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Developmental Biology

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629

Summary

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Abstract

A farinha vermelho besouro Tribolium castaneum tornou-se um importante organismo modelo inseto em genética do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento. A observação dos embriões Tribolium com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tem várias vantagens sobre widefield convencional e microscopia de fluorescência confocal. Devido às propriedades únicas de um microscópio com base em folha de luz, imagens em três dimensões de espécimes vivos podem ser gravados com altas relações de sinal-para-ruído e reduzida significativamente foto-branqueamento, bem como foto-toxicidade ao longo de várias direcções ao longo de períodos que duram várias dias. Com mais de quatro anos de desenvolvimento metodológico e um aumento contínuo de dados, o tempo parece adequado estabelecer procedimentos operacionais padrão para o uso da tecnologia folha de luz na comunidade Tribolium, bem como na comunidade de insetos em geral. Este protocolo descreve três técnicas de montagem adequados fou finalidades diferentes, apresenta dois novos transgênicos linhas Tribolium feitos sob medida adequada para imagens ao vivo de longo prazo, sugere cinco corantes fluorescentes para rotular estruturas intracelulares de embriões fixos e fornece informações sobre o pós-processamento de dados para a avaliação atempada dos dados gravados. Os resultados representativos concentrar em imagens ao vivo a longo prazo, de corte tico e a observação do mesmo embrião ao longo de várias direcções. Os respectivos conjuntos de dados são fornecidos como um recurso para download. Finalmente, o protocolo discute controlos de qualidade para os ensaios de imagens ao vivo, as actuais limitações e a aplicabilidade dos procedimentos descritos para outras espécies de insectos.

Este protocolo destina-se principalmente para os biólogos do desenvolvimento que buscam soluções de imagem que superam equipamentos de laboratório padrão. Ela promove a tentativa contínua para fechar o intervalo entre os laboratórios tecnicamente orientadas / comunidades, que se desenvolvem e refinar microscopiar metodologicamente, e os laboratórios de ciências da vida / comunidades, que exigem soluções 'plug-and-play' para os desafios técnicos. Além disso, ele suporta uma abordagem axiomático que move as questões biológicas para o centro das atenções.

Introduction

A farinha besouro Tribolium castaneum vermelho, que pertence à grande família de escaravelhos pretos (Tenebrionidae), tem uma longa história no âmbito das ciências agrícolas e de vida e é o segundo mais bem estudada organismo modelo inseto modelo após a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Durante as últimas quatro décadas, tornou-se um poderoso e popular organismo inseto modelo em genética do desenvolvimento, em biologia evolutiva do desenvolvimento e, durante os últimos vinte anos, na morfogênese embrionária para uma variedade de razões:

Drosophila e Tribolium ambos pertencem ao Holometabola, mas divergiram aproximadamente 300 milhões de anos atrás, 1, 2, 3, 4. Embora o desenvolvimento embrionário de Drosophila é vulgarmente considerado como altamente derivados, Tribolium mostra um modo mais ancestral da mentomento que é encontrado numa proporção consideravelmente maior de espécies de insectos 5, 6, 7, 8, 9. Em primeiro lugar, Tribolium exibe desenvolvimento cabeça não-involuído, ou seja, as suas partes bucais e antenas já surgem durante a embriogénese 10, 11, 12, 13, 14, 15. Em segundo lugar, Tribolium segue os princípios do desenvolvimento de curto germe, ou seja, segmentos abdominais são adicionados sequencialmente a partir de uma zona de crescimento posterior durante o alongamento germband 16, 17, 18, 19. Em terceiro lugar, Tribolium desenvolve e degrada posterioresduas membranas extra-embrionárias ou seja, o âmnio, o qual abrange o embrião única ventralmente, e a serosa, o qual envolve completamente o embrião 20, 21, 22. Ambas as membranas desempenham um morfogenética cruciais 23, bem como papel de proteção contra microorganismos 24, 25 e dessecação 26. Em quarto lugar, as pernas embrionariamente em desenvolvimento são totalmente funcionais durante a fase de vida das larvas e servir como o primórdio para as pernas adulto durante a metamorfose de pupa 27, 28, 29, 30, 31.

Devido ao seu tamanho e modestos pequenas demandas, cultivo de Tribolium em laboratório é bastante simples. As culturas de tipo selvagem (WT) estirpes ou linhas transgénicas consistem tipicamente de cerca de 100-300 adultos e pode ser mantido dentro de garrafas de um litro de vidro (80 cm pegada 2) cheios de três a quatro centímetros de altura (cerca de 50 g) com meio de crescimento que é constituída por grãos de trigo completo farinha suplementado com levedura seca inactivo. Um fornecimento de água não é necessária. Isto permite que mesmo pequenos laboratórios para manter dezenas de culturas besouro dentro de pequenas ou médias incubadoras de insecto comercialmente disponíveis. Fases posteriores de desenvolvimento de Tribolium (larvas após aproximadamente o quarto instar, pupas e adultos) são facilmente separados a partir do meio de crescimento por peneiração. embriões sincronizados são obtidos por incubação de adultos para curtos períodos em forma de postura de ovos. Para o desenvolvimento rápido, culturas besouro são mantidos a 32 ° C (cerca de quatro semanas por geração), mantendo estoque é tipicamente realizada a 22-25 ° C (cerca de 10 semanas por geração).

Na última década, muitos tec padrãohniques foram gradualmente adaptada e optimizado para Tribolium, como resumido nos livros Emerging modelo Organismos 32. De grande importância são avançados métodos genéticos, tais como embrionário 33, larval 34, 35 ou parental 36, 37 de ARN baseada em interferência silenciamento de genes, transformação da linha germinativa com quer o piggyBac 38, 39 ou o sistema de transposase Minos 40 e CRISPR / genoma baseados em cas9 engenharia 41. Além disso, o genoma Tribolium foi sequenciado cerca de uma década atrás 42, e está agora na terceira ronda de genoma conjunto de libertação 43, o qual permite a identificação eficiente e de todo o genoma e a análise sistemática de genes 44 45, 46. Além disso, os genomas de outros quatro espécies de coleópteros está disponível para abordagens genéticas comparativos 47, 48, 49, 50. Em associação com o genoma sequenciado, duas análises genéticas em larga escala têm sido efectuada, isto é um ecrã de mutagénese de inserção 51 e um gene knockdown tela à base de interferência de ARN sistemática 52, 53.

Fluorescência de imagens ao vivo com widefield, confocal ou microscopia de luz com base em folha (LSFM) permite observar a morfologia embrionária de Tribolium como uma função do tempo (isto é, a morfogénese) num contexto de multi-dimensional (Tabela 1). Na microscopia de campo amplo e fluorescência confocal, o excitção e emissão de luz é guiado através da mesma lente objetiva. Em ambas as abordagens, toda a amostra é iluminada por cada plano bidimensional gravado. Assim, as amostras são sujeitas a níveis muito altos de energia. Em LSFM, apenas os fluoroforos no plano focal está animado devido a uma dissociação de iluminação e detecção por meio de duas lentes objectivas dispostas perpendicularmente (Figura 1). LSFM vem em duas implementações canónicos - o único plano iluminação microscópio (SPIM) e a luz do laser digitalizada à base de folha de microscópio de fluorescência digitais (DSLM, Figura 2) - e oferece várias vantagens importantes em relação às abordagens tradicionais: (i) capacidade de corte óptico intrínseca, (ii) resolução boa axial, (iii) fortemente reduzido nível de foto-branqueamento, (iv) muito baixo foto-toxicidade, (v) relação elevada sinal-para-ruído, (vi) relativamente elevada velocidade de aquisição, (vii) imagiologia ao longo de várias direcções e (viii) penetração mais profunda do tecido devido ao uso de baixo numérica abertura iluminação lentes objectivas 54, 55, 56.

LSFM já foi aplicada com êxito em Tribolium para documentar quase toda a morfogénese embrionária 57 e para analisar os princípios da ruptura da membrana extra-embrionária, no início do fecho dorsal 23. Para aumentar a atratividade de LSFM na comunidade Tribolium e para a ciência de insetos em geral, é de grande importância para estabelecer procedimentos operacionais padrão e melhorar os métodos, protocolos e o conjunto de recursos para um nível onde o microscópio torna-se uma facilidade de -Use ferramenta padrão em laboratórios de biologia do desenvolvimento, e as questões biológicas ficar no centro das atenções.

Este protocolo começa com as noções básicas de Tribolium </ em> cultivo, ou seja, manutenção, reprodução e colheita de embriões. Em seguida, duas estratégias experimentais encontram-se ilustrados: (i) imagens ao vivo de linhas transgénicas feitos por medida e (ii) imagiologia de embriões fixos que foram coradas com corantes fluorescentes (Tabela 2). Subsequentemente, três técnicas de montagem com fins ligeiramente diferentes são explicados em detalhe (Figura 3 e Tabela 3): (i) a coluna de agarose, (ii) o hemisfério de agarose e (iii) o titular da teia romance. O protocolo, em seguida, explica o procedimento de aquisição de dados com LSFM. modalidades de imagem e considerações importantes são delineadas. Finalmente, a recuperação embrião é explicado e sugestões para processamento de dados básicos são fornecidos. Nos resultados representativos, os dados de imagem ao vivo de dois novos feito por encomenda e as 58 linhas transgénicas glia-azul são mostrados e os respectivos conjuntos de dados de imagem são fornecidos como um recurso para download. Além disso, a imagemdados de embriões fixos que foram coradas com uma variedade de corantes de fluorescência são apresentados. A discussão centra-se em controle de qualidade, as actuais limitações da abordagem imagens ao vivo e a adaptação do protocolo para outras espécies.

O protocolo é escrito para microscópios de fluorescência baseado em folha de luz, que estão equipados com uma câmara de amostras e um mecanismo de fixação pode rodar para suportes normalizados de amostra 54, 59, 60, que são tipicamente elementos em forma de cilindros feitos de metal, de plástico ou de vidro com um diâmetro na gama de milímetros. O protocolo também é adequado para ambas as implementações canónicos, ou seja SPIM e DSLM, bem como para as configurações com duas ou mais de iluminação e de detecção de braços 61, 62, 63. Os resultados representativos mostram dados em dois canais espectrais, verde (ILluminação com um laser de 488 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 525/50) e vermelho (iluminação com um laser de 561 nm, detecção por meio de um filtro passa banda 607/70), mas o protocolo pode ser expandido para três ou quatro canais espectrais.

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Protocol

1. Criação de Culturas Tribolium

NOTA: As condições padrão são definidas como uma temperatura de incubação de 25 ° C e 70% de humidade relativa dentro de 12 h / 12 h brilhantes ciclo escuro. Para mais informações sobre Tribolium criação, respectivas diretrizes estão disponíveis 64. Este protocolo requer dois meios diferentes à base de farinha, que podem ser preparados em quantidades kg e armazenados durante vários meses.

  1. Antes de trabalhar com farinha e fermento seco inactivo, armazenar as embalagens fechadas, a -20 ° C durante 24 h e depois deixá-los aquecer até à temperatura ambiente. Este procedimento elimina potenciais agentes patogénicos.
  2. Passe farinha de trigo de grão completo e levedura seca inactiva através de um peneiro com tamanho de malha de 710 um, em seguida, se preparar o meio de crescimento, completando a farinha de grão completo peneirada com 5% (w / w) de fermento seco peneirado inactivo.
  3. Passar 405 farinha de trigo fina e levedura inativa seca através de uma peneira com 250 & #181; m malhagem, em seguida, preparar o meio de postura de ovos, completando o 405 farinha de trigo fina peneirada com 5% (w / w) de fermento seco peneirado inactivo.
  4. Passar a respectiva cultura Tribolium através uma peneira com 800? M de tamanho de malha. Descartar o restante meio de crescimento. Transferir as larvas, pupas e adultos para um grande prato de vidro.
  5. Se não houver uma cultura descendência, transferir cerca de 80 larvas e / ou pupas de uma nova garrafa de vidro para estabelecer uma nova cultura descendência. Se não houver larvas e / ou pupas estão presentes, levar cerca de 40 adultos em seu lugar. Adicionar 50 g de meio de crescimento e incubar sob condições padrão.
  6. Recolha cerca de 300 adultos (500-700 mg) em um outro novo frasco de vidro para estabelecer a cultura de imagem. Adicionar 50 g de meio de crescimento e incubar sob condições padrão. Permitir que a cultura de imagem que se contentar com, pelo menos, 24 h em meio de crescimento fresco antes de colheita de embriões.
  7. Substituir o meio de crescimento da cultura de imagem pelo menos a cada dois nósEKS, o que pode ser feito em conjunto com a recolha de embriões (ver 3.2). Depois de dois a três meses, substituir a cultura de imagem completamente por novos adultos a partir da cultura descendência.
  8. Se uma linha transgénica homozigótica não é usado, curador as culturas de progenia frequentemente removendo animais não transgénicos. Idealmente, gerar linhas homozigóticas se o respectivo transgene não é letal ou causa esterilidade quando presente em ambos os cromossomas. culturas homozigóticas têm tipicamente um nível de fluorescência média mais elevada e as condições experimentais gerais são mais estreitas, uma vez que apenas um genótipo está presente.

2. Instalação Microscópio e Calibração

NOTA: O embrião Tribolium tem um comprimento ântero-posterior de cerca de 600-660 ^ m e um diâmetro transversal de cerca de 300-330? M. A maioria das câmaras CCD modernos têm um tamanho do chip do sensor de cerca de 9 mm x 7 mm, ou seja, um diâmetro de 11,4 um, e um raio de pixel do pixel de 6,45? M.Quando combinada com uma lente objectiva 10X de ampliação, o embrião pode ser representada por imagem in toto com uma densidade de pixéis de 0,645? M. A maioria das câmaras modernas scmos têm um tamanho maior do chip do sensor de cerca de 16 mm x 14 mm, isto é, um diâmetro de 21,3 um, e um raio de pixel do pixel de 6,5? M. Quando combinada com uma lente objectiva de 20x de ampliação, o embrião pode ser representada por imagem in toto com uma densidade de pixéis de 0,325? M.

  1. Anexar as lentes de iluminação e objetivos de detecção para o microscópio. Certifique-se de que os lasers e filtros de fluorescência corresponde a absorção fluoróforo e espectros de emissão muito bem.
  2. Anexar a câmara de amostras para o microscópio. Encher a câmara de amostras com PBS a pH 7,4 ou qualquer outro tampão de imagiologia apropriada.
  3. Ligar e calibrar o microscópio. rotinas e diretrizes de solução de problemas para microscópios à base de folha de luz custom-built (mais especificamente para a implementação DSLM) calibração abrangente foram publicados previously 65. Para dispositivos comerciais, siga as instruções do fabricante com muito cuidado. Manuseamento incorrecto pode esgotar a câmara de amostras do meio e causar estragos ao instrumento bem como a amostra.

3. Recolha de transgênicos ou WT embriões

  1. Passar a colónia de imagem através de um peneiro com tamanho de malha de 800? M. Recolhe escaravelhos adultos em um novo frasco de vidro e adiciona-se 10 g de meio de postura de ovos. Incubar a cultura de postura de ovos durante 1 h a 25 ° C e 70% de humidade relativa em luz.
  2. Passar a cultura de postura de ovos através de um peneiro com tamanho de malha de 800? M para separar os adultos a partir do meio de postura de ovos, o qual contém cerca de 30-100 embriões. Transferir adultos para um novo frasco de vidro e adicionar o antigo ou 50 g de meio de crescimento fresco.
  3. Se observação deve começar na fase de blastoderme uniforme (exemplo de conjunto de dados DS0002), incubar a forma de postura de ovos durante 15 h a 25 ° C e 70% de humidade relativa. TO começar no início de retracção germband (exemplo conjuntos de dados DS0001 e DS0003), incubar os embriões durante 23 h a 32 ° C e 70% de humidade relativa. Se outros estágios de desenvolvimento são desejados, referem-se à respectiva literatura 64, 65 e adaptar o tempo e / ou temperatura de incubação conforme necessário.

4. Embryo dechorionation

NOTA: O cório é a camada exterior da casca do ovo e consiste em proteínas e polissacarídeos. É fortemente a luz absorvente, mas não essencial para o desenvolvimento adequado e pode, assim, ser removido quimicamente.

  1. Passar o meio de postura de ovos através de um peneiro com tamanho de malha de 300? M. Recolher os embriões em um filtro de células com tamanho de malha de 100 um e rejeitar a forma de postura de ovos sobra.
  2. Prepara-se uma placa de 6 pos como se segue: encher a A1, A2, A3 e B3 poços com 10 mL de PBS pH 7,4 e os poços B1 e B2 com 9 ml de PBS. Então, cuidadosamente adicionar1 ml de hipoclorito de sódio a B1 e B2. Observar o andamento das etapas 4.3 a 4.8 sob o microscópio estéreo. CUIDADO hipoclorito de sódio é corrosivo.
  3. Inserir o filtro de células no poço A1 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante um minuto, sob agitação suave. partículas de farinha maiores devem separar os embriões.
  4. Transferir o filtro celular para o bem B1 (hipoclorito de sódio em PBS de pH 7,4) e agitar a placa vigorosamente durante 30 s. As partículas de farinha restantes deve destacar completamente a partir dos embriões.
  5. Transferir o filtro celular para o bem A2 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante 1 minuto, sob agitação suave.
  6. Para dechorionation, transferir o filtro celular para o bem B2 (hipoclorito de sódio em PBS de pH 7,4). Agitar a placa vigorosamente até que as rupturas córion e separa-se os embriões. O córion se parece com uma membrana fina, semi-transparente com bordas dilacerados, enquanto embriões dechorionated têm uma silhueta simples.
  7. th de transferênciacoador e celular para o bem A3 (PBS, pH 7,4) e lavar os embriões, durante 1 minuto, sob agitação suave. Se quaisquer fragmentos córion ainda est ligados aos embriões após a lavagem, repetir o passo 4.6.
  8. Armazenar os embriões no bem B3 (PBS pH 7,4). Armazenamento por várias horas não prejudique os embriões, mas tenha em mente que o desenvolvimento continua.
  9. Para as linhas de transgénicos não homozigóticos, remover quaisquer embriões não fluorescentes, se possível. Para a fixação e coloração de WT ou embriões transgénicos, continuar com o passo 5. Para imagens ao vivo de embriões transgénicos, continuar com o passo 6.

5. Vitelino Membrane permeabilização, Fixação e Coloração

NOTA: A membrana vitelina é a camada mais interior da casca do ovo. É impermeável para corantes fluorescentes e, portanto, tem de ser quimicamente permeabilizadas antes da coloração.

  1. Encher um frasco de cintilação com solução de fixação / permeabilização (1,5 ml de 4% (w / v) de paraformaldeo em PBS pH 6,9 de umND 1,5 mL de n-heptano). Transferir embriões com um pincel para os frascos. frascos de cobertura com uma folha de alumínio para proteger da luz fluoróforos e incubar durante 30 minutos numa plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. CUIDADO paraformaldeído é tóxico e corrosivo, de n-heptano é inflamável e tóxica.
  2. Remover solução de fixação e o tratamento de embriões três vezes durante 15 minutos em 3 mL de 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS pH 7,4 e subsequentemente uma vez durante 15 minutos em 3 mL de 1% (v / v) de Triton X-100 em PBS pH 7,4 numa plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. CUIDADO Triton X-100 é corrosivo.
  3. Remover a solução de permeabilização e adiciona-se 0,5 mL de solução de coloração para o frasco. Exemplos de soluções de coloração são apresentados na Tabela 2. Stain embriões durante a noite a 4 ° C sobre uma plataforma de agitação a 50 rotações por minuto. Para os corantes propostos na Tabela 2, a lavagem não é necessário.

6. Preparação de montagem de agarose

  1. Adicionar 1 g de baixo ponto de fusãode agarose a 100 mL de PBS pH 7,4 e aquecer a mistura durante 2-3 minutos num forno de microondas a 800 W. Se as pequenas partículas de agarose estão ainda presentes, repetir o processo de aquecimento em intervalos de 30 seg até que as partículas se dissolvem completamente. A agarose de montagem não precisa de ser preparada de fresco cada vez, o solidificado de agarose pode ser re-liquefeito por meio de aquecimento tal como descrito acima. Este processo pode ser repetido 5-6 vezes, antes demasiada água se tenha evaporado.
  2. Permitir que a agarose a arrefecer para cerca de 40-45 ° C, em seguida, encher dois tubos de reacção de 1,5 mL com a agarose aquecido e manter os tubos a 35 ° C em um termobloco.

7. Embryo Montagem e Inserção na Câmara Amostra

  1. Opção 1: Coluna de agarose (Figura 3A-C, a primeira coluna; Tabela 3, a segunda coluna)
    1. Encher uma seringa de 1,0 mL com água destilada e coloque-o uma das aberturas capilares de vidro utilizando um tubo de borracha pequena.Encher a meio caminho capilar com água destilada.
    2. Escolher um embrião com um pincel e colocá-lo sobre o lado interno da outra abertura capilar de vidro. Avançar rapidamente para a próxima etapa antes de o embrião seca.
    3. Furar o capilar para a agarose líquido e lentamente desenhar algumas uL de agarose líquido ao lado do embrião dentro do capilar. Em seguida, rapidamente aumentar a força de desenho para que o embrião é arrastado juntamente com a agarose. No final, alguns mL de agarose deve estar acima e abaixo do embrião. Defina o capilar de lado por alguns minutos e deixar a agarose solidificar.
    4. Encurtar o capilar com um cortador de vidro de diamante com um comprimento de cerca de 5 mm. O fragmento restante deve ser completamente preenchido com agarose e o embrião deve estar dentro do segundo quartil.
    5. Inserir o cilindro de aço com o pino para dentro da câmara da amostra, e em seguida, manter o fragmento capilar na parte superior do pino. A coluna de agarose deve sobressair um milímetro poucos fROM O fragmento capilar com a parte que contém o embrião.
  2. Opção 2: hemisfério de agarose (Figura 3A-C, a segunda coluna; Tabela 3, a terceira coluna)
    1. Desenhar 200 uL de agarose líquido numa seringa de 1,0 ml, então usá-lo para encher o tubo de aço a partir do topo com agarose até se formar um hemisfério, na abertura inferior. O diâmetro hemisfério deve ser igual ao diâmetro do tubo. Aguardar alguns minutos até que a agarose foi solidificada.
    2. Escolher um embrião com um pincel e reorganizar-lo na ponta do pincel de modo a que a extremidade anterior torna-se acessível. Mergulhar o hemisfério de agarose em agarose de líquidos para cobri-lo com uma fina película.
    3. Coloque o embrião com a sua extremidade anterior na posição vertical sobre o pólo do hemisfério de agarose. Girar o tubo de aço em volta e corrigir a posição do embrião com a escova. Se necessário, a estabilizar o embrião por adição de 2 ul de agarose para a fronteira embrião / hemisfério. Ideally, menos do que metade da superfície do embrião deve ser coberto de agarose e os flancos deve ser tão íngreme como possível.
    4. Inserir o tubo de aço com o hemisfério e embrião lentamente para dentro da câmara da amostra.
  3. Opção 3: Suporte de teia de aranha (Figura 3A-C, terceira coluna; Tabela 3, a quarta coluna)
    1. Escolher um embrião com um pincel e reserve.
    2. Cobrir o orifício oblongo do suporte da teia com 5-8 ul de agarose líquida, em seguida, remover a maior parte da agarose até que apenas um filme de agarose fino permanece.
    3. Coloque o embrião sobre a película de agarose e ajustar a sua posição. mover-se cuidadosamente o embrião ao centro do eixo x do orifício oblongo, e alinhar o seu eixo ântero-posterior alongada com o eixo alongado da abertura escatelada.
    4. Inserir o suporte da teia com o embrião montado lentamente para dentro da câmara da amostra. Posicione o suporte da teia de modo que não interfira com a excitação e emissãoluz, isto é, 45 ° em relação à x e z-eixo.

baseada em folha 8. Luz Microscopia de Fluorescência

  1. Decidir junto quantas direções (e ao longo do qual orientações) o embrião deve ser trabalhada. Quatro direcções (ao longo das orientações de 0 °, 90 °, 180 ° e 270 °) fornecem tipicamente um bom compromisso entre a cobertura e de carga de energia.
  2. Configure o número de canais de fluorescência. Os principais parâmetros para cada canal são a linha de laser, o filtro de fluorescência, a potência do laser e o tempo de exposição. Para geração de imagens ao vivo de longo prazo, é importante que a carga integrada de energia não exceda a tolerância do embrião. Um tempo de exposição de 25-50 ms garante imagens rápido, enquanto uma potência do laser entre 100 e 300 mW não deve afetar a viabilidade do embrião. Para amostras fixos, tempo de exposição e potência do laser pode ser pelo menos o dobro.
  3. Para ensaios de imagens ao vivo, configure o lapso de tempo. o complete embriogénese de Tribolium leva cerca de sete dias a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) e um pouco menos de três dias a 32-35 ° C 64. Definir o intervalo de tempo de acordo com os eventos morfogenéticos que devem ser observados. Para intervalos temporais curtos, considerar a redução do tempo de exposição e potência do laser (ver 8.2).
  4. Posição do embrião no modo de luz de transmissão ao longo da xey eixos para o centro do campo de visão sem expor-lo para o laser. Rodar o embrião por 360 ° em 90 ° etapas para examinar o embrião por quaisquer danos que possam ter ocorrido durante o processo de montagem.
  5. Rodar o embrião adequadamente em torno do eixo-y para alinhar os eixos embrionários com o microscópio de eixos, por exemplo, o eixo lateral com o eixo-x, ou seja, o eixo dorsoventral com o eixo z. Quando se utiliza a técnica de suporte de teia, o alinhamento pode não ser possível.
  6. No modo de fluorescência, definir o z-pilha for cada direcção. Adicionar 25-50? M como tampão espacial em frente de e atrás do embrião. Incluindo o tampão, o típico z-pilha abrange cerca de 350-400 mm para um embrião Tribolium. Definem também o z-o espaçamento, que deve ser de quatro vezes o espaçamento lateral, isto é, o espaçamento ao longo dos eixos X e Y-eixos 66.
  7. Se dois ou mais embriões são gravadas em paralelo, reinicie em 8,4 com o próximo embrião.
  8. Para imagiologia de longo prazo, garantir que a câmara da amostra é preenchido com suficiente PBS pH 7,4 ou outro tamp de imagem. cobrir também a abertura da câmara de amostra.
  9. Inicie o processo de imagem. Para geração de imagens ao vivo de longo prazo, monitorar a aquisição correta ao longo de todas as direções em todos os canais para todos os embriões. verifique ocasionalmente durante os próximos dias que os embriões estão vivos e na posição apropriada.

9. Embryo Recuperação e Controle de Qualidade

  1. Uma vez imaging for concluído, retire o suporte da amostra comos embriões a partir da câmara de amostras. Somente embriões de ensaios de imagens ao vivo tem que ser recuperado. embriões fixados e corados podem ser descartados.
  2. Se um ensaio de imagens ao vivo foi realizada, a transferência do embrião para um slide objecto. Para a técnica de agarose coluna, extrair os embriões de torno de agarose com um bisturi, de micro-faca ou lâmina de barbear. Para a técnica de agarose hemisfério, transferir o hemisfério com o lado plano para o objecto deslize. remoção embrião não é necessário. Para a técnica de suporte de teia de aranha, suavemente desmontar os embriões a partir da película de agarose com um pincel. Incubar a lâmina objeto em um pequeno prato de vidro em atmosfera saturada de humidade, em condições padrão até que as larvas eclodem.
  3. Após incubação, a transferência das larvas para poços individuais de uma placa de 24 cavidades e adicionar 500 mg de meio de crescimento em cada cavidade. Incubar, sob condições padrão. Comparar o tempo total de desenvolvimento e morfologia das larvas fotografada para WT sem imagem e LarV transgénicoae (ver discussão). Nos ensaios que caracterizam o desenvolvimento WT, há aberrações morfológicas óbvias devem, idealmente, ser perceptível.
  4. Uma vez que as larvas se desenvolvem em adultos saudáveis, proporcionar-lhes parceiros WT apropriadas da mesma cepa de fundo. Depois de duas semanas, para verificar a produção de progênie. Considere também para verificar a fertilidade da prole por meio de cruzamentos los inter pares. Só quando os embriões fotografada desenvolver em adultos férteis que produzem descendência fértil, o procedimento de imagiologia pode ser considerado não-invasiva.

10. Imagem de Processamento de Dados

NOTA: Para o processamento de dados de imagem, o open-source de processamento de imagem software ImageJ 67 ou seu FIJI derivado 68 são recomendados. Ambas as versões, bem como documentação completa são encontrados em www.imagej.net. O formato de arquivo padrão para dados LSFM é o formato de arquivo de imagem com marcas (TIFF). A opção recipiente intrínseca permite o storaiva de pilhas de imagens, tais como Z-pilhas ou série de projecções tempo máximos z dentro de um único ficheiro que pode ser aberto em ImageJ ou FIJI por meio de arrastar e largar.

  1. Se necessário, rodar os Z-pilhas para alinhar o eixo ântero-posterior do embrião com o eixo y (Imagem → Transformar → Rodar). Por favor, note que os parâmetros de rotação tem que ser definido individualmente para cada sentido, mas não para o lapso de tempo e os canais de fluorescência.
  2. Cortar os Z-pilhas ao longo do x, y e z-eixos, de modo que apenas o fundo mínimo (20 - 40 pixels ao longo da xey eixos, 5 - 10 planos ao longo do eixo z) permanece (por ox - e eixos y, use a ferramenta de seleção retangular, então imagem → Cortar, porque o eixo z, de uso de imagens → Pilhas → Ferramentas → Fatia Keeper). Por favor, note que os parâmetros de corte tem que ser definido individualmente para cada sentido, mas não para os pontos de tempo e os canais de fluorescência.
  3. Calcular a projecção máxima z para cada z-pilha(Imagem → Pilhas → Z Project, escolha Max Intensidade). cálculos de projecção intensidade são procedimentos de simplificação dados que removem uma dimensão espacial.
  4. Para dados de imagens ao vivo de longo prazo, considere o uso de um ImageJ ou script FIJI que realiza etapas de processamento 10,1-10,3 para todas as direções, todos os momentos e todos os canais de fluorescência 65. Idealmente, todas as projecções concatenar Z máxima por canal e direcção e guardá-las como uma série de tempo em um recipiente TIFF. Em alternativa, o plug-in 69 BigDataViewer para Fiji pode ser utilizado para navegar através de terabytes grandes conjuntos de dados.
  5. Dependendo das modalidades de linha de imagem e transgênicos, os ajustes de intensidade dinâmica das pilhas de tempo pode ser desejável devido ao foto-branqueamento e / ou flutuações de expressão fluoróforo. Ou o ImageJ- ou intrínseca FIJI-função Bleach Correction (Imagem → Ajuste → Correção Bleach, escolha Histograma Matching) ou dedicasoftware ted 65 são sugeridas.
  6. Se o embrião foi gravado e / ou ao longo múltiplas direções e em vários canais de fluorescência, combinação horizontal das direções (Imagem → Pilhas → Ferramentas → Combine) e merge canal (Imagem → Cor mesclar → Canais) são recomendados.
  7. Registo e fusão de z-pilhas adquiridos ao longo múltiplas direcções 70, eventualmente, em combinação com desconvolução 71, permite o cálculo de imagens tridimensionais superiores de qualidade uniforme e isotrópico resolução. Ambos os plug-ins são de código aberto e pré-instalado em Fiji, mas eles exigem a presença de marcos (microesferas fluorescentes, por exemplo, contas) em torno da amostra.
  8. Estruturas de software de código aberto para grande escala de extração de dados quantitativos e análise também estão disponíveis, por exemplo, para a segmentação e rastreamento de núcleos de células 72 ou cell reconhecimento de forma 73.

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Representative Results

Este protocolo descreve um modelo experimental para imagiologia por fluoresccia de vida ou embriões Tribolium fixadas e coradas com LSFM. Devido aos baixos níveis de foto-branqueamento e foto-toxicidade, uma consequência directa da sua capacidade de seccionamento óptico, LSFM é particularmente bem adequado para imagens ao vivo a longo prazo.

O novo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linha transgénica expressa uma proteína de fusão histone2B-mEmerald sob o controlo do alfa-tubulina um promotor 74. Ela mostra uma armadilha padrão de expressão semelhante intensificador de 51, uma vez que o sinal de fluorescência é obtida principalmente a partir da serosa, o saco vitelino e vários grupos de células neuronais. Utilizando esta linha, 66 h de desenvolvimento embrionário, à temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) foram registados, cobrindo retracção germband e o fecho dorsal (Filme Suplementar 1). esteA linha pode ser usada para visualizar aglomerados neuronais dentro dos apêndices de cabeça (Figura 4A) e a dinâmica da migração serosa durante o fecho dorsal (Figura 4B). O novo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linha transporta o mesmo transgene como a linha # 4, mas num local genómico diferente. Não mostra um padrão de intensificador de armadilha óbvia, mas o sinal de fluorescência é detectável espaço-temporalmente ubiquamente como descrito anteriormente para este promotor 74. Esta linha foi representada por imagem na zona de transição a partir de gastrulação para germband alongamento para demonstrar a capacidade de corte óptica a dois níveis de profundidade (Figura 4C). Outra característica, especialmente para imagens ao vivo, é a aquisição de z-pilhas ao longo de várias direcções de rotação por meio de amostra, que é o padrão para configurações LSFM utilizados na biologia do desenvolvimento. Por exemplo, na linha 58 Glia-azul, de rotação da amostra todosows a observação de reorganização célula glia ao longo e em torno do cordão nervoso ventral, bem como a dinâmica de proliferação no lobo cabeça à esquerda, o qual só pode ser visto adequadamente desde o local dorsal, no mesmo embrião (Figura 4D, filmes complementar 2). Os conjuntos de dados de imagem ao vivo associados a este estudo são fornecidos como um recurso informações, meta e acesso para download encontram-se na Tabela Suplementar 1.

Desde a escolha de linhagens transgênicas para imagens ao vivo ainda é limitado, as pequenas corantes fluorescentes pode ser usado para rotular especificamente estruturas intracelulares. SYTOX verde liga-se a núcleos celulares e pode ser visualizado no canal verde, enquanto YOYO-1 e Bobo-3 Iodeto de se ligar ao envelope nuclear e podem ser visualizados no canal verde ou vermelho, respectivamente (Figura 5A). Estes corantes podem ser usados ​​para destacar certas struct embrionáriasmentos, tais como a cicatriz serosa (Figura 5B, na primeira coluna), as células ventral posterior serosa (Figura 5B, a segunda coluna) ou o tecido-serosa-âmnio germband tri-camada que surge durante o fechamento da janela serosa (Figura 5B, em terceiro lugar a quinta coluna). coloração de duas cores permite a visualização de duas estruturas intracelulares no mesmo embrião, por exemplo, o envelope nuclear, juntamente com o citoesqueleto de actina, que podem ser coradas com corantes Alexa Fluor-faloidina conjugados. Por exemplo, YOYO-1 Iodeto pode ser combinado com Faloidina 546 (Figura 5C), enquanto Bobo-3 podem ser combinados com Faloidina 488 (Figura 5D).

Também é conveniente para corrigir e manchar embriões transgênicos que já expressam uma determinada proteína fluorescente, uma vez que o procedimento de fixação sacia a fluorescenc intrínsecae sinal de apenas marginalmente. Por exemplo, os embriões a partir do {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linha transgénica, em que os núcleos são detectadas no canal verde, AGOC podem ser coradas com faloidina 546 de modo que o citoesqueleto de actina se torna visível no canal vermelho (Figura 6 ).

figura 1
Figura 1: Comparação de Widefield convencional, Confocal Laser Scanning e luz à base de folha de microscopia de fluorescência. A microscopia de campo amplo de epi-fluorescência convencional utiliza lâmpadas de arco / de vapor de mercúrio de xénon com filtros apropriados ou luz de alta potência díodos emissores de luz como fontes. Para cada imagem bidimensional adquirida, toda a amostra é iluminada com um cone de luz não-limitado por difração. Na microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser, um feixe de laser Gaussian limitado por difração é scanned através da amostra e a fluorescência é detectada de forma incoerente ponto-por-ponto. Da mesma forma que a microscopia de campo amplo de epi-fluorescência convencional, toda a amostra é iluminada para cada imagem bidimensional adquirido. Na microscopia de fluorescência com base em folha de luz, um feixe de laser de Gauss limitado por difração ilumina a amostra de modo perpendicular ao eixo de detecção. A fluorescência é detectada qualquer plano-a-plano ou linha-a-linha. Durante a aquisição de uma imagem bidimensional, apenas um pequeno volume centrado no plano focal da objectiva a detecção sofre os efeitos da luz de excitação. O volume restante da amostra não estiver acesa, não contribui para o borrão fora de foco, não sofre de efeitos fotográficos-tóxico e não perde fluoróforos devido ao foto-branqueamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ep-together.within-page = "1"> Figura 2
Figura 2: O princípio de base de folha de luz-microscopia de fluorescência. Em LSFM, a iluminação e a detecção são divididos em pelo menos dois caminhos ópticos. Pelo menos um braço de iluminação for utilizado para gerar a folha de luz (ciano), enquanto que, pelo menos, um braço de detecção está equipado com um filtro apropriado e uma câmara para a detecção paralelo do sinal de fluorescência (verde). LSFM tem duas implementações canónicos, o único (ou selectiva) plano iluminação microscópio (azul) e a folha de microscópio de luz laser digitalizada digitais (fundo vermelho). Ao mover a amostra ea folha de luz em relação ao outro, as imagens tridimensionais são adquiridos. Informação ao longo múltiplas direcções é recolhido pela rotação do espécime em torno do eixo y, que é preferencialmente orientada ao longo gravidade.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Três técnicas de montagem diferentes utilizados na gravação do desenvolvimento embrionário de Tribolium com baseado em folha de luz microscopia de fluorescência. (A) A coluna de agarose refere-se a um cilindro de aço com um pequeno pino que empurra a coluna de agarose, em que o embrião é incorporado, de um capilar de vidro. O hemisfério agarose é montado num tubo de aço. O embrião está ligado ao pólo do hemisfério com uma pequena quantidade de agarose. O titular da teia é uma folha de metal com um orifício ranhurado montado no topo do cilindro de aço. O embrião é colada a uma película de agarose fino que se estende tele fenda buraco. (B) Sistemas das três técnicas de montagem no interior de uma folha de microscópio de luz. (C) As três técnicas de montagem aplicados dentro de um DSLM. (D) Exemplos de imagens a partir de embriões da linha transgénica Glia-azul gravado com as três técnicas de montagem. Os embriões, que são no início de retracção germband, são mostrados com a sua extremidade posterior, orientada para cima para combinar as imagens de luz de transmissão. FM, modo de fluorescência; ZA, a projecção máxima z com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Imagens ao vivo de Tribolium embriões. (A </ Forte>) Um embrião do AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linha na zona de transição a partir de retracção germband para o fecho dorsal. Esta linha exibe um padr de intensificador de armadilha expressão. O sinal de fluorescência é encontrado principalmente na serosa, o saco vitelino e alguns grupos de células neuronais. O embrião é mostrado durante um período de 15 h, com um intervalo de 5 horas. As imagens mostram detalhes grupos de células nos apêndices de cabeça. Inicialmente, os aglomerados estão ainda abrangidos pelas células serosas (primeira coluna), em caso de ruptura serosa, as células seguir juntamente com o movimento de rotação da cabeça. (B) O mesmo embrião mostrado durante o fecho dorsal para 1:30 h com um intervalo de 00:30 h. As imagens mostram o detalhe migração da serosa rompida sobre o saco vitelino. (C) Linha superior: Um embrião do AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linha na zona de transição a partir de gastrulação para germband alongamento. Médio e inferior consecutivas: aviões únicos são mostrados em duas profundidades ao longo de um período de 10:30 h com um intervalo de 1:30h. (D) Um embrião da linha de células da glia-azul, durante a retracção germband mostrado ao longo de um período de 50:30 h, com um intervalo de 07:30 h. As imagens mostram detalhes da reorganização morfogenética das células gliais no lobo cabeça esquerdo. ZA, a projecção máxima z com ajuste de intensidade; PA plano único com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: A fixação, coloração e Iimaging de WT embriões durante Germband Alongamento. Embriões (A) coradas com qualquer dos SYTOX verde, ou seja, uma mancha difusa nuclear, ou YOYO-1 ou iodeto Bobo-3 iodeto, ou seja, duas manchas do envelope nuclear. (B) Iodeto de embry-coradas YOYO-1o. Os detalhes mostram a cicatriz serosa (primeira coluna), o envelope nuclear das células grandes serosa póstero-ventral (segunda coluna) ou a organização do tecido de três camadas da serosa, o âmnio e o tecido embrionário real (terceira à quinta coluna). (C) coloração de duas cores com YOYO-1 e Iodeto de Faloidina 546. (D) coloração de duas cores com Faloidina 488 e Bobo-3 Iodeto. ZA, a projecção máxima z com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Imagens de fixação e coloração Transgenic embriões a partir das AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 line. Esta linhagem transgênica expressa mEmerald-labeled histone2B (H2B) sob o controlo do promotor de alfa-tubulina 1, o qual marca o núcleos / cromatina ubiquamente ao longo de todo o desenvolvimento embrionário. O embrião foi posteriormente corado com Alexa Fluor 546 faloidina, que rotula o citoesqueleto / f-actina actina. ZA, a projecção máxima z com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

critério Tipo de microscópio de fluorescência
vasto campo convencional varredura a laser confocal luz folha baseada
configuração da lente objetiva uma lente objectiva, médio-alto NA duas lentes objectivas dispostas perpendicularmente, iluminação de baixa: NA, detecção de alta: NA
fonte de luz de iluminação filtros fonte de luz branca e apropriados (por exemplo, lâmpadas de mercúrio de arco curto)
ou baseada em LED com filtros de limpeza
laser com filtro de clean-up
(Por exemplo, lasers de diodo ou DPPS)
laser com filtro de clean-up
(Por exemplo, lasers de diodo ou DPPS)
iluminação por imagem bidimensional amostra inteira amostra inteira
(Exploração de feixe Gaussiano tipicamente bidimensional)
única plano focal
(DSLM: unidimensional de exploração de feixe Gaussiano)
detecção paralelo
(Tipicamente CCD ou scmos câmara)
sequencial
(Tubo fotomultiplicador)
paralelo
(Tipicamente CCD ou SCMOS câmera)
velocidade de imagem rápido (milissegundos por imagem) lentos (segundos por imagem) rápido (milissegundos por imagem)
out-of-focus de fluorescência nenhuma discriminação bloqueado quase completamente pelo orifício
(Eficiência rejeição depende de diâmetro)
quase inexistente
(Apenas devido à dispersão)
dimensões espaciais 2
(X / y)
3
(X / y / z)
3
(X / y / z)
mais graus de liberdade 2
(Tempo, o canal de fluorescência)
2
(Tempo, o canal de fluorescência)
3
(Tempo, o canal de fluorescência, sentido)
resolução lateral r
(0,6 λ / NA)
0,66 r
(0,4λ / NA)
r
(0,6 λ / NA)
a capacidade de corte óptico Não sim
(Discriminação na via de detecção)
sim
(discriminação na via de iluminação 75)
disponibilidade e preço predominantemente comercial, de baixo custo predominantemente comercial, caro comercial, caro
custom-built, 54,59,60,75 moderada
publicações imagens ao vivo cobrindo embriões Tribolium seis 44,76,77,78,79,80 sete 23,77,79,81,82,81
(confocal de disco giratório) 83,84,85
quatro 23,57,65,86

Tabela 1 - Características de fluorescênciaTécnicas nce Microscopia utilizados na Tribolium viver Imaging.

corante coloração diluição
SYTOX verde núcleos (distorcido) 1: 10000 (1: 100 em ddH2O e 1: 100 em 1% (w / v) de BSA em PBS)
YOYO-1 Iodeto envelope nuclear 1: 10000 (1: 100 em ddH2O e 1: 100 em 1% (w / v) de BSA em PBS)
Bobo-3 Iodeto envelope nuclear 1: 10000 (1: 100 em ddH2O e 1: 100 em 1% (w / v) de BSA em PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin citoesqueleto de actina 1: 100 (em 1% (w / v) de BSA em PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin citoesqueleto de actina

Tabela 2 - Soluções de coloração.

coluna de agarose
(Opção 1)
hemisfério
(opção 2)
titular teia de aranha
(opção 3)
análise racional embrião é incorporado em uma coluna de agarose, que é empurrado para fora de um capilar extremidade posterior do embrião é colada ao pólo de um hemisfério de agarose embrião é colada a uma película fina de agarose que mede um orifício ranhurado
suporte de amostras cilindro de aço com o pino cano de aço cilindro de aço com
orifício oblongo
ilimitada (qualquer) ilimitada (qualquer) quatro (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
nível de habilidade exigida moderado Alto baixo
agarose em torno do embrião Alto baixo moderado
número de embriões por sessão até três 1 até seis
recuperação de embrião complicado fácil fácil
equipamentos descartáveis capilares de vidro - -
recomendado para imagens ao vivo, embriões manchadas de curto prazo imagens ao vivo de longo prazo imagens ao vivo, embriões manchadas de longo prazo
<strong> referências três 23,87,88 dois 57,65 esta publicação

Tabela 3 - Montagem Métodos vantagens e desvantagens.

indução fenótipo aberracional análise racional degrau referência (metodológico)
interferência de ARN embrionário ARN de cadeia dupla é injectado em embriões na fase de blastoderme sincicial para knock-down um ou mais genes específicos injectar embriões após o passo 4.8. dois 33,81
interferência de ARN parental de cadeia dupla de RNA é injectada lateralmente no FEMAle pupas entre os segmentos abdominais 3 e 4, o que leva ao gene knock-down na descendência levar as pupas do Passo 1,5. dois 36,37
linhas mutantes letais embrionárias recessivos culturas de postura de ovos que transportam uma mutação letal rendimento heterozigótica embrionário recessiva cerca de 25% homozigoto descendência mutante cruzar linha mutante em linha de imagem durante o Passo 1,5. três 39,51,89
aplicação de factores extrínsecos certos factores bioactivos ou tóxicos são extrinsecamente aplicada aos embriões, adicionando-os para o buffer de imagiologia adicionar factor a tampão de imagens durante o passo 2.2. dois 83,85

Tabela 4 - LSFM Imagens ao vivo de aberracional fenótipos

Tabela Suplementar 1 - Metadados e parâmetros para o longo prazo conjuntos de dados de geração de imagens ao vivo DS0001-0003. Por favor clique aqui para baixar o arquivo.

Filme Suplementar 1 - Imagens ao vivo de um embrião Tribolium do AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgenic Line.
Esta linha exibe um padr de intensificador de armadilha expressão. O sinal de fluorescência é encontrado principalmente na serosa, o saco vitelino e um subconjunto de células neuronais. O embrião é mostrado ao longo de quatro orientações das 00:00 h 66:00 h para com um intervalo de 00:30 h entre os pontos de tempo. O filme começa no início da retração germband e termina quando o fecho dorsal está concluída. taxa de fotogramas é cinco quadros por segundo. ZA,máxima projecção z com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para baixar o arquivo.

Filme Suplementar 2 - Imagens ao vivo de um embrião Tribolium da linhagem transgênica Glia-azul.
O embrião é mostrado ao longo de quatro orientações das 00:00 h 66:00 h para com um intervalo de 00:30 h entre os pontos de tempo. O filme começa no início da retração germband e termina quando o fecho dorsal está concluída. taxa de fotogramas é cinco quadros por segundo. ZA, a projecção máxima z com ajuste de intensidade. Por favor clique aqui para baixar o arquivo.

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Discussion

Controle de qualidade

Em ensaios de imagens ao vivo, o processo de preparação e de gravação deve ser não-invasivo, isto é, nem a mecânica e de manuseamento de produtos químicos (recolha, dechorionation, de montagem no suporte da amostra) nem a carga de energia integrada durante a observação deve afectar a viabilidade do espécime. Para estudos que caracterizam o desenvolvimento WT, recomenda-se usar dados apenas a partir de experimentos em que o embrião sobrevive o processo de gravação, é recuperado com sucesso e se desenvolve em um adulto saudável. O adulto não deve apresentar aberrações morfológicas, deve ser fértil e sua descendência também deve ser fértil. Existem três razões principais para baixas taxas de sobrevivência, especialmente em ensaios de imagens ao vivo de longo prazo:

Em primeiro lugar, a superfície de embrião foi coberto extensivamente com agarose durante o Passo 7, o que provavelmente impede a troca de iões e de gás e constringe o mechan embriãocamente. embriões afetados, especialmente quando fotografada durante a embriogênese precoce, geralmente desenvolvem discretamente por várias horas, prender de repente e perder o seu sinal de fluorescência rapidamente. Com alguma experiência, a fracção da superfície que está incorporado em agarose, usando a técnica hemisfério pode ser mantida abaixo de um terço, enquanto que com a técnica de suporte de teia de aranha, no máximo, metade da superfície é coberta por uma camada muito fina de agarose. Em segundo lugar, a carga de energia integrada aplicada ao embrião excede a tolerância. Os valores indicados na Etapa 8.2 servirá como uma regra de ouro, mas os seguintes critérios devem ser considerados: (i) os embriões durante o desenvolvimento embrionário inicial não suportar a irradiação do laser, bem como embriões durante o desenvolvimento embrionário tardio, (ii) embora a energia integrado carga pode ser idêntico, maior potência do laser ou com tempo de exposição inferior ou intervalos temporais mais longos parece ser mais estressante do que menor potência do laser com um tempo de exposição elevada ou intervalos temporais mais curtos, Os comprimentos de onda (iii) mais elevados são tipicamente melhor tolerado e (iv) para as linhas transgicas, o limite de tolerância parece ser específico de linha, enquanto que a força de expressão fluoróforo parece ser inversamente proporcional à tolerância a irradiação com laser. Além disso, o desenho da protea de fus e / ou a localização intracelular também desempenhar um papel. Em terceiro lugar, o embrião é danificada durante o processo de montagem. O factor mais importante aqui é que o tempo de incubação na solução de hipoclorito de sódio é o mais curto necessário para remover completamente o cório. períodos de incubação mais longos pode prejudicar os embriões. Cuidado também deve ser feita a não perfurar ou espremer os embriões com a escova e para manter a montagem de agarose a uma temperatura ambiente. embriões danificados podem ser identificados durante o Passo 8.4 antes do processo de imagiologia efectiva começa, de modo que os embriões danificados podem ser substituídos por outros viáveis.

Seguindo estas orientações, tipicamente cerca de 85-90% do embryOS sobreviver ao procedimento de imagem ao vivo e escotilha. Cerca de 90% dos embriões eclodidos desenvolver em adultos saudáveis ​​e férteis. A taxa de sobrevivência parece ser independente de imagiologia de temperatura e de montagem técnicas (quando a coluna de agarose e é utilizado para imagiologia períodos de não mais do que metade de um dia), mas ligeiramente diminui com níveis elevados de irradiação laser. Como um controle adicional, especialmente durante a primeira caracterização de linhas transgénicas feitos por medida para fluorescência imagens ao vivo ou o quadro que cria fase como precursor para uma sequência abrangente experimental, recomenda-se a correr sem imagem WT e embriões transgénicos em paralelo ao fotografada embriões, as quais são incubadas na mesma temperatura medida que o embrião com imagens, e comparar o seu tempo de desenvolvimento e morfologia 65.

Além disso, estudos que caracterizam fenótipos aberracional (Tabela 4) por meio de imagens ao vivo também devem executar um c não afectadosembrião ontrolo em paralelo. Recomenda-se manter o tratamento de ambos os embriões tão semelhantes quanto possível, mas isso tem de ser considerado individualmente para cada estratégia experimental:

Knock-down por interferência com ARN.

Para interferência de ARN embrionário 33, 81, os embriões que derivam da mesma cultura de postura de ovos devem ou ser injectados com ARN de cadeia dupla funcional ou controlar. Os embriões injectados de forma diferente deve então ser trabalhada ao mesmo tempo na mesma LSFM usando a coluna de agarose ou a técnica de suporte de teia de aranha. Para interferência de ARN parental 36, 37, a cultura de imagem deve ser dividida em duas sub-culturas. pupas fêmea de uma subcultura deve ser injectados com o RNA de cadeia dupla funcional, enquanto que a outra subcultura deve ser injectada com ARN de controlo de cadeia dupla. coll embriãoexão devem ser realizados em paralelo, e tanto o experimental e o embrião de controlo pode ser trabalhada ao mesmo tempo no mesmo microscópio usando a coluna de agarose ou suporte técnica teia.

Recessivos embrionárias linhas mutantes letais.

Quando se trabalha com os mutantes recessivos embrionárias letais 39, 89, 91, 92, 93, uma cultura de postura de ovos de mutantes heterozigóticos, que são normalmente fenotipicamente discreto, o rendimento teoricamente 25% da progenia mutante homozigico (mas, por vezes, menor devido a um manuseamento prático emite 89) e 75% de descendência fenotipicamente discreto (50% mutantes heterozigotos e 25% WT). Recomenda-se usar a técnica de suporte teia de aranha para montar vários embriões de uma tal cultura de postura. Os mutantes homozigóticos pode ser identified ao longo do curso de imagiologia pela manifestação do fenótipo, enquanto que os embriões em desenvolvimento normalmente servir como controlos. O genótipo dos espécimes espelhados pode ser determinada uma vez e controlo de qualidade de imagem está completado.

Aplicação de fatores extrínsecos.

Se a influência de factores extrínsecos dentro da memória tampão de imagem 83, 85, por exemplo, substâncias bioactivas ou tóxicos, em desenvolvimento é investigada, imagiologia paralelo em conjunto com um embrião de controlo no mesmo LSFM não é normalmente possível. Portanto, a imagem tem que ser realizada sequencialmente. Optimamente, o tempo entre as experiências subsequentes é minimizada e os embriões derivam da mesma cultura de imagiologia. Alternativamente, dois identicamente construída e operada LSFMs pode ser utilizado. Neste caso, os embriões do mesmo período de postura deve ser usado, mas é de grande importância que the calibração de ambos microscópio é conduzido cuidadosamente de modo a que as propriedades de imagem são comparáveis. Ao usar a técnica de suporte de teia de aranha, múltiplos embriões para cada condição pode ser trabalhada de uma só vez. Com a técnica de coluna de agarose, os fatores extrínsecos pode ser impedido de alcançar os embriões.

Atuais limitações da abordagem imagens ao vivo LSFM

LSFM é uma ferramenta poderosa para analisar a morfogénese embrionária de forma não invasiva em várias dimensões em escala largos. procedimentos de operação padrão, tal como proposto no presente protocolo, vai apoiar o processo de estabelecer tecnologia folha de luz como uma ferramenta de padrão em biologia do desenvolvimento. No entanto, a abordagem é limitada por um certo número de factores em diferentes níveis experimentais e organizacionais:

Inicialmente, LSFM foi desenvolvido para analisar uma amostra de cada vez. Todos corrente se aproxima a imagem de dois ou mais embriões simultaneamente no mesmo microscópio b y 'empilhamento' a amostra ao longo do eixo y na coluna de agarose ou os endereços suporte da teia de aranha Este problema só até um certo grau. Configurações multi-poço placa- e à base de lamelas estão disponíveis 94, 95, 96. No entanto, eles sofrem de reduzida qualidade de imagem e sacrificar alguns dos benefícios essenciais de LSFM, tais como imagens, juntamente múltiplas direções. Atualmente, a melhor opção é trabalhar com vários microscópios em paralelo, que se torna razoavelmente viável quando os componentes caros, como o laser, são compartilhados 60.

Com o EFA-nGFP 57, 65, 84, 86 do FNL, o Brainy 58, 86, o AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, o AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 e o azul-Glia= "xref"> 58, apenas seis linhagens transgênicas feitos sob medida adequada para imagens ao vivo de longo prazo estão disponíveis no momento. Além disso, o HC079 (âmnio), G12424 (serosa) e G04609 (coração) potenciadoras linhas armadilha 51 foram caracterizados com LSFM 23. Alternativamente, embriões fluorescentes também pode ser gerado por ARNm 81 ou corante de injecção 79, essas abordagens são relativamente simples, mas também sofrem de limitações 86. Vários outros padrões são ainda necessários, tais como linhas ou linhas cytoskeletal-, organelle- e marcado com membranas que expressam fluoróforos sob certos promotores não ubíquos para observar apenas determinados órgãos ou tecidos. Idealmente, essas linhas estão também disponíveis com diferentes proteínas fluorescentes.

Outro desafio é o volume de dados gerado pelo LSFM. Devido à aquisição de informações em três dimensões espaciais e pelo menos três fugraus rther de liberdade (tempo, direção, canal de fluorescência), o tamanho de conjuntos de dados de imagem ao vivo pode facilmente chegar a muitos gigabytes de alguns terabytes. Mesmo após corte tridimensional e compressão baseada em ZIP dos recipientes TIFF, os três conjuntos de dados exemplificativos associados a este estudo têm tamanhos de 31.6, 12.6 e 45.1, ou seja, 89,3 gigabytes Gigabyte no total. Ao trabalhar com LSFM, é necessário ter a respectiva infra-estrutura para armazenamento e processamento 88, 97 dados.

A mais alta qualidade de imagem é obtida na superfície do embrião, mas com o aumento da profundidade, o sinal de fluorescência torna-se cada vez mais embaçada. Por exemplo, a extremidade posterior do germband fica coberta pela dobra do saco vitelino durante a gastrulação e não pode ser adequadamente resolvido (Figura 4C, primeiro para a quinta coluna). Imagem junto múltiplas direções resolve esse problema pelo menos uma parteei ra me - informações de alta qualidade a partir da superfície em todo o embrião está disponível, mas as regiões interiores permanecem difusos. Actualmente, não há soluções satisfatórios estão disponíveis, mas, a longo prazo, as proteínas fluorescentes de infravermelhos 98, abordagens genéticas 99 ou configurações de microscópio com óptica adaptativa 100 poderia ser considerado.

Adaptação para outras espécies

Até agora, LSFM foi usada para documentar o desenvolvimento embrionário de três espécies de insectos, por exemplo mosca da fruta Drosophila melanogaster 61, 62, 101, a escotilha mosca Megaselia abdita 102 e o vermelho farinha escaravelho Tribolium castaneum 57. O quadro experimental, procedimentos operacionais e técnicas convencionais de montagem aqui descritos should seja facilmente adaptáveis ​​a outras espécies de insectos. Os protocolos de transformação de linha germinativa para muitos insectos que pertencem a várias ordens estão disponíveis 103, incluindo espécies de importância económica e / ou médica, tais como as abelhas 104, vários lepidópteros 105, 106 ou várias espécies de mosquitos, 107, 108, 109. Com respectivas linhas transgénicas adequadas para imagiologia por fluorescência ao vivo, a morfogénese embrionária de insectos pode ser caracterizada, considerando simultaneamente as suas linhagens evolucionárias e / ou nichos ecológicos. Cerca de um milhão de espécies de insectos têm sido descritos e mais espécies vinte milhões de insectos mais provável existir 110, cobrindo mais do que 400 milhões de anos de evolução 2. Apenas a abordagem comparativa irá gerar informações que, por sua vez provides idéias que não podem ser obtidos através do estudo dos princípios de desenvolvimento de apenas uma única espécie.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Autor Contribuições

FS e EHKS concebeu a pesquisa. FS gerado as linhas AGOC transgénicos. imagiologia por fluorescência baseado em folha de luz foi realizado por FS e SK. FS e EHKS escreveu o manuscrito com a entrada de SK.

Acknowledgments

Agradecemos Sven Plath para suporte técnico. A linhagem transgênica Glia-azul era um presente amável de Gregor Bucher (Göttingen, Alemanha). A pesquisa foi financiada pelo Cluster de Excelência Frankfurt am Main para Complexos Macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, orador Volker Dötsch) concedido em parte para EHKS no Instituto Buchmann Molecular Ciências da Vida (BMLS, diretor Enrico Schleiff) no Goethe Universität Frankfurt am Main pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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Developmental Biology 122 Edição artrópodes inseto Coleoptera, Morfogênese a embriogênese a longo prazo de fluorescência imagens ao vivo não-invasivo microscopia de fluorescência baseada na folha de luz microscopia de luz tridimensional LSFM DSLM SPIM
Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões
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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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