Summary
يصف هذا البروتوكول التحليلات النسيجية للكبد من اليرقات الزرد التي تم علاجها مع الايثانول 2٪ لمدة 24 ساعة. هذه النتائج العلاج الإيثانول الحاد في دهن الكبد وتورم في الأوعية الدموية الكبدية.
Abstract
يشير مرض الكبد الكحولي (ألد) إلى تلف الكبد بسبب تعاطي الكحول الحاد أو المزمن. وهو من بين الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات المرتبطة بالكحول ويؤثر على أكثر من 2 مليون شخص في الولايات المتحدة. فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء إصابة الكبد الناجم عن الكحول أمر حاسم لتطوير علاج فعال ل ألد. تعرض اليرقات الزرد الدهنية الكبدية و فيبروجينيسيس بعد 24 ساعة فقط من التعرض للإيثانول 2٪، مما يجعلها مفيدة لدراسة إصابة الكبد الكحولية الحادة. هذا العمل يصف الإجراء لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد ويظهر أنه يسبب تشحم وتورم في الأوعية الدموية الكبدية. ويرد وصف بروتوكول مفصل لهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ التي هي الأمثل للتحليل النسيجي للكبد اليرقات الزرد، كما وصف. H & E تلطيخ لديه العديد من المزايا الفريدة على المناعي، كما أنه يصادف كل حيالخلايا إر والمكونات خارج الخلية في وقت واحد، ويمكن بسهولة الكشف عن إصابة الكبد، مثل الدهن والتليف. نظرا لزيادة استخدام الزرد في النمذجة السم والفيروسات الناجم عن إصابة الكبد، وكذلك أمراض الكبد الموروثة، وهذا البروتوكول بمثابة مرجعا للتحليلات النسيجية التي أجريت في جميع هذه الدراسات.
Introduction
مرض الكبد الكحولية (ألد)، والذي يسببه الإفراط في استهلاك الكحول، هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالكحول. في الولايات المتحدة، ما يقرب من نصف الوفيات أمراض الكبد تنطوي على الكحول 1 ، و ألد هو المسؤول عن ما يقرب من 1 في 3 زرع الكبد 2 . ألد لديها طيف واسع. داء الدهن، الذي يتميز بزيادة تراكم الدهون في خلايا الكبد، ويحدث في مرحلة مبكرة من شرب الخمر ويمكن عكسها عند التوقف عن استخدام الكحول. تحت تأثير العوامل الوراثية والبيئية والاستمرار في تناول الكحول، يمكن أن يتقدم الدهن الكبدي إلى التهاب الكبد الكحولي، وفي نهاية المطاف، تليف الكبد 3 . وقد وفرت الدراسات باستخدام نماذج ألد القوارض رؤى كبيرة في هذا المرض، ولكن لديهم قيود (استعرض في المرجع 3 ). التغذية عن طريق الفم من اتباع نظام غذائي كحولي يسبب فقط التعرق في القوارض 4 ، </ سوب> 5 . تطوير الالتهاب والتليف يتطلب إما الإهانة الثانية 6 ، 7 أو التسريب داخل المعدة المزمن، وهو الغازية والتحدي من الناحية الفنية 8 ، 9 . الزرد عن بعد أيضا يتطور إصابة الكبد ردا على كل من علاج الكحول المزمن والحاد 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 . على وجه الخصوص، يمثل الزرد اليرقات كائن نموذج التكميلية جذابة التي لدراسة إصابة الكبد الكحولية الحادة 10 ، 11 ، 13 ، 15 . الكبد الزرد وظيفية وتنتج الانزيمات الرئيسية لالايضان الايثانول من قبل 4 أيامs بعد الإخصاب (دب) 13 ، 16 ، 17. الإيثانول يمكن أن تضاف مباشرة إلى الماء، والتعرض إلى 2٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة كافية للحث على دهن الكبد واستجابات فيبروجينيك في اليرقات الزرد 13 ، 15 .
وقد أفيد أن العلاج مع 2٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة أسفرت عن تركيز الايثانول الأنسجة من 80 ملي في اليرقات الزرد 13 . وأظهر آخرون أن اليرقات تتسامح مع هذا التركيز والنماذج الظاهرية الكبد ينظر في الحيوانات المعالجة هي محددة لتعرض الإيثانول 11 ، 13 ، 15 ، 18 . ومع ذلك، لأن 80 ملي هو قاتلة تقريبا في البشر 19 ، فمن المهم لتقييم الأنسجة الكبد من الزرد المعالجة الإيثانول و ديترمين صلة الفسيولوجية للبشر.
التطور الخارجي السريع وترجمة اليرقات الزرد تجعل من الممكن لتوصيف عمل الكحول داخل الكبد في الوقت الحقيقي وفي عينات ثابتة. توافر خطوط الخلايا المعدلة وراثيا الفلورسنت نوع معين والتطورات الأخيرة في المجهر متحد البؤر تسهل دراسة كيف تختلف أنواع خلايا الكبد المختلفة مورفولوجيا والسلوك ردا على العلاج الإيثانول الحاد 11 ، 15 . ومع ذلك، والتصور متحد البؤر من الزرد المعدلة وراثيا الفلورسنت لا يمكن أن يكون بديلا تماما عن الهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ عند دراسة الأنسجة الكبد. وضع علامات على جميع أنواع الخلايا الكبد في نفس الوقت باستخدام الزرد المعدلة وراثيا يتطلب توليد خطوط المعدلة وراثيا الفردية، كل وصفها نوع واحد من خلايا الكبد مع فلورفور فريدة من نوعها. إدخال خلفيات المعدلة وراثيا مختلفة في نفس السمك يتطلب بريدينز الأجيال المتعددة، التي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هناك حاجة إلى تلطيخ المناعي إضافية للكشف عن مكونات المصفوفة خارج الخلية. H & E تلطيخ، من ناحية أخرى، تسميات في وقت واحد جميع أنواع الخلايا الكبد ومكونات مصفوفة خارج الخلية، وبالتالي توفير لمحة عامة عن الكبد 20 . وعلاوة على ذلك، فإنه يكشف بسهولة العديد من الميزات النسيجية المرضية لأمراض الكبد، مثل موت الخلايا الكبدية، والدهون، والتليف. على الرغم من أن H & E هو وصمة عار روتينية في الأنسجة الكبدية الثدييات، فإنه لا يشيع استخدامها في البحوث الكبد الزرد، والبروتوكول هو أقل رسوخا.
يصف هذا العمل بروتوكول لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد والتحليل النسيجي المتابعة مع H & E تلطيخ. H & E تلطيخ بروتوكول يمكن استخدامها في جميع الدراسات من تطور الكبد وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام أقسام البارافين ل إمونوهيستوشيميستري، فضلا عن ستا خاصة أخرىفي أمراض الكبد، بما في ذلك وصمة عار ثلاثية الألوان، وصمة عار ريتيكولين، الخ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أب و وت الزرد البالغ واليرقات تحت ظروف قياسية 21 وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعاهد الوطنية للصحة المنشور 86-23، المنقحة 1985)؛ تمت الموافقة على استخدامها من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدامها في المركز الطبي مستشفى سينسيناتي للأطفال (كشمك).
1. إعداد الحلول
- إعداد ماء البيض.
- إعداد محلول الملح الأسهم عن طريق إذابة 40 غرام من ملح البحر التجاري في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج (د 2 O). يحرك حتى تذوب جميع الأملاح تماما.
- إعداد 0.1٪ محلول الميثيلين الأزرق بإضافة 0.1 غرام من مسحوق إلى 100 مل من د 2 O.
تنبيه: الأزرق الميثيلين هو مهيج إذا كان يأتي في اتصال مع العينين أو الجلد. دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات عند التعامل مع مسحوق. - الجمع بين 28.125 مل من الملح الأسهم لذلكلوتيون و 7 مل من محلول الميثيلين الأزرق في أنبوب مخروطي 50 مل. اخلط جيدا. إضافة هذا الخليط إلى 15 لتر من د 2 O. يهز جيدا وتخزينها في رت.
- إعداد 100 مل من 1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك عن طريق إضافة 12.1 غرام من مسحوق تريس إلى 100 مل من د 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 9.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك).
تنبيه: يمكن أن يسبب حمض الهيدروكلوريك حروق شديدة وتهيج الغشاء المخاطي إذا استنشق. دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات والتعامل مع زجاجة الأسهم في غطاء الكيميائية. - إعداد 0.4٪ تريكين (إثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات) الحل.
- حل 2 غرام من مسحوق تريكين في 489.5 مل من د 2 O. إضافة 10.5 مل من تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9 الحل. تخلط مع شريط التحريك حتى يذوب كل المسحوق. ضبط لدرجة الحموضة 7.0.
تنبيه: مسحوق تريكين يمكن أن يكون مهيجة الجهاز التنفسي. دائما ارتداء قناع الغبار عند التعامل مع مسحوق. - قسامة 45 مل من محلول تريكين في 50 مل أنابيب مخروطية. الحفاظ على سولوتيون عند 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري وعند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- حل 2 غرام من مسحوق تريكين في 489.5 مل من د 2 O. إضافة 10.5 مل من تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9 الحل. تخلط مع شريط التحريك حتى يذوب كل المسحوق. ضبط لدرجة الحموضة 7.0.
- إعداد مثبت ديتريش من خلال الجمع بين 30 مل من الايثانول 95٪، 10 مل من 37٪ الفورمالديهايد، 2 مل من حمض الخليك الجليدي، و 58 مل من د 2 O في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج. تخلط جيدا من خلال دوامة ومخزن في رت.
تنبيه: الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة مشتبه بها، وأي حل مع الفورمالديهايد ينبغي أن تستخدم في غطاء الكيميائية. حمض الخليك الجليدي يمكن أن يسبب حروق شديدة في الجلد وتلف العين. دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات والتعامل مع حل المخزون في غطاء الكيميائية. والفورمالديهايد، وحمض الخليك الجليدي، و 95٪ من الإيثانول كلها سوائل قابلة للاشتعال، وينبغي تخزينها في خزانة قابلة للاشتعال.
ملاحظة: تثبيتي ديتريش مستقرة في رت لمدة 1 سنة. - إعداد 1 لتر من 10X محلول ملحي الفوسفات مخزنة (بس) بإضافة 80 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، 2 غرام من كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 14.4 غرام من فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4 )، و 2.4 غرام من فوسفات مونوبوتاسيوم (خ 2 بو 4 ) إلى 800 مل من د 2 O. ضبط لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) وإضافة د 2 O إلى 1 L الحجم النهائي. تخزين هذا الحل في رت بعد التعقيم على دورة السائل التي تطهير لمدة 1 دقيقة واحتضان عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- جعل 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X عن طريق تمييع 100 مل من حل برنامج تلفزيوني 10X في 900 مل من د 2 O. مزيج جيدا عن طريق الهز وتخزينها في رت بعد التعقيم.
- إعداد 3٪ الاغاروز في زجاجة وسائل الإعلام الزجاجية لتثبيت الجنين.
- إضافة 3 غرام من الاغاروز إلى 100 مل من د 2 O ومزيج من دوامات. تسخين الخليط عن طريق المايكرويف لحل الاغاروز، ومشاهدة بعناية أثناء التسخين لضمان أن يكون هناك الحد الأدنى من الغليان.
تنبيه: من المحتمل أن تكون الزجاجة ساخنة عند إزالتها من الميكروويف، على الرغم من التسخين القصير. استخدم قفازات واقية أو قفاز لإزالة الزجاجة من المايكروويف. - إزالة زجاجة من الميكروويف.بينما يحوم بلطف، والبحث عن أي بلورات التي لم يتم حلها تماما. إذا لم يكن هناك بلورات، والحل جاهز للاستخدام. تخزين الاغاروز 3٪ في رت والحرارة مرة أخرى قبل الاستخدام.
- إضافة 3 غرام من الاغاروز إلى 100 مل من د 2 O ومزيج من دوامات. تسخين الخليط عن طريق المايكرويف لحل الاغاروز، ومشاهدة بعناية أثناء التسخين لضمان أن يكون هناك الحد الأدنى من الغليان.
- تصفية هاريس الهيماتوكسيلين حل الأسهم لإزالة أي المواد الصلبة التي عجلت.
- طي مرشح القهوة في نصف بحيث مرشح يخلق مخروط. افتح اللوحة الجانبية بحيث يعمل السائل من خلال الفلتر، مما يسمح بالقبض على أي حطام.
- ضع الفلتر داخل القمع ومسار القمع في زجاجة وسائط زجاجية. تصب تدريجيا هيماتوكسيلين الأسهم من خلال مرشح.
تنبيه: الهيماتوكسيلين خطير في حالة ملامسة العين، الابتلاع، والاستنشاق. دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات والتعامل مع حل المخزون في غطاء الكيميائية.
- إعداد 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من 12 N حمض الهيدروكلوريك إلى 250 مل من د 2 O.
- إعداد يوزين Y- فلوكسين B خليط الحل من خلال الجمع بين 25 مل من 1٪ هأوسين Y (أق)، 2.5 مل من 1٪ فلوكسين B (أق)، 195 مل من الايثانول 95٪، و 1 مل من حمض الخليك الجليدي في زجاجة. تخلط جيدا من خلال دوامة ومخزن في رت
تنبيه: يوسين Y هو خطير في حالة الاتصال العين، والابتلاع، واستنشاق. دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات والتعامل مع حل المخزون في غطاء الكيميائية. - إعداد 2٪ من الإيثانول بإضافة 2 مل من الكحول الإيثيلي النقي إلى 98 مل من ماء البيض.
تنبيه: الكحول الإيثيلي هو مهيج للعين. دائما ارتداء معدات واقية المناسبة عند التعامل مع الكحول الإيثيلي. كما أنها قابلة للاشتعال، وينبغي التعامل معها وتخزينها وفقا لذلك.
ملاحظة: إعداد الايثانول 2٪ الطازجة في كل مرة قبل إجراء العلاج الإيثانول الحاد.
2. أداء العلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد
- لتوليد الأجنة، إعداد الصلبان مع واحد ويلديب الذكور والأسماك الإناث وت واحد لكل خزان التزاوج. فصلها عن طريق إدراج مقسم البلاستيك في خزان التزاوج.
ملاحظة: تعيينيصل المصلين بعد التغذية النهائية من اليوم بحيث يتم تغذية الأسماك بشكل جيد.- في الساعة 8 صباحا في صباح اليوم التالي، اسحب الحاجز للسماح للزميل بالتزاوج.
- بعد 1 ساعة، وإرجاع الأسماك الكبار إلى خزان الأصلي. جمع الأجنة عن طريق صب الماء الذي يحتوي على الأجنة في مصفاة. تحويل مصفاة أكثر من في طبق بتري 100 ملم وغسل الأجنة في الطبق باستخدام زجاجة غسل تحتوي على ماء البيض. وضع الطبق مع الأجنة في حاضنة عند 28 درجة مئوية.
- عندما تصل الأجنة على الأقل مرحلة 4 خلايا (1 هف)، وإزالة أي الأجنة غير المخصبة والحطام في الماء مع ماصة باستور ووضع الطبق مع الأجنة المخصبة في حاضنة عند 28 درجة مئوية. الحفاظ على الأجنة في الحاضنة في 28 درجة مئوية حتى 96 ساعة بعد الإخصاب.
- تخدير الأسماك اليرقات بإضافة الحل تريكين لمياه البيض في 1-10 (حجم / حجم) نسبة.
- اختيار ما يصل إلى أربعين 96 اليرقات هف التي لديها تضخم المثانة السباحة باستخدامماصة باستور وتقسيمها بالتساوي إلى طبقين بتري جديدة.
- اخراج ما تبقى من مياه البيض المتبقية ممكن. في كثافة من يرقة واحدة لكل مل، إضافة ماء البيض يحتوي على 2٪ من الإيثانول إلى طبق واحد. إضافة نفس الكمية من ماء البيض إلى الطبق الآخر ليكون بمثابة السيطرة.
- الحفاظ على السيطرة واليرقات المعالجة الإيثانول في غرفة الأسماك لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: إجراء العلاج الإيثانول في غرفة الأسماك التي لديها 14 ساعة ضوء / 10 ساعة دورة حادة يؤدي إلى إصابة الكبد أكثر اتساقا وقوة من إجراء التجربة في الظلام في حاضنة. - جمع اليرقات في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل مع ما لا يزيد عن 20 اليرقات لكل أنبوب.
- إزالة أكبر قدر ممكن من السائل من اليرقات وإضافة ما لا يقل عن 1 مل (10x حجم الأنسجة) من مثبت ديتريش في غطاء محرك السيارة الكيميائية. السماح للأسماك لإصلاح على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل.
ملاحظة: الأسماك مستقرة في تثبيتي ديتريش لعدة أسابيع.
- تعيين عدد ضروري من أشرطة الأنسجة واثنين من خزعة خزعة الزرقاء في كاسيت. وضع لوحة خزعة واحدة في الجزء السفلي من كل كاسيت. تسمية كل كاسيت في قلم رصاص، وتحديد بوضوح العينة.
ملاحظة: لا تستخدم القلم أو علامة لتسمية أشرطة، لأن سيتم فقدان العلامات في الخطوات اللاحقة. - تضمين اليرقات في أغاروس 3٪ لضمان التوجه متسقة من جميع العينات.
- إزالة تثبيتي من الأنابيب في غطاء محرك السيارة الكيميائية وغسل اليرقات 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. وضع الأنابيب على نوتاتور في رت خلال يغسل.
- خلال يغسل، حرارة أعدت أغاروس 3٪ في الماء باستخدام الميكروويف لإذابة الصلبة. الحرارة لمدة 30 ثانية في وقت ومشاهدة بعناية لتقليل الغليان. الحفاظ على الاغاروز السائل على طبق ساخن تعيين إلى 90 درجة مئوية مع التحريك لطيف.
- باستخدام ماصة نقل، ونقل ما يصل إلى 8 لترأرفاي إلى قالب الأنسجة البلاستيكية وإزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني ممكن. باستخدام ماصة نقل مع قطع طرف، ملء تماما القالب مع الاغاروز 3٪.
- باستخدام حقنة الأنسولين، وجمع اليرقات إلى مركز القالب ودفعها إلى أسفل. لأقسام سهمي، وضع اليرقات في خط، مع رؤساء نحو الجزء العلوي من القالب. لضمان أن تكون موجهة الكبد بطريقة متسقة، وتحويل اليرقات بحيث الجانب الأيسر من الجسم يواجه أسفل ومسطحة ضد الجزء السفلي من القالب.
ملاحظة: لأن الكبد يقع على الجانب الأيسر من الجسم، وهذا تحديد المواقع يقلل من عدد الأقسام التي تحتاج إلى قطع قبل الوصول إلى الكبد. الحفاظ على اليرقات أقرب إلى بعضها البعض ممكن. - تعيين القالب إلى الجانب لمدة 4-5 دقيقة للسماح الاغاروز لتعيين تماما. إزالة كتلة الاغاروز من القالب واستخدام شفرة حلاقة لتقليم الاغاروز حول اليرقات. الوقوف كتلة على نهاية وقطع سمك في نصف ثانيةس أن كتلة النهائي هو ما يقرب من 2-3 ملم.
- نقل كتلة الاغاروز الصغيرة إلى كاسيت الأنسجة المعدة (الخطوة 3.1) ووضع لوحة الخزعة الثانية على رأس الكتلة. إغلاق كاسيت ووضع كاسيت تجميعها بالكامل في حاوية قابلة للإغلاق مع الايثانول 70٪ الطازجة في ddH2O.
ملاحظة: إذا كانت أشرطة لن يتم معالجتها على الفور، ووضعها في الايثانول 70٪ في حاوية في 4 درجات مئوية لتجنب فقدان التثبيت. الكاسيت مستقرة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
- معالجة الأنسجة
ملاحظة: يمكن تقديم عينات إلى الأنسجة أو مختبر الأمراض مجهزة معالج الأنسجة لمعالجة أشرطة في البارافين. طلب برنامج معالجة O / N القياسية بدلا من برنامج قصير بحيث البارافين يمكن اختراق تماما الاغاروز.- معالجة كاسيت الأنسجة عن طريق نقلها من خلال سلسلة التخفيف من الإيثانول، مع كمية متزايدة من الكحول، ليذوى الأنسجة، على النحو التالي: 70٪ من الإيثانول 2 مرات، 45 دقيقة لكل منهما. 80٪ الإيثانول، 45 دقيقة؛ 95٪ من الإيثانول، 2 مرات، 45 دقيقة لكل منهما؛ 100٪ من الإيثانول، 2 مرات، 45 دقيقة لكل منهما.
- استبدال الكحول مع المذيب (100٪ زيلين، 2 مرات، 45 دقيقة لكل منهما) من أجل البارافين لتسلل الأنسجة.
تنبيه: زيلين هو مهيج وضار إذا استنشاقه. تأكد من استخدام غطاء محرك السيارة الكيميائي دائما. الزيلين هو قابل للاشتعال ويجب أن يتم تخزينها وفقا لذلك. - احتضان أشرطة في البارافين O / N في حاضنة في 60-65 درجة مئوية. الحفاظ على أشرطة كاسيت دافئة حتى التضمين.
- تضمين كتل الاغاروز معالجتها في البارافين.
- إخراج واحد كاسيت من درج الاحترار من آلة التضمين وإزالة غطاء من الكاسيت وأعلى الخزعة وسادة من الكاسيت. ملء قالب الأنسجة مع البارافين السائل والاحتفاظ بها على لوحة دافئة على آلة التضمين.
- باستخدام ملقط دافئ، والتقاط كتلة أغاروس من الكاسيته ونقله إلى قالب الأنسجة مع البارافين. تأكد من أن الجانب من كتلة الاغاروز مع الأسماك الأقرب إلى السطح تواجه أسفل. رمي بعيدا لوحة خزعة أسفل ونقل قالب الأنسجة كله إلى لوحة باردة على آلة التضمين.
- باستخدام ملقط، بسرعة وضع كتلة الاغاروز في مركز القالب. وضع كتلة في الجزء السفلي من القالب. مرة واحدة يتم وضع كتلة بشكل صحيح، ووضع الجزء السفلي من الكاسيت على رأس قالب الأنسجة وملء في منتصف الطريق مع البارافين السائل. وضع القالب مباشرة على لوحة 4 ° C ولا تخل الكتل لمدة 10-15 دقيقة على الأقل للسماح للبارافين لتصلب. أثناء إنشاء الكتلة الأولى، كرر هذه العملية للكتل المتبقية.
- مرة واحدة يتم تعيين البارافين لجميع الكتل، وإزالة قالب الأنسجة من كتلة البارافين عن طريق الضغط بلطف على القالب لتخفيفه. هذه كتل البارافين يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.
4. سيكتيونينغ من كتل البارافين - في اليوم السابق سيكتيونينغ، وجه في كتلة البارافين باستخدام مشراح لإزالة البارافين الزائد تغطي الأنسجة. القسم 5 ميكرون في وقت حتى يتعرض الأنسجة على سطح كتلة البارافين. وقف وتجاهل كل المقاطع التي يتم قطع. نقع كتل وجهه لأسفل في برنامج تلفزيوني 1X في 4 ° كو / N.
ملاحظة: يجب أن تكون غارقة كتل لمدة 8 ساعة على الأقل. بدء تمرغ في نهاية اليوم. إذا تركت كتل في برنامج تلفزيوني 1X لفترة طويلة جدا، يمكن أن الأنسجة تنتفخ وتصبح مشوهة. - إزالة كتلة واحدة في وقت واحد من برنامج تلفزيوني 1X وقطع المقاطع 5 ميكرون باستخدام مشراح. افصل شرائط المقاطع من الشفرة عن طريق سحب الجزء الأخير برفق بعيدا عن النصل باستخدام ملقط أو فرشاة. التقاط الشريط من قبل القسم الأخير باستخدام ملقط ونقله إلى حمام مائي في 42 درجة مئوية. السماح للشرائط لتعويم على سطح الماء لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
ملاحظة: وين نقل المقاطع، لا تدع ملقط تلمس الماء في حين لا يزال على اتصال مع البارافين. وإلا، فإن البارافين تذوب على ملقط وجعل الانفصال صعبة للغاية. إذا لزم الأمر، ندف بعض المقاطع إلى مجموعات أصغر باستخدام ملقط نظيفة بحيث يمكن أن تناسب بسهولة على الشرائح. لمس بلطف التماس بين المقاطع لخلق الانفصال دون ضرر. - وضع شريحة مشحونة في الماء على زاوية 45 درجة ووضع بعناية تحت مجموعة من المقاطع التي سيتم جمعها. رفع بعناية الشريحة من الماء والسماح للأقسام لنعلق على الشريحة.
- طمس أي المياه الزائدة من المقاطع باستخدام الأنسجة الخالية من الوبر. وضع الشريحة في حامل الشريحة أو مربع. الاستمرار في قسم كتلة حتى تم جمع الأنسجة المطلوبة. كرر عملية باجتزاء لجميع الكتل.
- خبز الشرائح في حاضنة 55 درجة مئوية أو الفرن لمدة 3-16 ساعة لتذوب البارافين. إزالة الشرائح من الفرن والسماح لهم رس بارد قبل بدء تلطيخ.
ملاحظة: أقسام البارافين يمكن تخزينها في رت إلى أجل غير مسمى، سواء قبل وبعد الخبز. - ديبارافينيز الشرائح عن طريق غمس لهم في 100٪ زيلين لمدة 15 دقيقة. تغييره إلى الطازجة 100٪ زيلين لمدة 15 دقيقة أخرى.
- ترطيب الشرائح عن طريق غمس لهم من خلال السلسلة التالية من الايثانول متدرج حتى يعمل السائل نظيفة قبالة الشرائح. لكل حل، تراجع 8-10 مرات، 2 ثانية لكل تراجع: الإيثانول 100٪، الإيثانول 100٪، الايثانول 95٪، الايثانول 95٪، الايثانول 70٪، الايثانول 50٪، 30٪ الإيثانول، والمياه منزوع الأيونات.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، والشرائح يمكن أن تترك في رت في الماء لعدة ساعات. إذا لزم الأمر، والشرائح يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية في الماء O / N. - وضع الشرائح في 100٪ تصفيتها هيماتوكسيلين هاريس لمدة 4 دقائق. نقلها على الفور مرة أخرى إلى الحاوية مع الماء منزوع الأيونات. تشغيل منزوع الأيونات الماء إلى رانه الزاوية الخلفية للحاوية أبعد بعيدا عن المقاطع. تفريغ الحاوية دوريا حتى الماء لم يعد الأرجواني.
ملاحظة: لا تدع تشغيل المياه مباشرة على الشرائح، كما أقسام قد تأتي قبالة الشرائح. - تحقق بسرعة كثافة الهيماتوكسيلين على المجهر تشريح باستخدام أضواء معقوفة. لا تسمح الشرائح لتجف. إذا وصل وصمة عار إلى الكثافة المطلوبة، والاستمرار في الخطوة التالية. إذا كان اللون ليست داكنة بما فيه الكفاية، ضع الشرائح في 100٪ الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة وكرر يغسل الماء قبل التحقق مرة أخرى.
ملاحظة: الهيماتوكسيلين يحتاج إلى أن تكون مظلمة بما فيه الكفاية بحيث لا يتم فقدان اللون خلال تلطيخ يوزين. ومع ذلك، إذا كان ينظر إلى تلطيخ الهيماتوكسيلين في السيتوبلازم، وأوفيرستيند المقاطع. - تراجع الشرائح مرتين في 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك ونقلها على الفور مرة أخرى إلى الحاوية مع الماء منزوع الأيونات نظيفة. إفراغ الماء وإعادة ملء الحاوية بالماء مرتين.
- نقل الشرائح إلى 95٪ وآخرونهانول لمدة 30 ثانية ومن ثم نقلها إلى حاوية جديدة مع الايثانول 95٪ لمدة 30 ثانية.
- وضع الشرائح في يوزين Y- فلوكسين B الحل لمدة 2 دقيقة. نقل الشرائح مرة أخرى إلى حاوية الايثانول 95٪ السابقة وبسرعة التحقق من شدة اللون تحت المجهر تشريح. إذا كان تلوين كاف، انتقل إلى الخطوة التالية. إن لم يكن، والعودة إلى حل يوزين لمدة 30 ثانية، تحقق مرة أخرى، وتكرار حسب الضرورة.
ملاحظة: تلوين يوزين كافية وردي مشرق ويظهر في تباين واضح لصمة عار الهيماتوكسيلين. تأكد من مسح أي حل من الجزء الخلفي من الشرائح عند فحص تحت المجهر بحيث لا يلاحظ أي لون كاذب. لأن يوزين يتكون من الايثانول 95٪، وفترات طويلة من الوقت في الايثانول 95٪ في حين التحقق من كثافة اللون قد رشح بعض من اللون. - نقل الشرائح إلى الأيزوبروبانول 100٪ لمدة 15 ثانية. استبدال مع 100٪ الأيزوبروبانول جديدة ووضع الشرائح مرة أخرى في الأيزوبروبانول لمدة 15 ثانية أخرى. كرر هذا pروسيس لما مجموعه 6 يغسل الأيزوبروبانول.
تنبيه: الأيزوبروبانول هو العين والتنفس المهيج. تأكد دائما من ارتداء معدات الوقاية المناسبة وتجنب الرش. كما أنها قابلة للاشتعال للغاية ويجب تخزينها والتعامل معها وفقا لذلك.
ملاحظة: لحفظ على الكواشف، تجاهل فقط (بينكيست) غسل الأيزوبروبانول. الحفاظ على حلول غسل خمسة أخرى في زجاجات مرقمة من 1 إلى 5، لإعادة استخدامها لتلطيخ المقبل. عند إعادة استخدام الغسل، تبدأ مع زجاجة مرقمة "1" وتجاهل بعد الاستخدام. مرة واحدة غسل "2" وقد استخدمت، صب في زجاجة "1"، وهلم جرا. وينبغي أن يكون غسل النهائي دائما الأيزوبروبانول جديدة. - وضع الشرائح في زيلينس 100٪ لمدة 3 دقائق. إزالة شريحة واحدة في كل مرة ووضع ساترة.
- إضافة المتوسطة المتزايدة كافية لتغطية المقاطع وتراجع لهم في 100٪ زيلين.
ملاحظة: سوف هذه الخطوة على نحو سلس سطح وسط تصاعد وإزالة أي فقاعات. - تطبيق ساترةإلى أسفل الشريحة.
ملاحظة: يجب على وسط تصاعد سحب الشريحة في الموقف. إذا كان ساترة ليست مستقيمة أو يجلس تماما، اضغط بلطف في مكانه. - قم بلمس أي وسط تصاعد زائد على منشفة ورقية حتى ينظر إلى خط رفيع فقط. تراجع الأنسجة مسح في الزيلين ومسح الجزء الخلفي من الشريحة لإزالة أي المتوسطة التي قد انخفض. وضع الشريحة شقة على سطح قوي ولكن المحمول، مثل قطعة من الورق المقوى. يغطى جميع الشرائح المتبقية في نفس الأزياء. السماح لل زيلين لتتبخر في غطاء محرك السيارة لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يجب إزالة أي مواد ملوثة بالزيلين وتخلص منها في وعاء مغلق في غطاء المحرك لمنع أي أبخرة من الهروب.
- إضافة المتوسطة المتزايدة كافية لتغطية المقاطع وتراجع لهم في 100٪ زيلين.
- السماح للتركيب المتوسطة إلى تتصلب في رت O / N.
- أقسام الصورة على مركب المجهر مقلوب 18 .
ملاحظة: يمكن أن تبقى الشرائح في الغرفة تيدرجة الحرارة إلى أجل غير مسمى.
5. هيماتوكسيلين و يوسين تلطيخ أقسام البارافين
6. التصوير وتخزين الشرائح الملطخة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10٪ مخزنة الفورمالين و 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) هما من المثبتات الأكثر شيوعا المستخدمة في ممارسات الأنسجة. ومع ذلك، فإنها لا تعطي نتائج التثبيت الأمثل لأنسجة الكبد الزرد ( الشكل 1 والجدول 1 ). التثبيت مع 10٪ الفورمالين أو 4٪ بفا غالبا ما يؤدي إلى انكماش، وخلق فجوات كبيرة بين الكبد والأنسجة المحيطة بها ( الشكل 1A ، B ؛ الشكل 1B يوفر مثالا على انكماش الأنسجة). قد تسقط أجزاء من أنسجة الكبد أيضا من القسم. وغالبا ما فقدت السيتوبلازم من خلايا الكبد ( الشكل 1A ، 1B ). كلا المثبتات يمكن أن يسبب تشويه خلايا الكبد، لأنها إما تتقلص أو تنتفخ ولم يعد الحفاظ على التشكل عمودي الذي هو سمة للخلايا الظهارية. قضية إضافية واحدة مع تثبيت بفا هوأن هناك مسافات بين خلايا الكبد التي ليست حقيقية، والتي تسبب الأنسجة للنظر كسر ( الشكل 1B ). وعلاوة على ذلك، عندما يتم استخدام أي من هذين مثبتات، هي ملطخة خلايا الكبد بشكل جيد مع الهيماتوكسيلين، ولكن أقل من ذلك مع يوزين ( الشكل 1A ). الحمضية التي تعتمد على ديتريش مثبت يتغلب على القضايا مع الفورمالين و بفا مثبتات ( الشكل 1C ).
في ألد الإنسان، والدهون، والتي تتكون من الدهون الصغيرة والكبيرة قطرات، هو الأبرز بالقرب من الوريد المركزي ويمتد نحو الخارج نحو ثالوث البوابة مع زيادة شدة 22 . في الزرد، والعلاج مع الايثانول 2٪ من 96-120 هف يحفز أيضا الدهن الكبدي، والذي يتورط في ترسب المفرط للقطرات المستديرة في خلايا الكبد ( الشكل 2B ، والسهام). ومع ذلك، فإن قطرات لا إكسيبيتا نمط التوزيع مماثل كما رأينا في ألد الإنسان، لأنه لا يوجد تمييز واضح من البوابة والأوردة المركزية في الكبد الزرد 23 . الأوعية الدموية الكبدية في الكبد اليرقات يعامل الإيثانول وتورم مقارنة مع تلك الموجودة في السيطرة على الكبد ( الشكل 2B ، النجمة).
الشكل 1 : مقارنات من H & E تلطيخ في كبد اليرقات الزرد التي كانت ثابتة مع مثبتات مختلفة في 120 هف. ( A ) 10٪ فورمالين أت رت O / N؛ ( ب ) 4٪ بفا عند 4 ° كو / N؛ ( C ) تثبيتي ديتريش في رت لمدة 24 ساعة. مع 10٪ الفورمالين، وخلايا الكبد غالبا ما تفقد السيتوبلازم (A). لم يتم ملطخة الأنسجة بشكل صحيح مع يوزين ويظهر الأرجواني. بعد فيكسامع 4٪ بفا، وينظر ثغرات بين خلايا الكبد (B). 4٪ بفا يسبب أنسجة الكبد أن يتقلص، لذلك يبدو أن هناك فجوة كبيرة بين الكبد والأنسجة المحيطة بها. خط متقطع في B يشير إلى حدود الأنسجة المحيطة بها. تثبيتي ديتريش يوفر النتيجة المثلى بين الثلاثة (C). شريط مقياس = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : علاج الإيثانول الحاد الأسباب الدهن الكبدي وسفينة الدم تورم في الزرد اليرقات الكبد. ( A ) H & E تلطيخ الكبد في السيطرة، غير المعالجة، وت يرقة. ( B ) H & E تلطيخ الكبد في نوع يرقات فيل التي تم علاجها مع 2٪ إثانول من 96 - 120 هف. تم تثبيت كل من الحيوانات مع تثبيتي ديتريش في 120 هف. السهام في (B) تشير إلى خلايا الكبد مع ترسب المفرط من قطرات مستديرة. علامة النجمة الأوعية الدموية الكبدية تورم. شريط مقياس = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 10٪ الفورمالين | 4٪ بفا | ديتريش تثبيتي | |
| حالة التثبيت | على الأقل 24 ساعة في رت | 3 ساعة في رت أو O / N عند 4 درجات مئوية | على الأقل 24 ساعة في رت |
| عينة التثبيت بعد التثبيت | إلى أجل غير مسمى في رت | تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية | تصل إلى شهرين في رت |
| Compatibمع استخراج الحمض النووي الجيني | نعم فعلا | نعم فعلا | لا |
| الإنكماش | نعم فعلا | نعم فعلا | الحد الأدنى |
| تشويه الخلايا | نعم فعلا | نعم فعلا | الحد الأدنى |
| فقدان التفاصيل الخلوية | نعم فعلا | متواضع | الحد الأدنى |
| متوازن H & E وصمة عار | ضعف وصمة عار يوزين | ضعف وصمة عار يوزين | نعم فعلا |
| التوافق مع المناعية | نعم فعلا | نعم فعلا | نعم فعلا |
الجدول 1: مقارنات من الفورمالين 10٪، بفا 4٪، و ديتريش فيكساتيفس لعلم الأنسجة الزرد الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف البروتوكول الحالي إجراء مفصل لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد والتحليلات النسيجية اللاحقة مع H & E تلطيخ. وينبغي إجراء العلاج الإيثانول الحاد في أي وقت مضى من 96 ساعة بعد الإخصاب، وهذه هي المرحلة التي يبدأ الكبد الزرد للتعبير عن انزيمات الكحول استقلاب 13 . 2٪ الإيثانول هو الجرعة القصوى التي اليرقات يمكن أن يتسامح 13 ، 14 . وتبدأ اليرقات المعالجة بالايثانول في إظهار الدهن الكبدي بمقدار 8 ساعات من العلاج، ونسبة اليرقات التي تتطور الدهن تستمر في الارتفاع حتى 24 ساعة من المعالجة المستمرة 14 . اليرقات الزرد تمتص المغذيات حصرا من صفار البيض حتى 120 هف. ولذلك، لا ينصح العلاج الإيثانول وراء 120 هف، لأن الصيام يمكن أن تسهم أيضا في الدهن 14 . مقارنة بالبروتوكولات المنشورة من قبل مختبر آخرالمختبرات 13 ، 24 ، والتعديل الرئيسي المحرز في البروتوكول الحالي هو أن يتم إجراء العلاج الإيثانول في منشأة الأسماك التي لديها 14 ساعة ضوء / 10 ساعة دورة مظلمة. وهذا يؤدي إلى استجابات أكثر اتساقا وأكثر قوة من ستيتوتيك من تلك التي ينظر إليها عند إجراء العلاج في الظلام في حاضنة. هذا قد تكون ذات صلة إلى حقيقة أن الجينات الأيضية الدهون في الكبد الزرد تظهر التعبير إيقاع اليومي ردا على ضوء / دورة الظلام 25 .
ألمد هو مرض مزمن ويستغرق سنوات من تعاطي الكحول. الحد الحاسم من بروتوكول العلاج الإيثانول الحالي هو أنه يؤدي فقط الآثار الحادة للكحول على الكبد. العلاج مع مثل هذا تركيز الإيثانول عالية لأكثر من 48 ساعة يسبب ارتفاع معدل الوفيات، ومنع دراسة إصابة الكبد المزمن. وجدت دراسة حديثة أن العلاج المستمر من الزرد الكبار مع 1٪ من الإيثانول لمدة تصل إلى ثلاثةأشهر أدت إلى الدهن، التهاب الكبد الدهني، والتليف 12 . يمكن أن يكون أحد الاتجاهات المستقبلية الواعدة هو تحديد مشكل محتمل من ألد باستخدام بروتوكول العلاج الإيثانول الحاد ومن ثم للتحقق من صحة تأثيره في نموذج الإصابة المزمنة.
يتم تنفيذ H & E تلطيخ لتقييم الأضرار الكبدية التي يسببها العلاج الإيثانول الحاد. نظرا لسهولة أداء التصوير مضان في الزرد، H & E تلطيخ لا يستخدم بشكل روتيني في الأنسجة الكبد الزرد، ويتم وصف الإجراء أقل جيدا. يوفر البروتوكول الحالي وصفا خطوة بخطوة من H & E تلطيخ في الكبد اليرقات. اختيار المثبت الصحيح هو الخطوة الأولى والأكثر أهمية ل H & E تلطيخ. على الرغم من أن 10٪ مخزنة الفورمالين و 4٪ بفا تستخدم عادة في الأنسجة، كلاهما يسبب انكماش الأنسجة وأجزاء من الكبد تسقط من القسم. 10٪ تثبيت الفورمالين يؤدي إلى فقدان السيتوبلازم في الكبدocytes. 4٪ بفا التثبيت النتائج في الفجوات الاصطناعية بين خلايا الكبد. يبدو يوسين تلطيخ أن يكون أضعف بكثير من تلطيخ الهيماتوكسيلين في الكبد التي يتم إصلاحها مع إما تثبيتي. هو مثبت ديتريش الحمضية التي هي أكثر ملاءمة ل H & E تلطيخ الكبد الزرد، كما أنه يحافظ على التفاصيل الخلوية ويقلل من الانكماش. ويبدو أيضا أن اختراق الأنسجة الدهنية، مثل الكبد، وأسرع من الفورمالين و بفا. تلطيخ مع الهيماتوكسيلين ويوزين هو أكثر توازنا. واحد التحذير من تثبيته ديتريش هو أنه غير متوافق لاستخراج الحمض النووي الجيني. في تجربة تجريبية، تم استخراج الحمض النووي الجيني من اليرقات التي تم إصلاحها باستخدام الفورمالين 10٪، 4٪ بفا، أو ديتريش تثبيتي 26 . تم تحضين اليرقات في 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 50 ملي في 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم تم تبريدها إلى 4 درجات مئوية. 5 ميكرولتر من 1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك، ثم أضيفت درجة الحموضة 8.0 لتحييد الحل الأساسي. بعد الطرد المركزي وجيزة، طاف ثكما هو مستخدم في ير. مع نفس الاشعال ير و ير البرنامج، الحمض النووي الجيني من كل من اليرقات الفورمالين و بفا الثابتة أسفرت عن منتجات ير مع الأحجام المتوقعة، في حين فشل الحمض النووي الجيني من اليرقات تثبيتي الثابتة ديتريش في تحقيق أي منتجات ير.
H & E تلطيخ يمكن أن تجري على كل من أقسام البارافين والأقسام المجمدة. ومع ذلك، أقسام البارافين لها المزايا التالية على أقسام المجمدة: 1) في حين أن أقسام البارافين يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى، لا يمكن إلا أن يتم تخزين أقسام المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة. 2) للأقسام المجمدة، وتشكيل بلورات الجليد داخل الخلايا قد يزعج مورفولوجيا الخلية والتفاصيل تحت الخلوية. وعلاوة على ذلك، والأجزاء المجمدة غالبا ما تكون أكثر سمكا من أقسام البارافين. وهذا يمكن أن يؤدي إلى صور سيئة من مورفولوجيا الأنسجة مقارنة تلك التي تنتجها أقسام البارافين.
عند إعداد كتل البارافين لأنسجة الكبد، والبروتوكول الحالييدمج اليرقات في الاغاروز. يتم وضع اليرقات أفقيا، مع الجانب الأيسر من الجسم التي تواجه أسفل والكذب مسطحة ضد الجزء السفلي من القالب. وهذا يضمن التوجه متسقة من الكبد، بحيث عندما يتم قطع المقاطع بالتتابع، يمكن مقارنة مناطق ما يعادلها من الكبد من الأسماك للأسماك 27 . خطوة رئيسية أخرى تضمن نجاح H & E تلطيخ هو تطوير اللون. فمن الأهمية بمكان للتحقق من تلطيخ في كثير من الأحيان حتى يتم التوصل إلى كثافة اللون المطلوب.
H & E تلطيخ ينبغي أن تستخدم للحصول على تقييم أولي لإصابة الكبد. اليرقات المعالجة بالإيثانول تظهر ترسب المفرط للقطرات المستديرة في خلايا الكبد، موحية من الدهن 13 ، 14 ، 18 . وضع العلامات مع الأصباغ الدهنية، مثل النفط الأحمر O والنيل الأحمر، ضروري للتأكد من أن هذه القطرات هي في الواقع الدهون. الأوعية الدموية الكبديةإلس في الحيوانات المعالجة تظهر متوسعة وتورم. وينبغي إجراء الفحص المجهري الإلكتروني والمجهر الإلكتروني انتقال لدراسة التغيرات التركيبية في الجيوب الأنفية. وقد ذكرت في وقت سابق أن خارج الخلية المصفوفة ترسب البروتين وزيادة في الكبد الزرد المعالجة بالإيثانول، كما كشفت عن طريق المناعي 18 . ومع ذلك، نظرا لأن مستويات التعبير من الجينات الليفية فقط زيادة متواضعة في الأسماك المعالجة 18 ، H & E قد لا تكون حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن مثل هذه كمية صغيرة من البروتينات المصفوفة خارج الخلية. تم اختبار نفس طرق تثبيط وتلطيخ على الكبد المزمن الزرد كبد مزمن وكانت كافية للكشف التليف (يين، بيانات غير منشورة).
على الرغم من أن البروتوكول الحالي هو مصممة لفحص الأنسجة الكبد في اليرقات الزرد، فإنه يحتوي على تطبيق أوسع للمجتمع البحوث الزرد، كما سامه بروتوكول يمكن تطبيقها على الأنسجة الأخرى والزرد الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور كاتي موراي في مركز الموارد الدولية الزرد؛ الدكتور ستاسي هوبرت وكاري هوبيرت في كشمك، للحصول على مشورة مفيدة بشأن البروتوكول؛ والخدمة البيطرية لشمك، لرعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R00AA020514 ومنحة بحثية من مركز علم الجينوم الأطفال في كشمك (إلى قبرصي). كما كان الدعم في جزء منه من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة P30 DK078392 (التكاملية مورفولوجيا الأساسية) من المركز الأساسي لبحوث أمراض الجهاز الهضمي في سينسيناتي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol (EtOH) | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
