Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Визуализации морфогенеза эмбрионов насекомых с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией стало состоянием искусства. Этот протокол описывает и сравнивает три монтажных методов , подходящих для Tribolium castaneum эмбрионов, представляет две новые заказные линии трансгенные хорошо подходят для живых изображений, обсуждает основные контроля качества и указывает на существующие экспериментальные ограничения.

Abstract

Красный жук муки Tribolium castaneum стала важной моделью насекомых организма в области генетики развития и эволюционной биологии развития. Наблюдение Tribolium эмбрионов с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными широкопольным и конфокальной флуоресцентной микроскопией. Из-за уникальных свойств светового листа на основе микроскопа, трехмерные изображения живых образцов могут быть записаны с высоким соотношением сигнал-шум и значительно уменьшить фото-отбеливание, а также фото-токсичностью по нескольким направлениям в течение периодов, которые длятся несколько дней. Обладая более чем четырех лет развития методологии и непрерывного увеличение данных, время представляется целесообразным установить стандартные рабочие процедуры для использования светотехники листов в сообществе Tribolium, а также в сообществе насекомых в целом. Этот протокол описывает три крепежных методов, пригодных еили различные цели, представляют два новых заказные трансгенные линии Tribolium подходят для долгосрочного живого изображения, предлагают пять флуоресцентных красители для маркировки внутриклеточных структур фиксированных эмбрионов и предоставляют информацию о данных постобработке для своевременной оценки записанных данных. Представитель результатов сосредоточиться на долгосрочном живом изображении, оптическое секционирование и наблюдении того же эмбрион вдоль нескольких направлений. Соответствующие наборы данных предоставляются в виде загружаемого ресурса. И, наконец, протокол обсуждает контроль качества для анализов живых изображений, существующих ограничений и применимости, указанных процедур к другим видам насекомых.

Этот протокол предназначен прежде всего для биологов развития, которые ищут решение визуализации, превосходящую стандартное лабораторное оборудование. Это способствует непрерывную попытке ликвидировать разрыв между технически ориентированными лабораториями / сообществами, которые разрабатывают и уточняют Microsкопировать методологически, и жизнь научные лаборатории / сообщества, которые требуют решения «подключи и работай» технических проблем. Кроме того, он поддерживает аксиоматический подход, который перемещает биологические вопросы в центре внимания.

Introduction

Красная мука жук Tribolium castaneum, который принадлежит к большому семейству чернотелок (Tenebrionidae), имеет долгую историю в области сельского хозяйства и наук о жизни и является вторым наиболее изученным модель модель насекомое организм после того, как плодовой мушки дрозофилы. В течение последних четырех десятилетий, она стала мощной и популярной моделью насекомых организм в генетике развития, эволюционной биологии развития и, в течение последних двадцати лет, в эмбриональном морфогенезе по целому ряду причин:

Drosophila и Tribolium оба принадлежат к Holometabola, но расходились около 300 миллионов лет назад 1, 2, 3, 4. В то время как эмбриональное развитие дрозофилы обычно считаются весьма производными, Tribolium показывает более наследственный режим Develтие , который найден в значительно большем количестве видов насекомых 5, 6, 7, 8, 9. Во - первых, Tribolium демонстрирует развитие не-инволютированную головы, то есть его ротовые и усики появляются уже в процессе эмбриогенеза 10, 11, 12, 13, 14, 15. Во- вторых, Tribolium следует принципам развития короткого ростка, т.е. брюшные сегменты последовательно добавляют из зоны роста задней во germband удлинением 16, 17, 18, 19. В- третьих, Tribolium развивается и позже деградируетдва внеэмбриональные мембраны , т.е. амнион, который покрывает только эмбрион вентрально, и серозное, который обволакивает эмбрион полностью 20, 21, 22. Обе мембрана играет важные морфогенетическое 23, а также защитную роль в отношении микроорганизмов , 24, 25 и 26 высыхания. В- четвертых, в зародыше развивающиеся ноги полностью работоспособны в течение личиночной стадии жизни и служат зачатков для взрослых ног во время куколки метаморфоза 27, 28, 29, 30, 31.

Из - за их малого размера и скромные требования, выращивание Tribolium в лаборатории довольно просто. Культуры дикого типа (WT) , штаммы или трансгенные линии , как правило , состоит из около 100-300 взрослых и может храниться в течение одного-литровых стеклянных бутылок (80 следа см 2) , заполненные от трех до четырех сантиметров (около 50 г) с ростовой средой, состоящей из полного зерна пшеницы муки с добавлением неактивных сухих дрожжей. Подача воды не требуется. Это позволяет даже небольшие лаборатории, чтобы держать десятки жука культур в пределах малых и средних коммерчески доступных инкубаторах насекомых. Более поздние стадии развития Tribolium (личинки примерно через четвертую возрастную стадию, куколки и взрослые) легко отделяются от ростовой среды путем просеивания. Синхронные эмбрионы получаются путем инкубирования взрослых в течение коротких периодов времени на яйцекладки среды. Для быстрого развития, жук культуры выдерживают при 32 ° C (около четырех недель в поколение), в то время складского учета обычно проводят при температуре 22-25 ° С (около десяти недель на поколение).

В течение последнего десятилетия, многие стандартные ТЕСhniques постепенно адаптированы и оптимизированы для Tribolium, как представлено в книгах Emerging модельных организмов 32. Большое значение имеют расширенный генетические методы , такие как эмбриональное 33, личиночной 34, 35 или родительская 36, 37 РНК - интерференции на основе гена нокдаун, зародышевой преобразование либо с PiggyBac 38, 39 или система транспозаза Минос 40 и CRISPR / геном cas9 на основе инжиниринг 41. Кроме того, Tribolium геном был секвенирован около десяти лет назад 42, и в настоящее время в третьем раунде генома узла выпуска 43, что позволяет эффективно и геном идентификации и систематический анализ генов 44 45, 46. Кроме того, геном четырех других видов жесткокрылых доступны для сравнительных генетических подходов 47, 48, 49, 50. В ассоциации с виртуализированным геномом, два крупномасштабных генетические анализы были выполнены, т.е. инсерционного мутагенеза экрана 51 и гена нокдаун экрана 52, 53 Систематическое РНК - интерференция основы.

Флуоресцентный живой визуализации с широкопольных, конфокальной или легкого листа на основе микроскопии (LSFM) позволяет наблюдать эмбриональных морфологии Tribolium как функцию времени (т.е. морфогенез) в многомерном контексте (таблица 1). В широкопольными и конфокальной флуоресцентной микроскопии excitция и излучение света направляется через ту же самую линзу объектива. В обоих подходах весь образец освещается для каждого записываемого двухмерной плоскости. Таким образом, образцы подвергают очень высокий уровень энергии. В LSFM, только флуорофоры в фокальной плоскости возбуждаются за счет расцепления освещения и обнаружения с помощью двух перпендикулярно расположенных линз объектива (фиг.1). LSFM поставляется в двух канонические реализаций - единственная плоскость освещения микроскопа (SPIM) и цифровой сканируется лазерный луч листа на основе флуоресцентного микроскопа (DSLM, рисунок 2) - и предлагает несколько важных преимуществ по сравнению с традиционными подходами: (я) внутренняя способность оптического секционирования, (II) хорошее осевое разрешение, (III) сильно сниженный уровень фото-отбеливания, (IV) очень низкая фото-токсичность, (v) высокое отношение сигнал-шум, (VI) относительно высокая скорость сбора данных, (VII) формирования изображения по нескольким направлениям и (VIб) более глубокое проникновение ткани за счет использования низкой освещенности числовая апертура линзы объектива 54, 55, 56.

LSFM уже успешно применяется в Tribolium к документу почти весь эмбриональный морфогенеза 57 и проанализировать принципы внеэмбрионального разрыва мембраны в начале закрытия дорсальных 23. Для того, чтобы повысить привлекательность LSFM в сообществе Tribolium и для науки насекомых в целом, это имеет большое значение для установления стандартных рабочих процедур и совершенствование методов, протоколов и пула ресурсов до уровня , где микроскоп становится простотой -Использование стандартного инструмента в развитии биологии лабораторий, а также биологические вопросы остаются в центре внимания.

Этот протокол начинается с основами Tribolium </ EM> выращивание, т.е. содержание, размножение и сбор эмбрионов. Далее, две экспериментальные стратегии проиллюстрированы: (я) живая визуализация заказных линий трансгенных и (б) формирования изображения фиксированных эмбрионов , которые были окрашенными флуоресцентными красителями (Таблица 2). Впоследствии три монтажные методы с несколько различными целями подробно описаны (рис 3 и таблицей 3): (я) агарозный колонок, (II) агарозное полушарие и (III) роман держатель паутины. Протокол затем объясняет процедуру сбора данных с LSFM. методы визуализации и ключевые соображения изложены. И, наконец, извлечение эмбриона объясняется и предложения для основной обработки данных предоставляются. В репрезентативных результатов, живые данные изображений из двух новых на заказ и глии-голубые 58 трансгенные линии показаны и соответствующие наборы данных изображений представлены в виде загружаемого ресурса. Кроме того, изображениеДанные фиксированных эмбрионов, которые были окрашены с различными флуоресцентными красителями представлены. Обсуждение фокусируется на контроле качества, существующих ограничения подхода живого изображения и адаптацию протокола к другим видам.

Протокол написан для легких листовых на основе флуоресцентных микроскопов, которые оснащены отборную камеру и с возможностью вращения механизма зажима для стандартных держателей образцов 54, 59, 60, которые , как правило цилиндрической формы элементы , изготовленные из металла, пластика или стекла с диаметром в миллиметровом диапазоне. Протокол также подходит для обоих канонические реализаций, т.е. SPIM и DSLM, а также для установок с двумя или более освещения и обнаружения оружия 61, 62, 63. Представительные результаты показывают данные в двух спектральных каналах, зеленый (ILLumination с 488 нм лазера, обнаружение с помощью 525/50 полосовой фильтр) и красный (освещение с 561 нм лазера, обнаружение через 607/70 полосовой фильтр), но протокол может быть расширена до трех или четырех спектральных каналов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Земледелие из Tribolium культур

Примечание: Стандартные условия определяются как при температуре инкубации 25 ° С и 70% относительной влажности в течение 12 ч светлых / 12 ч темнота. Для получения более подробной информации о Tribolium хозяйства, соответствующие рекомендации доступны 64. Этот протокол требует двух различных мучных на основе средств массовой информации, которые могут быть получены в килограммовых количествах и хранить в течение нескольких месяцев.

  1. До работы с мукой и неактивными сухими дрожжами, хранить запечатанные пакеты при -20 ° С в течение 24 часов, а затем дайте им прогреться до комнатной температуры. Эта процедура устраняет потенциальные патогены.
  2. Pass полных мук зерна пшеницы и неактивные сухие дрожжи через сито с 710 мкм размером ячеек, а затем подготовить среду для роста пути дополнения просеянной муки полного зерна с 5% (весом / весом) просеивают неактивные сухие дрожжи.
  3. Проходят 405 тонкую пшеничную муку и сухие дрожжи неактивные через сито с 250 & #181; м размер сетки, а затем подготовить яйцекладки среду, дополняя просеянную 405 пшеничной муки пшеницы с 5% (вес / вес) просеивают неактивный сухие дрожжи.
  4. Пропускают соответствующую культуру через Tribolium сито с Размер ячейки 800 мкм. Удалите остатки питательной среды. Переносят личинок, куколок и взрослых в большой стеклянной посуде.
  5. Если нет Потомство культуры не существует, передача около 80 личинок и / или куколок в новую стеклянную бутылку, чтобы создать новую культуру потомка. Если нет личинки и / или куколки присутствуют, занимает около 40 взрослых вместо этого. Добавьте 50 г среды роста и инкубировать при стандартных условиях.
  6. Собрать около 300 взрослых (500-700 мг) в другой новой стеклянной бутылке, чтобы установить культуру формирования изображения. Добавьте 50 г среды роста и инкубировать при стандартных условиях. Разрешить культуру изображения отстояться в течение по меньшей мере 24 ч в свежей ростовой среде до получения эмбрионов.
  7. Замените среду роста культуры изображений по крайней мере каждые два мыЭКС, которые могут быть сделаны в сочетании с отбором эмбрионов (см 3.2). После того, как два-три месяца, полностью заменить культуру изображения новых взрослыми от потомка культуры.
  8. Если не-гомозиготная трансгенная линия используются, викарий потомства культур часто путем удаления не-трансгенных животных. В идеале, генерируют гомозиготные линии, если соответствующий трансген не смертельно или вызывает стерильность, если находится на обеих хромосомах. Гомозиготные культуры, как правило, имеют более высокий средний уровень флуоресценции, и общие экспериментальные условия являются более узкими, так как только один генотип присутствует.

2. Настройка микроскопа и калибровка

Примечание: Зародыш Tribolium имеет переднюю-заднюю длину около 600-660 мкм и диаметр поперечного около 300-330 мкм. Большинство современных ПЗС - камеры имеют размер сенсорного чипа около 9 мм х 7 мм, то есть диаметр 11,4 мкм, и пиксель-пиксельный расстояние 6,45 мкм.В сочетании с 10 - кратным увеличением объективом в эмбрион может быть отображен в целом с шагом пикселя 0,645 мкм. Большинство современного sCMOS камера имеет больший размер сенсорного чипа около 16 мм х 14 мм, то есть диаметр 21,3 мкм, и пиксель-пиксельного расстояния 6,5 мкм. В сочетании с 20 - кратным увеличением объективом в эмбрион может быть отображен в целом с шагом пикселя 0,325 мкм.

  1. Вложить освещение и объективные обнаружения линзы микроскопа. Убедитесь, что лазеры и флуоресцентные фильтры соответствуют поглощению флуорофоры и спектры излучения очень хорошо.
  2. Установите камеру для образца в микроскоп. Заполните камеру образца с PBS, рН 7,4, или какой-либо другой соответствующий буфер изображения.
  3. Включение и калибровка микроскопа. Комплексная калибровка процедуры и рекомендации по устранению неполадок для заказных легких листовых на основе микроскопов (более конкретно для реализации DSLM) были опубликованы прeviously 65. Для коммерческих устройств, очень внимательно следовать инструкциям производителя. Неправильное обращение может привести к истощению камеры для образца среды и вызвать опустошение к инструменту, а также образцу.

3. Сбор Трансгенные или WT Эмбрионы

  1. Пропустите колонии изображений через сито с 800 мкм размером ячеек. Сбор взрослых жуков в новой стеклянной бутылке и добавляют 10 г яйцекладки среды. Инкубируйте яйцекладки культуру в течение 1 ч при 25 ° С и относительной влажности 70% в свете.
  2. Пропускает яйцекладки культуры через сито с 800-мкм размером ячеек, чтобы отделить взрослый от яйцекладки среды, которая содержит около 30-100 эмбрионов. Передача взрослых в новую стеклянную бутылку и добавить либо старую или 50 г свежей ростовой среды.
  3. Если наблюдение должно начинаться с равномерной стадии бластодерма (пример набора данных DS0002), инкубировать яйцекладки среды в течение 15 ч при 25 ° С и относительной влажности 70%. TО начать в начале germband ретракции (пример набора данных DS0001 и DS0003), инкубировать эмбрионов в течение 23 ч при 32 ° С и относительной влажности 70%. Если другие стадии развития желательно, обратитесь к соответствующей литературе 64, 65 и адаптировать время инкубации и / или температуры по мере необходимости.

4. Эмбрион Dechorionation

Примечание: Хорион внешний слой из яичной скорлупы и состоит из белков и полисахаридов. Это сильно легкий абсорбент, но не является необходимым для правильного развития и, таким образом, может быть химически удалено.

  1. Пропустите яйцекладку среды через сито с 300 мкм размером ячеек. Сбор эмбрионов в клеточный фильтр с 100 мкм размером ячеек и отбросить остатки яйцекладки среды.
  2. Подготовка 6-луночного планшета следующим образом: заполнить A1, A2, A3 и B3 скважин с 10 мл PBS, рН 7,4 и В1 и В2 скважин с 9 мл PBS. Затем осторожно добавить1 мл гипохлорита натрия до В1 и В2. Обратите внимание на ход шагов 4.3 до 4.8 под стерео микроскопа. гипохлорит натрия ВНИМАНИЯ вызывает коррозию.
  3. Вставьте сетчатый фильтр клеток в лунке (A1 PBS, рН 7,4) и мыть эмбрионы в течение одной минуты при осторожном перемешивании. Более крупные частицы муки должны отделяться от эмбрионов.
  4. Перенести сетчатый фильтр клеток к B1 скважины (гипохлорита натрия в PBS, рН 7,4) и встряхнуть пластину энергично в течение 30 с. Остальные частицы муки должны отделяться полностью из эмбрионов.
  5. Перенести сетчатый фильтр клеток к А2 скважины (PBS, рН 7,4) и мыть эмбрионов в течение 1 мин при осторожном перемешивании.
  6. Для dechorionation, передать сетчатый фильтр клеток на лунку (В2 гипохлорита натрия в PBS, рН 7,4). Встряхните пластину энергично, пока хориона разрывов и отсоединяется от эмбрионов. Хориона выглядит тонкой, полупрозрачный мембрана с рваными краями, в то время как dechorionated эмбрионы имеют простой силуэт.
  7. Передача йэлектронной ячейки сетчатого фильтра к A3 и (PBS, рН 7,4) и мыть эмбрионов в течение 1 мин при осторожном перемешивании. Если какие-либо фрагменты хориона все еще прикреплены к эмбрионам после мытья, повторите шаг 4.6.
  8. Хранить эмбрионы в лунке B3 (PBS, рН 7,4). Хранение в течение нескольких часов не вредит эмбрионы, но имейте в виду, что развитие продолжается.
  9. Для не гомозиготных трансгенных линий, удалить любые нефлуоресцентные эмбрионы, если это возможно. Для фиксации и окрашивания WT или трансгенных эмбрионов, продолжайте с шага 5. Для живого изображения трансгенных эмбрионов, продолжайте с шага 6.

5. желточной оболочки пермеабилизации, фиксация и Окрашивание

Примечание: желточная оболочка представляет собой внутренний слой из яичной скорлупы. Это непроницаемо для люминесцентных красителей и, таким образом, должно быть химически проницаемыми перед окрашиванием.

  1. Заполните сцинтилляционный флакон с раствором фиксации / пермеабилизации (1,5 мл 4% (масса / объем) параформальдегида в PBS рН 6,9 сй 1,5 мл н-гептан). Перенос эмбрионов с кисточкой на флаконах. Крышка ампулы с алюминиевой фольгой для защиты от света флуорофоров и инкубируют в течение 30 мин на ротационном платформе со скоростью 50 оборотов в минуту. ВНИМАНИЕ параформальдегид является токсичным и коррозионным, н-гептан является горючим и токсичен.
  2. Удалить фиксации раствора и лечения эмбрионов три раза в течение 15 мин в 3 мл 0,1% (об / об) Тритона X-100 в PBS, рН 7,4, а затем один раз в течение 15 мин в 3 мл 1% (об / об) Тритон Х-100 в PBS, рН 7,4 на качающейся платформе при 50 оборотах в минуту. ВНИМАНИЕ Тритон Х-100 вызывает коррозию.
  3. Удалить пермеабилизации раствора и добавляют 0,5 мл раствора окрашивания во флакон. Примеры окрашивания растворов приведены в таблице 2. Пятно эмбрионов в течение ночи при 4 ° С на ротационном платформе при 50 оборотах в минуту. Для красителей , предложенных в таблице 2, стиральная не является необходимым.

6. Подготовка Монтаж агарозном

  1. Добавляют 1 г легкоплавкойагарозы в 100 мл PBS, рН 7,4, и нагревает смесь в течение 2-3 мин в микроволновой печи при 800 W. Если мелкие частицы агарозов все еще присутствуют, повторите процесс нагрева в течение 30-секундных интервалов, пока частицы не растворятся полностью. Монтажа агарозном не нужно быть готовым свеже каждый раз, затвердевшей агарозы может быть повторно сжижается при нагревании, как описано выше. Этот процесс может повторяться 5-6 раза, прежде чем слишком много воды испарилась.
  2. Дайте агарозном остыть до приблизительно 40-45 ° С, а затем заполнить две 1,5 мл реакционных труб с нагретой агарозы и сохранить эти пробирки при 35 ° С в термоблоке.

7. Эмбрион Монтаж и вставки в отборную камеру

  1. Вариант 1: агарозном колонка (рис 3A -C, первый столбец; таблица 3, второй столбец)
    1. Заполните 1,0 мл шприца с дистиллированной водой и прикрепить его к одному из стеклянного капилляра отверстий с помощью небольшого резинового шланга.Заполните капиллярную наполовину дистиллированной водой.
    2. Выберите зародыш с кистью и поместите его на внутренней стороне другого отверстия стеклянной капиллярной. быстро переходите к следующему шагу, прежде чем эмбрион высыхает.
    3. Вставьте капилляр в жидкие агарозы и медленно сделать несколько мклы жидкие агарозы вместе с эмбрионом в капилляр. Затем быстро увеличить рисунок силы так, что эмбрион валяющаяся с агарозами. В конце концов, несколько мкл агарозы должна быть выше и ниже эмбриона. Установите капилляр в стороне в течение нескольких минут, и пусть агарозные затвердевать.
    4. Укорачивание капилляра с алмазным резцом стекла с длиной около 5 мм. Оставшийся фрагмент должен быть полностью заполнен агарозами и эмбрион должен быть в пределах второй квартили.
    5. Вставьте стальной цилиндр с штифтом в камеру для образца, а затем вставить фрагмент капиллярного на верхней части штифта. Колонку агарозы должны выступать на несколько миллиметров пПЗУ фрагмент капиллярного с той частью, которая содержит зародыш.
  2. Вариант 2: агарозное полушария (рис 3A -C, второй столбец, таблица 3, третий столбец)
    1. Draw 200 мкл жидкого агарозы в 1,0 мл шприца, а затем использовать его, чтобы заполнить стальную трубу из верхней части с агарозой до полусферы формы в нижнем отверстии. Диаметр полусферы должен быть равен диаметру трубы. Подождите несколько минут, пока агарозном затвердевает.
    2. Выберите зародыш с кистью и переставить его на кончике кисти так, чтобы передний конец становится доступным. Dip агарозов полушария в жидких агарозы, чтобы покрыть ее тонкую пленку.
    3. Поместите эмбрион с его передним концом в вертикальном положении на полюсе агарозного полушария. Включите стальную трубу вокруг и исправить положение эмбриона с кистью. В случае необходимости, стабилизации эмбриона добавлением 2 мкл агарозном к границе эмбриона / полушарие. идеальныйлы, менее половины поверхности эмбриона должны быть покрыты агарозой и боковые поверхности должны быть настолько большим, насколько это возможно.
    4. Вставьте стальную трубу с полусферой и эмбрион медленно в камеру для образца.
  3. Вариант 3: Паутина держатель (рис 3A -C, третий столбец, таблица 3, четвертый столбец)
    1. Выберите зародыш с кисточкой и отложите его в сторону.
    2. Накройте щелевое отверстие держателя паутинообразного с 5-8 мкл жидким агарозы, а затем удалить большую часть агарозы, пока только тонкая пленка остается агарозы.
    3. Поместите эмбрион на агарозную пленку и отрегулировать его положение. Аккуратно перенести эмбрион к оси х центру отверстия щелевого, и выровнять его удлиненную передне-заднюю ось с удлиненной осью щелевого отверстия.
    4. Вставьте держатель с паутиной смонтированного эмбрион медленно в камеру для образца. Расположите держатель таким образом, что паутина это не мешает с возбуждением и испусканиемсвет, то есть 45 ° по отношению к оси x и оси.

8. Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии

  1. Решите вместе, сколько направлений (и вдоль которых ориентация) эмбрион должен быть образом. Четыре направления (вдоль ориентация 0 °, 90 °, 180 ° и 270 °), как правило, обеспечивает хороший компромисс между покрытием и нагрузкой энергии.
  2. Настройка количества флуоресцентных каналов. Основные параметры для каждого канала лазерной линии, флуоресценция фильтр, мощность лазера и время экспозиции. Для длительного живого изображения, важно, что комплексная нагрузка энергии не превышает допустимое отклонение зародыша. Время экспозиции 25-50 мс обеспечивает быструю визуализацию, в то время как мощность лазера в диапазоне от 100 до 300 мкВт не должен влиять на жизнеспособность эмбриона. Для фиксированных образцов, времени экспозиции и мощности лазера может быть, по крайней мере в два раза.
  3. Для анализов живых изображений, настроить промежуток времени. КомпLete эмбриогенез Tribolium занимает около семи дней при комнатной температуре (23 ± 1 ° С) и немного меньше , чем три дня при 32-35 ° C 64. Определить временной интервал в соответствии с морфогенетических событий, которые должны быть соблюдены. Для коротких временных интервалов, рассмотреть возможность снижения времени экспозиции и мощности лазера (см 8.2).
  4. Поместите эмбрион в режиме передачи света вдоль х и у осей в центр поля зрения, не подвергая его лазер. Поворот эмбриона на 360 ° в 90 °, чтобы исследовать эмбрион для каких-либо повреждений, которые могли бы иметь место в процессе монтажа.
  5. Поворот вокруг эмбриона соответственно осей у , чтобы выровнять эмбриональные оси с осями микроскопа, например боковой осью с осью х, т.е. дорсовентральной оси с осью г. При использовании техники держателя паутинка, выравнивание может быть невозможным.
  6. В режиме флуоресценции, определяют Z-стек Foг каждое направление. Добавьте 25-50 мкм в качестве пространственного буфера перед и позади эмбриона. В том числе буфера, типичный г-стек охватывает около 350-400 мкм для эмбриона Tribolium. Кроме того, определяют расстояние между Z-, которое должно быть в четыре раза поперечный шаг, т.е. расстояние вдоль осей х и у-оси 66.
  7. Если два или более эмбрионов изображаются параллельно, перезагружать на 8.4 со следующим эмбрионом.
  8. Для длительного визуализации, убедитесь, что образец камера заполнена с достаточным количеством PBS, рН 7,4 или другого буфера изображений. Кроме того, закрыть отверстие камеры для образца.
  9. Начало процесса формирования изображения. Для длительного живого изображения, контролировать правильное приобретение по всем направлениям во всех каналах для всех эмбрионов. Время от времени проверяйте в течение следующих дней, что эмбрионы живы и в соответствующем положении.

9. Эмбрион индексирование и контроль качества

  1. После формирования изображения завершено, удалить держатель образца сэмбрионы из камеры для образца. Только эмбрионы из анализов живых изображений должны быть извлечены. Фиксировали и окрашивали эмбрионы могут быть отброшены.
  2. Если анализ живой визуализации проводили, передача эмбриона на предметное стекло. Для метода агарозной колонны, извлекают эмбрионы из окружающих агарозов с скальпелем, микро-ножом или лезвием бритвы. Для агарозной техники полушария, передать полушарие с плоской стороной к предметному стеклу. удаление Эмбрион не является необходимым. Для метода держателя паутинки, осторожно демонтировать эмбрионы из агарозы пленки с кистью. Инкубируйте объект слайд в небольшой стеклянной посуде в насыщенной атмосфере влажности при стандартных условиях до личинок люка.
  3. После вылупления переноса личинок в отдельные лунки 24-луночного планшета и добавляют 500 мг ростовой среды в каждую лунку. Инкубировать в стандартных условиях. Сравните общее время разработки и морфологию изображаемых личинок не-отображаемый WT и трансгенный larvая (см обсуждения). В анализах, которые характеризуют развитие WT, никаких явных морфологические отклонения не должны в идеале быть заметными.
  4. После того, как личинки развиваются здоровых взрослых, обеспечить их соответствующими партнерами WT одного и того же фоне деформации. После двух недель, проверьте для производства потомства. Также рассмотреть , чтобы проверить плодородие потомства скрещивания их среди равных. Только тогда, когда изображаемые эмбрионы развиваются в плодородные взрослый, которые производят плодородное потомство, процесс создания образа можно считать неинвазивным.

10. Изображение Обработка данных

Примечание: Для обработки данных изображения, с открытым исходным кодом программного обеспечения для обработки изображений ImageJ 67 или его производный FIJI 68 рекомендуется. Обе версии, а также полную документацию можно найти на www.imagej.net. Стандартный формат файла для данных LSFM это размеченный формат файла изображения (TIFF). Опция внутренней емкости позволяет STOгнев изображений стеки, такие как Z-стека или временных ряды г максимальных выступов в пределах одного файла, который можно открыть в ImageJ или ФИДЖАХ с помощью перетаскивания и падения.

  1. При необходимости вращать Z-стеку для выравнивания передне-задней оси зародыша с осью у (Изображение → Transform → Поворот). Обратите внимание, что параметры вращения должны быть установлены индивидуально для каждого направления, но не за промежуток времени и флуоресцентных каналов.
  2. Обрезка Z-стеки вдоль осей X, Y и Z-оси, так что только минимальный фон (20 - 40 пикселей вдоль х и у осей, 5 - 10 плоскостей вдоль оси г) остается (для х - и у-оси, с помощью Rectangular Selection Tool, а затем изображение → Crop; на оси г, использование Image → стеки → Инструменты → Кусочек хранитель). Обратите внимание, что параметры обрезки должны быть установлены индивидуально для каждого направления, но не для моментов времени и флуоресцентных каналов.
  3. Вычислить максимальную проекцию г для каждого г стеки(Image → Стеки → Z проекта, выберите Max Intensity). Расчеты проекции интенсивности процедуры данные упрощения, которые удаляют одно пространственное измерение.
  4. Для длительного данных живого изображения, рассмотреть возможность использования ImageJ или FIJI сценарий , который выполняет обработку шаги 10.1 10.3 для всех направлений, всех временных точках и во всех каналах флуоресценции 65. В идеале, конкатенации все максимальные Z проекции на канал и направлении и сохранить их в виде временных рядов в одном контейнере TIFF. В качестве альтернативы, BigDataViewer 69 плагин для ФИДЖИ может использоваться для навигации по терабайт-больших массивов данных.
  5. В зависимости от условий трансгенных линий и обработки изображений, корректировки динамических интенсивностей временных стеков могут быть желательны, чтобы из-за фото-отбеливания и / или колебания экспрессии флуорофора. Либо ImageJ- или FIJI-характеристическая функция Bleach Коррекция (Image → Настройка → Bleach Коррекция выберите Гистограмма Matching) или dedicaПрограммное обеспечение Ted 65 предлагается.
  6. Если эмбрион был записан и / или вдоль нескольких направлений и в нескольких каналах флуоресценции, горизонтальные комбинации из направлений (Image → Стеки → Инструменты → Объединить) и слияние канала (Изображение → Цвет → Объединить каналы) рекомендуются.
  7. Регистрация и слияние Z-стека , полученная по нескольким направлениям 70, в конечном счете , в сочетании с деконволюцией 71, позволяют рассчитать превосходящие трехмерных изображения однородного качества и изотропного разрешения. Обе подключаемые модули с открытым исходным кодом и предварительно установлен в ФИДЖИ, но они требуют наличия ориентиров (флуоресцентные микросферы, например , шарики) вокруг образца.
  8. С открытым исходным кодом рамка программного обеспечения для крупномасштабных количественного извлечения и анализа данных также доступна, например , для сегментации и отслеживания клеточных ядер 72 или CELраспознавания формы 73 л.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает экспериментальную основу для флуоресцентной визуализации живых или фиксированных и окрашенных эмбрионов Tribolium с LSFM. Из-за низкие уровни фото-отбеливание и фото-токсичность, является прямым следствием его способности оптического секционирования, LSFM особенно хорошо подходит для длительного живого изображения.

Роман AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 трансгенная линия выражает слитый белок histone2B-mEmerald под контролем альфа-тубулин 1 промотор 74. Это показывает энхансер ловушку, как образец 51 выражения, так как сигнал флуоресценции главным образом получают из серозных, желточного мешка и нескольких нейронных клеточных кластеров. Используя эту линию, 66 ч эмбрионального развития при комнатной температуре (23 ± 1 ° С) были записаны, покрывая germband втягивания и закрытие дорсального (Дополнительный Movie 1). Эталиния может быть использована для визуализации нейронных кластеров внутри головок придатков (фиг.4А) и динамики миграции серозной во время закрытия дорсального (фиг.). Роман AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 линия несет тот же самый трансген как линии # 4, но в другом месте генома. Это не показывает очевидный образец энхансер ловушки, но сигнал флуоресценции spatiotemporally Повсеместно обнаруживается , как описано ранее для этого промотора 74. Эта линия была отображена при переходе от гаструляции к germband удлинения , чтобы продемонстрировать способность оптического секционирования на два уровнях глубины (рис 4в). Еще одна особенность, особенно для живого изображения, является приобретение Z-стеки вдоль нескольких направлениях с помощью вращения образца, который является стандартом для LSFM установок, используемых в биологии развития. Так , например, в Глия-голубой 58 линии, вращение образца всеРМО наблюдение реорганизации глии клеток вдоль и вокруг брюшной нервной цепочки, а также динамики пролиферации в левой головной лопасти, которые можно увидеть только должным образом из спинного сайта, в том же эмбрион (рис 4D, Дополнительный Movie 2). Наборы данных живого изображения , связанные с этим исследования представлены в виде загружаемого ресурса, мета и доступа к информации можно найти в Дополнительной таблице 1.

Поскольку выбор трансгенных линий для живого изображения по-прежнему ограничен, малые флуоресцентные красители могут быть использованы для специфического обозначения внутриклеточных структур. Sytox Зеленый связывается с клеточными ядрами и могут быть визуализированы в зеленом канале, в то время как YOYO-1 и БОБО-3 Йодид связываются с ядерной оболочкой и могут быть визуализированы в зеленом или красном канале, соответственно (фиг.5А). Эти красители могут быть использованы для выделения эмбриональной-структурыУРЭС, такие как серозный рубец (рис 5B, первый столбец), задние вентральные серозные клетки (фигура 5В, второй столбец) или серозная-амнион-germband ткань три слоя , которая возникает во время закрытия окна серозного (фигура 5В, третьи пятая колонна). Двухцветное окрашивание позволяет визуализацию два внутриклеточных структур в одной и тот же эмбрион, например ядерную оболочку вместе с актиновым цитоскелетом, который может быть окрашивал Alexa Fluor-конъюгированным фаллоидин красителей. Например, YOYO-1 Йодид может быть объединен с фаллоидином 546 (фиг.5С), в то время как БОБО-3 может быть объединен с фаллоидином 488 (Рис 5D).

Это также удобно фиксировать и окрашивать трансгенные эмбрионы, которые уже выражают определенный флуоресцентный белок, так как процедура фиксации тушит собственную fluorescencе сигнал лишь незначительно. Например, зародыши из AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 трансгенной линии, в которых ядро обнаружено в зеленом канале, могут быть окрашены с фаллоидином 546 таким образом , что актиновый цитоскелет становится видимым в красном канале (рис 6 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Сравнение обычных Widefield, конфокальной лазерной сканирующей и световой листов на основе флуоресцентной микроскопии. Обычные Widefield эпи-флуоресцентная микроскопия использует ксеноновые лампы дуги / ртутную с соответствующими фильтрами или высокой мощностью светодиодами в качестве источников света. Для каждого приобретенного двухмерного изображения, весь образец освещаются без дифракционного светового конуса. В конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии, дифракционного гауссова лазерный луч подкожноanned через образец и флуоресценции обнаружена некогерентно точка за точкой. Подобно традиционным Widefield эпи-флюоресцентной микроскопии, весь образец освещается для каждого приобретаемого двумерного изображения. В легкой листовой основе флуоресцентной микроскопии, дифракционного гауссова лазерный луч освещает образец перпендикулярно оси детектирования. Флуоресцентный обнаруживаются либо плоский по плоскости или линии за линией. Во время приобретения двухмерного изображения, только небольшой объем по центру на фокальной плоскости объектива обнаружения испытывает воздействие света возбуждения. Оставшийся объем образца не горит, не способствует несфокусированному размытости, не страдает от фото-токсических эффектов и не теряет флуорофоры из-за фото-отбеливание. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ер-together.within-страница = "1"> фигура 2
Рисунок 2: Принцип Light Листовые на основе флуоресцентной микроскопии. В LSFM, освещение и обнаружение разделены на по меньшей мере два оптических пути. По крайней мере, одна руки освещения используются для генерации света листа (голубой), в то время как по меньшей мере один рычаг для определения оснащен соответствующим фильтром и камерой для параллельного обнаружения сигнала флуоресценции (зеленый). LSFM имеет две канонических реализации, единственный (или селективный) плоскость освещение микроскоп (голубой фон) и цифровой отсканированный лазерный луч лист микроскоп (красный фон). При перемещении образца и световой листов относительно друг друга, трехмерные изображения приобретаются. Информация по нескольким направлениям собирают путем вращения образца вокруг оси у, которая преимущественно ориентированной вдоль тяжести.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Три различных монтажные методы , используемые в записи эмбрионального развития Tribolium с Light Листовые на основе флуоресцентной микроскопии. (A) агарозном колонка относится к стальному цилиндру с небольшим штифтом , который толкает агарозы колонки, в которой эмбрион заделан, из стеклянного капилляра. Агарозном полушарие установлен на стальной трубе. Эмбрион прикрепляется к полюсу полусферы с небольшим количеством агарозы. Держатель Паутины представляет собой лист металла с щелевым отверстием, установленным на верхней части стального цилиндра. Эмбрион приклеен к тонкой пленке агарозов, которая охватывает тон щелевые отверстия. (B) Схема трех методов монтажа внутри светового лист микроскопа. (C) три способа монтажа , применяемые в DSLM. (D) Примеры изображение из эмбрионов глии-голубой трансгенной линии , записанной с помощью трех установочных методов. Эмбрионы, которые в начале germband ретракции, показаны с их задним концом ориентирована в сторону верхней части, чтобы соответствовать светопропускание изображения. FM, режим флуоресценции; З., г максимальная проекция с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Живая съемка Tribolium эмбрионов. (А </ Сильный>) Эмбрион из AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 линии при переходе от germband обратного хода на закрытие спинного. Эта линия демонстрирует паттерн экспрессии ловушки энхансера. Сигнал флуоресценции в основном в серозной, желточного мешка и нескольких нейронных кластеров клеток. Эмбриона показан в течение 15 часов с интервалом в 5 ч. В детализации изображения показывают кластеры клеток в головных придатках. Изначально кластеры еще покрыты серозные клетки (первая колонка), при разрыве серозного, клетки следуют вместе с поворотным движением головы. (В) То же эмбрион показан во время закрытия дорсального для 1:30 ч с интервалом в 0:30 ч. В детализации изображения показывают миграцию разорваны серозный над желтком. (С) Верхний ряд: зародышем AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 линии при переходе от гаструляцией к germband удлинения. Средний и нижний ряд: Холостой плоскости показаны на двух глубинах в течение 10:30 часов с интервалом в 1:30час (D) Эмбрион из глии-синей линии во время germband ретракции , показанного в течение 50:30 часов с интервалом в 07:30 ч. В детализации изображения показывают морфогенетическое реорганизацию глиальных клеток в левой доле головного. З., г максимальная проекция с регулировкой интенсивности; PA одной плоскости с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Фиксация, Окрашивание и Iimaging из WT Эмбрионы во время Germband Относительное удлинение. (A) Эмбрионы окрашивали либо Sytox Грин, т.е. нечеткого окрашивающим ядра, или YOYO-1 иодид или БОБО-3 йодид, то есть два пятна ядерной оболочки. (Б) YOYO-1 Йодид окрашенной Embryо. Детали показывают серозной шрам (первый столбец), ядерная оболочку из больших задних-вентральных серозных клеток (второй столбец) или трехслойной организацию в ткани серозного, амнион и собственно эмбриональную ткань (третий к пятому колонке). (С) двухцветного окрашиванием с YOYO-1 йодидом и фаллоидином 546. (D) двухцветное окрашиванием с фаллоидином 488 и БОБО-3 йодидом. З., г максимальная проекция с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Изображения фиксировали и окрашивали трансгенные эмбрионы от AGOC {ATub 'Н-mEmerald} # 1 линии. Эта трансгенная линия выражает mEmerald-меткуред histone2B (Н) под контролем промотор альфа-тубулин 1, который отмечает ядра / хроматин Повсеместно в течение всего эмбрионального развития. Эмбрион был дополнительно окрашивали Alexa Fluor 546 фаллоидина, который маркирует актиновый цитоскелет / F-актин. З., г максимальная проекция с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

критерий флуоресцентный микроскоп типа
обычное широкое поле конфокальной лазерной сканирующей свет листа на основе
Цель установки объектива одна линза объектива, средневысокая Н.А. два перпендикулярно расположенных линз объектива, освещение: низкий NA, обнаружение: высокое NA
источник света освещения источник белого света и соответствующие фильтры (например , ртуть короткой дуговые лампы)
или LED на основе с очисткой фильтрами 		лазер с очисткой до фильтра
(Например , диод или ДЭС лазеры) 		лазер с очисткой до фильтра
(Например , диод или ДЭС лазеры)
Подсветка в двухмерное изображение весь образец весь образец
(Обычно двумерное сканирование гауссова пучка) 		только в фокальной плоскости
(DSLM: одномерное гауссово развертки луча)
обнаружение параллельно
(Обычно ПЗС или sCMOS камера) 		последовательный
(Фотоэлектронный умножитель) 		параллельно
(Обычно ПЗС или ДOS камеры)
скорость визуализации быстрые (миллисекунды на каждое изображение) медленные (секунды на каждое изображение) быстрые (миллисекунды на каждое изображение)
вне фокуса флуоресценции отсутствие дискриминации почти полностью заблокирован по точечным
(Эффективность отторжения зависит от диаметра) 		практически не существует
(Только из-за рассеяния)
пространственные размеры 2
(Х / у) 		3
(Х / у / г) 		3
(Х / у / г)
дополнительные степени свободы 2
(Время, флуоресценция канал) 		2
(Время, флуоресценция канал) 		3
(Время, флуоресценция канал, направление)
латеральное разрешение р
(0,6 λ / NA) 		0,66 г
(0,4λ / NA) 		р
(0,6 λ / NA)
способность оптического секционирования нет да
(Дискриминация в пути обнаружения) 		да
(дискриминация в осветительном пути 75)
наличие и цены преимущественно коммерческий, низкая стоимость преимущественно коммерческие, дорого коммерческие, дорого
несерийный, умеренная 54,59,60,75
публикации живых изображений , охватывающих Tribolium эмбрионов шесть 44,76,77,78,79,80 семь 23,77,79,81,82,81
(вращающийся диск конфокальной) 83,84,85 		четыре 23,57,65,86

Таблица 1 - Характеристики флуоресцирующиесть Микроскопия методы , используемые в Tribolium живого изображения.

краситель окрашивание разведение
Sytox Зеленый Ядра (нечеткий) 1: 10000 (1: 100 в DDH 2 O и 1: 100 в 1% (вес / объем) БСА в PBS)
YOYO-1 йодид ядерная оболочка 1: 10000 (1: 100 в DDH 2 O и 1: 100 в 1% (вес / объем) БСА в PBS)
БОБО-3 Йодид ядерная оболочка 1: 10000 (1: 100 в DDH 2 O и 1: 100 в 1% (вес / объем) БСА в PBS)
Alexa Fluor 488 фаллоидин актина цитоскелета 1: 100 (1% (вес / объем) БСА в PBS)
Alexa Fluor 546 фаллоидин актина цитоскелета

Таблица 2 - Окрашивание решения.

агарозном колонка
(Опция 1) 		полусфера
(вариант 2) 		держатель паутинка
(вариант 3)
обоснование Эмбрион встроен в агарозном столбец, который выталкивается из капилляра Задний конец зародыша приклеен к полюсу из агарозного полушария эмбрион приклеен к тонкой пленке агарозного остовнога выдолбленного отверстия
держатель образца стальной цилиндр со штырем стальная труба стальной цилиндр с
щелевое отверстие
неограничен (любой) неограничен (любой) четыре (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
Необходимый уровень квалификации умеренный высокая низкий
агарозном вокруг зародыша высокая низкий умеренный
количество эмбрионов на каждую сессию до трех один до шести
извлечения эмбриона запутанный легко легко
Одноразовое оборудование стеклянные капилляры - -
рекомендуется для краткосрочные живая визуализация, окрашенные эмбрионы долгосрочные жить изображения долгосрочные живая визуализация, окрашенные эмбрионы
<сильные> ссылки три 23,87,88 два 57,65 эта публикация

Таблица 3 - Методы монтажа Преимущества и недостатки.

аберрационную- индукции фенотипа обоснование шаг ссылка (методологический)
эмбриональная РНК-интерференции двухцепочечная РНК вводит в эмбрионов во время стадии синцитиальной бластодермы постучать вниз один или несколько специфических гены вводить эмбрионы после шага 4.8. два 33,81
интерференции РНК родительского двухцепочечный РНК вводятся в боковом направлении в FEMAле куколок между брюшными сегментами 3 и 4, что приводит к генной нокдаун в потомстве взять куколка из шага 1.5. два 36,37
рецессивные летальные эмбриональные линии мутантных яйцекладущие культуры, которые несут рецессивный эмбриональный летальные мутации гетерозиготного выход около 25% гомозиготного мутанта потомства пересекают мутантной линии в линии формирования изображения во время шага 1.5. три 39,51,89
применение внешних факторов некоторые биологически активные или токсичные факторы наружно применяются к эмбрионам, добавив их в буфер изображения добавить фактор в буфер формирования изображения во время шага 2.2. два 83,85

Таблица 4 - LSFM Живая съемка аберрационную- фенотипов

Дополнительный Таблица 1 - Метаданные и параметров для долгосрочного Datasets Live-изображений DS0001-0003. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить файл.

Дополнительный Movie 1 - Живая съемка эмбриона Tribolium из AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 трансгенной линии.
Эта линия демонстрирует паттерн экспрессии ловушки энхансера. Сигнал флуоресценции в основном находится в серозной, желточного мешка и подмножества нейрональных клеток. Эмбриона показан вдоль четырех ориентаций с 00:00 ч до 66:00 ч с интервалом 00:30 ч между точками времени. Фильм начинается в начале germband втягивания и заканчивается, когда закрытие спинного завершаются. Частота кадров составляет пять кадров в секунду. ZA,г максимальная проекция с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить файл.

Дополнительный Movie 2 - Живая съемка эмбриона Tribolium из глии-голубой трансгенной линии.
Эмбриона показан вдоль четырех ориентаций с 00:00 ч до 66:00 ч с интервалом 00:30 ч между точками времени. Фильм начинается в начале germband втягивания и заканчивается, когда закрытие спинного завершаются. Частота кадров составляет пять кадров в секунду. З., г максимальная проекция с регулировкой интенсивности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Контроль качества

В анализах живых изображений, процедура подготовки и записей должна быть неинвазивной, то есть ни механический и обработки химических (сбор, dechorionation, монтаж на держатель образца) , ни интегрированной энергетической нагрузку во время наблюдения должна влиять на жизнеспособность образца. Для исследований, которые характеризуют развитие WT, рекомендуется только использовать данные из экспериментов, в которых эмбрион выживает процесс записи, успешно восстановлена ​​и развивается в здоровых взрослых. Взрослый не должен показывать каких-либо морфологических отклонений, должна быть плодородной и его потомство должно также быть плодородной. Есть три основных причины низких показателей выживаемости, особенно в долгосрочных анализах живого изображения:

Во-первых, поверхность эмбрион был широко освещалось с агарозой во время шага 7, который, вероятно, препятствует ионный обмен и газа и сужает эмбриона Mechanчески. Пораженные эмбрионы, особенно когда изображаются во время раннего эмбриогенеза, как правило, развиваются незаметно в течение нескольких часов, арестовывать внезапно и теряют флуоресцентный сигнал быстро. С некоторым опытом, поверхность фракция, которая встроена в агарозе с использованием техники полусферы может быть ниже одной трети, в то время как с техникой держателя паутинка, не более половины поверхности покрыта очень тонким слоем агарозы. Во-вторых, интегрированная энергетическая нагрузка, приложенная к эмбриону превышает допуск. Значения, приведенные в пункте 8.2 служат правило, но следующие критерии следует учитывать следующее: (I) эмбрионов на ранних стадиях эмбрионального развития не переносят лазерное облучение, а также эмбрионов в конце эмбрионального развития, (II), хотя интегральную энергию нагрузка может быть идентичной, выше, мощность лазера или с меньшим временем экспозиции или более длинными временными интервалами оказывается более напряженными, чем более низкая мощность лазера с высоким временем экспозиции или более короткими временными интервалами, (III) более высокие длины волны, как правило, лучше переносятся и (IV) для трансгенных линий, предел допуска по-видимому, линейные конкретно, в то время как флуорофоры сила выражения, как представляется, обратно пропорциональна толерантности лазерного облучения. Кроме того, конструкция гибридного белка и / или внутриклеточная локализация также играют определенную роль. В-третьих, эмбрион поврежден в процессе монтажа. Наиболее важным фактором здесь является то, что время инкубации в растворе гипохлорита натрия короче по мере необходимости, чтобы полностью удалить хориона. Более длительное время инкубации может повредить эмбрионы. Следует также принимать, чтобы не прокалывать или сжать эмбрионы с щеткой и держать монтаж агарозов при температуре окружающей среды. Поврежденные эмбрионы могут быть определены в шаге 8.4 до фактического процесса визуализации начинается, так что поврежденные эмбрионы могут быть заменены жизнеспособными.

Следуя этим принципам, как правило, около 85-90% от ЭмбриОС пережить процедуру живого изображения и люк. Около 90% из вылупившихся эмбрионов развиваются в здоровые и плодовитые взрослый. Коэффициент выживаемости по-видимому, не зависит от температуры и визуализации монтажа методов (когда агарозном столбец используется для периодов, визуализирующих не более половины суток), но слегка уменьшается с повышенными уровнями лазерного излучения. В качестве дополнительного контроля, особенно во время первоначальной характеризации заказных трансгенных линий для флуоресцентной живого изображения или рамок, устанавливающих фазы в качестве предшественника для комплексной экспериментальной последовательности, рекомендуется работать без изображенную WT и трансгенных эмбрионов параллельно до изображаемого эмбрионы, которые инкубируют при той же температуре, что и изображаемым эмбрион, и сравнить их время разработки и морфологии 65.

Кроме того, исследование , которые характеризуют аберрационные фенотипы (таблица 4) посредством живого изображения должны также запустить незатрагиваемый грontrol эмбриона параллельно. Рекомендуется держать лечение обоих эмбрионов, чем аналогичные, как это возможно, но это должно рассматриваться индивидуально для каждой экспериментальной стратегии:

Knock вниз с помощью РНК - интерференции.

Для эмбриональной РНК интерференции 33, 81, эмбрионы , которые вытекают из того же яйцекладки культуры либо должны быть введены с функциональной или контролировать двухцепочечной РНК. В по-разному инъецированные эмбрионы должны затем быть отображены одновременно в одной и той же LSFM, используя либо колонку агарозы или технику держателя паутиной. Для родительской РНК - интерференции 36, 37, культура формирования изображения должна быть разделена на две субкультур. Женские куколки одной субкультуры следует вводить с функциональным двухцепочечным РНКОМ, а другая субкультура должна быть введена с контрольной двухцепочечной РНК. Эмбрион Collпрогиб должен быть выполнен параллельно, и как экспериментальный и контрольный эмбрион может быть отображен одновременно в одной и тот же микроскопе с помощью агарозы колонки или техники держателя паутины.

Рецессивные эмбриональные летальные мутантные линии.

При работе с рецессивными эмбриональными летальными мутантами 39, 89, 91, 92, 93, яйцом укладки культура гетерозиготных мутантов, которые обычно фенотипический незаметными, урожайность теоретически 25% гомозиготное мутантное потомство (но иногда меньше из - за практическую обработку выдает 89) и 75% фенотипически незаметной потомстве (50% гетерозиготных мутантов и 25% WTS). Рекомендуются использовать метод держателя для крепления паутины несколько эмбрионов от такой яйцекладки культуры. В гомозиготные мутанты может быть яdentified на протяжении визуализации проявления фенотипа, в то время как обычно развивающиеся эмбрионы служат в качестве контроля. Генотип отображенных образцов может быть определен после получения изображений и контроль качества будут завершены.

Применение внешних факторов.

Если влияние внешних факторов в буфере изображений 83, 85, например , биологически активные или токсичные вещества, на развитие исследуются, параллельная визуализация вместе с контрольным эмбрион в том же LSFM , как правило , не представляется возможным. Таким образом, отображение должно быть выполнено последовательно. Оптимально, время между последующими экспериментами сведено к минимуму и эмбрионы вытекают из одной и той же культуры формирования изображения. Альтернативно, два одинаково построены и эксплуатируются LSFMs могут быть использованы. В этом случае следует использовать эмбрионы из того же яйцекладки период, но это имеет большое значение, что ЧТэлектронная калибровка обоихов микроскопа тщательно проводится таким образом, что свойства визуализации сопоставимы. Используя технику держателя паутину, несколько эмбрионов для каждого условия могут быть отображены одновременно. С помощью метода агарозных колонок, внешние факторы могут быть затрудненными от достижения эмбрионов.

Существующие ограничения подхода LSFM живого изображения

LSFM является мощным инструментом для анализа эмбрионального морфогенеза неинвазивен в нескольких широких масштабных размерах. Стандартные процедуры эксплуатации, как предложено в этом протоколе, будет поддерживать процесс, чтобы установить светлую технологию листа в качестве стандартного инструмента в биологии развития. Тем не менее, этот подход ограничивается целым рядом факторов на различных экспериментальных и организационных уровнях:

Первоначально LSFM был разработан для анализа одного образца одновременно. Все современные подходы, что изображение двух или более эмбрионов одновременно в одной и той же микроскоп б у «укладки» образца вдоль оси у в столбце агарозном или держатель адресов Паутина Эта проблема только до определенной степени. Multi-хорошо пластинчатые и покровная на основе установки доступны 94, 95, 96. Тем не менее, они страдают от снижения качества изображения и принести в жертву некоторые существенные выгоды от LSFM, таких как изображения по нескольким направлениям. В настоящее время, лучший вариант для работы с несколькими микроскопов параллельно, что становится достаточно возможным , когда дорогостоящие компоненты, такие как лазер, являются общими 60.

С EFA-nGFP 57, 65, 84, 86 НОС, то Брейни 58, 86, то AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, то AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 и Глия-голубые= «Xref»> 58, только шесть заказных трансгенные линии , пригодные для длительного живого изображения в настоящее время доступен. Кроме того, HC079 (амнион), G12424 (серозный) и G04609 (сердце) энхансер ловушки линия 51, были охарактеризованы с LSFM 23. Альтернативно, флуоресцентные эмбрионы могут также быть получены с помощью мРНК 81 или красителя инъекции 79, эти подходы являются относительно простыми, но также страдают от ограничений 86. Еще несколько стандартов по-прежнему необходимы, такие как cytoskeletal-, organelle- и мембранных меченные линии или линии, которые экспрессируют флуорофоры при определенных без вездесущих промоторов наблюдать только определенные органы или ткань. В идеале, эти линии также доступны с различными флуоресцентными белками.

Еще одной проблемой является объем данных генерируется LSFM. В связи с приобретением информации в трех пространственных измерениях и, по меньшей мере, три-фуrther степеней свободы (время, направление, флуоресценция канал), размер наборов данных живых изображений можно легко добраться до многих гигабайтов до нескольких терабайт. Даже после того, как три-размерное кадрирования и ZIP на основе сжатия TIFF контейнеров, три примерных наборов данных , связанные с этим исследованием , имеют размеры 31,6, 12,6 и 45,1 гигабайта, то есть 89,3 Gigabyte в целом. При работе с LSFM, необходимо иметь соответствующую инфраструктуру для хранения и обработки 88, 97 данных.

Высочайшее качество изображения получается на поверхности эмбриона, но с увеличением глубины, сигнал флуоресценции становится все более и более размытым. Например, задний конец germband покрывается желточный мешок складка во время гаструляции и не может быть надлежащим образом решен (рис 4C, с первым по пятому колонку). Изображения по нескольким направлениям решают эту проблему, по крайней мере, частьially - информация высокого качества с поверхности все вокруг зародыша есть в наличии, но внутренние области остаются размытыми. В настоящее время, не удовлетворяющие решения не доступны, но , в конечном счете, инфракрасные флуоресцентные белки 98, генетические подходы 99 или микроскоп установка с адаптивной оптикой 100 может быть рассмотрены.

Адаптация для других видов

К настоящему времени , LSFM был использован для документирования эмбрионального развития трех видов насекомых, то есть плодовая мушка дрозофилы 61, 62, 101, ниша полететь Megaselia abdita 102 и красного жук муки Tribolium castaneum 57. Экспериментальная база, стандартные операционные процедуры и монтажные методы, описанные здесь Шоулиd легко адаптироваться к другим видам насекомых. Зародышевые линия протоколы трансформации для многих насекомых , которые принадлежат к различным заказам доступны 103, в том числе видов экономического и / или медицинского значения, такие как пчелы 104, несколько чешуекрылых 105, 106 или нескольких видов комаров 107, 108, 109. С соответствующими трансгенных линий, подходящих для флуоресцентного живого изображения, эмбриональный морфогенез насекомых можно охарактеризовать при рассмотрении их эволюционных и / или экологические ниши. Около одного миллиона видов насекомых были описаны и еще двадцать миллионов видов насекомых , скорее всего , существуют 110, охватывающие более чем 400 миллионов лет эволюции 2. Только сравнительный подход будет генерировать информацию, что, в свою очередь ProViдез идеи, которые не могут быть получены путем изучения закономерности развития только одного вида.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Автор Вклады

FS и EHKS задумывали исследование. FS генерируется трансгенный AGOC линии. Свет листа на основе изображения флуоресценции проводили с помощью ФС и SK. FS и EHKS написал рукопись с участием SK.

Acknowledgments

Мы благодарим Свен Плата за техническую поддержку. Глия-голубой трансгенная линия была своего рода подарок от Грегор Бачер (Геттинген, Германия). Исследование финансировалось Скопление Превосходство Франкфурт-на-Майне для макромолекулярных комплексов (CEF-MC, EXC 115, динамик Фолькер Дотш) предоставившей частично EHKS в Buchmann Института молекулярной Life Sciences (BMLS, режиссер Энрико Шлифф) в Гете Universität Франкфурт на Майне Немецким Исследовательским (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Биология развития выпуск 122 членистоногий насекомые жесткокрылый, Морфогенез эмбриогенез неинвазивное долгосрочные флуоресценции в прямом эфире формирование изображения свет лист на основе флуоресцентной микроскопии трехмерная световая микроскопия LSFM DSLM SPIM
Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Эмбрионы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter