Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

Abstract

מחלת כבד אלכוהולית (ALD) מתייחסת לנזק לכבד עקב שימוש חריף או חריף באלכוהול. זה בין הגורמים המובילים של תחלואה ותמותה הקשורים אלכוהול, משפיע על יותר מ -2 מיליון אנשים בארצות הברית. הבנה טובה יותר של המנגנונים הסלולר והמולקולריים העומדים מאחורי פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול היא הכרחית לפיתוח טיפול יעיל ל- ALD. זחלי דג הזברה התערוכה סטאטוזיס כבד ו fibrogenesis רק לאחר 24 שעות של חשיפה לאתנול 2%, מה שהופך אותם שימושי עבור מחקר של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול. עבודה זו מתארת ​​את ההליך לטיפול באתנול חריף בזחלי דג הזברה, ומראה כי היא גורמת להתפתחות סטטוזה ונפיחות של כלי הדם הכבד. פרוטוקול מפורט עבור Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים כי הוא מותאם לניתוח היסטולוגית של כבד הזחל דג הזברה, מתואר גם. מכתים H & E יש יתרונות ייחודיים מסוימים על ידי immunofluorescence, כפי שהוא מסמן את כל החייםתאים er ותאים תאיים בו זמנית והוא יכול בקלות לזהות פגיעה בכבד, כגון סטאטוזיס ו פיברוזיס. לאור השימוש הגובר של דג הזברה בדגימת רעלן הנגיף הנגרמת על ידי וירוס, כמו גם מחלות כבד בירושה, פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות לניתוח היסטולוגית שבוצעה בכל המחקרים הללו.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחלת כבד אלכוהולית (ALD), הנגרמת על ידי צריכת יתר של אלכוהול, היא הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה הקשורים לאלכוהול. בארצות הברית, כמעט מחצית ממקרי המוות של מחלת כבד כרוכים באלכוהול 1 , ו- ALD אחראי על כמעט 1 מתוך 3 השתלות כבד 2 . ALD יש ספקטרום רחב. סטאטוזיס, אשר מאופיין על ידי הצטברות שומנים עודף hepatocytes, מתרחשת בשלב מוקדם של שתייה כבדה והוא הפיך עם הפסקת השימוש באלכוהול. תחת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים צריכת אלכוהול מתמשך, סטאטוזיס כבד יכול להתקדם הפטיטיס אלכוהוליים, ובסופו של דבר, שחמת הכבד 3 . מחקרים באמצעות מודלים מכרסמים ALD סיפקו תובנות משמעותיות למחלה, אבל יש להם מגבלות (נבדק בהתייחסות 3 ). הזנה אוראלית של דיאטה אלכוהול גורם רק סטאטוזיס במכרסמים 4 , </ Sup> 5 . התפתחות של דלקת ו fibrosis דורש גם העלבון השני 6 , 7 או עירוי intragastric כרונית, אשר פולשנית מבחינה טכנית מאתגר 8 , 9 . דג הזברה Telost גם מפתחת פגיעה בכבד בתגובה לטיפול כרוני ו חריף אלכוהול 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . בפרט, דג הזברה הזחל מייצג אורגניזם מודל משלים מושך שבו ללמוד פגיעה חריפה בכבד אלכוהול 10 , 11 , 13 , 15 . הכבד דג הזברה הוא פונקציונלי מייצר אנזימים מפתח עבור מטבוליזם אתנול על ידי 4 ימיםשל הפריה (dpf) 13 , 16 , 17. אתנול ניתן להוסיף ישירות למים, וחשיפה לאתנול 2% במשך 24 שעות מספיקה כדי לגרום סטאטוז בכבד ותגובות fibrogenic בזחלים דג הזברה 13 , 15 .

זה כבר דווח כי הטיפול עם אתנול 2% במשך 24 שעות הביאה ריכוז אתנול רקמות של 80 מ"מ זחלים דג הזברה 13 . אחרים הראו כי הזחלים לסבול ריכוז זה פנוטיפים הכבד לראות את החיות המטופלים ספציפיים לחשיפה אתנול 11 , 13 , 15 , 18 . עם זאת, בגלל 80 מ"מ הוא כמעט קטלני בבני אדם 19 , חשוב להעריך את היסטולוגיה הכבד של דג הזברה שטופלו אתנול ו deteRmine הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם.

התפתחות חיצונית מהירה שקיפות של הזחלים דג הזברה מאפשרים לאפיין את הפעולה של אלכוהול בתוך הכבד בזמן אמת דגימות קבוע. הזמינות של תאים מסוג ספציפי קווי ניאון מהונדס ההתקדמות האחרונות מיקרוסקופיה confocal להקל על המחקר של כמה סוגים שונים של תאים בכבד לשנות את המורפולוגיה שלהם והתנהגות בתגובה לטיפול אתנול חריפה 11 , 15 . עם זאת, הדמיה confocal של דג הזברה מהונדס פלואורסצנטי לא יכול להחליף לחלוטין Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים בעת לימוד היסטולוגיה הכבד. סימון כל סוגי תאי הכבד באותו זמן באמצעות דג הזברה מהונדס דורש את הדור של קווים מהונדס הפרט, כל תיוג אחד סוג תא הכבד עם fluorophore ייחודי. הצגת רקע מהונדס שונה לתוך אותו דג דורש breedinG דורות מרובים, וזה זמן רב ויקר. מכתים immunofluorescence נוספים יש צורך לזהות רכיבים מטריקס תאיים. H & E מכתים, לעומת זאת, בו זמנית תוויות כל סוגי תאי הכבד ורכיבים מטריקס תאיים, ובכך לספק סקירה של הכבד 20 . יתר על כן, הוא מגלה בקלות כמה תכונות histopathological של מחלות כבד, כגון מוות hepatocyte, סטאטוזיס, ו פיברוזיס. למרות H & E הוא כתם שגרתית היסטולוגיה כבד יונקים, זה לא נפוץ במחקר כבד דג הזברה, והפרוטוקול הוא הקים פחות טוב.

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לטיפול אתנול חריפה הזחלים דג הזברה עבור מעקב אחר היסטולוגית עם מכתים H & E מכתים. פרוטוקול H & E מכתים ניתן להשתמש בכל המחקרים של התפתחות הכבד ואת הפונקציה. יתר על כן, חלקים פרפין יכול לשמש אימונוהיסטוכימיה, כמו גם עבור sta מיוחד אחרIn פתולוגיה של הכבד, כולל כתם trichrome, כתם reticulin, וכו ' .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AB WT מבוגר הזברה דג הזברה נשמרו בתנאים סטנדרטיים 21 בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (מכוני הבריאות הלאומיים פרסום 86-23, מתוקן 1985); השימוש בהם אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש בבית החולים לילדים Cincinnati החולים הרפואי (CCHMC).

1. הכנת פתרונות

  1. הכן מים ביצה.
    1. הכן את פתרון מלח המניות על ידי המסת 40 גרם של מלח ים מסחרי ב 1 L של מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O). מערבבים עד מלחים כל נמסה לחלוטין.
    2. הכן 0.1% מתילן כחול פתרון על ידי הוספת 0.1 גרם של אבקה ל 100 מ"ל של DDH 2 O.
      זהירות: מתילן כחול הוא מגרה אם זה בא במגע עם העיניים או העור. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות בעת הטיפול אבקה.
    3. שלב 28.125 מ"ל של מלח מלח כל כךLution ו 7 מ"ל של תמיסת כחול מתילן בצינור 50 מ"ל חרוטי. לערבב היטב. הוסף תערובת זו ל 15 L של DDH 2 O. לנער היטב ולאחסן ב RT.
  2. הכן 100 מ"ל של 1 M Tris-HCl ידי הוספת 12.1 גרם של אבקת Tris ל 100 מ"ל של DDH 2 O. התאם את ה- pH 9.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl).
    זהירות: HCl עלול לגרום לכוויות חמורות ולגירוי של קרום רירי אם הוא שואף. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות ולטפל בבקבוק במכסה כימי.
  3. הכן 0.4% tricaine (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate) פתרון.
    1. ממיסים 2 גרם של אבקת tricaine ב 489.5 מ"ל של DDH 2 O. הוסף 10.5 מ"ל של פתרון Tris-HCl, pH 9. מערבבים עם מערבל עד שכל האבקה נמסה. התאם ל- pH 7.0.
      זהירות: אבקת טריקאין יכולה להיות מגרה בדרכי הנשימה. תמיד ללבוש מסכת אבק בעת הטיפול אבקה.
    2. Aliquot 45 מ"ל של הפתרון tricaine לתוך צינורות 50 מ"ל חרוטי. שמור על הפיתרוןN ב 4 ° C לשימוש מיידי ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
  4. הכן מקבע של דיטריך על ידי שילוב של 30 מ"ל של אתנול 95%, 10 מ"ל של פורמלדהיד 37%, 2 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, ו 58 מ"ל של DDH 2 O בבקבוק זכוכית זכוכית. מערבבים היטב על ידי swirling ו לאחסן ב RT.
    זהירות: פורמלדהיד הוא חשוד מסרטן, וכל פתרון עם פורמלדהיד יש להשתמש במכסה כימי. חומצה אצטית קרחונית עלולה לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק בעין. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות ולטפל פתרון המניות במכסה כימי. פורמלדהיד, חומצה אצטית קרחונית, ואתנול 95% הם כל נוזלים דליקים ויש לאחסן בארון דליק המיועד.
    הערה: מקבע Dietrich הוא יציב ב- RT במשך שנה אחת.
  5. הכן 1 ליטר של 10x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) על ידי הוספת 80 גרם של נתרן כלורי (NaCl), 2 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 14.4 גרם של פוספט דיודיום (Na 2 HPO 4 ), ו 2.4 גרם של פוספט monopotassium (KH 2 PO 4 ) ל 800 מ"ל של DDH 2 O. התאם ל pH 7.4 באמצעות hydroxide נתרן (NaOH) ולהוסיף DDH 2 O ל 1 L נפח סופי. חנות פתרון זה ב RT לאחר מעוקר על מחזור נוזלי כי טיהור דקות 1 ו דגירות על 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  6. הפוך 1 L של 1x PBS ידי דילול 100 מ"ל של פתרון 10x PBS 900 מ"ל של DDH 2 O. מערבבים היטב על ידי רעד ולאחסן ב- RT לאחר מעוקר.
  7. הכן agarose 3% בבקבוק זכוכית זכוכית עבור העובר הרכבה.
    1. הוסף 3 גרם של agarose ל 100 מ"ל של DDH 2 O ומערבבים על ידי מתערבל. מחממים את התערובת על ידי microaving כדי לפזר את agarose, ולצפות בזהירות במהלך חימום על מנת להבטיח כי יש רתיחה מינימלית.
      זהירות: הבקבוק עשוי להיות חם בעת הסרתו מהמיקרוגל, למרות חימום קצר. השתמש כפפה מגן או כפפה כדי להסיר את הבקבוק מן המיקרוגל.
    2. מוציאים את הבקבוק מהמיקרוגל.בעוד מתערבל בעדינות, לחפש כל גבישים כי הם לא מומס לחלוטין; אם אין גבישים, הפתרון מוכן לשימוש. אחסן את agarose 3% ב RT וחום שוב לפני השימוש.
  8. סינון האריס hematoxylin פתרון המניות כדי להסיר את כל מוצקים כי יש זירז.
    1. מקפלים מסנן קפה לחצי כך המסנן יוצר קונוס. פתח את הלוח הצדדי כך הנוזל פועל דרך המסנן, ומאפשר כל פסולת להיתפס.
    2. מניחים את המסנן בתוך משפך ואת משפך לתוך בקבוק זכוכית זכוכית. בהדרגה לשפוך את hematoxylin המניות דרך המסנן.
      זהירות: Hematoxylin הוא מסוכן במקרה של מגע עין, בליעה, ושאיפה. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות ולטפל פתרון המניות במכסה כימי.
  9. הכן HCL 0.05% על ידי הוספת 125 μL של 12 N HCL ל 250 מ"ל של DDH 2 O.
  10. הכן eosin Y- פלוקסין תערובת פתרון B על ידי שילוב של 25 מ"ל של 1% האוזן Y (aq), 2.5 מ"ל של 1% ploxine B (aq), 195 מ"ל של אתנול 95%, ו 1 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני בבקבוק זכוכית. מערבבים היטב על ידי swirling ו לאחסן ב RT
    זהירות: Eosin Y מסוכנת במקרה של מגע עין, בליעה ושאיפה. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות ולטפל פתרון המניות במכסה כימי.
  11. הכן 2% אתנול ידי הוספת 2 מ"ל של אלכוהול אתילי טהור ל 98 מ"ל של מי ביצים.
    זהירות: אלכוהול אתילי הוא מגרה בעין. תמיד ללבוש ציוד מגן נאות בעת טיפול באלכוהול אתילי. הוא גם דליק ויש לטפל בו ולאחסן אותו בהתאם.
    הערה: הכן אתנול טרי של 2% בכל פעם לפני ביצוע הטיפול באתנול חריפה.

2. לבצע אתנול חריפה טיפול זחלים דג הזברה

  1. כדי ליצור עוברים, להקים צלבים עם זכר אחד wildtype ודג נקבה WT אחד לכל טנק ההזדווגות. הפרד אותם על ידי הוספת מחיצת פלסטיק במיכל ההזדווגות.
    הערה: הגדרלמעלה צלבים לאחר האכלה הסופי של היום, כך דגים מוזנים היטב.
    1. בשמונה בבוקר למחרת, משוך את המחיצה כדי לאפשר לצמד להזדווג.
    2. לאחר שעה, החזירו את הדגים למכל המקורי. איסוף העוברים על ידי שפכו את המים המכילים את העוברים לתוך מסננת. הפעל את מסננת מעל צלחת פטרי 100 מ"מ לשטוף את העוברים לתוך המנה באמצעות בקבוק לשטוף המכיל מים ביצה. מניחים את המנה עם העוברים באינקובטור ב 28 ° C.
    3. כאשר עוברים להגיע לפחות שלב 4 תאים (1 hpf), להסיר את כל עוברי unfertilized ופסולת במים עם פיפטה פסטר ומניחים את המנה עם עוברים מופרות בחממה ב 28 ° C. שמור את העוברים בחממה ב 28 ° C עד 96 שעות לאחר ההפריה.
    4. להרדים את הזחל דגים על ידי הוספת פתרון tricaine למים ביצה על יחס 1-10 (נפח / נפח).
    5. בחר עד ארבעים 96 זחלים hpf שיש להם שלפוחית ​​השתן inflated שימושפיפטה פסטר ו לפצל אותם באופן שווה לתוך שתי מנות פטרי חדש.
    6. להוציא כמו מים ביצה שיורית ככל האפשר. בצפיפות של זחל אחד לכל מ"ל, מוסיפים מים ביצה המכיל אתנול 2% למנה אחת. מוסיפים את אותה כמות של ביצים מים לתבשיל השני כדי לשמש את השליטה.
    7. שמור על בקרת הזחלים אתנול טיפול בחדר דגים במשך 24 שעות.
      הערה: ביצוע טיפול אתנול בחדר דגים עם מחזור של 14 שעות אור / 10 שעות כהה גורם לפגיעה עקבית וחזקה יותר בכבד מאשר ביצוע הניסוי בחושך באינקובטור.
    8. לאסוף את הזחלים בצינור 1.5 צנטריפוגה מ"ל עם לא יותר מ 20 זחלים לכל צינור.
    9. הסר נוזלים ככל האפשר מן הזחלים ולהוסיף לפחות 1 מ"ל (נפח רקמות 10x) של מקבע דיטריך בכיפה כימית. אפשר לדגים לתקן על nutator בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות.
      הערה: דגים הם יציבים מקבע של דיטריך במשך כמה שבועות.
<P class = "jove_title"> 3. הכנת קלטות ועיבוד רקמות

  1. קבע את המספר הדרוש של קלטות רקמה ושתי כריות ביופסיה כחול לכל קלטת. מקום אחד ביופסיה כרית בתחתית של כל קלטת. תווית כל קלטת בעיפרון, ברור לזהות את המדגם.
    הערה: אל תשתמש בעט או בסמן כדי לסמן את הקלטות, מכיוון שהתווית תאבד בשלבים מאוחרים יותר.
  2. הטמיעו את הזחלים ב agarose 3% כדי להבטיח את האוריינטציה עקבית של כל הדגימות.
    1. הסר את מקבע מן צינורות ברדס כימי לשטוף את הזחלים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של 1x PBS. מניחים את צינורות על nutator ב RT במהלך שוטף.
    2. במהלך שוטף, לחמם את agarose מוכן 3% במים באמצעות מיקרוגל להמיס את מוצק. מחממים 30 שניות בכל פעם ולצפות בזהירות כדי למזער רותחים. שמור על agarose נוזלי על צלחת חמה מוגדר 90 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.
    3. באמצעות פיפטה העברת, להעביר עד 8 lArvae כדי עובש היסטולוגיה פלסטיק ולהסיר כמה PBS ככל האפשר. באמצעות פיפטה העברת עם קצה לחתוך, לגמרי למלא את התבנית עם agarose 3%.
    4. באמצעות מזרק אינסולין, לאסוף את הזחלים למרכז התבנית לדחוף אותם לתחתית. עבור סעיפים sagittal, למקם את הזחלים בשורה, עם הראש לכיוון החלק העליון של התבנית. כדי להבטיח כי כבדים מכוונים באופן עקבי, להפוך את הזחלים כך בצד שמאל של הגוף הוא פונה כלפי מטה שטוח על החלק התחתון של התבנית.
      הערה: מכיוון שהכבד ממוקם בצד שמאל של הגוף, מיקום זה ממזער את מספר הסעיפים שצריך לחתוך לפני שהגיע לכבד. שמור את הזחלים קרוב ככל האפשר זה לזה.
    5. הגדר את התבנית בצד במשך 4-5 דקות כדי לאפשר agarose להגדיר לחלוטין. הסר את בלוק agarose מן התבנית ולהשתמש סכין גילוח לקצץ agarose סביב הזחלים. לעמוד את הבלוק על קצה לחתוך את עובי במחצית sO כי הגוש הסופי הוא בערך 2-3 מ"מ עובי.
    6. מעבירים את בלוק agarose קטנה כדי קלטת רקמה מוכן (שלב 3.1) ומניחים את לוח הביופסיה השני על גבי הבלוק. סגור את קלטת ומניחים את קלטת התאספו במלואו לתוך מיכל sealable עם אתנול 70% מוכן טרי dDH2O.
      הערה: אם קלטות הם לא הולכים להיות מעובד מיד, במקום אותם באתנול 70% במיכל ב 4 ° C, כדי למנוע אובדן של קיבעון. קלטות יציבים על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.
  3. עיבוד רקמות
    הערה: דוגמאות ניתן להגיש למעבדה היסטולוגיה או פתולוגיה מצויד במעבד רקמות לעיבוד קלטות פרפין. בקשה תקן O / N עיבוד התוכנית ולא תוכנית קצרה, כך פרפין יכול לחדור באופן מלא agarose.
    1. תהליך קלטות רקמה על ידי העברת אותם באמצעות סדרה דילול של אתנול, עם כמות הולכת וגדלה של אלכוהול, כדילייבש את הרקמה, כדלקמן: 70% אתנול 2 פעמים, 45 דקות כל אחד; 80% אתנול, 45 דקות; 95% אתנול, 2 פעמים, 45 דקות כל אחד; 100% אתנול, 2 פעמים, 45 דקות כל אחד.
    2. החלף את האלכוהול עם ממס (100% xylene, 2 פעמים, 45 דקות כל אחד) על מנת פרפין לחדור את הרקמה.
      זהירות: קסילן הוא מגרה והוא מזיק אם בשאיפה. הקפד תמיד להשתמש ברדס כימי. קסילן הוא דליק ויש לאחסן בהתאם.
    3. דגירה הקלטות פרפין O / N באינקובטור ב 60-65 מעלות צלזיוס. שמור את הקלטות חם עד הטבעה.
  4. הטמע את בלוקים agarose מעובד לתוך פרפין.
    1. מוציאים קלטת אחת ממגירת ההתחממות של מכונת הטבעת ומורידים את מכסה הקלטת ואת פנקס הביופסיה העליון מהקלטת. ממלאים עובש היסטולוגיה עם פרפין נוזלי ולשמור אותו על צלחת חמה על מכונת הטבעה.
    2. בעזרת מלקחיים חמים, להרים את הבלוק agarose מן הקאסטדואר ולהעביר אותו עובש היסטולוגיה עם פרפין. ודא כי בצד של בלוק agarose עם הדג הקרוב ביותר למשטח הוא פונה כלפי מטה. לזרוק את משטח הביופסיה התחתון ולהעביר את כל עובש היסטולוגיה לצלחת מגניב על מכונת הטבעה.
    3. בעזרת מלקחיים, במהירות למקם את הבלוק agarose במרכז התבנית; במקום את גוש בחלק התחתון של התבנית. לאחר הבלוק ממוקם כראוי, לשים את החלק התחתון של הקלטת על גבי עובש היסטולוגיה ולמלא אותו באמצע הדרך עם פרפין נוזלי. מניחים את התבנית ישירות על צלחת 4 ° C לא להפריע את אבני לפחות 10-15 דקות כדי לאפשר את הפרפין כדי לחזק. כאשר הבלוק הראשון הוא הגדרת, חזור על תהליך זה עבור בלוקים הנותרים.
    4. לאחר פרפין מוגדר עבור כל הבלוקים, להסיר את עובש היסטולוגיה מן הבלוק פרפין ידי לחיצה בעדינות על התבנית כדי לשחרר אותו. בלוקים אלה פרפין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.
  5. 4. חתך של בלוקים פרפין

    1. יום לפני החתך, בפנים-בלוק פרפין באמצעות microtome להסיר פרפין עודף מכסה את הרקמה. סעיף 5 מיקרומטר בכל פעם עד הרקמה נחשפת על פני השטח של בלוק פרפין. עצור וזורק את כל החלקים שנחתכים. משרים את אבני מול מטה 1x PBS ב 4 ° CO / N.
      הערה: בלוקים צריך להיות ספוג לפחות 8 שעות. להתחיל את השריית בסוף היום. אם חוסמים נותרים PBS 1x זמן רב מדי, הרקמה יכולה להתנפח ולהיות מעוות.
    2. הסר בלוק אחד בכל פעם מן PBS 1x ו לחתוך 5 מיקרומטר סעיפים באמצעות microtome. הפרד את הסרט של חלקים מהלהב על ידי משיכת בעדינות את הקטע האחרון מן הלהב באמצעות מלקחיים או מברשת. להרים את הסרט על ידי החלק האחרון באמצעות מלקחיים ולהעביר אותו לאמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס. אפשר לסרטים לצוף על פני המים לפחות 5 דקות.
      הערה: WheN העברת חלקים, לא נותנים את המלקחיים לגעת במים תוך כדי מגע עם פרפין. אחרת, הפרפין יתמוסס על המלקחיים ויעשה הפרדה קשה מאוד. במידת הצורך, להקניט את הקטעים לקבוצות קטנות באמצעות מלקחיים נקיים, כך שהם יכולים בקלות להתאים את השקופיות. בעדינות לגעת התפר בין חלקים כדי ליצור הפרדה ללא נזק.
    3. שים שקופית טעונה לתוך המים בזווית של 45 מעלות בזהירות להציב אותו מתחת לקבוצה של סעיפים כדי לאסוף. בזהירות הרם את השקופית מהמים ולאפשר את החלקים לצרף את השקופית.
    4. כתם כל עודף מים מן הסעיפים באמצעות רקמות ללא מוך. הצב את השקף בשקופית או בתיבה. המשך קטע את הבלוק עד הרקמה הרצויה נאסף. חזור על תהליך החתירה עבור כל הבלוקים.
    5. אופים את השקופיות ב 55 מעלות צלזיוס חממה או תנור במשך 3-16 שעות כדי להמיס את הפרפין. הסר את השקופיות מהתנור ולאפשר להםO מגניב לפני תחילת מכתים.
      הערה: חלקים פרפין ניתן לאחסן ב RT ללא הגבלת זמן, הן לפני ואחרי אפייה.

    5. Hematoxylin ו Eosin מכתים של פרפין חלקים

    1. Deparaffinize את השקופיות על ידי טבילה אותם 100% קסילן במשך 15 דקות; לשנות את זה 100% קסילן טרי עבור עוד 15 דקות.
    2. Rehydrate את השקופיות על ידי טבילה אותם באמצעות הסדרה הבאה של אתנול מדורגים עד הנוזל פועל בצורה נקייה את השקופיות. עבור כל פתרון, לטבול 8-10 פעמים, 2 s לכל לטבול: אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, אתנול 50%, אתנול 30%, ומים דיוניזיים.
      הערה: פרוטוקול ניתן לעצור כאן, ואת השקופיות ניתן להשאיר ב RT במים במשך מספר שעות. במידת הצורך, השקופיות ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס במים O / N.
    3. מניחים את השקופיות ב 100% מסוננים האריס hematoxylin במשך 4 דקות. מיד להעביר אותם בחזרה עם מיכל עם מים deionized. הפעל מים deionized לתוך tהוא בפינה האחורית של המכולה המרוחקת ביותר מן הסעיפים. רוקן את מיכל מעת לעת עד המים כבר לא סגול.
      הערה: אל תתנו למים לפעול ישירות על השקופיות, מכיוון שהקטעים עשויים לצאת מהשקופיות.
    4. לבדוק במהירות את עוצמת hematoxylin על מיקרוסקופ לנתח באמצעות אורות gooseneck; אל תאפשר לשקעים להתייבש. אם הכתם הגיע לעוצמה הרצויה, המשך לשלב הבא. אם הצבע אינו כהה מספיק, במקום שקופיות ב hematoxylin 100% למשך 1 דקות וחזור על המים שוטף לפני בדיקה נוספת.
      הערה: hematoxylin צריך להיות כהה מספיק, כך צבע לא איבד במהלך מכתים eosin. עם זאת, אם מכתים hematoxylin נראה בציטופלזמה, המדורים הם overstained.
    5. טובלים את השקופיות פעמיים 0.05% HCl ומיד להעביר אותם בחזרה במיכל עם מים נקיים deionized. רוקן את המים וממלא את המיכל במים פעמיים.
    6. מעבירים את השקופיות ל 95% etHanol עבור 30 s ולאחר מכן להעביר אותם מיכל חדש עם אתנול 95% עבור 30 s.
    7. מניחים את השקופיות לתוך eosin Y- פלוקסין פתרון B במשך 2 דקות. מעבירים את השקופיות בחזרה למיכל הקודם 95% אתנול במהירות לבדוק את עוצמת הצבע תחת מיקרוסקופ לנתח. אם מכתים מספיק, המשך לשלב הבא. אם לא, לחזור לפתרון eosin עבור 30 s, לבדוק שוב, וחזור לפי הצורך.
      הערה: מכתים eosin מספיק הוא ורוד בהיר מופיע בניגוד מובהק הכתם hematoxylin. הקפד לנגב כל פתרון מן החלק האחורי של השקופיות בעת בדיקה מתחת למיקרוסקופ, כך שלא נצפה צבע שקר. בגלל eosin מורכב של אתנול 95%, תקופות ממושכות של זמן באתנול 95% תוך בדיקת עוצמת הצבע עשוי ליץ החוצה חלק מן הצבע.
    8. מעבירים את השקופיות ל isopropanol 100% עבור 15 s. החלף עם isopropanol טרי 100% ומניחים את השקופיות בחזרה ב isopropanol עוד 15 s. חזור על זה pRocess עבור סך של 6 איסופרונול שוטף.
      זהירות: איזופרונול הוא עין ו irritant הנשימה. הקפידו תמיד ללבוש ציוד מגן מתאים ולמנוע התזה. היא גם דליקה מאוד ויש לאחסן ולטפל בהתאם.
      הערה: כדי לשמור על ריאגנטים, להשליך רק את הראשון (ורוד) איזופרונול לשטוף. שמור את שאר חמישה פתרונות לשטוף בבקבוקים ממוספרים 1 עד 5, כדי לעשות בה שימוש חוזר עבור מכתים הבא. בעת שימוש חוזר בשטיפות, התחילו בבקבוק המצוין "1" וזורקים לאחר השימוש. פעם לשטוף "2" כבר בשימוש, לשפוך אותו לתוך בקבוק "1", וכן הלאה. לשטוף הסופי צריך תמיד להיות איזופרונול טרי.
    9. מניחים את השקופיות ב xylenes 100% במשך 3 דקות. הסר שקופית אחת בכל פעם ומכניסים coverslip.
      1. הוסף בינוני הרכבה מספיק כדי לכסות את הסעיפים ולטבול אותם 100% xylene.
        הערה: שלב זה יחליק את פני השטח של המדיום המתלה ויסיר את כל הבועות.
      2. החל coverslipלחלק התחתון של השקופית.
        הערה: מדיום ההרכבה צריך למשוך את השקופית למצב. אם coverslip הוא לא ישר או יושב לגמרי, בעדינות הקש אותו למקום.
      3. כתם כל המדיום גובר על מגבת נייר עד רק קו דק נראה. טובלים רקמות לנגב לתוך קסילן ולנגב את החלק האחורי של השקופית כדי להסיר כל מדיום כי יש טפטוף. מניחים את השקופית שטוחה על משטח יציב אבל נייד, כמו חתיכת קרטון. Coverslip כל שאר שקופיות באותו אופן. אפשר את קסילן להתאדות במכסה המנוע למשך 10 דקות.
        הערה: יש להסיר כל חומר מזוהם בקסילן ולהשליכו במיכל אטום במכסה המנוע, כדי למנוע אדים מלהימלט.
    10. אפשר המדיום הרכבה להקשיח ב RT O / N.

    6. הדמיה ואחסון של שקופיות מוכתמות

    1. מקטעי תמונה על מיקרוסקופ הפוך הפוכה 18 .
      הערה: שקופיות ניתן לשמור על te החדרMperature ללא הגבלת זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

10% שנאגרו פורמלין ו paraformaldehyde 4% (PFA) הם שניים של fixatives הנפוצים ביותר המשמשים פרקטיקות היסטולוגיה. עם זאת, הם לא נותנים תוצאות קיבעון אופטימלי עבור דג הזברה דג הזברה ( איור 1 ו 1 טבלה ). קיבוע עם פורמולין 10% או 4% PFA לעיתים קרובות התוצאות התכווצויות, יצירת פערים גדולים בין הכבד לבין הרקמות הסובבות ( איור 1A , B , איור 1B מספק דוגמה של התכווצות רקמות). חלקים של רקמת הכבד עשויים גם ליפול מן הקטע. הציטופלסמה של hepatocytes הוא איבד לעתים קרובות ( איור 1 א , 1B ). שני fixatives יכול לגרום עיוות של hepatocytes, כפי שהם גם להתכווץ או להתנפח כבר לא לשמור על מורפולוגיה עמודה כי הוא אופייני עבור תאים אפיתל. בעיה נוספת עם קיבוע PFA הואכי ישנם רווחים בין hepatocytes שאינם אמיתיים, אשר לגרום הרקמה להיראות שבורה ( איור 1 ב ). יתר על כן, כאשר אחד משני אלה מקבע משמש, hepatocytes מוכתמים היטב עם hematoxylin, אבל פחות עם eosin ( איור 1 א ). מבוססי חומצה דיטריך של מקבע מתגבר על בעיות עם פורמטים פורמלין ו PFA ( איור 1 ג ).

ב- ALD האדם, סטיאטוזיס, המורכב משומן של טיפות קטנות וגדולות, בולט במיוחד ליד הווריד המרכזי, ומשתרע כלפי חוץ אל משולש הפורטל עם החומרה הגוברת 22 . ב דג הזברה, טיפול עם 2% אתנול מ 96-120 hpf גם גורם סטאטוזיס בכבד, אשר מעורבים על ידי בתצהיר מוגזם של טיפות עגולות ב hepatocytes ( איור 2 ב , חצים). עם זאת, טיפות לא התערוכהTa דפוס הפצה דומה כפי שנראה ALD האדם, כי אין הבחנה ברורה של הפורטל ו ורידים מרכזיים של כבד דג הזברה 23 . הכבד כלי הדם בכבד הזחל אתנול נפוחים לעומת אלה בכבד שליטה ( איור 2 ב , כוכביות).

איור 1
איור 1 : השוואות של מכתים H & E בכבד של הזחלים דג הזברה שהיו קבועים עם Fixatives דיפרנציאלי ב 120 hpf. ( א ) 10% Formalin ב RT O / N; ( ב ) 4% PFA ב 4 ° CO / N; ( ג ) מקבע דיטריך ב RT במשך 24 שעות. עם 10% פורמלין, hepatocytes לעיתים קרובות לאבד ציטופלסמה שלהם (א). הרקמה אינה מוכתמת כראוי עם eosin ונראה סגול. לאחר תיקוןעם 4% PFA, פערים נראים בין hepatocytes (B). 4% PFA גורם לרקמת הכבד להתכווץ, כך נראה שיש פער גדול בין הכבד לבין הרקמות הסובבות. קו מקווקו ב מסמן את הגבול של הרקמות הסובבות. מקבע דיטריך מספק את התוצאה האופטימלית בין שלושת (C). סולם בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 : טיפול אתנול חריף גורם סטאטוזיס בכבד כלי דם נפיחות בכבד הזחל דג הזברה. ( א ) מכתים H & E של הכבד בשליטה, ללא טיפול, זחל WT. ( ב ) מכתים H & E של הכבד זחל סוג wil כי טופל עם אתא 2%Nol מ 96 - 120 hpf. שני בעלי החיים היו קבועים עם מקבע דיטריך ב 120 hpf. חיצים ב (ב) הצבע על hepatocytes עם בתצהיר מוגזם של טיפות עגולות. כוכביות לסמן את כלי הדם נפוחים בכבד. סולם בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

10% פורמלין 4% PFA מקבע של דיטריך
תנאי קיבוע לפחות 24 שעות ב RT 3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C לפחות 24 שעות ב RT
דוגמה אחסון קיבוע פירסום ללא הגבלה ב- RT עד 2 שבועות ב 4 ° C עד 2 חודשים ב RT
Compatibעם מיצוי DNA גנומי כן כן לא
הצטמקות כן כן מִינִימוּם
עיוות של תאים כן כן מִינִימוּם
אובדן פרטים סלולריים כן צָנוּעַ מִינִימוּם
כתם מאוזן כתם eosin חלש כתם eosin חלש כן
תאימות עם אימונוהיסטוכימיה כן כן כן

טבלה 1: השוואות של פורמלין 10%, 4% PFA, ו Fixatives של דיסטריך עבור היסטולוגיה הכבד דג הזברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך מפורט לטיפול אתנול חריף זחלי דג הזברה ואת ניתוחים histopathological שלאחר מכן עם מכתים H & E. טיפול אתנול חריף צריך להתבצע לא לפני 96 שעות לאחר ההפריה, שכן זהו השלב שבו הכבד דג הזברה מתחיל להביע אנזימים מטבוליזם אלכוהול 13 . 2% אתנול הוא המינון המקסימלי כי הזחלים יכולים לסבול 13 , 14 . הזחלים שטופלו באתנול מתחילים להראות סטאטוזיס בכבד ב -8 שעות של טיפול, ואחוזי הזחלים המתפתחים ממשיכים לעלות עד 24 שעות של טיפול מתמשך 14 . הזחלים דג הזברה לספוג חומרים מזינים באופן בלעדי החלמון עד 120 hpf. לכן, טיפול ethanol מעבר 120 hpf לא מומלץ, כי צום יכול גם לתרום steatosis 14 . לעומת פרוטוקולים שפורסמו על ידי מעבדה אחרתאופטורים 13 , 24 , השינוי העיקרי שנעשה בפרוטוקול הנוכחי הוא כי הטיפול באתנול מתנהל במתקן דגים, כי יש 14 שעות אור / 10 שעות מחזור כהה. התוצאה היא תגובות סטאטוטיות עקביות וחזקות יותר מאלה שנראות כאשר הטיפול מתבצע בחושך באינקובטור. זה עשוי להיות קשור לעובדה כי השומנים המטבוליים שומנים בדם דג הזברה להראות ביטוי קצב יומי בתגובה למחזור האור / כהה 25 .

ALD היא מחלה כרונית ולוקח שנים של התעללות באלכוהול. הגבלה קריטית של פרוטוקול הטיפול האתנול הנוכחי הוא שזה רק מעורר את ההשפעות החריפות של אלכוהול על הכבד. טיפול בריכוז אתנול גבוה יותר מ -48 שעות גורם לתמותה גבוהה, המונעת את חקר הפגיעה בכבד כרונית. מחקר שנערך לאחרונה מצא כי טיפול מתמשך של דג הזברה מבוגר עם אתנול 1% עד שלושהחודשים הובילו סטיאטוזיס, statushepatitis, ו פיברוזיס 12 . כיוון אחד מבטיח בעתיד יכול להיות לזהות אפנן פוטנציאלי של ALD באמצעות פרוטוקול טיפול אתנול חריפה ולאחר מכן לאמת את השפעתה על מודל הפגיעה הכרונית.

מכתים H & E מבוצעת כדי להעריך את הנזקים hepatocellular כי הם המושרה על ידי טיפול אתנול חריפה. בשל הקלות בביצוע הדמיה פלואורסצנטי דג הזברה, מכתים H & E אינו משמש באופן שגרתי היסטולוגיה כבד דג הזברה, ואת ההליך הוא תיאר פחות טוב. הפרוטוקול הנוכחי מספק צעד אחר צעד תיאור של מכתים H & E בכבד הזחל. בחירת מקבע הנכון הוא הצעד הראשון החיוני ביותר עבור מכתים H & E. למרות 10% שנאגרו פורמלין ו 4% PFA משמשים בדרך כלל היסטולוגיה, שניהם לגרום התכווצות רקמות וחלקים של הכבד נופל מחוץ לסעיף. קיבעון פורמלי של 10% מוביל לאובדן הציטופלסמה בכבדOcytes. 4% קיבוע PFA תוצאות פערים מלאכותיים בין hepatocytes. מכתים Eosin נראה להיות חלש הרבה יותר מכתים hematoxylin בכבד כי הם קבועים עם מקבע או. חומצה מבוססת Dietrich של מקבע הוא מתאים יותר מכתים H & E של דג הזברה, כפי שהוא משמר פרטים הסלולר וממזער הצטמקות. זה גם נראה לחדור רקמת שומן, כגון הכבד, מהר יותר פורמלין ו- PFA. מכתים עם hematoxylin ו eosin מאוזן יותר. אחד האזהרות של המקבע של דיטריך הוא שהוא אינו תואם להפקת דנ"א גנומי. בניסוי ניסוי, DNA גנומי נלקח מן הזחלים שנקבעו באמצעות פורמלין 10%, PFA 4%, או מקבע של דיטריך 26 . הזחלים הודגרו μL 50 של NaOH 50 מ"מ ב 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ו היו מקורר אז 4 מעלות צלזיוס. 5 μL של 1 M Tris-HCl, pH 8.0 נוספו אז כדי לנטרל את הפתרון הבסיסי. לאחר צנטריפוגה קצרה, supernatant wכמו בשימוש PCR. עם אותם פריימרים PCR ו- PCR התוכנית, הדנ"א הגנומי משני פורמלין ו- PFA קבוע הזחלים הניב מוצרים PCR עם הגדלים הצפוי, ואילו הדנ"א הגנומי מן קבועה דיטריך של קבועים הזחלים לא הניבה כל מוצרי ה- PCR.

מכתים H & E יכול להתבצע על שני פרפין חלקים קטעים קפואים. עם זאת, חלקים פרפין יש את היתרונות הבאים על פני חלקים קפואים: 1) ואילו חלקים פרפין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן, קטעים קפואים ניתן לאחסן רק ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה. 2) עבור מקטעים קפואים, היווצרות של גבישי קרח בתוך התאים עלול להפריע מורפולוגיה התא פרט subcellular. יתר על כן, חלקים קפואים הם לעתים קרובות עבה יותר חלקים פרפין. זה יכול לגרום לתמונות עניים של מורפולוגיה רקמות לעומת אלה המיוצרים סעיפים פרפין.

בעת הכנת בלוקים פרפין עבור רקמות הכבד, הפרוטוקול הנוכחימטביע את הזחלים ב agarose. הזחלים ממוקמים רוחבית, עם הצד השמאלי של הגוף מול למטה שוכב שטוח על החלק התחתון של התבנית. זה מבטיח את האוריינטציה עקבית של הכבדים, כך שכאשר חלקים נחתכים ברצף, אזורים שווים של הכבד ניתן להשוות דגים לדגים 27 . צעד מפתח נוסף המבטיח הצלחה מכתים H & E הוא פיתוח צבע. זה חיוני כדי לבדוק את מכתים לעתים קרובות עד עוצמת הצבע הרצוי הוא הגיע.

H & E מכתים יש להשתמש כדי לקבל הערכה ראשונית של פגיעה בכבד. הזחלים מטופלים אתנול להראות בתצהיר מופרז של טיפות עגולות ב hepatocytes, מרמז של steatosis 13 , 14 , 18 . תיוג עם צבעי השומנים, כגון שמן אדום O וניל אדום, יש צורך לאשר טיפות אלה הם אכן שומנים. כלי הדם הכבדאלפים בחיות המטופלות מופיעות מורחבות ונפוחות. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים צריך להתבצע כדי לבחון את השינויים ultrastructural הסינוסים. זה כבר בעבר דווח כי תצהיר חלבון תאיים מטריקס הוא גדל בכבד דג הזברה מטופלים אתנול, כפי שזוהו על ידי immunofluorescence 18 . עם זאת, בהתחשב בכך רמות ביטוי של גנים fibrogenic הם רק גדל בצניעות בדגים מטופלים 18 , H & E לא יכול להיות רגיש מספיק כדי לזהות כמות קטנה של חלבונים מטריקס תאיים. שיטות מקבע אותו מכתים נבדקו על כבדי דג הזברה המבוגר כרונית היו מספיק כדי לגלות פיברוזיס (ין, נתונים שלא פורסמו).

למרות הפרוטוקול הנוכחי מותאם לבדיקה של היסטולוגיה הכבד זחלים דג הזברה, יש לו יישום רחב יותר לקהילה המחקר דג הזברה, כמו סםפרוטוקול e ניתן להחיל על רקמות אחרות כדי דג הזברה מבוגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר קייטי מוריי במרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה; ד"ר סטייסי הופרט וקארי הופרט ב CCHMC, על עצות מועילות שלהם על הפרוטוקול; ו CCHMC שירות וטרינרי, עבור טיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R00AA020514 ומענק מחקר מהמרכז לגנום ילדים ב CCHMC (ל- CY). זה היה גם תמיכה בחלקו על ידי מענק NIH P30 DK078392 (אינטגרטיבית מורפולוגיה Core) של מרכז העיכול מחקר מרכז הליבה בסינסינטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95, (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52, (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56, (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277, (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3, (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5, (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35, (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10, (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6, (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33, (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279, (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19, (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78, (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2, (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131, (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32, (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43, (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (11), 4358-4363 (2011).
ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter