Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Abstract

Kırmızı un böceği Tribolium castaneum gelişimsel genetik ve evrimsel gelişim biyolojisi önemli bir böcek model organizmadır haline gelmiştir. Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile Tribolium embriyoların gözlemlenmiş olması alışılmış geniş alan ve konfokal floresan mikroskobu üzerinde sayıda avantajı vardır. Nedeniyle hafif bir levha bazlı mikroskop eşsiz özelliklerine göre, canlı örneklerin üç boyutlu görüntüler yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip kaydedilebilir ve önemli ölçüde çok sayıda son dönemlerde foto-ağartma yanı sıra birden fazla yön boyunca foto-düşük toksisiteye günler. Metodolojik gelişme ve verilerin sürekli artış fazla dört yıllık zaman Tribolium toplumda ışık levha teknolojisinin kullanımı için de böcek toplumda olduğu gibi geniş standart operasyon prosedürlerini kurmak için uygun görünüyor. Bu protokol, f uygun üç montaj teknikleri tarifya da farklı amaçlar, uzun süreli canlı görüntüleme için uygun olan iki yeni ısmarlama transgenik Tribolium hatları sunulur sabit embriyo, hücre içi yapıları etiket beş floresan boyalar önerir ve kaydedilen verilerin zamanında değerlendirilmesi için, veriler, post-işlem hakkında bilgi sağlar. Temsilci sonuçlar uzun süreli canlı görüntüleme, optik olarak kısımlara ve birden doğrultular boyunca aynı embriyonun gözlem konsantre. ilgili veri kümeleri indirilebilir bir kaynak olarak temin edilmiştir. Son olarak, protokol canlı görüntüleme deneyleri, güncel sınırlamalar ve diğer böcek türlerine özetlenen prosedürlerin uygulanabilirliği için kalite kontrollerini anlatılır.

Bu protokol öncelikle standart laboratuar ekipmanı daha iyi performans görüntüleme çözümleri aramak gelişimsel biyologlar için tasarlanmıştır. Bu geliştirmek ve Mikrolara rafine teknik odaklı laboratuarlar / topluluklar arasındaki boşluğu kapatmak için sürekli girişimde teşvikmetodolojik olarak kopyalamak ve teknik sorunlara 'tak-çalıştır' çözüm gerektiren yaşam bilimleri laboratuvarları / topluluklar. Ayrıca, ilgi merkezi haline biyolojik soruları hamle bir aksiyomatik yaklaşımını desteklemektedir.

Introduction

Kara böceklerin büyük bir aile (Tenebrio) aittir kırmızı un böceği Tribolium castaneum, tarım ve yaşam bilimleri içinde uzun bir geçmişi vardır ve meyve sonra ikinci en iyi çalışılan model, böcek model organizma Drosophila melanogaster sinek olduğunu. Son dört yılda, bu çeşitli nedenlerle için embriyonik morfojenezinde, son yirmi yılda, evrimsel gelişim biyolojisi, gelişimsel genetiği güçlü ve popüler böcek model organizma haline geldi ve:

Drosophila ve Tribolium hem Holometabola aittir ama yaklaşık 300 milyon yıl önce 1, 2, 3, 4 sapmıştır. Yüksek türetilen Drosophila embriyonik gelişim yaygın olarak kabul edilmekle birlikte, Tribolium devel bir Atalara modu gösterirböcek türlerine 5, 6, 7, 8, 9 dikkate değer bir oranda bulunan opment. Onun ağız ve antenler embriyogenez 10, 11, 12, 13, 14, 15 boyunca ortaya çıkmakta, yani ilk olarak, Tribolium olmayan involuted baş geliştirme sergiler. İkinci olarak, Tribolium kısa tohumu geliştirme, örneğin, karın segmentleri germband uzama 16, 17, 18, 19 boyunca, arka büyüme bölgesinden ilave edilirler ilkelerini izler. Üçüncüsü, Tribolium geliştirmekte ve daha sonraki alçaltıriki ekstra-embriyonik zarlarını çok ventral embriyo kapsar amniyon, ve tamamen 20, 21, 22 embriyo saran serozası, yani. Her iki membranlar çok önemli bir morfogenetik 23 yanısıra mikroorganizmalar 24, 25 ve kuruması 26 karşı koruyucu bir rol oynar. Dördüncü olarak, embriyonik gelişmekte bacaklar larva yaşam safhasında tamamen işlevsel ve pupa başkalaşım 27, 28, 29, 30, 31 boyunca, yetişkin bacaklar için primordia olarak görev yapar.

Nedeniyle kendi küçük boyutları ve mütevazı talepleri, laboratuvarda Tribolium ekimi oldukça basittir. yabanıl tip Kültürler (WT) suşları veya transgenik çizgiler, tipik olarak yaklaşık 100-300 yetişkin oluşur ve tam tahıl buğday oluşur büyüme ortamı ile üç ila dört santimetre yüksek (yaklaşık 50 gr doldurulmuş bir litrelik bir cam şişe (ayak 80 cm2)) içinde tutulabilir un aktif kuru maya ile takviye edilmiştir. Bir su kaynağı gerekli değildir. Bu küçük veya orta ölçekli ticari olarak bulunabilen böcek kuluçka içinde böcek kültürlerinin onlarca tutmak için hatta küçük laboratuvarlar sağlar. Tribolium Daha sonra gelişim evreleri (larvalar sonra yaklaşık dördüncü safha, pupa ve yetişkin) kolayca eleme ile büyüme ortamından ayrılır. Senkronize embriyolar yumurtlama ortamı üzerinde kısa bir süre için yetişkin inkübe edilmesi ile elde edilir. stok tutma tipik 22-25 ° C'de gerçekleştirilir iken hızla gelişmesi için, böcek kültürleri, 32 ° C (kuşak başına yaklaşık dört hafta) tutulur (yaklaşık on hafta nesil başına).

Son on yıl içinde, birçok standart tecGelişen model organizmalar kitap 32 özetlenen hniques yavaş yavaş uyarlanmış ve Tribolium için optimize edilmiştir. Büyük önem embriyonik 33 gibi genetik yöntemler, larva 34, 35 ya da ebeveyn 36, 37 RNA interferans esaslı gen demonte ya piggyBac 38, 39 ya da Minos 40 transposaz sistemi ve CRISPR / Cas9 tabanlı genomu ile tohum çizgisi dönüşüm ilerletilirler mühendislik 41. Bundan başka, Tribolium genom on yıl önce 42 ile ilgili dizilenmiştir ve etkin ve genom kimlik ve genin 44. sistematik analiz sağlar düzeneği 43 serbest genomun üçüncü turda, şimdi 45, 46. Buna ek olarak, diğer dört koleopteran türlerinin genomlarının karşılaştırmalı genetik yaklaşımlar 47, 48, 49, 50 mevcuttur. Sekanslanmış genom ile bağlantılı olarak, iki büyük ölçekli genetik analizler bir araya sokma mutajenez ekran 51 ve sistematik bir RNA girişimi esaslı gen demonte ekran 52, 53, yani gerçekleştirilmiştir.

Geniş açılı, konfokal veya hafif levha bazlı mikroskobu (LSFM) ile floresan canlı görüntüleme çok boyutlu bir içerik (Tablo 1), zamanın bir fonksiyonu (örneğin, morfojenezi) halinde Tribolium embriyonik morfolojisi gözlemlenebilir. widefield ve konfokal floresan mikroskobu olarak, Excittirme ve emisyon ışık aynı objektif merceği içinden yönlendirilir. Her iki yaklaşımda da tüm numune her kaydedilen iki boyutlu düzlemde için aydınlatılmaktadır. Bu nedenle, numuneler çok yüksek enerji seviyesine tabi tutulmaktadır. LSFM olarak, odak düzlemi sadece flüoroforlar bağlı iki dikey yerleştirilmiş objektif lens (Şekil 1) kullanılarak aydınlatma ve saptama bir dekuplaj heyecan bulunmaktadır. Bir uçak ışıklandırma mikroskobu (SPIM) ve dijital taranmış lazer ışığı levha bazlı floresan mikroskobu (DSLM, Şekil 2) - - LSFM iki kanonik uygulamalarda gelir ve geleneksel yöntemlere göre birçok önemli avantajlar sunmaktadır: (i) iç optik kesit özelliği, (ii) iyi eksenel çözünürlüğü, (iii) foto-ağartma kuvvetli düşük bir seviyesi, (iv) çok düşük foto-toksisite, (v) yüksek sinyal-gürültü oranı, (vi), nispeten yüksek bir edinim hızı, (vii) görüntüleme birden fazla yönde ve (vi boyuncanedeniyle düşük sayısal açıklık aydınlatma objektifler 54, 55, 56 kullanımına ii) daha derin doku penetrasyonu.

LSFM zaten başarıyla neredeyse tüm embriyonik morfonogenezi 57 belgelemek ve dorsal kapatma 23 başında ekstra embriyonik membran rüptürü ilkelerini analiz etmek Tribolium içinde uygulanmıştır. Mikroskop bir kolaylığı olur nerede standart çalışma usulleri belirlemektir ve yöntemleri, protokolleri ve bir seviyeye kaynakların havuzu geliştirmek için büyük önem taşımaktadır, Tribolium toplumda ve genel olarak böcek bilimi için LSFM çekiciliğini artırmak için gelişimsel biyoloji laboratuvarlarında standart aracını -KULLANMA ve biyolojik sorular dikkat merkezinde kalmak.

Bu protokol Tribolium temelleri <ile başlar/ em> ekimi, yani bakım, üreme ve embriyo koleksiyonu. Daha sonra, iki deneysel stratejileri gösterilmiştir: (i) canlı ısmarlama transgenik hatların görüntüleme ve floresan boyalar (Tablo 2) ile boyanmıştır sabit embriyolar (ii) görüntüleme. (I) agaroz sütunu, (ii) agaroz hemisfer ve (iii) yeni örümcek ağı tutucu: Daha sonra, biraz daha farklı amaçlarla üç montaj teknikleri detaylı (Şekil 3 ve Tablo 3) açıklanmıştır. protokol daha sonra LSFM ile veri toplama işlemini açıklar. Görüntüleme Yöntemleri ve temel düşünceler özetlenmiştir. Son olarak, embriyo alma açıklanır ve temel veri işleme için öneriler ortaya konmuştur. Temsili sonuçlarda, canlı görüntü verileri iki yeni ısmarlama ve Glia mavisi 58 transjenik çizgi gösterilir ve karşılık gelen görüntü veri kümeleri indirilebilir bir kaynak olarak temin edilmiştir. Ayrıca, görüntüFloresan boyalar, çeşitli ile boyandı sabit embriyoların veriler sunulmaktadır. tartışma kalite kontrol, canlı görüntüleme yaklaşımının geçerli sınırlamalar ve diğer türlere protokolünün adaptasyonu odaklanır.

Protokol, bir numune haznesi ve tipik olarak bir çapa sahip bir metal, plastik ya da camdan yapılmış silindir şekilli elemanlar olan standart numune tutucuları 54, 59, 60, bir döner kelepçe mekanizması ile donatılmıştır ışık levha bazlı floresan mikroskobu için yazılmıştır milimetre aralığındadır. Protokol, her iki kanonik uygulamalarda örneğin, SPIM ve DSLM, aynı zamanda iki ya da daha fazla aydınlatma ve tespit kolları 61, 62, 63 ile kurulumları için uygundur. temsili sonuçlar, iki tayf kanalları verileri gösterir, yeşil (IL488 nm lazer, saptama bir geçiş filtresi bandpass 607/70 bir geçiş filtresi) ve kırmızı (bir 561 nm lazer ile aydınlatma, algılama bandpass 525/50), ancak protokol ile bir aydınlatma üç ya da dört spektral kanallara genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tribolium Kültürlerin 1. Yetiştirme

Not: standart koşullar / 12 saat karanlık döngüsü parlak bir 12 saat içinde 25 ° C ve% 70 nispi nemde bir inkübasyon sıcaklığı olarak tanımlanır. Tribolium hayvancılıkla ilgili daha fazla bilgi için, ilgili kurallar 64 mevcuttur. Bu protokol, kilogram miktarlar hazırlanmış ve birkaç ay boyunca saklanabilir iki farklı un bazlı ortam gerektirir.

  1. Önceki un ve aktif kuru maya ile çalışmak için, 24 saat boyunca -20 ° C ile paketleri depolamak ve daha sonra bunları oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verin. Bu prosedür, potansiyel patojenleri ortadan kaldırır.
  2. 710 um ağ gözü boyutuna sahip bir elek aracılığıyla tam tahıl buğday unu ve aktif olmayan kuru maya geçirin ve ardından aktif kuru maya elenmiş (ağırlık / ağırlık),% 5 ile elenmiş tam tahıl unu ilave etmek suretiyle bir büyüme ortamı hazırlar.
  3. 250 & # ile bir elekten 405 ince buğday unu ve inaktif kuru mayayı geçirin181 m örgü boyutu, daha sonra aktif kuru maya elenmiş (ağırlık / ağırlık),% 5 ile elenmiş 405 ince buğday unu ilave etmek suretiyle yumurtlama ortamı hazırlar.
  4. Ile ilgili Tribolium kültürü geçmek bir elek 800 m gözenek boyutu. artık büyüme ortamı atılır. Büyük bir cam tabak için larva, pupa ve yetişkin aktarın.
  5. Hiçbir döl kültürü varsa, yeni bir nesli kültürünü kurmak için yeni bir cam şişe yaklaşık 80 larva ve / veya pupa aktarın. Hiçbir larva ve / veya pupa varsa, bunun yerine yaklaşık 40 yetişkin almak. büyüme ortamı, 50 g ekleyin ve standart koşullar altında inkübe edilir.
  6. görüntüleme kültürünün oluşması için başka yeni bir cam şişede yaklaşık 300 yetişkin (500-700 mg) toplayın. büyüme ortamı, 50 g ekleyin ve standart koşullar altında inkübe edilir. görüntüleme kültür Embriyo toplanması öncesinde yeni yetiştirme ortamında en az 24 saat yerleşmek için izin verin.
  7. görüntüleme kültürü en azından her iki biz büyüme ortamını değiştirinEmbriyo toplanması ile birlikte yapılabilir eks, (3.2). iki üç ay sonra, döl kültüründen yeni yetişkinler tarafından tamamen görüntüleme kültürünü değiştirin.
  8. olmayan bir homozigot transjenik çizgi kullanılırsa, transgenik olmayan hayvanlar kaldırarak sık soy kültürleri küratörlüğünü. ilgili transgen öldürücü değildir veya sterilite iki kromozom üzerinde mevcut olan neden İdeal olarak, tek tür çizgilerini oluşturmak. Homozigot kültürleri, tipik olarak daha yüksek bir ortalama floresans seviyesine sahip ve tek bir genotip mevcut olduğu genel deney koşulları, daha dardır.

2. Mikroskop Kurulum ve Kalibrasyon

NOT: Tribolium embriyo yaklaşık 600-660 um bir ön-arka uzunluğu ve yaklaşık 300-330 mikron bir enine çapa sahiptir. Çoğu modern CCD kameralar, yaklaşık 9 mm x 7 mm bir sensör çipi boyutuna sahip 11,4 um arasında bir çapa ve 6.45 mm'lik bir piksel-piksel mesafe yani.Bir 10X büyütme objektif lens ile birlikte kullanıldığında, embriyo 0.645 mikron piksel aralığı ile toto görüntülü olabilir. Çoğu modern sCMOS kameralar 21.3 um bir çapa, yani yaklaşık 16 mm x 14 mm daha büyük bir sensör çipi boyutu, ve 6.5 um'lik bir piksel-piksel mesafe vardır. Bir 20X büyütme objektif lens ile birlikte kullanıldığında, embriyo 0.325 mikron piksel aralığı ile toto görüntülü olabilir.

  1. mikroskop için aydınlatma ve tespit objektiflerin takın. lazerler ve floresan filtreleri fluorofor emilimini ve emisyon spektrumları çok iyi maç emin olun.
  2. mikroskop için numune odası takın. PBS pH 7.4 veya uygun herhangi bir başka görüntüleme tamponu ile numune odası doldurun.
  3. açın ve mikroskop kalibre. Kapsamlı kalibrasyon (daha spesifik DSLM uygulanması için) özel olarak oluşturulmuş ışık levha bazlı mikroskoplar için rutinleri ve sorun giderme yönergeleri pr yayınlanmıştıreviously 65. Ticari cihazlar için, çok dikkatli üreticinin talimatlarını izleyin. ortamın numune odası incelten ve alet hem de numune hasara neden olabilir yanlış kullanımı.

Transgenik veya WT Embriyolar 3. Toplama

  1. 800 m gözenek büyüklüğüne sahip bir elekten görüntüleme kolonisi geçirin. yeni bir cam şişe içinde, yetişkin böcekler toplayın ve yumurtlama ortamı 10 g ekleyin. ışığında 1, 25 ° C de saat ve% 70 nispi nem ve yumurtlama kültür inkübe edin.
  2. yaklaşık 30-100 embriyolar içeren yumurtlama ortamından yetişkin ayırmak için 800 um ağ gözü boyutuna sahip bir elek aracılığıyla yumurtlama kültür geçirin. yeni bir cam şişe yetişkinleri aktarın ve taze büyüme orta yaşlı veya 50 g ya ekleyin.
  3. Gözlem düzgün blastoderm aşamasında (örneğin, veri kümesi DS0002) başlar olursa, 25 ° C'de ve% 70 nispi nemde 15 saat için yumurtlama ortamı inkübe edin. TO germband geri çekilmesi (örneğin, veri setleri DS0001 ve DS0003) başlangıcında başlayacak, 32 ° C ve% 70 nispi nemde 23 saat için embriyolar inkübe edin. Diğer gelişim aşamaları istenirse, söz konusu literatürün 64, 65 bakın ve gerektiğinde inkübasyon süresi ve / veya sıcaklığın uyum sağlar.

4. Embriyo dechorionation

NOT: koryon kabuğu dış tabakadır ve proteinler ve polisakkaridler oluşur. Bu emici kuvvetle hafif ama düzgün gelişimi için değil esastır ve bu nedenle kimyasal kaldırılabilir.

  1. 300 um ağ gözü boyutuna sahip bir elek aracılığıyla yumurtlama ortamı geçirin. 100 um ağ gözü boyutuna sahip olan bir hücre süzgecinden embriyolar toplayın ve artık yumurtlama ortamı atılır.
  2. aşağıdaki gibi, bir 6-yuvalı plaka hazırlanması: 10 ml PBS pH 7.4 ve 9 ml PBS ile B1 ve B2 kuyu A1, A2, A3 ve B3 kuyu doldurun. Sonra dikkatli ekleyinB1 ve B2, 1 mL sodyum hipoklorittir. adımlar stereo mikroskop altında 4.8'e 4.3 ilerleyişini gözlemleyin. DİKKAT sodyum hipoklorit aşındırıcıdır.
  3. de A1 (PBS, pH 7.4) içine hücre filtresi yerleştirin ve hafif çalkalama altında bir dakika için embriyolar yıkayın. Daha büyük un parçacıklarının, embriyolardan ayırmak gerekir.
  4. (PBS pH 7.4 içerisinde sodyum hipoklorit) B1 çukuruna hücre süzgecinden aktarın ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde plaka sallayın. Kalan un parçacıklarının, embriyolardan tamamen ayırmak gerekir.
  5. de A2 (PBS, pH 7.4) hücre süzgecinden aktarın ve hafif çalkalama ile 1 dakika için embriyolar yıkayın.
  6. dechorionation için, (PBS pH 7.4 içerisinde sodyum hipoklorit) B2 oyuğa hücre süzgecinden aktarın. koryon kopmalar kadar kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve plaka embriyolardan ayrılır. dechorionated embriyolar düz siluet varken koryon, yırtılmış kenarları olan ince, yarı saydam zar gibi görünüyor.
  7. aktarım inciE hücre de A3 süzgeci (PBS, pH 7.4) ve hafif çalkalama ile 1 dakika için embriyolar yıkayın. Herhangi bir koryon fragmanları yine yıkamadan sonra embriyolar bağlanmış ise, adım 4.6 tekrarlayın.
  8. B3 oyuk (PBS, pH 7.4) içinde embriyolar saklayın. birkaç saat Depolama embriyoları zarar, ama gelişme devam ettiğini akılda tutmaz.
  9. homozigot olmayan transjenik çizgileri için, herhangi bir floresan olmayan embriyolar mümkünse çıkarın. fiksasyon ve WT veya transgenik embriyo boyama için, adım 6 ile devam transgenik embriyo canlı görüntüleme için Adım 5'te devam edin.

5. Vitellin membran geçirgenliği, sabitleme ve boyama

NOT: Vitellin membran kabuğunun iç tabakadır. Bu fluoresan boyalar için geçirimsizdir ve böylece de kimyasal olarak lekelenme geçirgen hale zorundadır.

  1. sabitleme / besleyici çözeltiyi (1.5 ml% 4 (PBS pH 6.9 bir w / v) 'paraformaldehid ile bir sintilasyon flakonu Dolgund 1.5 ml n-heptan). şişeler için fırça ile embriyolar transfer. Alüminyum folyo ile kapatılır şişeler ışıktan florofor korumak ve dakikada 50 dönüşte sallanan bir platform üzerinde 30 dakika inkübe etmek. DİKKAT paraformaldehit toksik ve tahriş edicidir, n-heptan, yanıcı ve zehirlidir.
  2. 1 mL% sabitleme çözeltisini çıkarın ve 3, 15 dakika boyunca, daha sonra bir kez PBS pH 7.4 içinde 3 ml% 0.1 (h / h) Triton X-100, 15 dakika boyunca embriyolar üç kez tedavi etmek ve (h / h) Triton X-100 dakikada 50 dönüşte sallanan bir platform üzerinde PBS pH 7.4 ile yıkanmıştır. DİKKAT, Triton X-100 aşındırıcıdır.
  3. geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve şişeye 0.5 ml boyama çözeltisi ilave edilir. Örnek boyama çözeltileri Tablo 2'de verilmiştir. dakikada 50 dönüşte sallanan bir platform üzerinde gece boyunca 4 ° C 'de leke embriyolar. Tablo 2'de önerilen boyalar için, yıkama gerekli değildir.

Agaroz montajı 6. hazırlanması

  1. Ekle 1 gr düşük erimeparçacıklar, tamamen çözülünceye kadar agaroz 100 ml PBS pH 7.4 ve küçük agaroz parçacıkların hala mevcutsa 800 W bir mikrodalga fırın içinde 2-3 dakika için karışımın ısıtılması, 30 saniye aralıklarla, ısıtma işlemini tekrarlayın. Montaj agaroz yukarıda tarif edildiği gibi agaroz katılaşmış ısıtılarak yeniden sıvılaştınlabilir, taze her zaman hazır olmasına gerek yoktur. Bu süreç çok fazla su buharlaştı önce 5-6 kez tekrarlanabilir.
  2. agaroz ısıtıldı agaroz ile iki 1.5 ml reaksiyon tüpleri, dolgu, yaklaşık 40-45 ° C'ye kadar soğutulur ve bir termo-35 ° C 'de bu tüpler tutmak için izin verir.

7. Embriyo numune bölmesine ve montajı Ekleme

  1. 1. Seçenek: Agaroz kolonu (Şekil 3A-C, birinci kolon Tablo 3, ikinci sütun)
    1. damıtılmış su ile 1.0 mL şırınga doldurun ve küçük bir kauçuk hortum kullanılarak cam kılcal deliklerinden biri ekleyin.damıtılmış su ile kılcal yarıya doldurun.
    2. Bir boya fırçası ile bir embriyoya almak ve diğer cam kılcal açıklığının iç tarafına yerleştirin. Embriyo kurumadan sonraki adıma hızla devam edin.
    3. Sıvı Agaroz içine kılcal sopa ve yavaşça kılcal damar içine embriyo yanında sıvı agaroz bir kaç mcL çizin. Daha sonra hızlı bir şekilde embriyo agaroz ile birlikte sürüklenen böylece çekme kuvvetini arttırır. Sonunda, agaroz bir kaç mcL üstünde ve embriyonun altında olmalıdır. Birkaç dakika için bir kenara kılcal ayarlayın ve agaroz katılaşmaya edelim.
    4. 5 mm kadar bir uzunluğa, bir elmas cam kesici ile kılcal kısaltır. geri kalan kesiti tamamen agaroz ile doldurulmalıdır ve embriyo ikinci dörtte içinde olmalıdır.
    5. numune bölmesine pim çelik silindir yerleştirin ve daha sonra pimin üzerinde kılcal fragmanı sopa. agaroz sütunu birkaç milimetre f dışarı çıkmalıdırembriyo içeren kısmı ile kılcal fragmanı rom.
  2. Seçenek 2: Agaroz yarımküre (Şekil 3A-C, ikinci kolon; Tablo 3, üçüncü sütun)
    1. alt açıklığın bir yarı küre oluşana kadar agaroz ile üstten çelik boru doldurmak için kullanın, 1.0 mL şırınga içerisine sıvı agaroz 200 uL çizin. hemisfer çaplı boru çapına eşit olmalıdır. Agaroz katılaşmış kadar birkaç dakika bekleyin.
    2. Bir boya fırçası ile bir embriyoya almak ve ön uç erişilebilir hale gelir, böylece fırça ucuna yeniden düzenlemek. ince bir film ile örtün sıvı agaroz, agaroz yarı küre batırın.
    3. dik agaroz yarımkürenin direğin üzerindeki ön ucuyla embriyo yerleştirin. yaklaşık çelik boru getirin ve bir fırça ile embriyo konumunu düzeltin. Gerekirse, embriyo / hemisfer sınırına agaroz 2 uL ilave embriyo kararlı hale getirir. İdeally, embriyo yüzeyinin yarısından az agaroz ele alınmalıdır ve yanları, mümkün olduğunca dik olmalıdır.
    4. yavaş numune bölmesine hemisfer ve embriyo çelik boru yerleştirin.
  3. Seçenek 3: Örümcekağı tutucu (Şekil 3A-C, üçüncü sütun, Tablo 3, dördüncü bir kolon)
    1. Bir fırça ile bir embriyo seçin ve bir kenara koyun.
    2. 5-8 uL, sıvı agaroz ile örümcek ağı tutucunun yarıklı bir delik Kapak daha sonra sadece ince bir agaroz filmi kalana kadar agaroz en çıkarmak.
    3. agaroz film üzerine embriyo yerleştirin ve kendi konumunu ayarlamak. Dikkatle oluklu deliğin x ekseni merkezine embriyo hareket ve oluklu deliğin uzatılmış ekseni ile uzatılmış ön-arka eksen hizalamak.
    4. yavaş numune bölmesine monte embriyo kuruntu tutucu yerleştirin. o eksitasyon ve emisyon ile müdahale etmeyecek şekilde örümcek ağı tutucu yerleştirinışık, x ve z-ekseni, yani 45 °.

8. Işık levha bazlı floresan mikroskopi

  1. Embriyo görüntülü olmalıdır kaç tarifi (ve birlikte yönelimlerin) boyunca karar verin. Dört tarifi (yönelimler, 0 °, 90 °, 180 ° ve 270 ° birlikte) genellikle iyi ödünleşimi kapsamı ve enerji yük arasında bulunur.
  2. floresan kanal sayısını ayarlayın. Her kanal için önemli parametreler, lazer ışını, floresan filtre, lazer gücü ve uygulama süresi vardır. Uzun süreli canlı görüntüleme için, entegre enerji yükü embriyonun toleransını aşmayan önemlidir. 100 ve 300 uW arasında bir lazer güç embriyo canlılığını etkilememelidir ise 25-50 ms bir tutma süresi, hızlı görüntüleme sağlıyor. sabit örnekleri, pozlama süresi ve lazer gücü için en az iki katına edilebilir.
  3. Canlı görüntüleme deneyleri için geçen süreyi yapılandırın. compTribolium Lete embriyojenez, oda sıcaklığında (23 ± 1 ° C) ve 32-35 ° 'de biraz az üç gün bir C64 yaklaşık yedi gün sürer. gözlenmelidir morfogenetik olaylara göre zamansal aralığını tanımlar. Kısa zamansal aralıklar için, pozlama süresi ve lazer gücü (8.2) düşürücü düşünün.
  4. lazer maruz kalmadan görüş alanının merkezine x ve y eksenleri boyunca transmisyon ışığı modunda embriyo yerleştirin. Montaj işlemi sırasında meydana gelen herhangi bir hasar için embriyo incelemek için 90 ° adımlarla 360 ° embriyo döndürün.
  5. Mikroskop z-ekseninden dorsoventral eksen, yani, örneğin, x-ekseni, yatay bir eksene eksenleri ile embriyonik eksenlerin hizalamak için y-ekseni etrafında uygun bir şekilde embriyo döndürün. kuruntu tutucu tekniği kullanırken, hizalama mümkün olmayabilir.
  6. Floresan modunda fo z yığını tanımlamakher yön r. önünde mekansal tampon olarak ve embriyo arkasında 25-50 mikron ekleyin. Tampon dahil olmak üzere, tipik z yığın bir Tribolium embriyo için yaklaşık 350-400 um kapsar. Ayrıca, dört kez yanal aralık olmalıdır z aralığı tanımlamak x- boyunca aralık, yani ve 66 Y ekseni.
  7. İki ya da daha çok embriyo paralel olarak görüntülenmiştir, bir sonraki embriyo ile 8.4 olarak yeniden.
  8. Uzun süreli görüntüleme için, numune odası yeterli PBS pH 7.4 veya başka görüntüleme tampon ile doldurulmuş olduğundan emin olun. Ayrıca, örnek odasının açıklığı kapsamaktadır.
  9. görüntüleme işlemini başlatın. Uzun süreli canlı görüntüleme için, tüm embriyolar için tüm kanallarda her yöne boyunca doğru edinimi izlerler. Bazen embriyolar canlı ve uygun konumda olduğundan önümüzdeki günlerde kontrol edin.

9. Embriyo Alma ve Kalite Kontrol

  1. görüntüleme tamamlandıktan sonra, numune tutucu kaldırmakÖrnek odasından embriyolar. Canlı görüntüleme tahliller sadece embriyolar alınması gerekebilir. Sabit ve lekeli embriyolar bertaraf edilebilir.
  2. Canlı görüntüleme deneyi gerçekleştirildi Eğer bir nesne slayt embriyo transferi. agaroz sütunu teknik için, bir bisturi, mikro-bıçak ya da jilet ile agaroz çevreleyen embriyolar ekstrakte edin. Agaroz hemisfer teknik için, nesne slayt düz tarafı yarı küre aktarın. Embriyo kaldırma gerekli değildir. kuruntu tutucu tekniği için, hafifçe bir fırça ile agaroz filmden embriyolar inin. larva kadar standart koşullar altında doymuş bir nem atmosferinde küçük bir cam tabak içinde nesne slayt inkübe edin.
  3. Yumurtadan çıktıktan sonra, 24-çukurlu bir tabağın tek tek oyuklara larva transferi ve her bir büyüme ortamı, 500 mg ekleyin. Standart koşullar altında inkübe edin. görüntülenmeyen WT ve transgenik larv için görüntülü larvaların toplam geliştirme zamanı ve morfolojik karşılaştırınae (tartışma). WT gelişimini karakterize analizlerde, belirgin morfolojik anormallikler ideal olarak farkedilebilir olmalıdır.
  4. larva sonra, sağlıklı yetişkinler için geliştirmek aynı arka plan suşu uygun WT ortaklarıyla bunları sağlamak. İki hafta sonra, döl üretimi için kontrol edin. Ayrıca pares onları arası çiftleşme yoluyla döl verimliliğini kontrol etmek düşünün. görüntüsü embriyolar bereketli hücre üretir üretken yetişkinler halinde geliştiğinde Sadece, görüntüleme prosedürü non-invazif olarak kabul edilebilir.

10. Görüntü Veri İşleme

NOT: Görüntü veri işleme için açık kaynak görüntü işleme yazılımı ImageJ 67 veya türev FİJİ 68 tavsiye edilir. Her iki sürüm yanı sıra kapsamlı dokümantasyon www.imagej.net bulunurlar. LSFM verileri için standart dosya biçimi etiketli bir resim dosyası biçimi (TIFF) 'dir. içsel konteyner seçeneği sto verirBu tür z-yığınları veya sürükleme ve bırakma yoluyla ImageJ veya FİJİ açılabilen tek bir dosya içinde z en çıkıntıların zaman serisi olarak görüntü yığınlarının öfke.

  1. Gerekirse, y-ekseni (Şekil → → Döndürme dönüşümü) olan embriyo ön-arka ekseni hizalamak için z-yığınlar döndürün. rotasyon parametreleri ancak zaman atlamalı ve floresan kanalları için, her yön için ayrı ayrı ayarlanması gereken unutmayın.
  2. boyunca z-yığınlar kırpma sadece minimal arka plan şekilde X-, Y- ve Z-eksenleri (20 - x- ve y-ekseni boyunca 40 piksel, 5 - z ekseni boyunca 10 uçak) X için (kalır - ve y-ekseni, Dikdörtgen Seçim Aracı, Crop → sonra Resim kullanmak; Dilim Gardiyan'a → Yığınlar → Araçlar) → z ekseni, kullanım Image. kırpma parametreleri, her yön için ayrı ayrı ayarlanması gereken unutmayın, ancak zaman değil noktaları ve floresan kanalları için lütfen.
  3. Her bir Z-yığını z en projeksiyon hesaplama(Yığınlar → Z Projesi → Görüntü Max Yoğunluğu seçin). Yoğunluk projeksiyon hesaplamaları bir mekansal boyutuna kaldırmak veri sadeleştirme işlemlerdir.
  4. Uzun süreli canlı görüntüleme verileri, işlem 10.1 her yöne, bütün zaman noktalarında ve flüoresan kanallar 65 10.3 adımları gerçekleştiren bir ImageJ veya FİJİ komut kullanabilirsiniz. İdeal olarak, kanal ve yön başına tüm z en çıkıntıları birleştirir ve bir TIFF kap içinde bir zaman serisi olarak kaydedin. Seçenek olarak ise, FİJİ için BigDataViewer 69 eklenti TB-büyük veri gezinmek için kullanılabilir.
  5. Transgenik satır ve görüntüleme yöntemleri bağlı olarak, zaman yığınlarının dinamik yoğunluğu ayarlamaları Foto-ağartma ve / veya florofor sentezleme dalgalanmalarına uygun olabilir. ImageJ- veya FİJİ-içsel Bleach Düzeltme fonksiyonu Ya (Resim → Histogram Eşleştirme seçin → Bleach Düzeltme ayarlayın) ya da dedicated yazılım 65 önerilmektedir.
  6. embriyo / veya kanal birleştirme, yön yatay kombinasyonu (Yığınlar → Araçlar → birleştirin → Resim) birden doğrultular boyunca ve çoklu floresan kanallarında ve kaydedilmiş ise (Görüntü → Renkli → Birleştirme Kanallar) önerilir.
  7. Kayıt ve sonunda dekonvolüsyon 71 ile kombinasyon halinde, birden fazla yönde 70 boyunca elde edilen Z yığınlarının füzyon, aynı kalitede ve izotropik çözünürlük üstün üç boyutlu görüntüler hesaplanmasını sağlar. Her iki eklentiler açık kaynak ve FİJİ önceden yüklenmiş, ancak örnek yaklaşık yerlerinden varlığı (floresan mikro küreler, örneğin boncuk) gerektirir.
  8. Büyük ölçekli sayısal veri ekstraksiyonu ve analizi için açık kaynak yazılım çerçeveler de mevcuttur hücre çekirdekleri 72 veya cel bölütlenmesine ve takibi için, örneğinl şekil tanıma 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, yaşayan floresan görüntüleme veya LSFM ile sabitlenmiş ve lekeli Tribolium embriyolar için deneysel bir çerçeve tanımlamaktadır. Foto-ağartma ve foto-toksisite, optik kesit yeteneğinin doğrudan bir sonucu olarak, düşük seviyelerde, LSFM uzun süreli canlı görüntüleme için özellikle uygundur.

Yeni AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgenik hat alfa-tübülin 1 promotör 74 kontrolü altında bir histone2B-mEmerald füzyon proteinini ifade eder. Floresans sinyali esas olarak serozası, yolk kesesi ve çeşitli nöronal hücre kümeleri elde edilir, çünkü bir güçlendirici kapan gibi ekspresyon modelini 51 göstermektedir. Bu çizgi kullanılarak, oda sıcaklığında (23 ± 1 ° C), embriyonik gelişim 66 saat germband geri çekilmesini ve dorsal kapak (Ek Film 1) kapsayan kaydedildi. Buhat kafa uzantıların (Şekil 4A) ve dorsal kapağın (Şekil 4B) sırasında serosa göç dinamikleri nöronal kümeleri görüntülemek için kullanılabilir. yeni AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 4. satır 4. satır aynı transgeni taşır, ancak farklı bir genomik konumda. Bu açık bir arttırıcı tuzak modelini göstermektedir, ancak bu promotör 74, daha önce tarif edildiği gibi floresan sinyali spatiotemporally her yerde bulunan bir tespit edilebilir. Bu hat, iki derinlik seviyeleri (Şekil 4C) optik kesit yeteneğini göstermek için uzama germband için gastrülasyon geçişte görüntülenmiştir. Diğer bir özelliği, özellikle de canlı görüntüleme için, gelişim biyolojisi kullanılan LSFM kurulumları için standart örnek rotasyon yoluyla birden fazla yönleri boyunca Z yığınlarının elde edilmesidir. Örneğin, Glia mavisi 58 doğrultusunda, örnek bir dönüşübirlikte ve ventral sinir kablosu hem de aynı embriyo sadece dorsal sitesinden iyi görülebilmektedir sol baş lob proliferasyon dinamikleri, (Şekil 4D, Ek Film 2) çevresinde glia hücre yeniden gözlemlenmesi akımları. Bu çalışmayla bağlantılı canlı görüntüleme veri kümeleri indirilebilir bir kaynak, meta ve erişim bilgileri gibi sağlanır Tamamlayıcı Tablo 1'de bulunur.

Canlı görüntüleme için transgenik hatların seçimi hala sınırlı olduğundan, küçük floresan boyalar özellikle hücre içi yapılarını etiketlemek için kullanılabilir. SYTOX Yeşil YOYO-1 ve BOBO-3 iyodür çekirdek zarfına bağlanan ve yeşil ve kırmızı kanal, sırasıyla (Şekil 5A) gösterildiği edilebilir ise, çekirdek hücre ve yeşil kanaldaki görselleştirilebilir bağlanır. Bu boyalar, bazı embriyonik yapı vurgulamak için kullanılabilirbu tür serosa skar (Şekil 5B, birinci sütun), arka karın serosa hücreleri (Şekil 5B, ikinci sütun) ya da serosa pencere kapanması sırasında ortaya çıkan Seroza amniyon-germband doku üç katmanlı olarak ures, (Şekil 5B, bir üçüncü beşinci kolonu). Çift renkli boyama Alexa Fluor birleşmiş falloidin boyalar ile boyanmış olabilir, aktin hücre iskeleti ile birlikte, örneğin, çekirdek zarfı aynı embriyo iki hücre içi yapılarda görselleştirme sağlar. BOBO-3 FITC 488 (Şekil 5D) ile kombine edilebilir Örneğin, YOYO-1 iyodür, FITC 546 (Şekil 5C) ile kombine edilebilir.

Sabitleme işlemi içsel fluorescenc doyurur için, düzeltme ve daha önce, belirli bir floresan protein ifade eden transgenik embriyo leke de uygundurE sinyali sadece marjinal. Örneğin, AGOC çekirdekleri yeşil kanalda tespit edildiği {ATub'H2B-mEmerald} 4. transgen doğru, embriyolar FITC 546 çok aktin hücre iskeletinin kırmızı kanal görünür hale gelir (Şekil 6 ile boyanmış olabilir ).

Şekil 1
Şekil 1: Klasik geniş açılı, konfokal lazer tarama ve ışık levha bazlı floresan mikroskobu karşılaştırılması. Geleneksel Geniş açılı, epi-floresan mikroskopi uygun filtreler veya ışık kaynakları olarak yayıcı diyotlar yüksek güçlü ışık ksenon ark / cıva buharlı lambalar kullanır. Her bir alınan iki boyutlu bir görüntü için, bütün numune olmayan bir kırınım sınırlı ışık konisi ile aydınlatılır. odaklı lazer tarama floresan mikroskobu olarak, bir kırınım sınırlı Gauss lazer ışını Scnumunesi boyunca anned ve floresan düzensiz biçimde nokta-nokta tespit edilir. Benzer şekilde geleneksel widefield epi-floresan mikroskop için, tüm numune her edinilmiş iki boyutlu görüntü için aydınlatılmaktadır. Işık levha bazlı floresan mikroskobu olarak, bir kırınım sınırlı Gauss lazer ışını algılama eksenine dik numune yanar. Flüoresan ile de tespit edilebilir düzlemsel yan düzlem veya satır-satır edilir. iki boyutlu bir görüntüsünün yakalanması sırasında, tespit amacı odak düzlemi üzerinde ortalanmış sadece küçük bir hacim uyarma ışık efekt. numunenin kalan hacim foto-toksik etkilerine maruz etmez dışı odak bulanıklık katkıda bulunmaz, ışıklı değildir ve Foto-beyazlatma için fluorophores kaybetmez. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

ep-together.within sayfalık = "1"> şekil 2
Şekil 2: Hafif levha bazlı floresan mikroskobu prensibi. LSFM, aydınlatma ve tespit en az iki optik yol halinde bölünür. en az bir algılama kolu uygun bir filtre ve bir floresan sinyali (yeşil) paralel olarak saptanması için bir kamera ile donatılmış, en az bir aydınlatma kolu, açık tabaka (mavi) oluşturmak için kullanılır. LSFM iki kanonik uygulamaları, tek (veya seçici) düzlem aydınlatma mikroskobu (mavi arka plan) ve dijital taranmış lazer ışığı tabaka mikroskobu (kırmızı alan) sahiptir. numune ve birbirlerine ışık sac göre hareket ettirerek, üç boyutlu görüntüler elde edilir. Birden yönleri boyunca bilgiler tercihen yerçekimi boyunca yönlendirilmiştir, y-ekseni etrafında numune döndürülmesiyle toplanır.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3: Işık Levha tabanlı Floresan Mikroskopi ile Tribolium Embriyonik Gelişim Kaydı kullanılan Üç Farklı Montaj Teknikleri. (A), agaroz sütunu embriyo, bir cam kılcal üzerinden, gömülü olduğu agaroz kolonu, iter küçük iğne ile çelik bir silindire ilişkindir. agaroz hemisfer bir çelikten bir boru üzerine monte edilir. Embriyo agaroz küçük bir miktarı ile yarım küre kutbuna bağlanmıştır. kuruntu tutucu çelik silindir üzerine monte edilmiş bir yarıklı bir delik ile bir metal tabakadır. Embriyo t kapsayan ince bir agaroz filme yapıştırılmışo delik yaptı. Hafif bir levha mikroskop içinde üç montaj teknikleri (B) Şema. (C) bir DSLM içinde uygulanır üç montaj teknikleri. (D) üç montaj teknikleri ile kaydedilen Glia mavisi transgenik hattın embriyolardan örnek görüntüler. germband geri çekilmesi başlangıcından altındadır embriyolar, transmisyon ışığı görüntü eşleştirmek için üst kısmına doğru yönlendirilmiş kendi arka ucu ile gösterilmektedir. FM floresan modu; ZA, yoğunluk ayar z maksimum projeksiyon. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: Tribullum Embriyolar Canlı Görüntüleme. (A <Dorsal kapatılması germband geri çekilmesi geçişte AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 1. hattı bir embriyo)> / güçlü. Bu çizgi, bir arttırıcı tuzak ifade şekli sergiler. floresans sinyali esas olarak serozası, yolk kesesi ve birkaç nöronal hücre kümeleri bulunur. Embriyo 5 saat ara ile 15 saat arasında bir süre boyunca gösterilmektedir. detay görüntüler kafa apendiksinde hücre kümeleri gösterir. Başlangıçta, kümeler hala serosa kopma üzerine serosalın hücreleri (ilk sütun) kapsamındadır, hücreler başın döndürme hareketiyle birlikte takip. (B), 00:30 saatlik bir aralık ile 1:30 saat boyunca, sırt kapatılması sırasında gösterilen aynı embriyosu. detay görüntüleri sarısı kesesi üzerinde kopmuş serozanin göçünü gösteriyor. (C), en sıra: gastrülasyon geçişte AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 4. satır bir embriyo uzama germband için. Orta ve düşük sıra: Tek düzlemler 1:30 arasında bir aralık 10:30 saatlik bir süre boyunca, iki derinlikli gösterilmektedirh. (D), 07:30 saatlik bir aralık ile 50:30 saatlik bir süre boyunca gösterilen germband geri çekme esnasında Glia-mavi bir çizgi bir embriyo. detay görüntüler sol baş lobunda glial hücrelerin morfogenetik yeniden düzenlenmesi göstermektedir. ZA, yoğunluk ayar z maksimum çıkıntı; yoğunluk ayar PA tek düzlem. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5: Sabitleme, Boyama ve Iimaging Germband uzama sırasında WT Embriyolar. Yani ya SYTOX Green ile boyanmıştır (A) Embriyolar, bulanık bir nükleer boya veya YOYO1 iyodür veya BOBO-3 iyodür, yani iki çekirdek zarı lekeleri. (B), YOYO-1 iyodür lekeli EmbryO. Ayrıntılar serosa yara (birinci sütun), geniş arka-ventral serosa hücrelerin çekirdek zarı (ikinci sütun) ya da serozanin üç katmanlı mendil organizasyonu, amniyon ve (üçüncü, beşinci kolonuna) gerçek embriyonik dokuyu göstermektedir. (C), YOYO-1 iyodür ve FITC 546 (D), FITC 488 ve BOBO-3 iyodür ile çift-renkli boyama ile çift-renkli boyama. ZA, yoğunluk ayar z maksimum projeksiyon. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6: AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} 1. hattı Sabit ve Lekeli Transgenik Embriyolar görüntüleri. Bu transgenik hat mEmerald-etiket ifadeBütün embriyonik gelişimi boyunca her yerde bulunan bir çekirdek / kromatin işaret alfa-tübülin 1 promotörünün kontrolü altında ed histone2B (H2B). Embriyo ayrıca aktin hücre iskeletinin / f-aktin etiketler Alexa Fluor 546 FITC ile boyandı. ZA, yoğunluk ayar z maksimum projeksiyon. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

kriter floresans mikroskop türü
Geleneksel geniş alan odaklı lazer tarama Işık levha bazlı
objektif lens kurulumu bir objektif lens, orta-yüksek NA İki dik olarak düzenlenmiş objektif lens, aydınlatma: düşük NA, saptama: yüksek NA
aydınlatma ışık kaynağı Beyaz ışık kaynağı ve uygun filtreler (örneğin civa kısa ark lambaları)
veya temizlik filtrelerle LED tabanlı 		temizlik filtresi ile lazer
(Örneğin diyot veya DPPS lazerler) 		temizlik filtresi ile lazer
(Örneğin diyot veya DPPS lazerler)
iki boyutlu görüntü başına aydınlatma bütün numune bütün numune
(Tipik olarak iki boyutlu Gauss ışın tarama) 		Sadece odak düzlemi
(DSLM: tek boyutlu Gauss ışın tarama)
bulma paralel
(Tipik olarak CCD veya sCMOS kamera) 		ardışık
(Foto-multiplikatör tüpü) 		paralel
(Tipik olarak CCD veya SCMOS kamera)
görüntüleme hızı hızlı (her resim milisaniye) Yavaş (görüntü başına saniye) hızlı (her resim milisaniye)
aşımı of-focus floresan hiçbir ayrımcılık iğne deliği ile neredeyse tamamen bloke
(Ret verim çapına bağlıdır) 		Neredeyse varolmayan
(Sadece saçılma nedeniyle)
mekanla ilgili boyutlar 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
serbestlik derecesi daha 2
(Zaman, flüoresan kanalı) 		2
(Zaman, flüoresan kanalı) 		3
(Zaman, flüoresan kanalı, yön)
yanal çözünürlük r
(0.6 λ / NA) 		0.66 r
(0.4λ / NA) 		r
(0.6 λ / NA)
optik kesit yeteneği Yok hayır Evet
(Tespit yolu ayrımcılık) 		Evet
(aydınlatma yolu 75 ayrımcılık)
kullanılabilirliği ve fiyatı Ağırlıklı olarak ticari, düşük maliyetli Ağırlıklı olarak ticari, pahalı ticari, pahalı
ısmarlama, ılımlı 54,59,60,75
Tribullum embriyoları kapsayan canlı görüntüleme yayınlar altı 44,76,77,78,79,80 yedi 23,77,79,81,82,81
(dönen disk konfokal) 83,84,85 		dört 23,57,65,86

Tablo 1 - floresan ÖzellikleriTribolium kullanılan nce Mikroskopi Teknikleri Görüntüleme yaşıyor.

boya lekeleme seyreltme
SYTOX Yeşil çekirdek (bulanık) 1: 10,000 (1: GKD 2 O 100 ve 1: 1,% 100 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA)
YOYO1 iyodür nükleer zarf 1: 10,000 (1: GKD 2 O 100 ve 1: 1,% 100 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA)
BOBO-3 iyodür nükleer zarf 1: 10,000 (1: GKD 2 O 100 ve 1: 1,% 100 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA)
Alexa Fluor 488 Phalloidın aktin hücre iskeleti 1: 100 (% 1 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA içinde)
Alexa Fluor 546 Phalloidın aktin hücre iskeleti

Tablo 2 - Çözümler boyama.

agaroz sütunu
(seçenek 1) 		yarımküre
(seçenek 2) 		örümcek ağı tutucu
(isteğe bağlı 3)
gerekçe embriyo, bir kılcal kısmın dışarı itilir bir agaroz sütunu gömülüdür embriyonun arka ucu, bir agaroz yarıkürenin kutbuna yapıştırılmaktadır Embriyo yarıklı bir delik kapsayan ince agaroz filme yapıştırılmış
numune tutucu pim çelik silindir Çelik boru Çelik silindir
yarıklı
Sınırsız (herhangi bir) Sınırsız (herhangi bir) Dört (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
Gerekli yetenek seviyesi ılımlı yüksek düşük
Embriyo çevresinde agaroz yüksek düşük ılımlı
Oturum başına embriyo sayısı en fazla üç bir en fazla altı
embriyo alımı hileli kolay kolay
tek kullanımlık ekipman cam kılcal - -
için tavsiye Kısa vadeli canlı görüntüleme, lekeli embriyolar Uzun süreli canlı görüntüleme Uzun süreli canlı görüntüleme, lekeli embriyolar
<strong> referanslar üç 23,87,88 iki 57,65 bu yayın

Tablo 3 - Yöntem Avantajları ve dezavantajları montajı.

çılgınlıkları fenotip indüksiyon gerekçe adım Referans (metodolojik)
Embriyonik RNA interferans Çift sarmallı RNA knock-down için bir veya daha fazla spesifik genler sinsityal blastoderm aşamasında embriyoların içine enjekte edilir Aşama 4.8 sonrasında embriyolar enjekte edilir. iki 33,81
Ebeveyn RNA interferans Çift sarmallı RNA FEMA yanal olarak enjekte edilirsoyunda gen knock-down neden karın segmentleri 3 ve 4 arasındaki le pupalar Adım 1.5 den pupa alır. iki 36,37
resesif embriyonik öldürücü mutant sıraların % 25 homozigot mutant soyu hakkında bir resesif embriyonik öldürücü mutasyon heterozigot verim taşıyan yumurtlama kültürler Aşama 1.5 sırasında görüntüleme hattı mutant çizgiyi. üç 39,51,89
harici faktörlerin uygulama Bazı biyolojik olarak aktif ya da toksik faktörler dışsal görüntüleme tamponu ekleyerek embriyolar uygulanır Adım 2.2 sırasında görüntüleme tamponuna faktörünü ekleyin. iki 83-85

Tablo 4 - çılgınlıkları fenotip LSFM Canlı Görüntüleme

Ek Tablo 1 - Uzun süreli Canlı görüntüleme Veri Setleri DS0001-0003 için Meta Veri ve Parametre. Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Film 1 - AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgenik Hattı Bir Tribolium Embriyoya Canlı Görüntüleme.
Bu çizgi, bir arttırıcı tuzak ifade şekli sergiler. floresans sinyali esas serozası, yolk kesesi ve nöronal hücre alt grubunda bulunur. Embriyo zaman noktaları arasında 00:30 saatlik bir aralık ile 66:00 h 00:00 dört yönelimleri birlikte gösterilmektedir. Film germband retraksiyon başında başlar ve dorsal kapatma tamamlandıktan sonra biter. Çerçeve hızı saniyede beş karedir. ZA,yoğunluk ayar z maksimum projeksiyon. Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Film 2 - Glia'dan mavisi Transgenik Hattı Bir Tribolium Embriyoya Canlı Görüntüleme.
Embriyo zaman noktaları arasında 00:30 saatlik bir aralık ile 66:00 h 00:00 dört yönelimleri birlikte gösterilmektedir. Film germband retraksiyon başında başlar ve dorsal kapatma tamamlandıktan sonra biter. Çerçeve hızı saniyede beş karedir. ZA, yoğunluk ayar z maksimum projeksiyon. Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kalite kontrol

Canlı görüntüleme deneylerinde, hazırlanması ve kayıt prosedürü mekanik ve kimyasal işleme (numune tutucu üzerine monte toplanması, dechorionation,), ne de gözlem sırasında entegre enerji yükü de, yani örneğin yaşamını etkilemelidir, invazif olmayan olmalıdır. WT gelişimini karakterize çalışmalar için, embriyo başarıyla alınır, kayıt işleminden zarar ve sağlıklı erişkin hale hangi deneylerden tek kullanım verilerine önerilir. yetişkin doğurgan olmalıdır herhangi morfolojik sapmaları gösterilmemesi gerekir ve bunun soyu da bereketli olması gerekmektedir. özellikle uzun süreli canlı görüntüleme deneylerinde düşük sağkalım oranları için üç ana nedeni vardır:

İlk olarak, embriyo yüzey muhtemelen iyonu ve gaz alışverişini önler ve embriyo Mechan daraltır Aşama 7, sırasında agaroz ile yoğun kaplandıically. Etkilenen embriyolar, erken embriyogenez sırasında görüntülenmiş, özellikle tipik birkaç saat boyunca dikkat çekmeden geliştirmek aniden tutuklayıp hızla floresan sinyali kaybederler. yüzeyin en fazla yarısı çok ince bir agaroz tabakası ile kaplı olan en biraz tecrübe ile, yarım küre tekniği kullanılarak agaroz gömülü yüzey fraksiyonu ise örümcek ağı tutucu tekniği ile üçte bir altında tutulabilir. İkinci olarak, embriyo uygulanan entegre enerji yük tolerans aşmaktadır. Adım 8.2'de verilen değerler kural olarak hizmet, ancak aşağıdaki kriterler dikkate alınmalıdır: Erken embriyonik gelişimi sırasında, (i) embriyolar, geç embriyonik gelişimi sırasında embriyoların yanı sıra, (ii) her ne kadar entegre enerji lazer ışınlama tahammül yok düşük maruz kalma süresi veya daha uzun zaman aralıklarının her iki yük özdeş olabilir, daha yüksek lazer gücü yüksek maruz kalma süresi ya da daha kısa zaman aralıklarının alt lazer gücü daha stresli görünmektedirfluorofor ifade gücü lazerle ışınlama toleransı ile ters orantılı olduğu görülmesine rağmen, (iii) daha yüksek bir dalga boyu tipik olarak daha iyi tolere ve (iv) transgenik kuşaklar için, tolerans sınır çizgisi özgü olduğu görülmektedir vardır. Buna ek olarak, füzyon proteininin bir tasarım ve / veya hücre içi lokalizasyon da bir rol oynamaktadır. Üçüncüsü, embriyo montaj işlemi sırasında zarar görmüş. Burada en önemli faktör, sodyum hipoklorit çözeltisi içinde kuluçka süresi tamamen koryon kaldırmak için gerekli olduğu kadar kısa olmasıdır. Daha uzun inkübasyon süreleri embriyo zarar verebilir. Bakım ayrıca delinme veya fırçayla embriyolar sıkıp ortam sıcaklığında agaroz montaj tutmak için dikkat edilmelidir. Hasarlı embriyolar fiili görüntüleme işlemi öncesinde Adım 8.4 esnasında tespit edilebilir hasarlı embriyolar yaşayabilir olanlarla değiştirilebilir, böylece başlar.

Embry bu yönergeleri izleyerek, genellikle yaklaşık 85-90% tarafındanos canlı görüntüleme prosedürü ve kapağı hayatta. yumurtadan embriyoların yaklaşık% 90'ı sağlıklı ve üretken yetişkinler halinde gelişir. sağkalım oranı sıcaklığı görüntüleme ve (agaroz sütunu yarısından fazlasını bir günün görüntüleme dönemler için kullanıldığında) montajı teknikleri bağımsız gibi görünmektedir, ama biraz lazer ışımasının yüksek seviyeleri ile azalır. özellikle floresan canlı görüntüleme ya da kapsamlı bir deney dizisi için ön-madde olarak aşamasını teşkil eden bir çerçeve için ölçüye göre transgenik hatların Başlangıçtaki karakterizasyon sırasında ilave bir kontrol olarak, görüntülü paralel olarak görüntülenmemiş WT ve transgenik embriyo çalıştırmak için tavsiye edilir gelişim zamanı ve şekil 65 görüntülü embriyo ile aynı sıcaklıkta inkübe edildi ve karşılaştırma embriyolar.

Ayrıca, canlı görüntüleme yoluyla çılgınlıkları fenotipleri (Tablo 4) karakterize çalışmaları da etkilenmeyen bir c çalışmalıdırparalel ontrol embriyosu. Mümkün olduğunca benzer her iki embriyo tedavi tutmak için önerilir, ancak bu her deneysel strateji için ayrı ayrı dikkate alınacak vardır:

Knock-RNA etkileşimi vasıtasıyla.

Embriyonik RNA girişimi 33, 81 için, aynı yumurtlama kültüründen elde embriyolar ya işlevsel ya da kontrol çift sarmallı RNA ile enjekte edilmelidir. farklı enjekte Embriyolar daha sonra agaroz kolonu veya örümcek ağı tutucu tekniği kullanarak aynı LSFM eş zamanlı olarak görüntülü olmalıdır. Ebeveyn RNA girişimi 36, 37 için, görüntüleme kültür iki alt kültür haline bölünmüş olmalıdır. Diğer alt-kültür kontrolü çift sarmallı RNA ile enjekte edilmelidir ise bir alt-kültür Kadın pupa fonksiyonel çift sarmallı RNA ile enjekte edilmelidir. Embriyo collection paralel olarak gerçekleştirilir ve bu deney ve kontrol embriyo agaroz kolonu veya örümcek ağı tutucu tekniği kullanarak aynı mikroskop eş zamanlı olarak görüntülenebilir iki olmalıdır.

Resesif embriyonik öldürücü mutant sıraların.

Resesif embriyonik ölümcül mutantları 39, 89, 91, 92, 93 ile birlikte çalışırken, normal olarak fenotipik farkedilmez heterozigot mutantlar, verim teorik% 25 homozigoz mutant soy bir yumurtlama kültür (pratik kullanım için bazen daha az bağlı ama 89 sorunları) ve fenotipik göze çarpmayan döl (% 50 heterozigot mutantlar ve% 25 Wts)% 75. Tür bir yumurtlama kültüründen çeşitli embriyo monte etmek örümcek ağı tutucu tekniği kullanmak tavsiye edilir. homozigot mutantlar i olabilirNormal gelişim gösteren embriyolar kontroller olarak hizmet ederken, fenotipinin ortaya tarafından görüntüleme kurs boyunca dentified. görüntüleme ve kalite kontrol tamamlandığında görüntüsü örneklerin genotip belirlenebilir.

Dışsal faktörlerin uygulanması.

Görüntüleme tamponu 83, 85, örneğin aynı LSFM bir kontrol embriyo ile biyoaktif veya toksik maddeler, geliştirme incelenmiştir ile, paralel görüntüleme içinde harici faktörlerin etkisi tipik olarak mümkün değilse. Bu nedenle, görüntüleme sırayla yapılmalıdır. En uygun olarak, daha sonraki deneyler arasındaki süre en aza indirilir ve embriyolar aynı görüntüleme kültüründen elde. Seçenek olarak ise, iki aynı inşa edilen LSFMs kullanılabilir. Bu durumda, aynı yumurtlama döneminden embriyolar kullanılması gerektiğini, ancak inci büyük önem taşıyorgörüntüleme özellikleri karşılaştırılabilir için her iki mikroskop e kalibrasyon dikkatli bir şekilde yürütülür. kuruntu tutucu tekniği kullanarak, her bir durum için çok sayıda embriyolar aynı anda görüntülenebilir. agaroz sütunu tekniği ile, dış faktörler embriyolar ulaşmasını engellendiği görülmüştür.

LSFM canlı görüntüleme yaklaşımının Güncel sınırlamalar

LSFM çoklu geniş ölçekli boyutlarda invasiv olmayan bir embriyonik morfojenezini analiz etmek için güçlü bir araçtır. Standart operasyon prosedürleri, bu protokolde teklif edildiği üzere, gelişimsel biyoloji standart bir araç olarak hafif levha teknolojisini kurmak sürecini destekleyecektir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, çeşitli deneysel ve kurumsal düzeyde bir dizi faktöre ile sınırlıdır:

Başlangıçta, LSFM birer birer örnek analiz için geliştirilmiştir. Tüm aynı akım mikroskop b, iki veya daha fazla embriyolar aynı anda bu görüntüyü yaklaşımlar y 'istifleme' agaroz kolonuna y-ekseni ya da örümcek ağı tutucu adresleri sadece belli bir dereceye kadar, bu sorun boyunca numune. Çok-çukurlu tabak-ve kapak tabanlı kurulumları 94, 95, 96 mevcuttur. Ancak, düşük görüntü kalitesi muzdarip ve bu tür çoklu doğrultular boyunca görüntüleme gibi LSFM gelen temel faydaları, bazı feda. Şu anda, en iyi seçenek, lazer gibi yüksek maliyetli bileşenleri, 60 paylaşıldığı zaman makul olarak mümkün hale gelir paralel olarak birden mikroskoplar ile çalışmaktır.

EFA-nGFP 57, 65, 84 ile, FNL 86, Zeki 58, 86, AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 1., AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 4. ve Glia mavisi= "xref"> 58, uzun vadeli canlı görüntüleme için uygun sadece altı ısmarlama transgenik hatları şu anda mevcuttur. Buna ek olarak, HC079 (amniyon), G12424 (serosa) ve G04609 (kalp) arttırıcı tuzak hatları 51 LSFM 23 ile karakterize edilmiştir. Alternatif olarak, floresan embriyolar ayrıca, mRNA'nın 81 tarafından oluşturulan ya da damardan 79 boya olabilir, bu yaklaşım, nispeten basit olan, ama aynı zamanda sınırlamalar 86 muzdarip. Birkaç tane daha standartlar yine de belirli olmayan yerde promotörler altında floroforlar sadece belirli organ veya dokuların gözlemlemek ifade cytoskeletal- organelle- ve membran etiketli çizgiler veya çizgiler gibi gereklidir. İdeal olarak, bu hat aynı zamanda farklı floresan proteinleri mevcuttur.

Başka bir sorun LSFM tarafından üretilen veriler birimdir. Nedeniyle üç boyutta ve en az üç fu bilgilerin edinilmesi içinözgürlük (zaman, yön, floresan kanalı) rther derece, canlı görüntüleme veri setleri büyüklüğü kolayca birkaç terabayt birçok Gigabyte ulaşabilir. Hatta üç boyutlu Kırpma ve TIFF konteynerlerin Posta tabanlı sıkıştırmadan sonra, bu çalışma ile ilişkili üç örnek veri kümeleri 31.6, 12.6 ve 45.1 GB, toplamda yani 89,3 Gigabyte boyutları vardır. LSFM ile çalışırken, veri depolama ve işleme 88, 97 için ilgili altyapıya sahip gereklidir.

yüksek görüntü kalitesi embriyo yüzey elde edilir, ancak derinliği arttıkça, floresan sinyali daha bulanık hale gelir. Örneğin, germband posterior ucu gastrülasyon sırasında yolk kesesi kat kaplanır ve uygun çözülemez (Şekil 4C birinci, beşinci kolonuna). Birden doğrultular boyunca Görüntüleme azından kısmen bu sorunu çözerially - tüm embriyo etrafında yüzeyden yüksek kalitede bilgi mevcuttur, ancak iç bölgeler bulanık kalır. Şu anda, herhangi bir tatmin edici çözüm mevcuttur, ancak uzun vadede, kızıl ötesi floresan proteinleri 98, uyarlamalı optik 100 ile genetik yaklaşımlar 99 veya mikroskop kurulumları düşünülebilir.

Diğer türler için Adaptasyon

Artık, LSFM meyve yani 61, 62, 101 melanogaster Drosophila sinek 102 ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum 57 abdita Megaselia sinek scuttle, üç böcek türlerinin embriyonik gelişimi belgelemek için kullanılmıştır. Deneysel çerçeve, burada shoul tarif edilen standart çalışma prosedürleri ve montaj teknikleriDiğer böcek türleri için de uyarlanabilir olurdu. Farklı sıralarda ait pek çok böcek gen transformation protokolleri, bal arısı 104 kadar ekonomik ve / veya tıbbi öneme sahip türlerin, çeşitli lepidopteranlara 105, 106 veya daha fazla sivrisinek türleridir, 107, 108, 109 de dahil olmak üzere, 103 mevcuttur. Floresan canlı görüntüleme için uygun olan, ilgili transgenik çizgiler, böceklerin embriyonik morfogenez evrimsel soy ve / veya çevresel uygunluğa göz önünde bulundurarak, karakterize edilebilir. Yaklaşık bir milyon böcek türü tanımlanmıştır ve bir başka yirmi milyon böcekler türler büyük olasılıkla evrim 2'nin 400 milyondan fazla yılı kapsayan, 110 mevcuttur. Sadece karşılaştırmalı yaklaşım bu bilgileri üretecektir dönüş yazarlara içindesadece tek bir türün gelişim ilkelerini inceleyerek elde edilemez des anlayışlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarların Katkıları

FS ve EHKS araştırma gebe. FS transgenik AGOC çizgileri oluşturulur. Işık levha bazlı fluoresans görüntü FS ve SK gerçekleştirildi. FS ve EHKS SK girişi ile el yazması yazdı.

Acknowledgments

Biz teknik destek için Sven Plath teşekkür ederim. Glia-mavi transgenik çizgi Gregor Bucher (Göttingen, Almanya) bir tür hediye oldu. Araştırma Goethe Buchmann Moleküler Yaşam Bilimleri Enstitüsü (BMLS, yönetmen Enrico Schleiff) de EHKS kısmen verilen makromoleküler Tesisler (CEF-MC, EXC 115, hoparlör Volker Dötsch) için Frankfurt am Mükemmellik Frankfurt Küme tarafından finanse edildi Universität Frankfurt Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından am Main.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 122 Eklembacaklılar böcek Coleoptera, Morfogenez embriyogenez invazif olmayan uzun süreli floresan canlı görüntüleme hafif levha bazlı floresan mikroskopi üç boyutlu ışık mikroskobisi LSFM DSLM SPIM
Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter