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Developmental Biology

Zebrafish में तीव्र अल्कोहल जिगर की चोट के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

Published: May 25, 2017 doi: 10.3791/55630
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल ने zebrafish लार्वा से लिवर के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का वर्णन किया है जो 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के साथ इलाज किया गया है। यौगिक स्टेटोसिस में इस तरह के गंभीर इथेनॉल उपचार के परिणाम और यकृत वैस्यूलेटर के सूजन।

Abstract

अल्कोहल लीवर रोग (एएलडी) तीव्र या पुरानी शराब दुरुपयोग के कारण जिगर को नुकसान का उल्लेख करता है। यह अल्कोहल से संबंधित रोग और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है और संयुक्त राज्य में 2 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। एएलडी के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए शराब से प्रेरित लिवर की चोट के अंतर्गत सेलुलर और आणविक तंत्र की बेहतर समझ महत्वपूर्ण है। Zebrafish लार्वा प्रदर्शन यकृत स्टेटोसिस और fibrogenesis 2% इथेनॉल के लिए जोखिम के सिर्फ 24 घंटे के बाद, उन्हें तीव्र शराबी यकृत की चोट के अध्ययन के लिए उपयोगी बना। यह काम zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल के उपचार की प्रक्रिया का वर्णन करता है और यह दर्शाता है कि यह यकृत रक्त वाहिकाओं के स्टेटोसिस और सूजन का कारण बनता है। हेमटॉक्सिलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जो कि zebrafish लार्वा जिगर के ऊतकीय विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, को भी वर्णित किया गया है। एच एंड ई के धुंधला होने पर immunofluorescence पर कई अनूठे फायदे होते हैं, क्योंकि यह सभी जीवों के निशान हैंएर कोशिकाएं और बाह्य घटकों को एक साथ और आसानी से यकृत चोट, जैसे कि स्टेटोसिस और फाइब्रोसिस का पता लगा सकता है। मॉडलिंग विष और वायरस प्रेरित लीवर की चोट के साथ-साथ विरासत में मिली लीवर रोगों में zebrafish के बढ़ते उपयोग को देखते हुए, यह प्रोटोकॉल इन सभी अध्ययनों में किए गए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है।

Introduction

अल्कोहल लीवर रोग (ALD), जो अल्कोहल अतिसंवेदनशीलता के कारण होता है, अल्कोहल से संबंधित रोग और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। संयुक्त राज्य में, लगभग आधा यकृत रोग की मृत्यु में शराब 1 शामिल है, और ALD लगभग 3 में से 3 यकृत प्रत्यारोपण के लिए जिम्मेदार है। ALD एक व्यापक स्पेक्ट्रम है स्टीटोसिस, जो हेपोटोसाइट्स में अतिरिक्त लिपिड संचय के द्वारा होता है, अत्यधिक पीने के प्रारंभिक चरण में होता है और अल्कोहल के उपयोग की समाप्ति पर प्रतिवर्ती होता है आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव में और शराब का सेवन जारी रखने से, यकृत स्टेटोसिस शराबी हेपेटाइटिस को प्रगति कर सकता है और अंत में, सिरोसिस 3 । कृंतक एएलडी मॉडल का उपयोग करने वाले अध्ययन ने रोग में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान की है, लेकिन उनके पास सीमाएं हैं (संदर्भ 3 में समीक्षा की गई) एक अल्कोहल आहार का मौखिक भोजन केवल कृन्तकों में स्टेटोसिस का कारण बनता है 4 , </ Sup> 5 सूजन और फाइब्रोसिस का विकास या तो दूसरा अपमान 6 , 7 या पुराने इंट्रागास्ट्रिक इन्फ्यूजन की आवश्यकता है, जो कि आक्रामक और तकनीकी रूप से 8 , 9 को चुनौतीपूर्ण है। टेलीस्ट्रोस्ट zebrafish भी पुराने और तीव्र शराब उपचार 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 दोनों के जवाब में जिगर की चोट विकसित करता है। विशेष रूप से, लार्वा ज़ेब्राफिश एक आकर्षक पूरक मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें तीव्र शराबी यकृत की चोट 10 , 11 , 13 , 15 का अध्ययन करना है। Zebrafish जिगर कार्यात्मक है और 4 दिनों से इथेनॉल चयापचय के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम पैदा करता है(डीपीएफ) 13 , 16 , 17। इथनॉल को सीधे पानी में जोड़ा जा सकता है, और 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के संपर्क में जैब्राफिश्श लार्वा 13 , 15 में यकृत स्टेटोसिस और फाइब्रोजेनिक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है।

यह बताया गया है कि 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के उपचार के कारण ज़ेब्राफिश्श लार्वा 13 में 80 मिमी के ऊतक इथेनॉल एकाग्रता में परिणाम हुआ। दूसरों ने यह दिखाया है कि लार्वा इस एकाग्रता को बर्दाश्त करते हैं और इलाज वाले जानवरों में पाए जाने वाले यकृत फ़ोनोटाइप्स 11 , 13 , 15 , 18 के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, चूंकि 80 एमएम मनुष्यों में लगभग 1 9 घायल है, इसलिए इथेनॉल के इलाज के zebrafish और dete के जिगर ऊतक विज्ञान का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण हैमनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता rmine

ज़ीब्राफिश्श लार्वा का तीव्र बाह्य विकास और पारगमन वास्तविक समय और निश्चित नमूनों में यकृत के भीतर शराब की कार्रवाई को चिह्नित करना संभव बनाता है। कोशिका प्रकार-विशिष्ट फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों की उपलब्धता और confocal microscopy में हाल की प्रगति तीव्र एथेनॉल उपचार 11 , 15 के जवाब में अलग-अलग जिगर सेल प्रकार कैसे उनके आकारिकी और व्यवहार को बदलने के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। हालांकि, फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक zebrafish के confocal इमेजिंग जिगर ऊतक विज्ञान का अध्ययन करते समय पूरी तरह से हेमटॉक्सिलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला के लिए विकल्प नहीं कर सकते हैं। ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करते हुए एक ही समय में सभी यकृत सेल प्रकार को चिह्नित करने के लिए व्यक्तिगत ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, प्रत्येक लेबलिंग एक यकृत सेल प्रकार एक अद्वितीय फ्लोरोफोरे के साथ। एक ही मछली में अलग ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि पेश करने के लिए प्रजनन की आवश्यकता हैजी कई पीढ़ियों, जो समय लेने वाली और महंगा है अतिरिक्त मैट्रिक्स घटकों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेंसिंग की आवश्यकता होती है। दूसरी तरफ एच एंड ई धुंधला हो जाना, साथ ही साथ सभी यकृत सेल प्रकार और बाह्य मैट्रिक्स घटकों को लेबल करता है, इस प्रकार यकृत 20 का अवलोकन प्रदान करता है इसके अलावा, यह आसानी से यकृत रोग के कई हिस्टोपाथावैज्ञानिक विशेषताओं, जैसे कि हेपेटाइटा मौत, स्टीटोसिस और फाइब्रोसिस का पता चलता है। यद्यपि एचएंडई स्तनधारी यकृत ऊतक विज्ञान में नियमित रूप से दाग है, हालांकि इसका उपयोग सामान्यतः ज़ेबराफिष जिगर अनुसंधान में नहीं किया जाता है, और प्रोटोकॉल कम अच्छी तरह से स्थापित है।

यह काम zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल और एच एंड ई धुंधला हो जाना के साथ अनुवर्ती हिस्टोलोलॉजिकल विश्लेषण के लिए वर्णन करता है। जिगर विकास और कार्य के सभी अध्ययनों में एच एंड ई स्टैनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, पैराफिन वर्गों का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए और साथ ही अन्य विशेष स्टे के लिए भी किया जा सकता हैजिगर विकृति में आईएनएस, ट्रिक्रोम दाग, रेटिकुलिन का दाग, आदि सहित

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Protocol

अटल बिहारी WT वयस्क और लार्वा ज़ेब्राफिश को मानक शर्तों 21 के तहत रखरखाव के लिए मार्गदर्शिका के प्रयोग और लैबोरेटरी जंतुओं के उपयोग के अनुसार बनाए रखा गया था (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान 86-23, संशोधित 1 9 85); उनके उपयोग को सिनसिनाटी चिल्ड्रन अस्पताल मेडिकल सेंटर (सीसीएचएमसी) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. अंडे का पानी तैयार करें
    1. डबल नमक पानी (डीडीएच 2 ओ) में 1 एल में वाणिज्यिक समुद्री नमक के 40 ग्राम को भंग करके स्टॉक नमक समाधान तैयार करें। जब तक सभी लवण पूरी तरह भंग न हों तब तक हलचल।
    2. 0.1 ग्राम पाउडर को 100 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर 0.1% मिथाइलन नीले समाधान तैयार करें।
      सावधानी: आंखों या त्वचा के संपर्क में आने पर मिथाइलिन नीला एक परेशानी है। पाउडर को संभालने के दौरान हमेशा प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें।
    3. 28.125 एमएल का शेयर नमक का मिश्रण करेंल्यूशन और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 7 एमएल मिथाइलन नीला समाधान। अच्छी तरह मिलाएं। इस मिश्रण को 15 एल डीडीएच 2 ओ में जोड़ें। अच्छी तरह से शेक और आरटी पर स्टोर करें।
  2. 100 एमएल डीडीएच 2 ओ के 12.1 ग्राम को जोड़कर 1 एम ट्रिस-एचसीएल के 100 एमएल तैयार करें। पीएच को 9.0 हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग करके समायोजित करें।
    चेतावनी: साँस ले जाने पर एचसीएल गंभीर जलन और श्लेष्म झिल्ली में जलन पैदा कर सकता है। हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें और एक रासायनिक हुड में स्टॉक की बोतल को संभालना।
  3. 0.4% tricaine (एथिल 3-एमिनोबेंजोएट मेथेनसफॉनेट) तैयार करें।
    1. 48 9 .5 एमएल डीडीएच 2 ओ में 2 ग्राम ट्रिक्सिन पाउडर को भंग करें। त्रि-एचसीएल के 10.5 एमएल, पीएच 9 समाधान जोड़ें। जब तक सभी पाउडर भंग न हो जाएं तब तक एक हलचल बार मिलाएं। पीएच 7.0 में समायोजित करें
      चेतावनी: ट्राइकेन पाउडर एक श्वसन परेशानी हो सकती है। पाउडर को संभालने में हमेशा एक धूल मास्क पहनें।
    2. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में tricaine समाधान के 45 मिलीलीटर की भिन्नता। सोलुटिओ रखें4 डिग्री सेल्सियस पर तत्काल उपयोग के लिए और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. 30 एमएल की 95% इथेनॉल, 10 एमएल 37% फॉर्मलाडिहाइड, 2 एमएल ग्लैशीय एसिटिक एसिड, और 58 एमएल डीडीएच 2 ओ को एक गिलास मीडिया बोतल में मिलाकर डायट्रिच के लगाम तैयार करें। आरटी पर घूमता और स्टोर करके अच्छा मिक्स करें
    सावधानी: फार्मलाडेहाइड एक संदिग्ध कैसिनोजेन है, और फार्मलाडहाइड के साथ किसी भी समाधान का प्रयोग रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए। ग्लेशियल एसिटिक एसिड गंभीर त्वचा जलने और आंखों के नुकसान का कारण बन सकता है। हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें और एक रासायनिक हुड में स्टॉक समाधान को संभालना। फार्मलाडहाइड, हिमनदों एसिटिक एसिड, और 95% इथेनॉल सभी ज्वलनशील तरल पदार्थ हैं और उन्हें एक निर्दिष्ट ज्वलनशील कैबिनेट में रखा जाना चाहिए।
    नोट: डीट्रिच का लगानेवाला 1 वर्ष के आरटी पर स्थिर है।
  5. 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl), 2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केएलएल), 14.4 ग्राम डिजोडियम फॉस्फेट (ना 2 एचपीओ 4 ), और 2 जोड़कर 1 एल 10x फॉस्फेट-बफरेड सलाइन (पीबीएस) समाधान तैयार करें।4 जी मोनोपोटेसियम फॉस्फेट (केएच 2 पीओ 4 ) से 800 एमएल डीडीएच 2 ओ। सोडाइड हाइड्रोक्साइड (नाओएएच) का प्रयोग करके पीएच 7.4 को समायोजित करें और डीडीएच 2 ओ को 1 एल अंतिम मात्रा में जोड़ें। आरटी पर इस समाधान को एक तरल चक्र पर आटोक्लेव करना जो 1 मिनट के लिए शुद्ध होता है और 120 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित होता है।
  6. 900 एमएल डीडीएच 2 ओ में 100 एमएल के 1 एम पीईबी को 1x पीबीएस बनाकर आरक्षित करें और आटोक्लेविंग के बाद आरटी पर स्टोर करें।
  7. भ्रूण माउंटिंग के लिए ग्लास मीडिया बोतल में 3% agarose तैयार करें।
    1. Agarose के 3 ग्राम को 100 एमएल डीडीएच 2 ओ में जोड़ें और घुमाव से मिश्रण करें। मिश्रण को मिटाने के लिए माइक्रोवेव करके agarose को भंग करने के लिए, और गर्म करने के दौरान सावधानी देखते रहें ताकि सुनिश्चित हो सके कि कम से कम उबलते हैं।
      सावधानी: शॉर्ट हीटिंग के बावजूद, बोतल गर्म होने पर माइक्रोवेव से हटा दिया जाएगा। माइक्रोवेव से बोतल हटाने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने या मिट का उपयोग करें
    2. माइक्रोवेव से बोतल निकालेंधीरे-धीरे घूमते हुए, किसी भी क्रिस्टल की तलाश करें जो कि पूरी तरह भंग न हो; अगर कोई क्रिस्टल नहीं हैं, समाधान उपयोग के लिए तैयार है। आरटी पर 3% agarose स्टोर और उपयोग करने से पहले फिर गर्मी।
  8. फिल्टर हैरिस हेमटोक्सीयलिन स्टॉक समाधान किसी भी ठोस निकालने के लिए है कि उपजी है
    1. एक कॉफी फिल्टर को आधे से मोड़ो ताकि फिल्टर एक शंकु बनाता है साइड पैनल खोलें ताकि लिक्विड फिल्टर के माध्यम से चलाया जा सके, जिससे किसी भी मलबे को पकड़ा जाए।
    2. एक फ़नल के अंदर फिल्टर और एक कांच मीडिया बोतल में फ़नल रखें फिल्टर के माध्यम से धीरे-धीरे स्टॉक हैमैटॉक्सिलीन डालें
      सावधानी: आंखों के संपर्क, घूस, और साँस लेना के मामले में हेमटॉक्सिलीन खतरनाक है। हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें और एक रासायनिक हुड में स्टॉक समाधान को संभालना।
  9. 125 μL 12 एन एचसीएल को 250 एमएल डीडीएच 2 ओ जोड़कर 0.05% एचसीएल तैयार करें।
  10. ईोसिन वाई-फ्लोक्साइन बी समाधान मिश्रण तैयार करें, जिसमें 1% ई 25 एमएल का संयोजन होओएसिन वाई (एसी), 1 एमएल का 1% फ्लॉक्साइन बी (एसी), 1 9 0 9 एलएल 95% इथेनॉल, और 1 एमएल ग्लैषियल एसिटिक एसिड कांच की बोतल में। आरटी पर घूमता और स्टोर करके अच्छा मिक्स करें
    सावधानी: आंखों के संपर्क, घूस, और साँस लेना के मामले में ईोसिन वाई खतरनाक है। हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें और एक रासायनिक हुड में स्टॉक समाधान को संभालना।
  11. 2 एमएल शुद्ध एथिल शराब को 98 एमएल अंडे का पानी जोड़कर 2% इथेनॉल तैयार करें।
    सावधानी: एथिल अल्कोहल एक आंखों में अड़चन है एथिल अल्कोहल को संभालने पर हमेशा उचित सुरक्षा उपकरण पहनें। यह भी ज्वलनशील है और इसे संभाला और तदनुसार संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    नोट: तीव्र इथेनॉल उपचार करने से पहले हर बार ताजा 2% इथेनॉल तैयार करें।

2. Zebrafish लार्वा में तीव्र ईथेनॉल उपचार करें

  1. भ्रूण उत्पन्न करने के लिए, एक जंगली पुरुष और एक डब्ल्यूटीई मादा मछली प्रति संभोग टैंक के साथ पार सेट करें। संभोग टैंक में एक प्लास्टिक डिवाइडर डालने से उन्हें अलग करें।
    नोट: सेट करेंअप दिन के अंतिम भोजन के बाद पार हो जाती है ताकि मछली अच्छी तरह से खिलाया जा सके।
    1. सुबह 8 बजे सुबह, विभक्त करने के लिए जोड़ी को दोस्त की अनुमति दें।
    2. 1 घंटे के बाद, वयस्क मछली को अपने मूल टैंक में लौटा दें। भ्रूण को एक झरनी में पानी डालने से भ्रूण ले लीजिए। स्ट्रेनर को 100 मिमी पेट्री डिश में बदल दें और भ्रूण को डिश में धो लें, जिसमें अंडे का पानी युक्त वॉश की बोतल है। 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में भ्रूण के साथ पकवान रखें
    3. जब भ्रूण कम-से-कम 4-सेल चरण (1 एचपीएफ) तक पहुंचते हैं, पाश्चर पिपेट के साथ पानी में किसी भी बिना खारिज भ्रूण और मलबे को हटा दें और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में निषेचित भ्रूण के साथ डिश रखें। इनक्यूबेटर में भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस तक बनाए रखने के लिए 96 घंटे बाद निषेचन।
    4. एक 1-10 (मात्रा / मात्रा) अनुपात पर अंडा के पानी के लिए tricaine समाधान जोड़कर लार्वा मछली की संज्ञा दें।
    5. चालीस 96 एचपीएफ लार्वा तक का चयन करें जो कि फुलाए हुए तैर मूत्राशय का प्रयोग कर रहे हैंएक पाश्चर पिपेट और उन्हें समान रूप से दो नए पेट्री डिश में विभाजित किया गया
    6. संभव के रूप में अधिक अवशिष्ट अंडा पानी के रूप में बाहर ले लो एक लार्वा प्रति एमएल के घनत्व पर, एक डिश में 2% इथेनॉल युक्त अंडा पानी जोड़ें। नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अन्य डिश में अंडे के पानी की समान मात्रा जोड़ें।
    7. 24 घंटे के लिए मछली के कमरे में नियंत्रण और इथेनॉल-युक्त लार्वा रखें।
      नोट: एक मछली के कमरे में इथेनॉल का उपचार करना जो एक 14 घंटे का प्रकाश / 10 घंटे का अंधेरा चक्र होता है, एक इनक्यूबेटर में अंधेरे में प्रयोग करने से अधिक सुसंगत और मजबूत जिगर की चोट में होता है।
    8. लार्वा को 1.5 एमएल की अपकेंद्रित्र ट्यूब में ले लीजिए, न 20 से अधिक लार्वा प्रति ट्यूब।
    9. लार्वा से जितना संभव हो उतना तरल निकालें और रासायनिक हुड में डीट्रिच के लगाने वाले कम से कम 1 एमएल (10x ऊतक मात्रा) जोड़ें। कम से कम 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मछली को एक नाइटर पर ठीक करने दें।
      नोट: कई हफ्तों के लिए डीट्रिच के लगाने वाले में मछली स्थिर हैं।
<P वर्ग = "jove_title"> 3 ऊतक कैसेट और प्रसंस्करण की तैयारी

  1. टिशू केसेट की आवश्यक संख्या निर्धारित करें और दो नाली बायोप्सी पैड प्रति कैसेट सेट करें। प्रत्येक कैसेट के नीचे एक बायोप्सी पैड रखें। पेंसिल में प्रत्येक कैसेट लेबल, स्पष्ट रूप से नमूना की पहचान।
    नोट: कैसेट लेबल करने के लिए पेन या मार्कर का उपयोग न करें, क्योंकि लेबलिंग बाद के चरणों में खो जाएंगे।
  2. सभी नमूनों की सुसंगत अभिविन्यास सुनिश्चित करने के लिए 3% agarose में लार्वा को एम्बेड करें।
    1. एक रासायनिक हुड में ट्यूबों से लगानेवाला निकालें और 5 मिनट के लिए लार्वा 3 बार प्रत्येक को 1 एमबीएल 1x पीबीएस में धो लें। वाश के दौरान आरटी पर एक nutator पर ट्यूब रखें।
    2. वाश के दौरान, ठोस में पिघला करने के लिए माइक्रोवेव का उपयोग करके पानी में तैयार 3% agarose गर्म करें। एक समय में 30 एस के लिए गर्मी और उबलते को कम करने के लिए ध्यान से देखें कोमल सरगर्मी के साथ तरल एगरोज़ को 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हॉट प्लेट पर रखें।
    3. ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करना, 8 एल तक स्थानांतरित करेंआर्विए को एक प्लास्टिक हिस्टोलॉजी ढालना और जितना संभव हो उतना पीबीएस हटा दें। टिप के साथ एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करना, पूरी तरह से 3% agarose के साथ मोल्ड भरें।
    4. इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके, लार्वा को मोल्ड के केंद्र में इकट्ठा करें और उन्हें नीचे तक धक्का दें। दांतेदार वर्गों के लिए, लार्वा को एक पंक्ति में रखें, मोल्ड के ऊपर की ओर सिर। यह सुनिश्चित करने के लिए कि यकृत सुसंगत तरीके से उन्मुख होते हैं, लार्वा को बदल दें ताकि शरीर की बाईं ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा हो और ढालना के तल के नीचे फ्लैट।
      नोट: क्योंकि जिगर शरीर के बाईं तरफ स्थित है, इस तरह की पोजिशनिंग से उन वर्गों की संख्या कम हो जाती है जिनके लिए जिगर तक पहुंचने से पहले कटौती की आवश्यकता होती है। संभव के रूप में लार्वा को एक दूसरे के करीब रखें।
    5. 4-5 मिनट के लिए साइड को मोल्ड सेट करें ताकि एगरोज पूरी तरह से सेट कर सकें। ढेर से agarose ब्लॉक निकालें और लार्वा के आसपास agarose ट्रिम करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। अंत पर ब्लॉक खड़े हो जाओ और आधा में मोटाई कटौतीओ कि अंतिम ब्लॉक मोटे तौर पर 2-3 मिमी मोटी है।
    6. छोटे agarose ब्लॉक तैयार ऊतक कैसेट (चरण 3.1) के लिए स्थानांतरण और ब्लॉक के शीर्ष पर दूसरे बायोप्सी पैड को रखें। कैसेट को बंद करें और डीडीएच 2 ओ में ताजा तैयार 70% इथेनॉल के साथ एक सील योग्य कंटेनर में पूरी तरह इकट्ठा कैसेट रखें।
      नोट: यदि कैसेट तुरंत संसाधित नहीं होने जा रहे हैं, तो फिक्सिंग के नुकसान से बचने के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कंटेनर में 70% इथेनॉल में रखें। कैसेट 3 दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होते हैं।
  3. ऊतक प्रसंस्करण
    नोट: पैराफिन में कैसेट प्रसंस्करण के लिए एक ऊतक विज्ञान या पैथोलोजी लैबोरेटरी के लिए नमूने प्रस्तुत की जा सकती हैं। एक लघु कार्यक्रम के बजाय एक मानक ओ / एन प्रोसेसिंग प्रोग्राम का अनुरोध करें ताकि पैराफिन पूरी तरह से एगरोस में घुसना कर सके।
    1. ऊतक केसेट पर उन्हें एथनॉल की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के माध्यम से स्थानांतरित करके, शराब की बढ़ती मात्रा में,ऊतक निर्जलीकरण, निम्नानुसार है: 70% इथेनॉल 2 गुना, प्रत्येक 45 मिनट; 80% इथेनॉल, 45 मिनट; 95% इथेनॉल, 2 बार, 45 मिनट प्रत्येक; 100% इथेनॉल, 2 बार, 45 मिनट प्रत्येक
    2. पैराफिन के ऊतक को घुसपैठ करने के क्रम में विलायक (100% xylene, 2 बार, 45 मिनट प्रत्येक) के साथ शराब को बदलें।
      सावधानी: ज़ीलीन एक परेशानी है और अगर साँस लेना हानिकारक है। हमेशा एक रासायनिक हुड का उपयोग करना सुनिश्चित करें Xylene ज्वलनशील है और तदनुसार संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    3. 60-65 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में पैराफिन ओ / एन में कैसेट सेते हैं एम्बेडिंग तक कैसेट गर्म रखें।
  4. पैराफिन में प्रसंस्कृत agarose ब्लॉकों को एम्बेड करें
    1. एम्बेडिंग मशीन के वार्मिंग दराज से एक कैसेट लें और कैसेट के ढक्कन को हटा दें और कैसेट से शीर्ष बायोप्सी पैड हटा दें। तरल पैराफिन के साथ एक हिस्टोलॉजी मोल्ड भरें और एम्बेडिंग मशीन पर गर्म प्लेट पर रखें।
    2. गर्म संदंश का उपयोग करके, कैसर से एगरोज़ ब्लॉक को उठाएंई और पैराफिन के साथ हिस्टोलॉजी मोल्ड में स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि सतह के निकट मछली के साथ agarose ब्लॉक की तरफ का सामना करना पड़ रहा है। नीचे बायोप्सी पैड को फेंक दें और एम्बेडिंग मशीन पर ठंडे प्लेट के पूरे हिस्टोलॉजी मोल्ड को स्थानांतरित करें।
    3. संदंश का उपयोग करना, मोल्ड के केंद्र में एगरोज़ ब्लॉक को तुरंत स्थान देना; ढालना के नीचे स्थित ब्लॉक रखें। एक बार ब्लॉक ठीक से रखा जाने के बाद, ऊतक विज्ञान के शीर्ष पर कैसेट के नीचे रख दिया और इसे अर्धवे से तरल पैराफिन के साथ भरें। मोल्ड सीधे 4 डिग्री सेल्सियस प्लेट पर रखें और कम से कम 10-15 मिनट के लिए ब्लॉकों को परेशान न करें ताकि पैराफिन को जमना पड़े। जबकि पहला ब्लॉक सेट अप है, शेष ब्लॉकों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. एक बार सभी ब्लॉकों के लिए पैराफिन सेट हो जाता है, पैराफिन ब्लॉक से हिस्टोलॉजी मोल्ड को धीरे से दबाकर इसे ढीला करके इसे ढीला कर दें। इन पैराफिन ब्लॉकों को कमरे के तापमान पर अनिश्चितकाल में संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. 4. पैराफिन ब्लॉक का हिस्सा

    1. सेक्शनिंग के पहले दिन, टिशू को कवर करने वाले अतिरिक्त पैराफिन को हटाने के लिए एक माइक्रोोटिम का उपयोग करके पैराफिन ब्लॉक का सामना करना पड़ता है। ऊतक पैराफिन ब्लॉक की सतह पर उजागर होने तक एक समय में धारा 5 सुक्ष्ममापी। बंद करो और कट जाने वाले सभी वर्गों को त्याग दें। 4 डिग्री CO / N में 1x पीबीएस में ब्लॉकों का सामना करना चाहिए।
      नोट: ब्लॉक को कम से कम 8 घंटे के लिए लथपथ होना चाहिए। दिन के अंत में भिगोने शुरू करें यदि ब्लॉक 1x पीबीएस में बहुत लंबे समय तक छोड़ दिया जाता है, तो ऊतक सूख सकता है और विकृत हो सकता है।
    2. 1x पीबीएस से एक समय में एक ब्लॉक को निकालें और माइक्रोट्रॉम का उपयोग करके 5-माइक्रोग्राम काट कर। धीरे से अंतिम भाग को संदंश या ब्रश का उपयोग करके ब्लेड से दूर खींचकर ब्लेड से वर्गों के रिबन को अलग करें। संदंश का उपयोग करके अंतिम अनुभाग द्वारा रिबन को उठाएं और उसे 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। रिबन को कम से कम 5 मिनट के लिए पानी की सतह पर फ्लोट करने की अनुमति दें
      नोट: Wheवर्गों को स्थानांतरित करना, पैरागिन के संपर्क में रहने के दौरान संदंश पानी को छूने न दें। अन्यथा, पैराफिन संदंश पर पिघल जाएगा और अलगाव बहुत मुश्किल बना देगा। यदि जरूरी हो तो, वर्गों को साफ संदंशों के उपयोग से छोटे समूहों में तंग कर दें ताकि वे स्लाइड पर आसानी से फिट हो सकें। क्षति के बिना अलगाव बनाने के लिए वर्गों के बीच सीवन को धीरे से स्पर्श करें।
    3. एक 45 डिग्री के कोण पर पानी में एक चार्ज स्लाइड डालें और एकत्रित किए जाने वाले अनुभागों के समूह के नीचे सावधानी बरतें। सावधानी से पानी से स्लाइड उठाएं और स्लाइड्स को स्लाइड से संलग्न करने दें।
    4. लिंट-फ्री टिशू का उपयोग कर अनुभागों से कोई भी अधिक पानी को हटा दें एक स्लाइड धारक या बॉक्स में स्लाइड रखें। खंड खंड तक जारी रखें जब तक वांछित टिशू एकत्र नहीं किया गया हो। सभी ब्लॉकों के लिए सेक्शनिंग प्रक्रिया को दोहराएं।
    5. पैराफिन को पिघलाने के लिए 3 से 16 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या ओवन में स्लाइड्स सेंकना। ओवन से स्लाइड निकालें और उन्हें टी की अनुमति देंधुंधला होने से पहले शांत हो
      नोट: पैराफिन वर्ग को आरटी पर अनिश्चितकाल में संग्रहीत किया जा सकता है, पाक के पहले और बाद में।

    5. पैराफिन सेक्शन के हैमटॉक्सिलीन और ईोसिन स्टेनिंग

    1. स्लाइड्स को 15 मिनट के लिए 100% xylene में डिब्बे छोड़ दें; इसे एक और 15 मिनट के लिए ताजा 100% xylene में बदलें।
    2. स्लाइड्स के ठीक से चलने तक लिक्विडिड एथेनॉल की निम्नलिखित श्रृंखला के माध्यम से उन्हें स्लाइड करके स्लाइड्स को दोहराएं। प्रत्येक समाधान के लिए, 8-10 बार डुबकी, 2 एस प्रति डुबकी: 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, 30% इथेनॉल, और विआयनीकृत पानी।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और कई घंटों के लिए स्लाइड्स को आरटी पर पानी में छोड़ा जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पानी O / N में संग्रहीत किया जा सकता है
    3. 4 मिनट के लिए 100% फ़िल्टर्ड हैरिस हेमटोक्सीसिलिन में स्लाइड रखें। तुरंत उन्हें विआयनीकृत पानी के साथ कंटेनर में वापस स्थानांतरित करें विआयनीकृत पानी टी में चलाएंवह कंटेनर के पीछे के कोने से दूर वर्गों से दूर है कंटेनर समय-समय पर खाली न करें जब तक कि पानी अब बैंगनी न हो।
      नोट: सीधे स्लाइड पर पानी चलने न दें, क्योंकि अनुभाग स्लाइड्स से निकल सकते हैं।
    4. एक विदारक माइक्रोस्कोप पर हेमटोक्सीसिलिन तीव्रता की जांच जल्दी से गोजनेनेक रोशनी का उपयोग करें; स्लाइडों को सूखने की अनुमति न दें यदि दाग वांछित तीव्रता तक पहुंच गया है, तो अगले चरण पर जारी रखें। यदि रंग काफी अंधेरा नहीं है, तो स्लाइड्स को 100% हेमटॉक्सिलीन में 1 मिनट के लिए रखें और फिर से जाँच करने से पहले पानी की धोया दोहराएं।
      नोट: हेमटैक्ससिलिन को अंधेरे होने की आवश्यकता है ताकि ईओस के धुंधला होने के दौरान रंग नहीं खोला जा सके। हालांकि, यदि हेमटैक्साइलिन धुंधला कोशिका द्रव्य में देखा जाता है, तो वर्गों की संख्या अधिक हो गई है।
    5. स्लाइड्स को 0.05% एचसीएल में दो बार डुबकी और उन्हें तुरंत साफ विआयनीकृत पानी के साथ कंटेनर पर वापस स्थानांतरित करें। पानी खाली करें और दो बार पानी के साथ कंटेनर को फिर से भरें
    6. स्लाइड्स को 95% एट पर स्थानांतरण करें30 एस के लिए हानोल और फिर उन्हें 30 एस के लिए 95% इथेनॉल के साथ एक नए कंटेनर में स्थानांतरण करें।
    7. 2 मिनट के लिए ईओस्न वाई-फ्लॉक्साइन बी समाधान में स्लाइड्स रखें स्लाइड्स को पिछले 95% इथेनॉल कंटेनर पर वापस स्थानांतरित करें और विदारक सूक्ष्मदर्शी के नीचे रंग की तीव्रता को तुरंत जांचें। यदि धुंधला हो जाना पर्याप्त है, तो अगले चरण पर जाएं यदि नहीं, तो 30 एस के लिए ईोसिन समाधान पर लौटें, पुनः जांचें और आवश्यकतानुसार दोहराएं
      नोट: पर्याप्त ईोसिन धुंधला उज्ज्वल गुलाबी है और हेमटॉक्सीसिलिन का दाग के विपरीत भिन्न होता है। सूक्ष्मदर्शी के नीचे की जांच करते समय स्लाइड्स के पीछे से किसी भी समाधान को पोंछना सुनिश्चित करें जिससे कि कोई भी गलत रंग न देखा जाए। चूंकि रंगीन तीव्रता की जांच करते समय ईोसिन 95% इथेनॉल से बना है, 95% इथेनॉल में लंबे समय तक की अवधि, कुछ रंगों को निकाल सकते हैं।
    8. 15 एस के लिए स्लाइड्स को 100% आइसोप्रोपेनॉल में स्थानांतरित करें ताजा 100% आइसोप्रोपेनॉल के साथ बदलें और स्लाइड्स को एक अन्य 15 एस के लिए एसोप्रोपेनॉल में वापस रखें। इस पी को दोहराएंकुल 6 isopropanol washes के लिए rocess
      सावधानी: आइसोप्रोणोल एक आंख और श्वसन परेशानी है। हमेशा उचित सुरक्षा उपकरण पहनना और छिड़कने से बचने के लिए सुनिश्चित करें। यह भी अत्यधिक ज्वलनशील है और तदनुसार संग्रहीत और संभाला जाना चाहिए।
      नोट: अभिकर्मकों को बचाने के लिए, केवल पहले (गुलाबी) आइसोपोप्रानोल वॉश छोड़ दें। अगले पांच धुंधलों के लिए पुन: उपयोग किए जाने के लिए 1 से 5 गिने जाने वाले बोतलों में अन्य पांच धोने के समाधान रखें। फिर से उपयोग करने के बाद, बोतल की संख्या "1" के साथ शुरू करें और उपयोग के बाद त्याग दें। धोने के बाद "2" का इस्तेमाल किया गया है, इसे 1 "बोतल में डालें," और इसी तरह। अंतिम धो हमेशा ताजा आईसोप्रोणोल होना चाहिए।
    9. 3 मिनट के लिए 100% xylenes में स्लाइड रखें एक समय में एक स्लाइड निकालें और एक कवरलाप रखें।
      1. वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त बढ़ते माध्यम जोड़ें और 100% xylene में उन्हें डुबकी।
        नोट: यह चरण बढ़ते माध्यम की सतह को चिकना कर देगा और किसी बुलबुले को हटा देगा।
      2. एक कवरलाप लागू करेंस्लाइड के नीचे।
        नोट: बढ़ते माध्यम स्लाइड को स्थिति में खींचा चाहिए। यदि कंडोलिप सीधे या पूरी तरह से बैठा नहीं है, तो उसे धीरे-धीरे जगह पर टैप करें
      3. एक पेपर तौलिया पर किसी भी अतिरिक्त माउन्टिंग माध्यम को ब्लॉक करें जब तक कि केवल एक पतली रेखा दिखाई न दे। एक ऊतक डुबकी से xylene में पोंछते हैं और किसी भी माध्यम को हटाने के लिए स्लाइड के पीछे पोंछते हैं। एक सख्त लेकिन मोबाइल सतह पर स्लाइड फ्लैट प्लेस करें, जैसे कार्डबोर्ड का एक टुकड़ा एक ही फैशन में सभी शेष स्लाइड्स को कवर करें Xylene 10 मिनट के लिए हुड में लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें
        नोट: एक्सलीन से दूषित किसी भी सामग्री को हटाया जाना चाहिए और उसे छोड़ने से किसी भी वाष्प को रोकने के लिए हुड में सील कंटेनर में हटा दिया जाना चाहिए।
    10. आरटी ओ / एन पर बढ़ते माध्यम को कठोर करने की अनुमति दें

    6. इमेजिंग और स्टोरेज स्लाइडिंग स्लाइड

    1. एक कंपाउंड इनवर्टेड माइक्रोस्कोप 18 पर छवि अनुभाग
      नोट: स्लाइड को कमरे में रखा जा सकता हैमापेन अनिश्चित काल के लिए

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Representative Results

10% बफर फॉम्ररीन और 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) ऊतक विज्ञान प्रथाओं के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सबसे आम फिक्सिटी हैं। हालांकि, वे zebrafish जिगर ऊतक ( चित्रा 1 और तालिका 1 ) के लिए इष्टतम निर्धारण परिणाम नहीं देते हैं। 10% फॉम्रिनिन या 4% पीएफए ​​के साथ फिक्सेशन, अक्सर लिमिट और आसपास के ऊतकों ( चित्रा 1 ए , बी ; चित्रा 1 बी , ऊतक संकोचन का एक उदाहरण प्रदान करता है) के बीच बड़े अंतराल बनाते हैं। जिगर के ऊतकों के अंश भी खंड से निकल सकते हैं। हेपेटासाइट्स का कोशिका द्रव्यमान अक्सर खो जाता है ( चित्रा 1 ए , 1 बी )। दोनों तय करने वाले हेपेटोसाइट्स की विरूपण पैदा कर सकते हैं, क्योंकि वे या तो सिकुड़ते या सूंघते हैं और स्तंभ स्तंभ की संरचना को बनाए रखते हैं जो उपकला कोशिकाओं के लिए विशेषता है। पीएफए ​​निर्धारण के साथ एक अतिरिक्त मुद्दा हैकि हेपॅटोसाइट्स के बीच रिक्त स्थान हैं जो वास्तविक नहीं हैं, जिससे ऊतक को खंडित ( चित्रा 1 बी ) देखने का कारण होता है। इसके अलावा, जब इन दोनों में से एक का प्रयोग किया जाता है, तो हेपॅटोसाइट्स हेमटोक्सीसिलिन के साथ अच्छी तरह से रंगे हुए हैं, लेकिन कम ईोसिन ( चित्रा 1 ए ) के साथ। एसिड-आधारित डीट्रिच का निर्धारण फॉरेनिफ़िन और पीएफए ​​फिक्स्चर ( चित्रा 1 सी ) के साथ मुद्दों पर काबू पाता है।

मानव ALD में, स्टेटोसिस, जो छोटे और बड़े-छोटी बूंदों से बना है, केंद्रीय नस के पास सबसे महत्वपूर्ण है और 22 तीव्रता से बढ़कर पोर्टल त्रय की ओर फैली हुई है। Zebrafish में, 96-120 एचपीएफ से 2% इथेनॉल के साथ उपचार भी हेपेटाइटिस स्टीटोसिस को प्रेरित करता है, जो हैपेटोसाइट्स ( चित्रा 2 बी , तीर) में गोल बूंदों के अत्यधिक बयान से जुड़ा हुआ है। हालांकि, बूंदों को प्रदर्शित नहीं करते हैंटाई समान डिलीवरी पैटर्न जैसा कि मानव ALD में देखा गया है, क्योंकि ज़बराफ़िश जिगर 23 में पोर्टल और केंद्रीय नसों का कोई स्पष्ट अंतर नहीं है। इथेनॉल के इलाज वाले लार्वावल यकृत में यकृत रक्त वाहिकाओं को नियंत्रित जिगर ( चित्रा 2 बी , तारांकन) में उन लोगों की तुलना में सूजन हुई है।

आकृति 1
चित्रा 1 : 120 एचपीएफ में डिफेंफेरेट फिक्स्डिव्स के साथ फिक्स्ड किए गए जेबराफिश लार्वा के लिवर में एच एंड ई स्टैनिंग की तुलना। ( ए ) आरटी ओ / एन में 10% फॉर्मलिन; ( बी ) 4 डिग्री सीओ / एन में 4% पीएफए; ( सी ) 24 घंटे के आरटी पर डीट्रिच का लगानेवाला 10% फॉस्फोरिन के साथ, हेपेटासाइट्स अक्सर अपने कोशिका द्रव्य (ए) खो देते हैं। ऊतक ईोसिन के साथ ठीक से दाग नहीं है और बैंगनी दिखाई देता है फिक्का के बाद4% पीएफए ​​के साथ संबंध, अंतराल हेपेटासाइट्स (बी) के बीच देखा जाता है। 4% पीएफए ​​जिगर के ऊतकों को हटने का कारण बनता है, इसलिए यकृत और आसपास के ऊतकों के बीच एक बड़ा अंतर दिखाई देता है। बी में धराशायी रेखा आसपास के ऊतकों की सीमा के निशान हैं। डीट्रिच का लगानेवाला तीन (सी) में इष्टतम परिणाम प्रदान करता है स्केल बार = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : तीव्र ईथेनॉल उपचार के कारण हेपेटिक स्टेटोसिस और ज़ीब्राफीज लार्वाल लिवर में रक्त पोत सूजन। ( ए ) एक नियंत्रण, अनुपचारित, डब्ल्यूटी लार्वा में जिगर के एच एंड ई धुंधला हो जाना ( बी ) जिगर के एच एंड ई स्टेनिंग का विल्म टाइप लार्वा में 2% एथा के साथ इलाज किया गया था96 से नोल - 120 एचपीएफ दोनों जानवरों को डीएटीरिच के लगाने वाले 120 एचपीएफ में तय किया गया था। तीक्ष्ण (बी) बिंदु में हेपोटोसाइट्स को गोल बूंदों के अत्यधिक जमाव के साथ। तारों से सूखा हुआ यकृत रक्त वाहिकाओं को चिह्नित करते हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

10% फॉस्फोरिन 4% पीएफए डीट्रिच का लगानेवाला
फिक्सेशन हालत आरटी पर कम से कम 24 घंटे 3 घंटे आरटी या ओ / एन पर 4 डिग्री सेल्सियस आरटी पर कम से कम 24 घंटे
नमूना संग्रहण पोस्ट निर्धारण आरटी पर अनिश्चितकाल 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस तक आरटी पर 2 महीने तक
Compatibजीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के साथ ility हाँ हाँ नहीं
shrinkages हाँ हाँ न्यूनतम
कोशिकाओं का विरूपण हाँ हाँ न्यूनतम
सेलुलर विवरणों की हानि हाँ मामूली न्यूनतम
संतुलित एच एंड ई का दाग कमजोर ईोसिन का दाग कमजोर ईोसिन का दाग हाँ
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संगतता हाँ हाँ हाँ

तालिका 1: 10% फॉम्ररीन की तुलना, 4% पीएफए, और डीट्रिच के फिक्सिटिव्स फॉर ज़ेराबिश जिगर हिस्टोलॉजी।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल उपचार के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया और एच एंड ई धुंधला हो जाना के साथ बाद के हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण का वर्णन किया गया है। तीव्र ईथेनॉल उपचार 96 9 के बाद के निषेचन के बाद नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह वह चरण है, जिस पर ज़ेबराफिश जिगर शराब-मेटाबोलाइजिंग एंजाइम 13 को व्यक्त करना शुरू कर देता है। 2% इथेनॉल अधिकतम खुराक है कि लार्वा 13 , 14 को सहन कर सकता है। इथेनॉल के इलाज वाला लार्वा उपचार के 8 घंटे के द्वारा यकृत स्टेटोसिस को दिखाना शुरू कर देता है, और स्टेटोस के विकास के लार्वा के प्रतिशत लगातार 14 घंटे तक लगातार उपचार 14 तक बढ़ रहे हैं। Zebrafish लार्वा विशेष रूप से जर्दी से पोषक तत्वों अवशोषित 120 एचपीएफ इसलिए, 120 एचपीएफ से परे इथेनॉल का इलाज अनुशंसित नहीं है, क्योंकि उपवास भी स्टेटोसिस 14 में योगदान कर सकता है। अन्य प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना मेंऑटोरेटरी 13 , 24 , मौजूदा प्रोटोकॉल में किए गए मुख्य संशोधन यह है कि इथेनॉल का इलाज एक मछली की सुविधा में किया जाता है जिसमें 14 घंटे का प्रकाश / 10 घंटे का अंधेरा चक्र होता है। इससे इनक्यूबेटर में अंधेरे में इलाज किया जाता है, जब उन लोगों की तुलना में अधिक सुसंगत और मजबूत स्टीटोटिक प्रतिक्रियाएं होती हैं। यह तथ्य से संबंधित हो सकता है कि प्रकाश / अंधेरे चक्र 25 के जवाब में ज़ीब्राफिश जिगर में लिपिड मेटाबोलिक जीन रोज़ ताल की अभिव्यक्ति दिखाती है

ALD एक पुरानी बीमारी है और शराब के दुरुपयोग के वर्षों लगते हैं। वर्तमान इथेनॉल उपचार प्रोटोकॉल की महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह केवल यकृत पर शराब के तीव्र प्रभाव को ट्रिगर करता है। 48 घंटे से अधिक के लिए इस तरह के एक उच्च इथेनॉल एकाग्रता के साथ उपचार उच्च मृत्यु दर, पुरानी जिगर की चोट के अध्ययन को रोकने के कारण होता है। एक हालिया अध्ययन में पाया गया कि वयस्क zebrafish के लगातार इलाज के लिए 1% इथेनॉल के साथ तीन तकमहीनों में स्टीटोसिस, स्टीटोहेपेटाइटिस और फाइब्रोसिस 12 का नेतृत्व किया। एक भविष्य का भविष्य होनहार तीव्र एथानोल उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग करके ALD के एक संभावित न्यूजलेटर को पहचानने के लिए और फिर पुरानी चोट मॉडल में इसके प्रभाव को मान्य करने के लिए हो सकता है।

एचएंडआरई स्टेनाइंग को एपाटेनसुलुलर हर्जर्स का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है जो तीव्र इथनॉल उपचार द्वारा प्रेरित होते हैं। Zebrafish में प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन करने में आसानी के कारण, एच एंड ई धुंधला हो जाना नियमित रूप से zebrafish जिगर ऊतक विज्ञान में प्रयोग नहीं किया जाता है, और प्रक्रिया कम अच्छी तरह से वर्णित है। वर्तमान प्रोटोकॉल लार्वा जिगर में एच एंड ई स्टेंसिंग का चरण-दर-चरण वर्णन प्रदान करता है। एच एंड ई के धुंधला होने के लिए सही लगाने का पहला और सबसे जरूरी कदम है। यद्यपि 10% buffered formalin और 4% पीएफए ​​आमतौर पर ऊतक विज्ञान में उपयोग किया जाता है, वे दोनों ऊतक संकोचन और खंड से बाहर गिर यकृत के हिस्से का कारण। 10% फॉस्फोरिन फिक्सेशन की वजह से हेपेट में साइटोप्लाज्म का नुकसान होता हैocytes। हेप्टोसाइट्स के बीच कृत्रिम अंतराल में 4% पीएफए ​​निर्धारण परिणाम। ईोसिन धुंधला हो सकता है कि यकृत में हेमटोक्सीलिन धुंधला होने से ज्यादा कमजोर हो या फिर तय करने वाले के साथ तय हो। एसिड आधारित डीट्रिच का लगानेवाला ज़ेब्राफिश जिगर के एच एंड ई स्टेंसिंग के लिए अधिक उपयुक्त है, क्योंकि यह सेलुलर विवरण को सुरक्षित रखता है और संकोचन को कम करता है। यह फैटीय ऊतक को फैलता है, जैसे कि यकृत, फॉरमेटरीन और पीएफए ​​से ज्यादा। हेमटैक्साइलिन और ईोसिन के साथ धुंधला अधिक संतुलित है। डीट्रिच का लगानेवाला की एक चेतावनी यह है कि यह जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए संगत नहीं है। परीक्षण प्रयोग में, जीनोमिक डीएनए लार्वा से निकाला गया था जो कि 10% फॉम्ररीन, 4% पीएफए, या डीट्रिच के लगानेवाला 26 का उपयोग करके तय किया गया था। लार्वा 50 मील के 50 मिमी NaOH में 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए और फिर 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया। 5 एमएल 1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 को मूल समाधान को बेअसर करने के लिए जोड़ा गया था। एक संक्षिप्त मध्यवर्तीकरण के बाद, सतह पर तैरनेवाला wजैसा कि पीसीआर में प्रयोग किया जाता है एक ही पीसीआर प्राइमरों और पीसीआर कार्यक्रम के साथ, औपचारिक और पीएफए-निश्चित लार्वा दोनों से जीनोमिक डीएनए ने भविष्यवाणी के आकार के साथ पीसीआर उत्पादों को मुहैया कराया, जबकि डीट्रिच के लगाने वाले-निश्चित लार्वा से जीनोमिक डीएनए किसी भी पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न नहीं कर पाया।

एचएंडआरई धुंधला पैराफिन वर्गों और जमे हुए वर्गों दोनों पर आयोजित किया जा सकता है। हालांकि, पैराफिन वर्गों में जमे हुए वर्गों के ऊपर निम्न लाभ हैं: 1) जहां पैराफिन वर्गों को अनिश्चित काल के कमरे के तापमान पर भंडारित किया जा सकता है, जमे हुए वर्ग केवल एक वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। 2) जमे हुए वर्गों के लिए, कोशिकाओं के भीतर बर्फ के क्रिस्टल का गठन सेल आकारिकी और subcellular विस्तार उलझन में हो सकता है। इसके अलावा, फ्रोजन वर्ग अक्सर पैराफिन वर्गों की तुलना में अधिक मोटा होता है। इससे पैराफिन वर्गों से उत्पादित लोगों की तुलना में टिशू आकृति विज्ञान की खराब छवियां हो सकती हैं।

यकृत के ऊतकों के लिए पैराफिन ब्लॉकों की तैयारी करते समय, वर्तमान प्रोटोकॉलAgarose में लार्वा एम्बेड करता है लार्वा बाद में स्थित होता है, शरीर के बाईं तरफ नीचे का सामना करना पड़ता है और मोल्ड के नीचे के बीच फ्लैट झूठ बोलता है। यह यकृत की सुसंगत अभिविन्यास सुनिश्चित करता है, ताकि जब खंड क्रमिक रूप से कट जाए, तो यकृत के समतुल्य क्षेत्र मछली से मछली 27 की तुलना कर सकते हैं। एक और महत्वपूर्ण कदम यह है कि सफल एच एंड ई धुंधला हो जाना सुनिश्चित करता है रंग विकास। वांछित रंग तीव्रता तक पहुंचने तक लगातार धुंधला हो जाना महत्वपूर्ण है।

जिगर की चोट के प्रारंभिक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए एच एंड ई का धुंधला इस्तेमाल किया जाना चाहिए इथेनॉल-युक्त लार्वा हेपेटासाइट्स में गोल बूंदों के अत्यधिक बयान दिखाता है, स्टेटोसिस 13 , 14 , 18 के सूचक। लिपिड डाईज़ के साथ लेबलिंग, जैसे तेल रेड ओ और नील रेड, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि ये बूंदियां वास्तव में लिपिड हैं। यकृत रक्त वाहिकाइलाज वाले जानवरों में एल्स फैली हुई और सूजी हुई दिखाई देती हैं। साइनासॉइड में मूलभूत संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन करना चाहिए। यह पहले से सूचित किया गया है कि इटिनोल-चबाने वाला zebrafish यकृत में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन जमाव बढ़ रहा है, जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस 18 द्वारा पता लगाया गया है। हालांकि, यह देखते हुए कि फाइब्रोजेनिक जीन के अभिव्यक्ति के स्तर को केवल नम्र रूप से इलाज किया गया मछली 18 में बढ़ाया जाता है, एचएंडई इस तरह की छोटी मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हो सकता है। वही स्थूल और धुंधला हो जाने वाले तरीकों का गंभीर रूप से घायल वयस्क zebrafish livers पर परीक्षण किया गया था और फाइब्रोसिस (यिन, अप्रकाशित डेटा) का पता लगाने के लिए पर्याप्त थे।

यद्यपि मौजूदा प्रोटोकॉल ज़ेब्राफिश्श लार्वा में जिगर ऊतक विज्ञान की परीक्षा के अनुरूप है, लेकिन यह जैब्राफिश अनुसंधान समुदाय के लिए एक व्यापक आवेदन है, जैसा कि सैमई प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों और वयस्क zebrafish के लिए लागू किया जा सकता है

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

लेखक ज़ीबराफिश अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र में डॉ कैटी मरे को स्वीकार करना चाहते हैं; डॉ। स्टैसी हूपर्ट और करि हूपर्ट, प्रोटोकॉल पर उनकी सहायक सलाह के लिए, सीसीएचएमसी में; और मछली देखभाल के लिए सीसीएचएमसी पशु चिकित्सा सेवा यह काम एनआईएच अनुदान R00AA020514 और सीसीएचएमसी (सीवाईएम) में बाल चिकित्सा जेनोमिक्स के केंद्र से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित था। यह भी सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान केंद्र के एनआईएच अनुदान P30 DK078392 (एकीकृत रूपिकी कोर) द्वारा भाग में समर्थन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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Ellis, J. L., Yin, C. Histological… More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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