Summary
Ce protocole décrit des analyses histologiques des foies provenant de larves de poissons zèbres qui ont été traitées avec 2% d'éthanol pendant 24 h. Un tel traitement aigu de l'éthanol entraîne une stéatose hépatique et un gonflement du système vasculaire hépatique.
Abstract
La maladie du foie alcoolique (ALD) désigne des lésions hépatiques causées par l'abus d'alcool aigu ou chronique. Il est parmi les principales causes de la morbidité et de la mortalité liés à l'alcool et touche plus de 2 millions de personnes aux États-Unis. Une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les lésions hépatiques induites par l'alcool est cruciale pour développer un traitement efficace pour l'ALD. Les larves de zébrés présentent une stéatose hépatique et une fibrogénèse après seulement 24 heures d'exposition à 2% d'éthanol, ce qui les rend utiles pour l'étude d'une lésion hépatique alcoolique aiguë. Ce travail décrit la procédure pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et montre qu'il provoque une stéatose et un gonflement des vaisseaux sanguins hépatiques. Un protocole détaillé pour la coloration par hématoxyline et éosine (H & E) optimisé pour l'analyse histologique du foie larvaire du poisson zèbre est également décrit. La coloration H & E présente plusieurs avantages uniques par rapport à l'immunofluorescence, car elle marque tous les vivantsDes cellules er et des composants extracellulaires simultanément et peuvent facilement détecter une lésion hépatique, comme la stéatose et la fibrose. Compte tenu de l'utilisation croissante du poisson zèbre dans la modélisation de la toxine et des lésions hépatiques induites par un virus, ainsi que des maladies hépatiques héréditaires, ce protocole sert de référence aux analyses histologiques effectuées dans toutes ces études.
Introduction
La maladie du foie alcoolique (ALD), causée par la surconsommation d'alcool, est une cause majeure de morbidité et de mortalité liés à l'alcool. Aux États-Unis, près de la moitié des décès liés à une maladie du foie impliquent l'alcool 1 , et ALD est responsable de près de 1 fois sur 3 transplantations de foie 2 . ALD a un large spectre. La statose, qui se caractérise par une accumulation excessive de lipides dans les hépatocytes, se produit au stade précoce de la consommation excessive et est réversible lors de la cessation de la consommation d'alcool. Sous l'influence des facteurs génétiques et environnementaux et de la consommation continue d'alcool, la stéatose hépatique peut progresser vers l'hépatite alcoolique et, éventuellement, la cirrhose 3 . Les études utilisant les modèles ALD de rongeurs ont fourni des informations importantes sur la maladie, mais elles ont des limites (examinées dans la référence 3 ). L'alimentation orale d'un régime alcoolique provoque seulement une stéatose chez les rongeurs 4 , </ Sup> 5 . Le développement de l'inflammation et de la fibrose nécessite soit une deuxième insulte 6 , 7 soit une infusion intragastrique chronique, qui est envahissante et techniquement difficile 8 , 9 . Le pèlerin zélotechnique développe également une lésion hépatique en réponse au traitement à l'alcool chronique et aigu 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . En particulier, le poisson zèbre larvaire représente un organisme modèle complémentaire intéressant dans lequel étudier une lésion alcoolique aiguë du foie 10 , 11 , 13 , 15 . Le foie de poisson zèbre est fonctionnel et produit des enzymes clés pour le métabolisme de l'éthanol de 4 joursS post-fertilisation (dpf) 13 , 16 , 17. L' éthanol peut être ajouté directement à l'eau et l'exposition à 2% d'éthanol pendant 24 h est suffisante pour induire la stéatose hépatique et les réponses fibrogéniques dans les larves de poissons zèbres 13 , 15 .
Il a été rapporté que le traitement avec 2% d'éthanol pendant 24 h a entraîné une concentration en éthanol tissulaire de 80 mM dans les larves de poissons zèbres 13 . D'autres ont montré que les larves tolèrent cette concentration et que les phénotypes du foie observés chez les animaux traités sont spécifiques à l'exposition à l'éthanol 11 , 13 , 15 , 18 . Cependant, car 80 mM sont presque mortels chez les humains 19 , il est important d'évaluer l'histologie du foie du poisson zèbre traité par l'éthanol et de détecterRmine la pertinence physiologique pour les humains.
Le développement externe rapide et la translucide des larves de poissons zèbres permettent de caractériser l'action de l'alcool dans le foie en temps réel et dans des échantillons fixes. La disponibilité de lignes transgéniques fluorescentes spécifiques à un type de cellule et les progrès récents dans la microscopie confocale facilitent l'étude de la façon dont différents types de cellules hépatiques modifient leur morphologie et leur comportement en réponse au traitement aigu de l'éthanol 11 , 15 . Cependant, l'imagerie confocale du poisson zèbre transgénique fluorescent ne peut pas se substituer complètement à la coloration par l'hématoxyline et l'éosine (H & E) lors de l'étude de l'histologie du foie. Le marquage de tous les types de cellules hépatiques en même temps en utilisant du poisson zèbre transgénique nécessite la génération de lignes transgéniques individuelles, chacune étiquetant un type de cellule hépatique avec un fluorophore unique. L'introduction de différents milieux transgéniques dans le même poisson nécessite une élevageG générations multiples, qui prend beaucoup de temps et coûte cher. Une coloration immunofluorescence supplémentaire est nécessaire pour détecter les composants de la matrice extracellulaire. La coloration H & E, d'autre part, étiquette simultanément tous les types de cellules du foie et les composants de la matrice extracellulaire, fournissant ainsi une vue d'ensemble du foie 20 . De plus, il révèle facilement plusieurs caractéristiques histopathologiques des maladies du foie, telles que la mort des hépatocytes, la stéatose et la fibrose. Bien que H & E soit une tache de routine dans l'histologie du foie de mammifère, elle n'est pas couramment utilisée dans la recherche sur le foie du poisson zèbre et le protocole est moins bien établi.
Ce travail décrit un protocole pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et pour les analyses histologiques de suivi avec la coloration H & E. Le protocole de coloration H & E peut être utilisé dans toutes les études sur le développement et la fonction du foie. De plus, les sections de paraffine peuvent être utilisées pour l'immunohistochimie, ainsi que pour d'autres structures spécialesIns dans la pathologie du foie, y compris la tache de trichrome, la tache de réticuline, etc.
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Protocol
Le poisson zèbre adulte et larvaire AB WT a été maintenu dans des conditions standard 21 conformément au Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Institutes of Health publication 86-23, 1985); Leur utilisation a été approuvée par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux au Centre médical de l'hôpital pour enfants de Cincinnati (CCHMC).
1. Préparation des solutions
- Préparer l'eau des oeufs.
- Préparez la solution saline en dissolvant 40 g de sel marin commercial dans 1 L d'eau double-distillée (ddH 2 O). Remuer jusqu'à ce que tous les sels aient complètement disparu.
- Préparer 0,1% de solution de bleu de méthylène en ajoutant 0,1 g de poudre à 100 ml de ddH 2 O.
ATTENTION: Le bleu de méthylène est irritant s'il entre en contact avec les yeux ou la peau. Toujours porter un manteau de laboratoire et des gants lors de la manipulation de la poudre. - Mélanger 28,125 ml de sel ordinaireEt 7 ml de solution de bleu de méthylène dans un tube conique de 50 ml. Bien mélanger. Ajouter ce mélange à 15 L de ddH 2 O. Bien agiter et ranger à la RT.
- Préparer 100 ml de Tris-HCl 1 M en ajoutant 12,1 g de poudre de Tris à 100 ml de ddH 2 O. Ajuster le pH à 9,0 en utilisant de l'acide chlorhydrique (HCl).
ATTENTION: Le HCl peut provoquer de graves brûlures et une irritation des muqueuses si inhalé. Toujours porter un manteau de laboratoire et des gants et manipuler la bouteille de stock dans un capot chimique. - Préparer 0,4% de solution de tricaine (méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate).
- Dissoudre 2 g de poudre de tricaine dans 489,5 ml de ddH 2 O. Ajouter 10,5 ml de la solution de Tris-HCl, pH 9. Mélanger avec une barre d'agitation jusqu'à dissolution de la poudre. Ajuster à pH 7.0.
ATTENTION: La poudre de tricaine peut être un irritant respiratoire. Toujours porter un masque anti-poussière lors de la manipulation de la poudre. - Aliquotez 45 ml de la solution de tricaine dans des tubes coniques de 50 ml. Conserver la solutionN à 4 ° C pour une utilisation immédiate et à -20 ° C pour un stockage à long terme.
- Dissoudre 2 g de poudre de tricaine dans 489,5 ml de ddH 2 O. Ajouter 10,5 ml de la solution de Tris-HCl, pH 9. Mélanger avec une barre d'agitation jusqu'à dissolution de la poudre. Ajuster à pH 7.0.
- Préparez le fixateur de Dietrich en combinant 30 ml d'éthanol à 95%, 10 ml de formaldéhyde à 37%, 2 ml d'acide acétique glacial et 58 ml de ddH 2 O dans une bouteille de milieu de verre. Mélangez bien en remuant et rangez-en à la RT.
ATTENTION: Le formaldéhyde est un agent cancérogène suspecté, et toute solution avec du formaldéhyde doit être utilisée dans un capot chimique. L'acide acétique glacial peut provoquer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Toujours porter un manteau de laboratoire et des gants et manipuler la solution stock dans un capot chimique. Le formaldéhyde, l'acide acétique glacial et l'éthanol à 95% sont tous des liquides inflammables et doivent être stockés dans une armoire inflammable désignée.
NOTE: Le fixateur de Dietrich est stable à la RT pendant 1 an. - Préparez 1 L de solution salée tamponnée au phosphate 10 fois (PBS) en ajoutant 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 14,4 g de phosphate disodique (Na 2 HPO 4 ) et 2.4 g de phosphate monopotassique (KH 2 PO 4 ) à 800 ml de ddH 2 O. Ajuster à pH 7,4 en utilisant de l'hydroxyde de sodium (NaOH) et ajouter ddH 2 O à un volume final de 1 L. Conservez cette solution à la RT après autoclavage sur un cycle liquide qui purge pendant 1 min et incube à 121 ° C pendant 20 min.
- Faire 1 L de 1x PBS en diluant 100 ml de la solution de PBS 10x dans 900 ml de ddH 2 O. Mélanger bien en secouant et en ranger à TA après autoclavage.
- Préparez 3% d'agarose dans une bouteille de milieu de verre pour le montage d'embryons.
- Ajouter 3 g d'agarose à 100 ml de ddH 2 O et mélanger par tourbillonnement. Chauffer le mélange par micro-ondes pour dissoudre l'agarose, et regarder attentivement pendant le chauffage pour s'assurer qu'il y a une ébullition minimale.
ATTENTION: le flacon sera probablement chaud lorsqu'il sera retiré du micro-ondes, malgré un court chauffage. Utilisez un gant ou un gant de protection pour enlever la bouteille du micro-ondes. - Retirez la bouteille du micro-ondes.En faisant tourbillons doucement, cherchez des cristaux qui ne sont pas complètement dissous; S'il n'y a pas de cristaux, la solution est prête à l'emploi. Conserver l'agarose à 3% à la température ambiante et réchauffer à nouveau avant utilisation.
- Ajouter 3 g d'agarose à 100 ml de ddH 2 O et mélanger par tourbillonnement. Chauffer le mélange par micro-ondes pour dissoudre l'agarose, et regarder attentivement pendant le chauffage pour s'assurer qu'il y a une ébullition minimale.
- Filtrer la solution mère d'hématoxyline de Harris pour éliminer les solides qui ont précipité.
- Pliez un filtre à café en deux afin que le filtre crée un cône. Ouvrez le panneau latéral pour que le liquide passe à travers le filtre, ce qui permet de détecter tout débris.
- Placez le filtre à l'intérieur d'un entonnoir et de l'entonnoir dans une bouteille en verre. Verser graduellement l'hématoxyline à l'aide du filtre.
ATTENTION: L'hématoxyline est dangereuse en cas de contact avec les yeux, d'ingestion et d'inhalation. Toujours porter un manteau de laboratoire et des gants et manipuler la solution stock dans un capot chimique.
- Préparer 0,05% de HCl en ajoutant 125 uL de HCl 12 N à 250 ml de ddH 2 O.
- Préparer le mélange de solution d'eosine Y-phloxine B en combinant 25 ml de 1% eOsine Y (aq), 2,5 ml de 1% de phloxine B (aq), 195 ml d'éthanol à 95% et 1 ml d'acide acétique glacial dans une bouteille en verre. Mélangez bien en remuant et rangez à la RT
ATTENTION: L'éosine Y est dangereuse dans le cas du contact visuel, de l'ingestion et de l'inhalation. Toujours porter un manteau de laboratoire et des gants et manipuler la solution stock dans un capot chimique. - Préparez 2% d'éthanol en ajoutant 2 ml d'alcool éthylique pur à 98 ml d'eau d'oeuf.
ATTENTION: L'alcool éthylique est un irritant pour les yeux. Toujours porter un équipement de protection approprié lors de la manipulation de l'alcool éthylique. Il est également inflammable et doit être manipulé et stocké en conséquence.
REMARQUE: Préparez 2% d'éthanol frais chaque fois avant de procéder au traitement aigu de l'éthanol.
2. Effectuer un traitement aigu de l'éthanol dans les larves du poisson-zèbre
- Pour générer des embryons, organiser des croisements avec un mâle de type sauvage et un poisson femelle WT par échassier. Séparez-les en insérant un diviseur en plastique dans le réservoir accouplé.
REMARQUE: DéfinirCroise après l'alimentation finale de la journée afin que les poissons soient bien nourris.- À 8 h le lendemain matin, tirez le diviseur pour permettre à la paire de s'accoupler.
- Après 1 h, retournez les poissons adultes dans leur réservoir d'origine. Recueillir les embryons en versant l'eau contenant les embryons dans une crépine. Tournez la crépine dans une boîte de Petri de 100 mm et lavez les embryons dans le plat en utilisant un flacon de lavage contenant de l'eau d'oeuf. Placez le plat avec les embryons dans un incubateur à 28 ° C.
- Lorsque les embryons atteignent au moins le stade de 4 cellules (1 hpf), éliminer les embryons et les débris non fertilisés dans l'eau avec une pipette Pasteur et placer le plat avec les embryons fertilisés dans un incubateur à 28 ° C. Maintenir les embryons dans l'incubateur à 28 ° C jusqu'à 96 heures après la fertilisation.
- Anesthésier le poisson larvaire en ajoutant la solution de tricaine à l'eau des oeufs à un ratio de 1 à 10 (volume / volume).
- Sélectionnez jusqu'à quarante larves de 96 hpf qui ont une vessie de bain gonflée en utilisantUne pipette Pasteur et les diviser uniformément dans deux nouvelles boîtes de Petri.
- Sortez autant d'eau d'oeuf résiduelle que possible. À une densité d'une larve par ml, ajouter de l'eau à l'oeuf contenant 2% d'éthanol dans un plat. Ajouter la même quantité d'eau aux oeufs dans l'autre plat pour servir de témoin.
- Garder le contrôle et les larves traitées à l'éthanol dans la salle des poissons pendant 24 h.
REMARQUE: Le traitement de l'éthanol dans une salle de poissons ayant un cycle de lumière 14 h / 10 h donne lieu à des blessures hépatiques plus cohérentes et robustes que la conduite de l'expérience dans le noir dans un incubateur. - Recueillir les larves dans un tube de centrifugation de 1,5 mL avec pas plus de 20 larves par tube.
- Retirez le plus de liquide possible des larves et ajoutez au moins 1 ml (volume tissulaire 10x) du fixateur de Dietrich dans le capot chimique. Laisser le poisson se fixer sur un mouchoir à température ambiante pendant au moins 24 h.
NOTE: Les poissons sont stables dans le fixateur de Dietrich pendant plusieurs semaines.
- Indiquez le nombre nécessaire de cassettes en tissu et deux plaquettes de biopsie bleues par cassette. Placez un coussinet de biopsie au bas de chaque cassette. Étiquetez chaque cassette au crayon, identifiant clairement l'échantillon.
REMARQUE: N'utilisez pas le stylet ou le marqueur pour étiqueter les cassettes, car l'étiquetage sera perdu dans les étapes ultérieures. - Incorporer les larves dans 3% d'agarose pour assurer une orientation cohérente de tous les échantillons.
- Retirez le fixateur des tubes dans une hotte chimique et lavez les larves 3 fois pendant 5 min chacun avec 1 mL de 1x PBS. Placez les tubes sur un nutator à la température ambiante pendant les lavages.
- Au cours des lavages, chauffer l'agarose 3% préparé dans de l'eau en utilisant un micro-ondes pour faire fondre le solide. Chauffer pendant 30 s à la fois et regarder attentivement pour minimiser l'ébullition. Conservez l'agarose liquide sur une plaque chauffante réglée à 90 ° C sous agitation douce.
- En utilisant une pipette de transfert, transférez jusqu'à 8 lArvee un moule d'histologie plastique et élimine autant de PBS que possible. En utilisant une pipette de transfert avec la pointe coupée, remplir complètement le moule avec 3% d'agarose.
- En utilisant une seringue d'insuline, rassemblez les larves jusqu'au centre du moule et poussez-les vers le bas. Pour les sections sagittales, positionner les larves dans une ligne, avec les têtes vers le haut du moule. Pour s'assurer que les foies sont orientés de façon cohérente, tournez les larves de sorte que le côté gauche du corps soit vers le bas et plat contre le fond du moule.
NOTE: Parce que le foie est situé sur le côté gauche du corps, ce positionnement minimise le nombre de sections qui doivent être coupées avant d'atteindre le foie. Gardez les larves aussi proches que possible. - Mettre le moule sur le côté pendant 4 à 5 minutes pour permettre à l'agarose de se mettre complètement. Retirez le bloc d'agarose du moule et utilisez une lame de rasoir pour couper l'agarose autour des larves. Stand the block on end et coupe l'épaisseur dans la moitié sO que le bloc final a une épaisseur d'environ 2-3 mm.
- Transférer le petit bloc d'agarose sur la cassette de tissu préparée (étape 3.1) et placer le deuxième tampon de biopsie sur le dessus du bloc. Fermez la cassette et placez la cassette entièrement assemblée dans un récipient pouvant être scellé avec de l'éthanol 70% fraîchement préparé dans du ddH2O.
REMARQUE: si les cassettes ne vont pas être traitées immédiatement, placez-les dans de l'éthanol à 70% dans un récipient à 4 ° C pour éviter une perte de fixation. Les cassettes sont stables à 4 ° C jusqu'à 3 jours.
- Traitement des tissus
NOTE: Les échantillons peuvent être soumis à un laboratoire d'histologie ou de pathologie équipé d'un processeur de tissus pour le traitement des cassettes en paraffine. Demander un programme de traitement O / N standard plutôt qu'un programme court afin que la paraffine puisse pénétrer complètement l'agarose.- Traiter les cassettes en tissu en les transférant dans une série diluée d'éthanol, avec une quantité croissante d'alcool, pourDéshydrate le tissu, comme suit: 70% d'éthanol 2 fois, 45 minutes chacun; 80% d'éthanol, 45 min; 95% d'éthanol, 2 fois, 45 minutes chacun; 100% d'éthanol, 2 fois, 45 minutes chacun.
- Remplacez l'alcool par un solvant (100% xylène, 2 fois, 45 minutes chacun) afin que la paraffine infiltre le tissu.
ATTENTION: Le xylène est un irritant et est dangereux s'il est inhalé. Assurez-vous d'utiliser toujours un capot chimique. Le xylène est inflammable et doit être stocké en conséquence. - Incuber les cassettes dans de la paraffine O / N dans un incubateur à 60-65 ° C. Gardez les cassettes chaudes jusqu'à l'encastrement.
- Incorporer les blocs d'agarose traités dans la paraffine.
- Retirez une cassette du tiroir réchauffeur de la machine d'enrobage et retirez le couvercle de la cassette et la plaque supérieure de biopsie de la cassette. Remplissez un moule histologique avec de la paraffine liquide et gardez-le sur la plaque chauffante sur la machine d'embrayage.
- En utilisant des pinces chaudes, retirez le bloc d'agarose de la cassetteE et transférez-le au moule histologique avec de la paraffine. Assurez-vous que le côté du bloc d'agarose avec le poisson le plus proche de la surface est vers le bas. Jette le coussin de biopsie au fond et transférez l'ensemble du moule histologique sur la plaque de refroidissement sur la machine d'embrayage.
- En utilisant une pince, positionner rapidement le bloc d'agarose au centre du moule; Placez le bloc au bas du moule. Une fois que le bloc est correctement placé, placez le fond de la cassette sur le moule de l'histologie et remplissez-le à mi-chemin avec de la paraffine liquide. Placez le moule directement sur la plaque de 4 ° C et ne perturbez pas les blocs pendant au moins 10-15 minutes pour permettre à la paraffine de se solidifier. Pendant la mise en place du premier bloc, répétez ce processus pour les blocs restants.
- Une fois que la paraffine est réglée pour tous les blocs, retirez le moule histologique du bloc de paraffine en appuyant doucement sur le moule pour le desserrer. Ces blocs de paraffine peuvent être conservés à température ambiante indéfiniment.
4. Section des blocs de paraffine - Le jour avant la section, face-in le bloc de paraffine en utilisant un microtome pour enlever l'excès de paraffine couvrant le tissu. Section 5 μm à la fois jusqu'à ce que le tissu soit exposé à la surface du bloc de paraffine. Arrêtez et jetez toutes les sections qui sont coupées. Faire tremper les blocs face vers le bas dans 1x PBS à 4 ° CO / N.
REMARQUE: Les blocs doivent tre trempés pendant au moins 8 h. Commencez le trempage en fin de journée. Si les blocs sont laissés dans 1x PBS pendant trop longtemps, le tissu peut gonfler et devenir déformé. - Retirez un bloc à la fois du 1x PBS et coupez des sections de 5 μm à l'aide d'un microtome. Séparez le ruban des sections de la lame en tirant doucement sur la dernière section de la lame en utilisant une pince ou une brosse. Prenez le ruban par la dernière section à l'aide de la pince et transférez-la à un bain-marie à 42 ° C. Laisser les rubans flotter sur la surface de l'eau pendant au moins 5 min.
REMARQUE: WheN transférant des sections, ne laissez pas les pinces toucher l'eau tout en étant en contact avec la paraffine. Sinon, la paraffine fondra sur la pince et rendra la séparation très difficile. Si nécessaire, décomposez les sections en petits groupes à l'aide de pinces propres afin qu'elles puissent facilement glisser sur les glissières. Touchez délicatement la couture entre les sections pour créer une séparation sans dommage. - Placez une glissière chargée dans l'eau à un angle de 45 degrés et placez-la soigneusement sous le groupe de sections à collecter. Soulevez soigneusement la glissière de l'eau et autorisez les sections à attacher à la glissière.
- Nettoyer l'excès d'eau des sections en utilisant des tissus sans peluches. Placez la glissière dans un porte coulissant ou une boîte. Continuez à sectionner le bloc jusqu'à ce que le tissu souhaité ait été collecté. Répétez le processus de séparation pour tous les blocs.
- Faire cuire les lames dans un incubateur ou un four à 55 ° C pendant 3-16 h pour faire fondre la paraffine. Retirer les glissières du four et les laisser tO cool avant de commencer la coloration.
REMARQUE: Les sections de paraffine peuvent être conservées en RT indéfiniment, avant et après la cuisson. - Déparaffiner les diapositives en les immergeant dans 100% de xylene pendant 15 minutes; Changez-le en 100% de xylène frais pendant 15 minutes supplémentaires.
- Réhydratez les diapositives en les immergeant à travers la série suivante d'éthanol gradué jusqu'à ce que le liquide se nettoie proprement. Pour chaque solution, plongez 8 à 10 fois, 2 s par immersion: éthanol à 100%, éthanol à 100%, éthanol à 95%, éthanol à 95%, éthanol à 70%, éthanol à 50%, éthanol à 30% et eau désionisée.
REMARQUE: Le protocole peut être arrêté ici, et les diapositives peuvent être laissées à la RT dans l'eau pendant plusieurs heures. Si nécessaire, les diapositives peuvent être stockées à 4 ° C dans l'eau O / N. - Placez les diapositives dans une hématoxyline à Harris 100% filtrée pendant 4 min. Immédiatement, les transférer dans le récipient avec de l'eau désionisée. Faire couler de l'eau désionisée dans tIl recule le coin du conteneur le plus éloigné des sections. Videz le récipient périodiquement jusqu'à ce que l'eau ne soit plus violette.
REMARQUE: Ne laissez pas l'eau couler directement sur les glissières, car les sections peuvent sortir des glissières. - Vérifier rapidement l'intensité de l'hématoxyline sur un microscope à dissection à l'aide de feux de col de cygne; Ne laissez pas les glissières sécher. Si la tache a atteint l'intensité souhaitée, passez à l'étape suivante. Si la couleur n'est pas suffisamment foncée, placez les diapositives dans 100% d'hématoxyline pendant 1 min et répétez les lavages à l'eau avant de vérifier à nouveau.
NOTE: L'hématoxyline doit être assez sombre pour ne pas perdre la couleur pendant la coloration de l'éosine. Cependant, si la coloration à l'hématoxyline est observée dans le cytoplasme, les sections sont surchargées. - Trempez les diapositives deux fois dans du HCl à 0,05% et transférez-les immédiatement dans le récipient avec de l'eau propre et désionisée. Videz l'eau et remplissez le récipient à l'eau deux fois.
- Transférer les diapositives à 95% etHanol pendant 30 s puis les transférer dans un nouveau récipient avec 95% d'éthanol pendant 30 s.
- Placez les diapositives dans la solution d'eosine Y-phloxine B pendant 2 min. Transférez les diapositives vers le contenant d'éthanol précédent de 95% et vérifiez rapidement l'intensité de la couleur sous le microscope à dissection. Si la coloration est suffisante, passez à l'étape suivante. Sinon, retournez à la solution eosine pendant 30 s, vérifiez à nouveau, et répétez le cas échéant.
REMARQUE: Une coloration suffisante en éosine est rose vif et apparaît en contraste avec la tache d'hématoxyline. Assurez-vous d'essuyer toute solution à l'arrière des diapositives lors de la vérification sous microscope afin d'éviter toute fausse couleur. Étant donné que l'éosine est constituée d'éthanol à 95%, des périodes de temps prolongées dans l'éthanol à 95%, tout en vérifiant l'intensité de la couleur, peuvent perdurer une partie de la couleur. - Transférer les diapositives à 100% d'isopropanol pendant 15 s. Remplacez-le par de l'isopropanol 100% frais et placez les diapositives dans l'isopropanol pendant 15 secondes supplémentaires. Répétez cette pPour un total de 6 lavages isopropanol.
ATTENTION: L'isopropanol est un irritant respiratoire et respiratoire. Assurez-vous toujours de porter un équipement de protection approprié et évitez les éclaboussures. Il est également très inflammable et doit être stocké et manipulé en conséquence.
REMARQUE: Pour économiser sur les réactifs, ne jeter que le premier lavage isopropanol (le plus rose). Gardez les cinq autres solutions de lavage en bouteilles numérotées de 1 à 5, pour être réutilisées pour la prochaine coloration. Lors de la réutilisation des lavages, commencez avec la bouteille numérotée "1" et laissez-la après utilisation. Une fois que le "2" a été utilisé, versez-le dans la bouteille "1", et ainsi de suite. Le lavage final doit toujours être l'isopropanol frais. - Placez les diapositives dans 100% de xylènes pendant 3 min. Retirez une glissière à la fois et placez une lamelle.
- Ajouter un support de support suffisant pour couvrir les sections et les immerger dans du xylene 100%.
REMARQUE: cette étape va lisser la surface du support de montage et éliminer les bulles. - Appliquer une lamelleAu bas de la diapositive.
REMARQUE: Le support de montage doit être en position de positionnement. Si le couvercle n'est pas droit ou complètement assis, tapez doucement sur place. - Nettoyer tout support de support excessif sur une serviette en papier jusqu'à ce que seule une ligne mince soit visible. Trempez un essuyage de tissu dans le xylène et essuyez l'arrière de la glissière pour enlever tout milieu qui a goutté. Placez la glissière sur une surface robuste mais mobile, comme un morceau de carton. Couvrez toutes les autres diapositives de la même manière. Permettre au xylene de s'évaporer dans le capot pendant 10 min.
REMARQUE: Tout matériau contaminé par du xylène doit être retiré et jeté dans un récipient scellé dans le capot pour éviter toute fuite de vapeurs.
- Ajouter un support de support suffisant pour couvrir les sections et les immerger dans du xylene 100%.
- Laisser durcir le support de montage à RT O / N.
- Sections d'images sur un microscope inversé composé 18 .
REMARQUE: les diapositives peuvent être conservées à la salleMperature indéfiniment.
5. Mélange d'hématoxyline et d'éosine de la paraffine
6. Imagerie et stockage des diapositives tachées
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Representative Results
10% de formol tamponné et 4% de paraformaldéhyde (PFA) sont deux des fixateurs les plus courants utilisés pour les pratiques histologiques. Cependant, ils ne donnent pas des résultats de fixation optimale pour le tissu hépatique du poisson zèbre ( figure 1 et tableau 1 ). La fixation avec 10% de formol ou 4% de PFA entraîne souvent des rétrécissements, créant de grandes lacunes entre le foie et les tissus environnants ( figure 1A , B , la figure 1B fournit un exemple de retrait de tissu). Des portions du tissu hépatique peuvent également tomber de la section. Le cytoplasme des hépatocytes est souvent perdu ( figure 1A , 1B ). Les deux fixateurs peuvent provoquer une distorsion des hépatocytes, puisqu'ils rétrécient ou gonflent et ne maintiennent plus la morphologie colombienne qui caractérise les cellules épithéliales. Un autre problème avec la fixation PFA estQu'il existe des espaces entre les hépatocytes qui ne sont pas réels, ce qui provoque une fracture du tissu ( figure 1B ). En outre, lorsque l'un de ces deux fixateurs est utilisé, les hépatocytes sont bien colorés avec l'hématoxyline, mais moins avec l'éosine ( figure 1A ). Le fixateur acide de Dietrich résout les problèmes avec les fixateurs de formol et de PFA ( figure 1C ).
Dans l'ALD humaine, la stéatose, qui est composée de graisse de gouttelettes petites et grandes, est la plus proéminente près de la veine centrale et s'étend vers l'extérieur vers la triade du portail avec une gravité croissante 22 . Dans le poisson zèbre, le traitement avec 2% d'éthanol de 96-120 hpf induit également une stéatose hépatique, ce qui est impliqué par le dépôt excessif de gouttelettes rondes dans les hépatocytes ( figure 2B , flèches). Cependant, les gouttelettes ne présentent pasUn modèle de distribution similaire à celui observé dans l'ALD humaine, car il n'existe aucune distinction claire de pores et de veines centrales dans le foie de poisson zèbre 23 . Les vaisseaux sanguins hépatiques dans le foie larvaire traité à l'éthanol sont gonflés par rapport à ceux du foie témoin ( Figure 2B , astérisques).
Figure 1 : Comparaisons de la coloration H & E dans les foies des larves du poisson zébré qui ont été corrigées avec des fixateurs différents à 120 hpf. ( A ) 10% Formaline à TA O / N; ( B ) 4% de PFA à 4 ° CO / N; ( C ) Fixateur de Dietrich à la RT pendant 24 h. Avec 10% de formol, les hépatocytes perdent souvent leur cytoplasme (A). Les tissus ne sont pas correctement colorés avec de l'éosine et apparaissent pourpre. Après fixaAvec 4% de PFA, des lacunes sont observées entre les hépatocytes (B). 4% de PFA provoque une diminution du tissu hépatique, de sorte qu'il semble y avoir un grand écart entre le foie et les tissus environnants. La ligne pointillée en B marque la bordure des tissus environnants. Le fixateur de Dietrich fournit le résultat optimal parmi les trois (C). Barre d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Traitement de l'éthanol aiguë provoque une stéatose hépatique et un gonflement du vaisseau sanguin dans les foies de larves du poisson zèbre. ( A ) coloration H & E du foie dans une larve de contrôle, non traitée, WT. ( B ) La coloration H & E du foie dans une larve de type wil qui a été traitée avec 2% d'éthaNol de 96 à 120 hpf. Les deux animaux ont été fixés avec le fixateur de Dietrich à 120 hpf. Les flèches dans (B) indiquent les hépatocytes avec un dépôt excessif de gouttelettes rondes. Les astérisques marquent les vaisseaux sanguins hépatiques gonflés. Barre d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| 10% de formol | 4% PFA | Fixateur de Dietrich | |
| Condition de fixation | Au moins 24 h à la RT | 3 h à TA ou O / N à 4 ° C | Au moins 24 h à la RT |
| Fixation du poste de stockage des échantillons | Indépendamment à la RT | Jusqu'à 2 semaines à 4 ° C | Jusqu'à 2 mois à la RT |
| CompatibUne extraction de l'ADN génomique | Oui | Oui | Non |
| Shrinkages | Oui | Oui | Le minimum |
| Distorsion des cellules | Oui | Oui | Le minimum |
| Perte de détails cellulaires | Oui | Modeste | Le minimum |
| Tache équilibrée H & E | Faible coloration à l'éosine | Faible coloration à l'éosine | Oui |
| Compatibilité avec l'immunohistochimie | Oui | Oui | Oui |
Tableau 1: Comparaisons de 10% de formol, de 4% de PFA et de Fixations de Dietrich pour l'histologie du foie de poisson zèbre.
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Discussion
Le protocole actuel décrit une procédure détaillée pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et les analyses histopathologiques suivantes avec la coloration H & E. Le traitement aigu de l'éthanol doit être effectué au plus tôt avant 96 heures après la fertilisation, car c'est le stade auquel le foie du poisson zébré commence à exprimer les enzymes métabolisant l'alcool 13 . 2% d'éthanol est la dose maximale que les larves peuvent tolérer 13 , 14 . Les larves traitées à l'éthanol commencent à présenter une stéatose hépatique de 8 heures de traitement et les pourcentages de stéatose développant les larves continuent à augmenter jusqu'à 24 h de traitement continu 14 . Les larves de zèbres absorbent les nutriments exclusivement du jaune d'oeuf jusqu'à 120 hpf. Par conséquent, le traitement de l'éthanol au-delà de 120 hpf n'est pas recommandé, car le jeûne peut également contribuer à la stéatose 14 . Par rapport aux protocoles publiés par un autre laboratoireOratoires 13 , 24 , la modification principale faite dans le protocole actuel est que le traitement à l'éthanol est effectué dans une installation de poissons qui a un cycle de lumière de 14 h / 10 h. Il en résulte des réponses steatontiques plus cohérentes et robustes que celles observées lorsque le traitement est effectué dans l'obscurité dans un incubateur. Cela peut être lié au fait que les gènes métaboliques des lipides dans le foie du poisson zèbre présentent une expression rythmique quotidienne en réponse au cycle lumière / obscurité 25 .
L'ALD est une maladie chronique et prend des années d'abus d'alcool. La limitation critique du protocole actuel de traitement de l'éthanol est qu'elle déclenche seulement les effets aigus de l'alcool sur le foie. Le traitement avec une concentration élevée en éthanol pendant plus de 48 h entraîne une mortalité élevée, ce qui empêche l'étude d'une lésion chronique du foie. Une étude récente a révélé que le traitement continu du poisson zèbre adulte avec 1% d'éthanol pour un maximum de troisDes mois ont conduit à la stéatose, la stéato-hépatite et la fibrose 12 . Une direction future prometteuse pourrait être d'identifier un modulateur potentiel d'ALD en utilisant le protocole de traitement aigu de l'éthanol, puis de valider ses effets sur le modèle de traumatisme chronique.
La coloration H & E est effectuée pour évaluer les dommages hépatocellulaires induits par un traitement aigu de l'éthanol. En raison de la facilité d'effectuer l'imagerie par fluorescence dans le poisson zèbre, la coloration H & E n'est pas utilisée habituellement dans l'histologie du foie du poisson zèbre et la procédure est moins bien décrite. Le protocole actuel fournit une description étape par étape de la coloration H & E dans le foie larvaire. Choisir le correcteur correct est la première et la plus essentielle étape pour la coloration H & E. Bien que 10% de formol tamponné et 4% de PFA soient couramment utilisés dans l'histologie, ils provoquent tous deux des rétrécissements de tissus et des parties du foie tombant de la section. La fixation de 10% de formol conduit à la perte de cytoplasme dans l'hépatOcytes. La fixation à 4% de PFA entraîne des lacunes artificielles entre les hépatocytes. La coloration à l'éosine semble être beaucoup plus faible que la coloration par hématoxyline dans les foies qui sont fixés soit avec un fixateur. Le fixateur Dietrich à base d'acide est plus adapté à la coloration H & E du foie du poisson zèbre, car il préserve les détails cellulaires et minimise le retrait. Il semble également pénétrer le tissu adipeux, comme le foie, plus rapidement que le formol et le PFA. La coloration avec l'hématoxyline et l'éosine est plus équilibrée. Une mise en garde du fixateur de Dietrich est qu'il n'est pas compatible avec l'extraction de l'ADN génomique. Dans une expérience expérimentale, l'ADN génomique a été extrait des larves qui ont été fixées en utilisant 10% de formol, 4% de PFA ou le fixateur de Dietrich 26 . Les larves ont été incubées dans 50 ul de NaOH 50 mM à 95 ° C pendant 20 min et ont ensuite été refroidies à 4 ° C. 5 μL de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 ont ensuite été ajoutés pour neutraliser la solution basique. Après une brève centrifugation, le surnageant wTel qu'utilisé dans la PCR. Avec les mêmes amorces de PCR et le programme de PCR, l'ADN génomique à la fois des larves fixées à la formaline et à la PFA a produit des produits de PCR avec des tailles prédites, alors que l'ADN génomique provenant des larves fixatrices fixatrices de Dietrich n'a pas réussi à produire des produits de PCR.
La coloration H & E peut être effectuée à la fois sur les sections de paraffine et les sections surgelées. Cependant, les sections de paraffine ont les avantages suivants sur les sections gelées: 1) Alors que les sections de paraffine peuvent être conservées à température ambiante indéfiniment, les sections congelées ne peuvent être conservées qu'à une température de -80 ° C. 2) Pour les coupes congelées, la formation de cristaux de glace à l'intérieur des cellules peut perturber la morphologie cellulaire et les détails subcellulaires. En outre, les sections congelées sont souvent plus épaisses que les sections de paraffine. Cela peut entraîner de mauvaises images de morphologie tissulaire par rapport à celles produites à partir de sections de paraffine.
Lors de la préparation de blocs de paraffine pour les tissus du foie, le protocole actuelIncorpore les larves dans l'agarose. Les larves sont positionnées latéralement, avec le côté gauche du corps vers le bas et posé à plat contre le fond du moule. Cela garantit une orientation cohérente des foies, de sorte que lorsque les sections sont coupées séquentiellement, des régions équivalentes du foie peuvent être comparées du poisson au poisson 27 . Une autre étape clé qui garantit une coloration H & E réussie est le développement de la couleur. Il est crucial de vérifier la coloration fréquemment jusqu'à ce que l'intensité de couleur souhaitée soit atteinte.
La coloration H & E devrait être utilisée pour obtenir une évaluation préliminaire des lésions hépatiques. Les larves traitées à l'éthanol présentent un dépôt excessif de gouttelettes rondes dans les hépatocytes, ce qui suggère une stéatose 13 , 14 , 18 . L'étiquetage avec des colorants lipidiques, tels que Oil Red O et Nile Red, est nécessaire pour confirmer que ces gouttelettes sont en effet des lipides. La vessie de sang hépatiqueLes animaux traités apparaissent dilatés et gonflés. La microscopie électronique à balayage et la microscopie électronique de transmission devraient être effectuées pour examiner les changements ultrastructoraux dans les sinusoïdes. On a déjà signalé que le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire est augmenté dans le foie de poisson zèbre traité à l'éthanol, tel que détecté par l'immunofluorescence 18 . Cependant, étant donné que les niveaux d'expression des gènes fibrogéniques ne sont que légèrement augmentés dans le poisson traité 18 , H & E peut ne pas être suffisamment sensible pour détecter une telle quantité de protéines de la matrice extracellulaire. Les mêmes méthodes de fixation et de coloration ont été testées sur les foies de poisson zèbre adultes chroniquement blessés et étaient suffisantes pour détecter la fibrose (Yin, données non publiées).
Bien que le protocole actuel soit adapté à l'examen de l'histologie du foie dans les larves de poissons zèbres, il a une application plus large à la communauté de recherche du poisson zèbre, comme le samLe protocole e peut être appliqué à d'autres tissus et au poisson zèbre pour adultes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Katy Murray au Zebrafish International Resource Centre; Dr. Stacey Huppert et Kari Huppert au CCHMC, pour leurs conseils utiles sur le protocole; Et le service vétérinaire CCHMC, pour les soins des poissons. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH R00AA020514 et une subvention de recherche du Centre for Pediatric Genomics au CCHMC (à CY). Il s'agissait également d'un soutien en partie par la subvention NIH D30103939 (Intégrative Morphology Core) du Centre de recherche sur les maladies digestives à Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol (EtOH) | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
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