Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Avbildning av morfogenes av insektsembryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har blivit teknikens ståndpunkt. Detta protokoll beskriver och jämför tre monteringstekniker som är lämpliga för Tribolium castaneum embryon, introducerar två nya skräddarsydda transgena linjerna väl lämpade för levande avbildning, diskuterar väsentliga kvalitetskontroller och indikerar aktuella experimentella begränsningar.

Abstract

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum har blivit en viktig insekt modellorganism i utvecklingsgenetik och evolutionär utvecklingsbiologi. Observationen av Tribolium embryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har flera fördelar jämfört med konventionell widefield och konfokal fluorescensmikroskopi. På grund av de unika egenskaperna hos en ljus ark baserad mikroskop, kan tredimensionella bilder av levande exemplar registreras med högt signal-till-brusförhållanden och signifikant reducerad fotoblekning liksom foto-toxicitet längs flera riktningar över perioder som varar flera dagar. Med mer än fyra år av metodutveckling och en kontinuerlig ökning av data, verkar tiden lämpligt att fastställa standardrutiner för användning av ljus ark teknik i Tribolium samhället samt i insekts samhället i stort. Detta protokoll beskriver tre monteringstekniker lämpliga feller olika syften, presenterar två nya skräddarsydda transgena Tribolium linjer lämpliga för långsiktig levande avbildning, föreslår fem fluorescerande färgämnen för att märka intracellulära strukturer fasta embryon och ger information om uppgifter efterbehandling för tid utvärdering av de registrerade uppgifterna. Representativa resultat koncentrera sig på långsiktig levande avbildning, optisk sektione och observationen av samma embryo längs flera riktningar. Respektive dataset tillhandahålls som en nedladdningsbar resurs. Slutligen diskuterar protokoll kvalitetskontroller för live imaging assays, aktuella begränsningar och tillämpligheten av de beskrivna förfarandena till andra insektsarter.

Detta protokoll är främst avsedd för utvecklingsbiologer som söker bildlösningar som överträffar standardlaboratorieutrustning. Det främjar den kontinuerliga försök att stänga gapet mellan de tekniskt inriktade laboratorier / samhällen, som utvecklar och förbättra microskopiera metodiskt och life science laboratorier / samhällen, som kräver 'plug-and-play' lösningar på tekniska utmaningar. Dessutom stöder ett självklart synsätt som flyttar biologiska frågor i centrum för uppmärksamheten.

Introduction

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum, som tillhör den stora familjen av mjölmaskar (Tenebrionidae), har en lång historia inom jordbruks- och biovetenskap och är den näst bäst studerade modellen insekt modellorganism efter bananfluga Drosophila melanogaster. Under de senaste fyra decennierna, blev det en mäktig och populär insekt modellorganism i utvecklingsgenetik, i evolutionär utvecklingsbiologi och under de senaste tjugo åren, embryonala morfogenes för en rad olika skäl:

Drosophila och Tribolium båda tillhör Holometabola, men avvek ungefär 300 miljoner år sedan 1, 2, 3, 4. Medan den embryonala utvecklingen av Drosophila anses allmänt som mycket härstammar visar Tribolium mer fäderneärvda sätt develling som finns i en betydligt större andel av insektsarter 5, 6, 7, 8, 9. För det första, Tribolium uppvisar icke-inrullade huvud utveckling, dvs dess mundelar och antenner uppstår redan under embryogenes 10, 11, 12, 13, 14, 15. För det andra, Tribolium följer principerna för kortgroddar utveckling, dvs abdominala segmenten tillsätts i tur och ordning från en bakre tillväxtzonen under germband töjning 16, 17, 18, 19. För det tredje utvecklar Tribolium och senare bryts nedtvå extra-embryonala membranen dvs amnion, som täcker embryot endast ventralt, och serosa, vilket omsluter embryot helt 20, 21, 22. Båda membranen spelar en avgörande morfogenetiska 23 liksom skyddande roll mot mikroorganismer 24, 25 och uttorkning 26. För det fjärde, de embryonal utveckling benen är fullt fungerande under larvstadiet och fungera som primordia för vuxna ben under PUPP metamorfos 27, 28, 29, 30, 31.

På grund av sin ringa storlek och blygsamma krav, är odling av Tribolium i laboratoriet ganska enkelt. Kulturer av vildtyp (WT) stammar eller transgena linjerna består typiskt av omkring 100-300 vuxna och kan hållas inom en-liters glasflaskor (fotavtryck 80 cm 2) fylld tre till fyra centimeter hög (omkring 50 g) med tillväxtmedium som består av full grain vete mjöl kompletterat med inaktiv torrjäst. En vattenförsörjning är inte nödvändigt. Detta gör att även små laboratorier för att hålla dussintals skalbagge kulturer inom små och medelstora kommersiellt tillgängliga insekts inkubatorer. Senare utvecklingsstadier Tribolium (larver efter ungefär den fjärde stadiet, puppor och vuxna) kan lätt separeras från tillväxtmediet genom siktning. Synkroniserade embryon erhålls genom inkubation vuxna för korta perioder på äggläggning medium. För snabb utveckling, är skalbagge kulturer hölls vid 32 ° C (omkring fyra veckor per generation), medan lagerhållning utförs typiskt vid 22-25 ° C (cirka tio veckor per generation).

Inom det senaste decenniet har många standard techniques har successivt anpassas och optimeras för Tribolium, som sammanfattas i Emerging modellorganismer böcker 32. Av stor betydelse är avancerade genetiska metoder såsom embryonal 33, larval 34, 35 eller moder 36, 37 RNA-interferens-baserad gen knockdown, arvslinjetransformation med antingen piggyBac 38, 39 eller Minos 40 transposas systemet och CRISPR / Cas9 baserade genomet engineering 41. Vidare har Tribolium genomet sekvenserats ungefär ett decennium sedan 42, och är nu i den tredje omgången av genomet aggregatet släpp 43, som tillåter effektiv och genomet hela identifiering och systematisk analys av gener 44 45, 46. Dessutom, genomen av fyra andra ordningen skalbaggar arter är tillgängliga för jämförande genetiska tillvägagångssätt 47, 48, 49, 50. I association med den sekvense genomet, har två storskaliga genetiska analyser utförts, dvs en infogningsmutagenes skärm 51 och en systematisk RNA-interferens-baserad gen knockdown skärm 52, 53.

Fluorescens levande avbildning med widefield, konfokal eller ljus ark baserad mikroskopi (LSFM) gör det möjligt att observera den embryonala morfologi Tribolium som en funktion av tiden (dvs morfogenes) i en flerdimensionell sammanhang (tabell 1). I Widefield och konfokal fluorescensmikroskopi, den EXCITation och emissionsljuset leds genom samma objektivlins. I bägge metoderna är hela provet belyses för varje inspelad tvådimensionellt plan. Därmed är proverna utsattes för mycket höga energinivåer. I LSFM, endast fluoroforerna i fokalplanet exciteras på grund av en frikoppling av belysning och detektering genom att använda två vinkelrätt anordnade objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i två kanonisk implementeringar - den enda plan belysningsmikroskop (SPIM) och den digitala avsökta laserljuset arket baserade fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) - och erbjuder flera avgörande fördelar jämfört med traditionella metoder: (i) inneboende optisk sektione kapacitet, (ii) god axiell upplösning, (iii) kraftigt reducerad nivå av fotoblekning, (iv) mycket låg fototoxicitet, (v) högt signal-till-brusförhållande, (vi) relativt hög uppsamlingshastighet, (vii) imaging längs flera riktningar och (viii) djupare vävnadspenetrering på grund av användningen av låg numerisk apertur belysning objektivlinser 54, 55, 56.

LSFM har redan framgångsrikt tillämpats i Tribolium att dokumentera nästan hela embryonala morfogenes 57 och analysera principerna för extra embryonala membran bristning i början av rygglutning 23. För att höja attraktionskraft LSFM i Tribolium samhället och för insekts vetenskap i allmänhet, är det av stor vikt att etablera standardrutiner och förbättra metoder, protokoll och den pool av resurser till en nivå där mikroskopet blir en enkel att -använda standardverktyg i utvecklingsbiologiska laboratorier och biologiska frågor bo i centrum för uppmärksamheten.

Detta protokoll börjar med grunderna i Tribolium </ em> odling, dvs underhåll, reproduktion och embryosamlings. Nästa, är två experimentella strategier illustreras: (i) levande avbildning av skräddarsydda transgena linjerna och (ii) bildåtergivning av fasta embryon som var färgade med fluorescerande färgämnen (tabell 2). Därefter tre monteringstekniker med något olika ändamål förklaras i detalj (figur 3 och tabell 3): (i) agaroskolonn, (ii) agarosen hemisfären och (iii) den nya spindelvävshållaren. Protokollet förklarar sedan datainsamlings förfarandet med LSFM. Avbildningsmetoder och nyckel överväganden beskrivs. Slutligen embryo hämtning förklaras och förslag på grundläggande databehandling tillhandahålls. I de representativa resultat, aktuella bilddata från två nya skräddarsydda och Glia-blå 58 transgena linjerna visas och de respektive avbildningsdatauppsättningar är anordnade som en nedladdningsbar resurs. Dessutom, avbildadata för fasta embryon som färgades med en mängd olika fluorescensfärgämnen presenteras. Diskussionen fokuserar på kvalitetskontroll, nuvarande begränsningar av levande avbildningsteknik och anpassning av protokollet till andra arter.

Protokollet är skriven för lätta skivbaserade fluorescensmikroskop som är utrustade med en provkammare och en roterbar klämmekanism för standardiserade provhållare 54, 59, 60, vilka typiskt är cylinderformade element tillverkade av metall, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollet är också lämplig för både kanonisk implementeringar, dvs. SPIM och DSLM, såväl som för uppställningar med två eller flera belysnings- och detekteringsarmarna 61, 62, 63. De representativa resultat visar data i två spektralkanaler, grön (illumination med en 488 nm laser, upptäckt genom ett 525/50 bandpassfilter) och röd (belysning med en 561 nm laser, upptäckt genom ett 607/70 bandpassfilter), men protokollet kan utökas till tre eller fyra spektralkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Husbandry av Tribolium kulturer

OBS: Standardbetingelser definieras som en inkubationstemperatur av 25 ° C och 70% relativ fuktighet i en 12 h ljus / 12 h mörker-cykel. För mer information om Tribolium djurhållning, respektive riktlinjer finns 64. Detta protokoll kräver två olika mjölbaserade media, som kan framställas i kilogram kvantiteter och lagras under flera månader.

  1. Före arbetet med mjöl och inaktiv torrjäst, lagra de oöppnade paket vid -20 ° C under 24 h och därefter låta dem värmas upp till rumstemperatur. Detta förfarande eliminerar potentiella patogener.
  2. Passera fullkornsvetemjöl och inaktiv torrjäst genom en sikt med 710 pm maskstorlek, sedan förbereda tillväxtmedium genom att komplettera det siktade fullkornsmjöl med 5% (vikt / vikt) siktat inaktiv torrjäst.
  3. Pass 405 fint vetemjöl och inaktiv torrjäst genom en sikt med 250 & #181; m maskstorlek, sedan förbereda äggläggande mediet genom att komplettera det siktade 405 fint vetemjöl med 5% (vikt / vikt) siktat inaktiv torrjäst.
  4. Passera den respektive Tribolium kulturen genom en sikt med 800 | j, m maskstorlek. Kasta överblivna tillväxtmediet. Överför larver, puppor och vuxna till en stor glasskål.
  5. Om ingen avkomma kultur existerar, överföra cirka 80 larver och / eller puppor till en ny glasflaska för att etablera en ny avkomma kultur. Om ingen larver och / eller puppor är närvarande, tar cirka 40 vuxna i stället. Lägga 50 g av tillväxtmedium och inkubera under standardbetingelser.
  6. Samlar in omkring 300 vuxna (500-700 mg) i en annan ny glasflaska för att etablera avbildningskulturen. Lägga 50 g av tillväxtmedium och inkubera under standardbetingelser. Tillåta avbildning kultur sedimentera under minst 24 timmar i färskt tillväxtmedium innan embryosamlings.
  7. Byt odlingsmedium av bildkultur minst vartannat vieks, som kan göras i samband med embryosamlings (se 3.2). Efter två till tre månader, byt bildkulturen helt av nya vuxna från avkomman kulturen.
  8. Om en icke-homozygot transgen linje används kyrkoherden avkomman kulturer ofta genom att ta bort icke-transgena djur. Helst generera homozygota linjer om respektive transgenen inte är letal eller orsakar sterilitet när den är närvarande på båda kromosomerna. Homozygota kulturer har typiskt en högre genomsnittlig fluorescens nivå och de övergripande försöksbetingelser är smalare, eftersom endast en genotyp är närvarande.

2. Mikroskop inställning och kalibrering

OBS: Tribolium embryot har en anterior-posterior längd på ca 600 till 660 ^ m och en tvärgående diameter av ca 300-330 um. De flesta moderna CCD-kameror har ett sensorchip storlek av ca 9 mm x 7 mm, dvs en diameter av 11,4 | im, och en pixel-pixelavstånd av 6,45 pm.När de kombineras med en 10X förstoring objektivlins, kan embryot avbildas i sin helhet med en pixelavstånd 0,645 um. De flesta moderna sCMOS kameror har en större sensor spånstorlek av ca 16 mm x 14 mm, dvs. en diameter av 21,3 | im, och en pixel-pixelavstånd av 6,5 pm. När de kombineras med en 20X förstoring objektivlins, kan embryot avbildas i sin helhet med en pixelavstånd 0,325 um.

  1. Bifoga belysnings- och detekteringsobjektivlinser till mikroskopet. Säkerställa att lasrar och fluorescensfilter matcha fluoroforen absorptions- och emissionsspektra mycket väl.
  2. Fäst provkammaren till mikroskopet. Fylla provkammaren med PBS pH 7,4 eller något annat lämpligt avbildnings buffert.
  3. Slå på och kalibrera mikroskop. Omfattande kalibrering rutiner och felsökning riktlinjer för specialbyggda lätta plåtbaserade mikroskop (närmare bestämt för att genomföra DSLM) har publicerats previously 65. För kommersiella enheter följa tillverkarens anvisningar mycket noga. Felhantering kan utarma provkammaren av mediet och orsaka förödelse till instrumentet samt provet.

3. Insamling av transgena eller WT embryon

  1. Passera avbildnings kolonin genom en sikt med 800 pm maskstorlek. Samla vuxna skalbaggar i en ny glasflaska och tillsätt 10 g äggläggande medium. Inkubera äggläggande odling under 1 h vid 25 ° C och 70% relativ fuktighet i ljus.
  2. Passera äggläggande kultur genom en sikt med 800 | im maskvidd för att separera vuxna från äggläggande medium, vilket innehåller cirka 30-100 embryon. Överför vuxna till en ny glasflaska och tillsätt antingen gamla eller 50 g färsk odlingsmedium.
  3. Om observation bör börja vid en enhetlig BLASTODERM steget (exempel dataset DS0002), inkubera äggläggande medium under 15 h vid 25 ° C och 70% relativ fuktighet. To starta vid början av germband upprullning (t.ex. datauppsättningar DS0001 och DS0003), inkubera embryon för 23 timmar vid 32 ° C och 70% relativ fuktighet. Om andra utvecklingsstadier önskas, Se respektive litteraturen 64, 65 och anpassa inkubationstid och / eller temperatur efter behov.

4. Embryo dechorionation

OBS: Den chorion är det yttre lagret av äggskalet och består av proteiner och polysackarider. Det är starkt Ijusabsorberande men inte nödvändigt för korrekt utveckling och kan därmed vara kemiskt bort.

  1. Passera äggläggande mediet genom en sikt med 300 pm maskstorlek. Samla embryon i en cell sil med 100 ^ m maskstorlek och kassera överblivna äggläggande medium.
  2. Framställa en 6-brunnsplatta enligt följande: fylla A1, A2, A3 och B3 brunnar med 10 ml PBS pH 7,4 och B1 och B2 brunnar med 9 ml PBS. Sedan försiktigt1 ml natriumhypoklorit för B1 och B2. Observera utvecklingen av steg 4,3 till 4,8 under lupp. FÖRSIKTIGHET natriumhypoklorit är frätande.
  3. För in cellfilter in i A1 väl (PBS pH 7,4) och tvätta embryona under en minut under försiktig omrörning. Större mjölpartiklar ska lossna från embryon.
  4. Överföra cell sil till B1 brunn (natriumhypoklorit i PBS pH 7,4) och skaka plattan kraftigt i 30 s. De återstående mjölpartiklarna bör lossa helt från embryona.
  5. Överföra cell sil till A2 väl (PBS pH 7,4) och tvätta de embryon för en min under försiktig omrörning.
  6. För dechorionation, överför cell sil till B2 brunn (natriumhypoklorit i PBS pH 7,4). Skaka plattan kraftigt tills chorion spricker och lossnar från embryon. Chorion ser ut som ett tunt, halvtransparent membran med sargade kanter, medan dechorionated embryon har en slät siluett.
  7. Överför the cell sil till A3 väl (PBS pH 7,4) och tvätta de embryon för en min under försiktig omrörning. Om några chorion fragment fortfarande fäst embryona efter tvätt, upprepar steg 4,6.
  8. Lagra embryona i B3 brunn (PBS pH 7,4). Lagring i flera timmar inte skadar embryon, men tänk på att utvecklingen fortsätter.
  9. För icke-homozygota transgena linjer, ta bort alla icke-fluorescerande embryon om möjligt. För fixering och färgning av WT eller transgena embryon, fortsätt med steg 5. För levande avbildning av transgena embryon, fortsätt med steg 6.

5. vitellinmembranet Permeabilization, Fixering, och färgning

OBS: Den vitellinmembranet är det inre skiktet av äggskalet. Det är ogenomtränglig för fluorescerande färger och därmed måste vara kemiskt permeabiliseras före färgning.

  1. Fylla en scintillationsflaska med fixering / permeabilization lösning (1,5 ml 4% (vikt / volym) paraformaldehyd i PBS pH 6,9 ennd 1,5 ml n-heptan). Överför embryon med en pensel på flaskorna. Täckinjektionsflaskor med aluminiumfolie för att skydda fluoroforer från ljus och inkubera i 30 minuter på en gungande plattform vid 50 varv per minut. FÖRSIKTIGHET paraformaldehyd är giftigt och korrosivt, n-heptan är lättantändlig och giftig.
  2. Avlägsna fixeringslösning och behandla embryon tre gånger under 15 min i 3 ml 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i PBS pH 7,4 och därefter en gång under 15 min i 3 ml 1% (vol / vol) Triton X-100 i PBS pH 7,4 på en gungande plattform vid 50 varv per minut. FÖRSIKTIGHET Triton X-100 är frätande.
  3. Avlägsna permeabilization lösning och tillsätt 0,5 ml färgningslösning till ampullen. Exemplifierande färgningslösningar ges i tabell 2. Fläck embryon över natten vid 4 ° C på en gungande plattform vid 50 varv per minut. För färgämnen som föreslås i tabell 2, är inte nödvändigt att tvätta.

6. Beredning av Monterings Agarose

  1. Lägg 1 g lågsmältandeagaros till 100 ml PBS, pH 7,4 och upphetta blandningen under 2-3 minuter i en mikrovågsugn vid 800 W. Om små agarospartiklar fortfarande är närvarande, upprepa värmeprocessen i 30 sekunders intervall till dess att partiklarna löses upp helt. Monterings agaros inte behöver beredas direkt varje gång, den stelnade agarosen kan åter flytande genom upphettning, såsom beskrivits ovan. Denna process kan upprepas 5-6 gånger innan för mycket vatten har avdunstat.
  2. Tillåta agarosen svalna till approximativt 40-45 ° C, sedan fylla två 1,5 ml reaktionsrören med den uppvärmda agaros och hålla dessa rören vid 35 ° C i en termo.

7. Embryo Montering och Insättning i provkammaren

  1. Alternativ 1: Agarose-kolonn (Figur 3A-C, första kolumnen; tabell 3, andra kolumnen)
    1. Fyll en 1,0 ml spruta med destillerat vatten och koppla den till en av de glas kapilläröppningar genom användning av en liten gummislang.Fyll kapillär hälften med destillerat vatten.
    2. Plocka ett embryo med en pensel och placera den på den inre sidan av den andra glas kapillär öppning. Fortsätt snabbt till nästa steg innan embryot torkar ut.
    3. Stick kapillären in i vätske agaros och långsamt dra några mikroliter av vätske agaros vid sidan av embryot in i kapillären. Sedan snabbt öka dragkraften så att embryot dras tillsammans med agarosen. I slutändan bör ett fåtal mikroliter av agaros vara över och under embryot. Ställ kapillär åt sidan för ett par minuter och låt agarosen stelna.
    4. Korta kapillär med en diamant glas fräs till en längd av ca 5 mm. Den återstående fragment bör helt fylld med agaros och embryot bör ligga inom den andra kvartilen.
    5. Sätt i stålcylindern med tappen in i provkammaren, och därefter hålla kapillären fragmentet på toppen av tappen. Den agaroskolonnen bör skjuta ut ett par millimeter from kapillär fragment med den del som innehåller embryot.
  2. Alternativ 2: Agarose hemisfär (Figur 3A-C, andra kolumnen, Tabell 3, tredje kolumnen)
    1. Rita 200 mikroliter av flytande agaros i en 1,0 ml spruta, sedan använda den för att fylla stålröret från toppen med agaros tills en halvsfär bildas vid bottenöppningen. Halvsfären diameter bör vara lika med rördiametern. Vänta några minuter tills agarosen har stelnat.
    2. Välj ett embryo med en pensel och ordna det på spetsen av borsten så att den främre änden blir åtkomlig. Doppa agarosen hemisfären i flytande agaros för att täcka den med en tunn film.
    3. Placera embryo med sin främre änden upprätt på pol agarosen halvklotet. Vänd stålrör runt och korrigera läget av embryot med borsten. Om nödvändigt, stabilisera embryot genom tillsats av 2 | il agaros till embryot / halvklotet gränsen. Idealiskly, bör mindre än halv av embryot ytan att täckas i agaros och flankerna skall vara så brant som möjligt.
    4. Infoga stålröret med halvklotet och embryot långsamt in i provkammaren.
  3. Alternativ 3: spindelnät hållaren (Figur 3A-C, tredje kolumnen; tabell 3, fjärde kolumnen)
    1. Välj ett embryo med en pensel och ställ den åt sidan.
    2. Täcka det slitsade hålet i spindelvävs hållare med 5-8 mikroliter flytande agaros, sedan avlägsna det mesta av agarosen tills endast en tunn agaros film återstår.
    3. Placera embryot till agarosen film och justera sin position. flytta noggrant embryot till x-axeln centrum av det slitsade hålet, och anpassa sin långsträckta anterior-posterior axel med den långsträckta axeln hos det slitsade hålet.
    4. För in spindelnät hållaren med den monterade embryot långsamt in i provkammaren. Placera spindelnät hållaren så att den inte stör excitation och emissionljus, dvs 45 ° i förhållande till x- och z-axeln.

8. Ljus Sheet baserade fluorescensmikroskopi

  1. Bestäm tillsammans hur många riktningar (och längs vilka inriktningar) embryot bör avbildas. Fyra riktningar (längs orientering 0 °, 90 °, 180 ° och 270 °) typiskt ger en god kompromiss mellan täckning och energibelastning.
  2. Ställa in det antal fluorescenskanaler. De stora parametrar för varje kanal är laserlinjen, fluorescensfilter, lasereffekten och exponeringstiden. För långsiktig levande avbildning, är det viktigt att den integrerade energibelastning inte överskrider toleransen av embryot. En exponeringstid av 25-50 ms garanterar snabb avbildning, medan en lasereffekt mellan 100 och 300 pW inte bör påverka viabiliteten av embryot. För fasta prov, exponeringstiden och lasereffekt kan åtminstone fördubblas.
  3. För levande imaging analyser konfigurera tidsförloppet. complete embryogenes av Tribolium tar ca sju dagar vid rumstemperatur (23 ± 1 ° C) och en lite mindre än tre dagar vid 32-35 ° C 64. Definiera tidsintervallet enligt de morfogenetiska händelser som bör följas. För korta tidsintervaller, överväga att sänka exponeringstiden och lasereffekt (se 8.2).
  4. Placera embryo i transmissionsljusläge längs x- och y-axlarna in i centrum av synfältet utan att utsätta den för lasern. Rotera embryot genom 360 ° i steg om 90 ° för att undersöka embryot för eventuella skador som kan ha inträffat under monteringsprocessen.
  5. Rotera embryot lämpligt runt y-axeln för att inrikta de embryonala axlar med mikroskopet yxor, exempelvis den laterala axeln med x-axeln, dvs dorsoventral axeln med z-axeln. Vid användning av spindelnät hållaren tekniken kanske inriktning inte vara möjligt.
  6. I fluorescensläge, definierar z-stack for varje riktning. Lägg till 25-50 pm som spatial buffert framför och bakom embryot. Inklusive bufferten, täcker den typiska z-stack omkring 350-400 ^ m för en Tribolium embryo. Också definiera z-avstånd, som bör vara fyra gånger sidoavståndet, dvs avståndet längs x- och y-axlarna 66.
  7. Om två eller flera embryon avbildas parallellt startar på 8,4 med nästa embryo.
  8. För långtids avbildning, se till att provkammaren är fylld med tillräckligt PBS pH 7,4 eller annan avbildningsbuffert. Också täcka provkammarens öppning.
  9. Starta avbildningsprocessen. För långsiktig levande avbildning, övervaka korrekt förvärv längs alla riktningar i alla kanaler för alla embryon. Ibland kontrollera under de närmaste dagarna att embryona lever och i rätt läge.

9. Embryo hämtning och kvalitetskontroll

  1. När avbildning är klar, ta bort provhållaren medembryona från provkammaren. Endast embryon från levande imaging analyser måste hämtas. Fixeras och färgas embryon kan kasseras.
  2. Om en levande avbildning analys utfördes, överföra embryot till ett objekt slide. För agaroskolonnen tekniken, extrahera embryon från den omgivande agaros med en skalpell, mikro-kniv eller rakblad. För agarosen hemisfären tekniken, överföra halvsfären med den platta sidan till objektglas. Embryo borttagning är inte nödvändigt. För spindelnät hållaren teknik försiktigt demontera embryon från agarosen film med en pensel. Inkubera objektglas i en liten glasskål i mättad fuktighetsatmosfär under standardbetingelser till dess att larverna kläcks.
  3. Efter kläckning, överföra larver till enskilda brunnar i en 24-brunnsplatta och tillsätt 500 mg tillväxtmedium till varje brunn. Inkubera under normala förhållanden. Jämför den totala utvecklingstiden och morfologi avbildade larver till icke-avbildade WT och transgena larvAE (se diskussion). I analyser som karaktäriserar WT utveckling bör inga uppenbara morfologiska avvikelser helst vara märkbara.
  4. När larverna utvecklas till friska vuxna, förse dem med lämpliga WT partners av samma bakgrundsstammen. Efter två veckor, kontrollera avkomma produktion. Också överväga att kontrollera fertiliteten hos avkomman genom att para dem inter pares. Först när avbildade embryona utvecklas till fertila vuxna som producerar fertila avkomma, kan bildförfarandet betraktas som icke-invasiv.

10. Image Data Processing

OBS: För bild databehandling, är öppen källkod bildbehandlingsprogram ImageJ 67 eller dess derivat FIJI 68 rekommenderas. Båda versionerna samt omfattande dokumentation finns på www.imagej.net. Den standardfilformat för LSFM data är Tagged Image File Format (TIFF). Den inneboende container alternativet kan storage av bildstaplar såsom z-staplar eller tidsserier av z maximala upphöjningar i en enda fil som kan öppnas i ImageJ eller FIJI via dra-och-släpp.

  1. Om så är nödvändigt, rotera z-stackar för att rikta in främre-bakre axeln av embryot med y-axeln (Bild → Transform → Rotera). Observera att rotations parametrar måste ställas in individuellt för varje riktning, men inte för den tid förflutit och fluorescenskanalerna.
  2. Beskära z-stackar längs x-, y- och z-axlar, så att endast minimal bakgrund (20 - 40 pixlar längs x- och y-axlarna, 5 - 10 plan längs z-axeln) förblir (för x - och y-axlarna, använd rektangulära markeringsverktyget, då Bild → Crop; för z-axeln, användning Bild → Staplar → Verktyg → Slice Keeper). Observera att beskärnings parametrar måste ställas in individuellt för varje riktning, men inte för tidpunkter och fluorescenskanalerna.
  3. Beräkna z maximala projektionen för varje z-stack(Bild → travar → Z Project väljer Max Intensity). Intensitet projektions beräkningar förenklings uppgifter procedurer som tar bort en rumslig dimension.
  4. För långsiktig levande avbildningsuppgifter, överväga att använda en ImageJ eller FIJI skript som utför bearbetningsstegen 10,1-10,3 för alla riktningar, alla tidpunkter och alla fluorescenskanaler 65. Idealt konkatenera alla z största projektion per kanal och riktning och spara dem som en tidsserie i en TIFF behållare. Alternativt kan BigDataViewer 69 plug-in för FIJI användas för att navigera genom terabyte-stora datauppsättningar.
  5. Beroende på de transgena linjer och avbildningsmetoder, kan dynamiska intensitets justeringar av de tidsstaplar vara önskvärt på grund av fotoblekning och / eller fluorofor expressionsfluktuationer. Antingen ImageJ- eller FIJI inneboende Bleach Correction funktion (Bild → Justera → Bleach Correction, välj Histogram Matching) eller DedicaTed programvara 65 föreslås.
  6. Om embryot registrerades och / eller längs flera riktningar och i multipla fluorescenskanaler, horisontella kombination av riktningarna (Bild → Staplar → Verktyg → Kombinera) och kanal merge (Bild → Färg Merge → Kanaler) rekommenderas.
  7. Registrering och fusion av z-stackar som förvärvats längs flera riktningar 70, eventuellt i kombination med dekonvolution 71, möjliggör beräkning av överlägsna tredimensionella bilder med enhetlig kvalitet och isotropiska upplösning. Båda plug-ins är öppen källkod och förinstallerad i FIJI, men de kräver närvaro av landmärken (fluorescerande mikrosfärer, t ex pärlor) runt provet.
  8. Öppen källkod ramar för storskalig kvantitativ extraktion och analys av data finns också, till exempel för segmentering och spårning av cellkärnor 72 eller cell formigenkännings 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en experimentell ram för fluorescens avbildning av levande eller fixerade och färgade Tribolium embryon med LSFM. På grund av de låga nivåer av fotoblekning och fototoxicitet, en direkt följd av dess optiska sektionering kapacitet, är LSFM särskilt väl lämpad för långsiktig levande avbildning.

Den nya AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgen linje uttrycker ett histone2B-mEmerald fusionsprotein under kontroll av alfa-tubulin en promotor 74. Den visar en förstärkare trap-liknande uttrycksmönster 51, eftersom fluorescenssignalen är huvudsakligen erhålles från serosa, gulesäcken och flera neuronala cellkluster. Med användning av denna linje, var 66 h av embryonal utveckling vid rumstemperatur (23 ± 1 ° C) registrerades, som täcker germband retraktion och dorsal förslutning (Kompletterande Movie 1). Dettalinje kan användas för att visualisera neuronala kluster inuti huvudet bihang (Figur 4A) och dynamiken i serosa migration under dorsal förslutning (Figur 4B). Den nya AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linje bär samma transgen som # 4 linje, men vid en annan genomisk plats. Den visar inte en uppenbar enhancer trap mönster, men fluorescenssignalen är spatiotemporally ubiquitously detekterbar såsom beskrivits tidigare för denna promotor 74. Denna linje avbildades vid övergången från gastrulation till germband töjning för att demonstrera den optiska sektioneförmågan vid två djupnivåer (Figur 4C). Ett annat särdrag, särskilt för levande avbildning, är förvärvet av z-stackar längs flera riktningar via provrotation, vilket är standard för LSFM uppställningar som används i utvecklingsbiologi. Till exempel, i den Glia-blå 58 linje, prov rotation allaows observationen av Glia cell omorganisation längs och runt den ventrala nervsträngen samt proliferationsdynamiken i det vänstra huvudet loben, som bara kan ses på rätt sätt från den dorsala stället, i samma embryo (Figur 4D, Kompletterande Movie 2). De levande imaging dataset i samband med denna studie tillhandahålls som en nedladdningsbar resurs, meta och få tillgång till information finns i tilläggs tabell 1.

Eftersom valet av transgena linjer för levande avbildning fortfarande är begränsad, kan små fluorescerande färger användas för att specifikt märka intracellulära strukturer. Sytox Grön binder till cellkärnor och kan visualiseras i den gröna kanalen, medan YOYO-1 och BOBO-3 Jodid binda till kärnhöljet och kan visualiseras i den gröna eller röda kanalen, respektive (figur 5A). Dessa färgämnen kan användas för att belysa vissa embryonala structgärder, såsom serosa ärr (figur 5B, första kolumnen), de bakre ventrala serosa-celler (Figur 5B, andra kolumnen) eller serosa-amnion-germband vävnad treskikt som framträder under serosa fönster förslutning (figur 5B, tredje till femte kolonn). Tvåfärgad färgning tillåter visualisering av två intracellulära strukturer i samma embryo, exempelvis kärnhöljet tillsammans med aktincytoskelettet, som kan färgas med Alexa Fluor-konjugerade phalloidin färgämnen. Till exempel, kan YOYO-1 Jodid kombineras med falloidin 546 (figur 5C) medan BOBO-3 kan kombineras med falloidin 488 (figur 5D).

Det är också praktiskt att fixa och färga transgena embryon som redan uttrycker en viss fluorescerande protein, eftersom fixeringsförfarandet släcker inneboende fluorescence signal endast marginellt. Till exempel, kan embryon från AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 transgen linje, i vilken kärnorna detekteras i den gröna kanalen, färgas med falloidin 546 så att aktincytoskelettet blir synlig i den röda kanalen (figur 6 ).

Figur 1
Figur 1: Jämförelse av Konventionell Widefield, Confocal Laser Scanning and Light Sheet baserade fluorescensmikroskopi. Konventionell widefield epi-fluorescensmikroskopi utnyttjar xenonbåge / kvicksilverlampor med lämpliga filter eller hög effekt lysdioder som ljuskällor. För varje förvärvad tvådimensionell bild, är hela provet belyses med en icke-diffraktionsbegränsad ljuskägla. I konfokal laserscanning fluorescensmikroskopi, är en diffraktionsbegränsad gaussisk laserstråle scanned genom provet och fluorescens detekteras inkoherent punkt-för-punkt. På liknande sätt som konventionell widefield epi-fluorescensmikroskopi, är hela provet belyses för varje förvärvad tvådimensionell bild. I ljuset ark baserade fluorescensmikroskopi, belyser en diffraktionsbegränsad gaussisk laserstråle provet vinkelrätt mot detekteringsaxeln. Fluorescens detekteras antingen plan-för-plan eller linje-för-linje. Under förvärv av en tvådimensionell bild, endast en liten volym centrerad på fokalplanet hos detekteringsmålet upplever effekterna av excitationsljuset. Den återstående volymen av provet inte lyser, inte bidrar till out-of-fokus oskärpa, inte lider av fototoxiska effekter och inte förlora fluoroforer på grund av fotoblekning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ep-together.within-page = "1"> figur 2
Figur 2: Principen of Light Sheet baserade fluorescensmikroskopi. I LSFM, är belysning och detektering delas upp i åtminstone två optiska vägar. Åtminstone en belysningsarmen används för att generera ljus arket (cyan), medan åtminstone en detekteringsarmen är utrustad med ett lämpligt filter och en kamera för parallell detektion av fluorescenssignal (grön). LSFM har två kanonisk implementeringar, den enda (eller selektiv) planet belysningsmikroskop (blå bakgrund) och den digitala avsökta laserljuset ark mikroskop (röd bakgrund). Genom att förflytta provet och ljuset arket i förhållande till varandra, är tredimensionella bilder förvärvas. Information tillsammans flera riktningar uppsamlas genom att rotera provet kring y-axeln, som företrädesvis är orienterad längs tyngdkraften.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3: Tre olika monteringstekniker som används vid inspelning av embryonala Utveckling av Tribolium med Ljus Sheet baserade fluorescensmikroskopi. (A) Den agaroskolonn avser en stålcylinder med ett litet stift som skjuter agaroskolonn, där embryot är inbäddad, av en glaskapillär. Agarosen hemisfären är monterad på ett stålrör. Embryot är fäst vid polen hos hemisfären med en liten mängd av agaros. Spindelvävshållaren är ett ark av metall med ett slitsat hål monterad på toppen av stålcylindern. Embryot är limmad till en tunn agaros film som spänner tHan slitsade hål. (B) System av de tre monteringstekniker inuti en ljus ark mikroskop. (C) De tre monteringstekniker som tillämpas inom en DSLM. (D) Exempel på bilder embryon av Glia-blå transgen linje som spelats in med de tre fästtekniker. Embryona, som är vid början av germband tillbakadragning, är visade med sin bakre ände orienterad uppåt för att matcha de transmissionsljusbilder. FM, fluorescensläge; ZA, z maximal projektion med intensitet justering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Live avbildning av Tribolium embryon. (A </ Strong>) Ett embryo av AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linje vid övergången från germband indragning till dorsala stängning. Denna linje uppvisar en enhancer trap uttrycksmönster. Fluorescenssignalen finns främst i serosa, gulesäcken och några neuronala cellkluster. Embryot visas under en period av 15 timmar med ett intervall på 5 timmar. Detalj Bilderna visar cellkluster i huvudet bihang. Initialt är de kluster fortfarande täckt av serosala celler (första kolumnen), vid serosa bristning, cellerna följa med vridrörelsen av huvudet. (B) Samma embryo visat vid dorsala förslutning för 01:30 h med ett intervall på 00:30 timmar. Detaljbilder visar migreringen av brusten slemhinnorna över gulesäcken. (C) Översta raden: Ett embryo av AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 linje vid övergången från gastrulation till germband töjning. Mellersta och nedre raden: Enstaka plan visas i två olika djup under en period av 10:30 h med ett intervall på 1:30h. (D) Ett embryo av Glia-blå linje under germband indragning visas under en period av 50:30 h med ett intervall på 07:30 timmar. Detaljbilder visar morfogenetiska omstrukturering av gliaceller i den vänstra huvud lob. ZA, z maximal projektion med intensitet justering; PA enda plan med intensitet justering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Fixering, Färgning och Iimaging av WT Embryon under Germband Töjning. (A) Embryon färgade med antingen Sytox Grön, dvs en luddig nukleär fläck eller YOYO-1 jodid- eller BOBO-3 jodid, dvs två nukleär höljes fläckar. (B) YOYO-1 Jodid-färgade embryo. Detaljer visar serosa ärr (första kolumnen), kärnhöljet av de stora posteriora-ventral serosa-celler (andra kolumnen) eller tre skikt vävnads organisationen av serosa, amnion och den faktiska embryonal vävnad (tredje till femte kolumnen). (C) Dual-color färgning med YOYO-1 Jodid och falloidin 546. (D) Dual-color färgning med falloidin 488 och BOBO-3 Jodid. ZA, z maximal projektion med intensitet justering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Bilder av fixerades och färgades Transgen Embryon från AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 linje. Denna transgen linje uttrycker mEmerald märkeed histone2B (H2B) under kontroll av alfa-tubulin en promotor, som markerar kärnor / kromatin ubiquitously hela embryonal utveckling. Embryot ytterligare färgades med Alexa Fluor 546 falloidin, vilka etiketter aktincytoskelettet / f-aktin. ZA, z maximal projektion med intensitet justering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

kriterium fluorescensmikroskop typ
konventionell brett fält konfokal laserscanning ljus ark baserade
objektivlinsinställnings en objektivlins, medelhög NA två vinkelrätt anordnade objektivlinser, belysning: låg NA, detektions: hög NA
belysningsljuskällan vit ljuskälla och lämpliga filter (t.ex. kvicksilver kort-båglampor)
eller LED-baserad med sanering filter 		laser med sanering filter
(T.ex. diod eller DPPS lasrar) 		laser med sanering filter
(T.ex. diod eller DPPS lasrar)
belysning per tvådimensionella bilden hela provet hela provet
(Typiskt tvådimensionell Gauss-stråle skanning) 		endast fokalplan
(DSLM: endimensionell gaussisk stråle skanning)
upptäckt parallell
(Typiskt CCD eller sCMOS kamera) 		sekventiell
(Fotomultiplikatorrör) 		parallell
(Typiskt CCD eller SCMOS kamera)
utskriftshastighet snabb (millisekunder per bild) långsam (sekunder per bild) snabb (millisekunder per bild)
out-of-fokus fluorescens ingen diskriminering blockerad nästan fullständigt av pinhole
(Avstötning Effektiviteten beror på diametern) 		nästan obefintlig
(Bara på grund av spridning)
rumsliga dimensioner 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
ytterligare frihetsgrader 2
(Tid, fluorescens kanal) 		2
(Tid, fluorescens kanal) 		3
(Tid, fluorescens kanal, riktning)
lateral upplösning r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
optisk sektioneförmåga Nej Ja
(Diskriminering i detekteringsvägen) 		Ja
(diskriminering i belysningsbanan 75)
tillgänglighet och pris övervägande kommersiell, låg kostnad övervägande kommersiell, dyra kommersiella, dyra
specialbyggd, måttlig 54,59,60,75
levande imaging publikationer som täcker Tribolium embryon sex 44,76,77,78,79,80 sju 23,77,79,81,82,81
(spinning disk konfokala) 83,84,85 		fyra 23,57,65,86

Tabell 1 - Egenskaper hos FluoresceNCE Mikroskopi tekniker som används i Tribolium lever Imaging.

färga färgning utspädning
Sytox Grön kärnor (fuzzy) 1: 10 tusen (1: 100 i DDH 2 O och 1: 100 i 1% (vikt / volym) BSA i PBS)
YOYO-1 Jodid kärnhölje 1: 10 tusen (1: 100 i DDH 2 O och 1: 100 i 1% (vikt / volym) BSA i PBS)
BOBO-3 Jodid kärnhölje 1: 10 tusen (1: 100 i DDH 2 O och 1: 100 i 1% (vikt / volym) BSA i PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin aktincytoskelettet 1: 100 (i 1% (vikt / volym) BSA i PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin aktincytoskelettet

Tabell 2 - Färgning Solutions.

agaroskolonn
(Alternativ 1) 		hemisfär
(alternativ 2) 		spindelnät hållare
(alternativ 3)
logisk grund embryo är inbäddad i en agaroskolonn som trycks ut ur en kapillär bakre änden av embryot är limmad till polen på en agaros hemisfär embryot limmas att tunna agaros film som spänner över ett slitsat hål
provhållaren stålcylinder med pin stålrör stålcylinder med
slitsat hål
obegränsad (någon) obegränsad (någon) fyra (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
krävs skicklighetsnivå måttlig hög låg
agaros runt embryot hög låg måttlig
antal embryon per session upp till tre ett upp till sex
embryo hämtning knepig lätt lätt
engångsutrustning glaskapillärer - -
rekommenderas för kortfristiga levande imaging, färgade embryon långsiktiga live-imaging långsiktiga live-imaging, färgade embryon
<strong> referenser tre 23,87,88 två 57,65 denna publikation

Tabell 3 - monteringsmetoder fördelar och nackdelar.

aberrational fenotyp induktion logisk grund steg referens (metodologiska)
embryonala RNA-interferens dubbelsträngat RNA injiceras i embryon under syncytial BLASTODERM scenen för att knock-down en eller flera specifika gener injicera embryon efter steg 4,8. två 33,81
föräldra RNA-interferens dubbelsträngat RNA injiceras i sidled in female puppor mellan de abdominala segmenten 3 och 4, vilket leder till gen knock-down i avkomman ta puppor från steg 1,5. två 36,37
recessiva embryonala letala mutanta linjer äggläggande kulturer som bär en recessiv embryonal letal mutation heterozygot utbyte ca 25% homozygot mutant avkomma korsa mutantlinjen in i avbildningslinjen under steg 1,5. tre 39,51,89
applicering av yttre faktorer vissa bioaktiva eller giftiga faktorer extrinsically appliceras på embryon genom att lägga till dem till avbildnings buffert lägga faktor till avbildnings buffert under steg 2,2. två 83,85

Tabell 4 - LSFM Live avbildning av Aberrational fenotyper

Kompletterande Tabell 1 - Metadata och Parameter för Långsiktig Live-avbildnings Dataset DS0001-0003. Klicka här för att ladda ner filen.

Kompletterande Movie 1 - Live avbildning av en Tribolium Embryo från AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgen linje.
Denna linje uppvisar en enhancer trap uttrycksmönster. Fluorescenssignalen finns främst i serosa, gulesäcken och en delmängd av neuronala celler. Embryot visas längs fyra orienteringar från 00:00 h till 66:00 h med ett intervall av 00:30 h mellan tidpunkterna. Filmen startar i början av germband indragning och slutar när rygglutning är klar. Bildhastighet är fem bilder per sekund. ZA,z maximal projektion med intensitet justering. Klicka här för att ladda ner filen.

Kompletterande Movie 2 - Live avbildning av en Tribolium Embryo från Glia-blue transgen linje.
Embryot visas längs fyra orienteringar från 00:00 h till 66:00 h med ett intervall av 00:30 h mellan tidpunkterna. Filmen startar i början av germband indragning och slutar när rygglutning är klar. Bildhastighet är fem bilder per sekund. ZA, z maximal projektion med intensitet justering. Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitetskontroll

I levande imaging assays, måste beredningen och inspelningsförfarande vara icke-invasiv, dvs varken den mekaniska och kemiska hantering (insamling, dechorionation, montering på provhållaren) eller den integrerade energibelastningen under observationen bör påverka viabiliteten av provet. För studier som kännetecknar WT utveckling, är det rekommenderat att bara använda data från experiment där embryot överlever inspelningsprocessen, hämtas framgångsrikt och utvecklas till en frisk vuxen. Den vuxna bör inte uppvisa några morfologiska avvikelser bör vara fertila och dess avkomma bör också vara fertila. Det finns tre viktiga skäl för låg överlevnad, särskilt i långsiktiga live-imaging analyser:

För det första, var embryot yta täckt omfattande med agaros under steg 7, som förmodligen hindrar jon och gasutbyte och constricts embryot mechantiskt. Berörda embryon, särskilt när avbildas under tidig embryogenes, vanligtvis utveckla obemärkt under flera timmar, gripa plötsligt och förlorar sin fluorescenssignal snabbt. Med viss erfarenhet kan ytan fraktionen som är inbäddat i agaros genom användning av halvklotet tekniken hållas under en tredjedel, medan med spindelvävshållaren tekniken, som mest halv av ytan är täckt av ett mycket tunt agaros skiktet. För det andra, den integrerade energibelastning appliceras på embryot överstiger tolerans. De värden som anges i steg 8,2 fungera som en tumregel, men bör övervägas följande kriterier: (i) embryon under tidig fosterutveckling inte uthärda laserstrålning samt embryon under slutet av embryonal utveckling, (ii) även om den integrerade energin belastning kan vara identiska, högre lasereffekt med antingen lägre exponeringstiden eller längre tidsintervaller tycks vara mer stressande än lägre lasereffekt med en hög exponeringstiden eller kortare tidsintervaller, (Iii) högre våglängder är typiskt tolereras bättre och (iv) för transgena linjer, visas toleransgräns för att vara spårspecifika, medan fluoroforen uttrycksstyrkan verkar vara omvänt proportionell mot laserbestrålning tolerans. Dessutom utformningen av fusionsproteinet och / eller den intracellulära lokaliseringen spelar också en roll. För det tredje, är embryot skadas under monteringsprocessen. Den mest avgörande faktorn här är att inkubationstiden i natriumhypokloritlösning är så kort som behövs för att helt ta bort chorion. Längre inkubationstider kan skada embryon. Man bör också vidtas för att inte punkteras eller pressa embryon med borsten och för att hålla monterings agaros vid en omgivningstemperatur. Skadade embryon kan identifieras under steg 8,4 innan den faktiska avbildningsprocessen börjar, så att skadade embryon kan ersättas med viabla sådana.

Genom att följa dessa riktlinjer, vanligtvis omkring 85-90% av Embryos överleva den levande bildförfarandet och lucka. Omkring 90% av de streckade embryona utvecklas till friska och fertila vuxna. Överlevnadsförhållandet synes vara oberoende av avbildning temperatur och monteringstekniker (när agaros kolonn används för avbildning perioder på mer än en halv dag), men något minskar med förhöjda nivåer av laserstrålning. Som en ytterligare kontroll, särskilt under den första karakterisering av skräddarsydda transgena linjer för fluorescens levande avbildning eller ramen upprättandet fas som prekursor för en omfattande experimentell sekvens, är det rekommenderat att köra icke-bildförsedda WT och transgena embryon parallellt med det bildförsedda embryon, som inkuberas vid samma temperatur som den avbildade embryot, och jämför deras utveckling tid och morfologi 65.

Dessutom bör studier som karakteriserar aberrational fenotyper (tabell 4) via levande avbildning också köra en icke-påverkade cKONTROLL embryo parallellt. Det rekommenderas att hålla behandling av både embryon så lika som möjligt, men detta måste prövas individuellt för varje experimentell strategi:

Knock-down via RNA-interferens.

För embryonala RNA-interferens 33, 81, bör embryon som härrör från samma äggläggande kultur antingen injiceras med funktionell eller styra dubbelsträngat RNA. De olik injicerade embryon bör sedan avbildas samtidigt i samma LSFM genom att använda antingen agaroskolonn eller spindelvävshållaren tekniken. För föräldra RNA-interferens 36, 37, bör det bildgivande kulturen delas upp i två subkulturer. Kvinnliga puppor av en subkultur bör injiceras med den funktionella dubbelsträngat RNA, medan den andra subkultur bör injiceras med kontroll dubbelsträngat RNA. embryo Collektion bör utföras parallellt, och både experimentella och kontroll embryot kan avbildas samtidigt i samma mikroskop med hjälp av agaros-kolonnen eller spindelvävs hållare teknik.

Recessiva embryonala dödliga muterade linjer.

När man arbetar med recessiva embryonala letala mutanter 39, 89, 91, 92, 93, (utfärdar 89 men ibland mindre på grund av praktiska hantering) en äggläggande kultur av heterozygota mutanter, vilka normalt är fenotypiskt inconspicuous, avkastning teoretiskt 25% homozygot mutant avkomma och 75% av fenotypiskt diskret avkomma (50% heterozygota mutanter och 25% WTS). Det rekommenderas att använda spindelnät innehavaren teknik för att montera flera embryon från en sådan äggläggande kultur. De homozygota mutanter kan vara identified under hela avbildning genom manifestationen av fenotyp, medan de normalt utvecklande embryona fungera som kontroller. Genotypen för de avbildade proven kan bestämmas när avbildning och kvalitetskontroll är klara.

Tillämpning av yttre faktorer.

Om påverkan av yttre faktorer inom avbildnings buffert 83, 85, exempelvis bioaktiva eller giftiga ämnen, om utveckling undersöks, parallell avbildning tillsammans med en styr embryo i samma LSFM är typiskt inte möjlig. Därför måste avbildning utföras sekventiellt. Optimalt är tiden mellan efterföljande experiment minimeras och embryona härrör från samma avbildningskulturen. Alternativt kan två identiskt konstruerade och drivs LSFMs kan användas. I detta fall bör embryon från samma äggläggande period användas, men det är av stor vikt att the kalibrering av både mikroskop utföres noggrant, så att avbildningsegenskaper är jämförbara. Genom att använda spindelnät hållaren tekniken kan flera embryon för varje tillstånd avbildas på en gång. Med agaroskolonnen tekniken, kan de yttre faktorer hindras från att nå embryona.

Nuvarande begränsningar av LSFM levande avbildningsteknik

LSFM är ett kraftfullt verktyg för att analysera embryonala morfogenes icke-invasivt i flera breda klasser dimensioner. Standardrutiner som föreslås i detta protokoll kommer att stödja processen att skapa ljus ark teknik som ett standardverktyg i utvecklingsbiologi. Dock är det tillvägagångssätt begränsas av ett antal faktorer på olika experimentella och organisationsnivåer:

Inledningsvis var LSFM utvecklats för att analysera ett prov åt gången. All ström närmar sig bilden två eller flera embryon samtidigt i samma mikroskop B y 'stapling' provet längs y-axeln i agaroskolonn eller spindelnät innehavaren behandlar denna fråga endast till en viss grad. Multi-väl platt- och täckbaserade installationer är tillgängliga 94, 95, 96. Men de lider av minskad bildkvalitet och offra en del av de väsentliga fördelarna med LSFM, såsom avbildning längs flera riktningar. Närvarande, är det bästa alternativet att arbeta med flera mikroskop parallellt, som blir rimligen möjligt då dyrbara komponenter, såsom lasern, är delade 60.

Med EFA-nGFP 57, 65, 84, FNL 86, den Brainy 58, 86, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, den AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 och Glia-blå= "xref"> 58, bara sex skräddarsydda transgena linjer som lämpar sig för långsiktig levande imaging är för närvarande tillgängliga. Dessutom, HC079 (amnion), G12424 (serosa) och G04609 (hjärta) enhancer trap linjer 51 har karakteriserats med LSFM 23. Alternativt kan fluorescerande embryon även genereras av mRNA 81 eller färgämne injektion 79, dessa metoder är relativt enkelt, men också lider av begränsningar 86. Flera flera standarder krävs fortfarande såsom cytoskeletal-, organelle- och membranmärkta linjer eller linjer som uttrycker fluoroforer under vissa icke-ubiquitous promotorer för att observera endast vissa organ eller vävnader. Helst dessa linjer är också tillgängliga med olika fluorescerande proteiner.

En annan utmaning är datamängden som genereras av LSFM. På grund av förvärvet av informationen i tre rumsdimensioner och minst tre further frihetsgrader (tid, riktning, fluorescenskanal), kan storleken av levande avbildningsdatamängder enkelt kan nå många gigabyte till några få terabyte. Även efter tredimensionell beskärning och ZIP baserad kompression av TIFF-behållare kan de tre exemplifierande datauppsättningar associerade med denna studie har storlekar av 31,6, 12,6 och 45,1 gigabyte, dvs 89,3 Gigabyte totalt. När du arbetar med LSFM, är det nödvändigt att ha respektive infrastruktur för datalagring och bearbetning 88, 97.

Högsta bildkvalitet erhålles vid ytan av embryot, men med ökande djup, blir fluorescenssignalen mer och mer suddiga. Till exempel, blir den bakre änden av germband täcks av gulesäcken faldigt under gastrulation och kan inte korrekt lösas (Figur 4C, första till femte kolumnen). Imaging längs flera riktningar löser detta problem åtminstone en delially - information av hög kvalitet från ytan runt embryot är tillgängliga, men de inre regionerna förblir otydlig. Närvarande, inga tillfredsställande lösningar är tillgängliga, men i det långa loppet, infraröda fluorescerande proteiner 98, genetiska tillvägagångssätt 99 eller mikroskop uppställningar med adaptiv optik 100 skulle kunna övervägas.

Anpassning för andra arter

Vid det här laget har LSFM använts för att dokumentera den embryonala utvecklingen av tre insektsarter, dvs bananfluga Drosophila melanogaster 61, 62, 101, utblåsnings flyga megaselia abdita 102 och den röda mjölbagge Tribolium castaneum 57. Den experimentella ram standardrutiner och monteringstekniker som beskrivs här should vara lätt att anpassa till andra insektsarter. Nedärvda transformationsprotokoll för många insekter som hör till olika beställningar är tillgängliga 103, inklusive arter av ekonomisk och / eller medicinsk betydelse, såsom honeybee 104, flera lepidopteraner 105, 106 eller flera mygga arter 107, 108, 109. Med respektive transgena linjer som är lämpliga för fluorescens levande avbildning, kan den embryonala morfogenes av insekter karaktäriseras samtidigt överväga deras evolutionära härstamningar och / eller ekologiska nischer. Omkring en miljon insektsarter har beskrivits och ytterligare tjugo miljoner insekter arter finns troligen 110, som omfattar mer än 400 miljoner år av evolution 2. Endast jämförelsetillvägagångssättet kommer att generera information som i sin tur bestämdes insikter som inte kan erhållas genom att studera de utvecklingsmässiga principerna för endast en enda art.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Författare bidrag

FS och EHKS tänkt forskningen. FS genererade de transgena AGOC linjer. Ljus ark baserade fluorescensavbildning utfördes genom FS och SK. FS och EHKS skrev manuskriptet med input från SK.

Acknowledgments

Vi tackar Sven Plath för teknisk support. Den Glia-blå transgen linje var en vänlig gåva från Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen har finansierats av Cluster of Excellence Frankfurt am Main för Makromolekylär (CEF-MC, EXC 115, högtalare Volker Dötsch) beviljades delvis EHKS vid Buchmann Institutet för molekylär Life Sciences (BMLS, regissören Enrico Schleiff) vid Goethe Universität Frankfurt am Main av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Utvecklingsbiologi leddjur insekt Coleoptera, Morfogenes embryogenes icke-invasiv långsiktig fluorescens levande avbildning lätt ark baserade fluorescensmikroskopi tredimensionell Ijusmikroskopi LSFM DSLM SPIM
Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter