolonne eller den spindelvev holderen teknikk. For parenteral RNA-interferens 36, 37, bør det billeddannende kultur deles i to subkulturer. Kvinnelig puppe av en subkultur skal injiseres med det funksjonelle dobbelt-trådet RNA, mens den annen subkultur skal injiseres med kontroll dobbelt-trådet RNA. embryo collection bør utføres i parallell, og både de eksperimentelle og kontroll embryo kan avbildes samtidig i samme mikroskop ved hjelp av agarose-kolonne eller spindelvev holder teknikk.

Recessive embryonale dødelige mutant linjer.

Når det arbeides med recessive embryoniske dødelige mutanter 39, 89, 91, 92, 93, et egg-leggende kultur av heterozygote mutanter, som normalt er fenotypisk uanselig, gir teoretisk 25% homozygot mutant avkom (men noen ganger er mindre på grunn av praktiske håndteringsproblemer 89) og 75% av fenotypisk iøynefallende avkom (50% heterozygote mutanter og 25% WT). Det anbefales å bruke spindelvev holderen teknikk for å montere flere embryoer fra en slik eggleggingen kultur. Homozygot mutanter kan være identified i løpet av avbildnings ved manifestasjonen av fenotype, mens de normalt utviklende embryoer som kontroller. Genotypen av den avbildede prøvene kan bestemmes en gang avbildning og kvalitetskontroll er fullført.

Bruk av ytre faktorer.

Ved påvirkning av ytre faktorer innenfor avbildningsbufferen 83, 85, for eksempel bioaktive eller giftige stoffer, videre utvikling blir undersøkt, parallelt avbildning sammen med en kontroll embryo i det samme LSFM er vanligvis ikke mulig. Derfor har avbildning som skal utføres sekvensielt. Optimalt er tiden mellom etterfølgende eksperimenter ble minimalisert, og embryoene stammer fra den samme avbildnings kulturen. Alternativt kan to identisk konstruert og drevet LSFMs kan benyttes. I dette tilfellet bør embryoer fra samme egglegging perioden brukes, men det er av stor betydning at the kalibrering av begge mikroskop utføres forsiktig, slik at de billeddannende egenskaper er sammenlignbare. Ved hjelp av spindelvev holderen teknikk, kan flere embryoer for hver tilstand skal avbildes på en gang. Med agarosekolonne teknikk, kan det hende at ytre faktorer bli hindret fra å nå embryoer.

Nåværende begrensninger av LSFM levende bilde tilnærming

LSFM er et kraftig verktøy for å analysere embryonisk morfogenese en ikke-invasiv i flere fleksible skalert dimensjoner. Standard operasjonsprosedyrer, som foreslått i denne protokollen, vil støtte prosessen for å etablere lys ark teknologi som et standardverktøy i utviklingsbiologi. Imidlertid er tilnærmingen begrenset av en rekke faktorer på forskjellige eksperimentelle og organisa- sjonsnivåer:

Til å begynne med, LSFM ble utviklet for å analysere noe prøvestykke av gangen. All strøm nærmer det bildet to eller flere embryoer samtidig i samme mikroskop b y 'stabling' av prøven langs y-aksen i agarose kolonne eller spindelvev holder løser dette problemet bare til en viss grad. Multi-brønn Plater og dekkbasert oppsett er tilgjengelige 94, 95, 96. Men de lider av redusert bildekvalitet og ofre noen av de viktige fordelene fra LSFM, for eksempel bildebehandling sammen flere retninger. Foreløpig er det beste alternativet for å arbeide med flere mikroskoper i parallell, som blir rimelig gjennomførbart når kostbare komponenter, for eksempel laser, er delt 60.

Med den EFA-nGFP 57, 65, 84, FNL 86, den Brainy 58, 86, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 og Glia-blå= "xref"> 58, bare seks skreddersydde transgene linjer som er egnet for langvarig direkte avbildning er for tiden tilgjengelige. I tillegg er det HC079 (amnion), G12424 (serosa) og G04609 (hjerte) enhancer felle linjer 51 er blitt karakterisert med LSFM 23. Alternativt kan fluorescerende embryoer også bli generert av mRNA 81 eller fargestoffinjeksjonen 79, disse tilnærminger er relativt enkel, men også lider av begrensninger 86. Enda flere standarder er fortsatt nødvendig slik som cytoskeletal-, organelle- og membran-merkede linjer eller linjer som uttrykker fluoroforer under visse ikke-allestedsnærværende promotorer for å observere bare visse organer eller vev. Ideelt disse linjene er også tilgjengelige med forskjellige fluorescerende proteiner.

En annen utfordring er det datavolum som genereres av LSFM. Med hensyn til anskaffelse av informasjonen i tre romlige dimensjoner og i det minste tre fude ytterligere grader av frihet (tid, retning, fluorescerende kanalen), kan størrelsen av levende avbildning datasett lett nå mange gigabyte til noen få terabyte. Selv etter tre-dimensjonal beskjæring og ZIP basert kompresjon av TIFF beholderne, de tre eksempelvise datasettene er forbundet med denne studien har størrelser på 31,6, 12,6 og 45,1 gigabyte, det vil si 89,3 Gigabyte i total. Når man arbeider med LSFM, er det nødvendig å ha den respektive infrastrukturen for datalagring og prosessering 88, 97.

Bildekvalitet som oppnås ved overflaten av embryoet, men med økende dybde, blir fluorescenssignalet mer og mer uklart. For eksempel, blir den bakre ende av germband dekket av plommesekken folden under gastrulation og kan ikke bli skikkelig oppløst (figur 4C, først til femte kolonne). Imaging langs flere retninger løser dette problem i det minste delvisially - informasjon av høy kvalitet fra overflaten rundt embryoet er tilgjengelige, men de indre områder forblir uklar. For tiden finnes det ikke noen tilfredsstillende løsninger er tilgjengelige, men i det lange løp, infrarøde fluorescerende proteiner 98, genetiske tilnærminger 99 eller objekt oppsett med adaptiv optikk 100 kunne bli vurdert.

Tilrettelegging for andre arter

Nå har LSFM blitt brukt til å dokumentere embryoutvikling av tre insektarter, det vil si frukten fly Drosophila melanogaster 61, 62, 101, den scuttle fly Megaselia abdita 102 og den røde mel bille Tribolium castaneum 57. Den eksperimentelle rammeverk, standard operasjonsprosedyrer og monteringsteknikker som er beskrevet her should være lett tilpasses til andre insektarter. Kimlinje-transformasjonsprotokoller for mange insekter som tilhører forskjellige ordener er tilgjengelige 103, inkludert arter av økonomisk og / eller medisinsk betydning, som honningbien 104, flere lepidopterans 105, 106 eller flere myggarter 107, 108, 109. Med de respektive transgene linjer som er egnet for fluorescens direkte avbildning, kan den embryoniske morfogenesen av insekter karakteriseres samtidig ta hensyn til deres evolusjons linjer og / eller økologiske nisjer. Om lag én million insektarter er beskrevet og ytterligere tjue millioner insekter arter mest sannsynlig eksisterer 110, som dekker mer enn 400 millioner år med evolusjon to. Bare den komparative tilnærmingen vil generere informasjon som i sin tur provides innsikt som ikke kan oppnås ved å studere utviklings prinsippene for bare en enkelt art.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Forfatter bidrag

FS og EHKS unnfanget forskningen. FS genereres transgene AGOC linjer. Lett ark-baserte fluorescensavbildning ble utført av FS og SK. FS og EHKS skrev manuskriptet med innspill fra SK.

Acknowledgments

Vi takker Sven Plath for teknisk støtte. Den Glia-blå transgene linjen var en slags gave fra Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen ble finansiert av Cluster of Excellence Frankfurt am Main for makromolekylær komplekser (CEF-MC, EXC 115, høyttaler Volker Dötsch) innvilget delvis EHKS på Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS, direktør Enrico Schleiff) ved Goethe Universität Frankfurt am Main ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Developmental Biology Arthropod insekt Coleoptera, Morfogenese embryogenese ikke-invasiv langvarig fluorescens direkte avbildning lys ark-baserte fluorescens mikroskopi tredimensjonal lysmikroskopering LSFM DSLM SPIM
Lys Sheet-basert Fluorescensmikroskopi of Living eller fikseres og farges<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryoet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter