Summary
Questo protocollo descrive le analisi istologiche dei fegati delle larve di zebrafish che sono state trattate con 2% di etanolo per 24 ore. Tale trattamento di etanolo acuto provoca steatosi epatica e gonfiore della vasculatura epatica.
Abstract
Malattia alcolica del fegato (ALD) si riferisce a danni al fegato a causa di abuso acuto o cronico di alcol. È tra le principali cause della morbilità e della mortalità correlate all'alcol e colpisce più di 2 milioni di persone negli Stati Uniti. Una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base del danno epatico indotto da alcool è cruciale per lo sviluppo di un trattamento efficace per ALD. Le larve di Zebrafish mostrano steatosi epatica e fibrogenesis dopo solo 24 ore di esposizione al 2% di etanolo, rendendole utili per lo studio di lesioni al fegato alcoliche acute. Questo lavoro descrive la procedura per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e mostra che provoca steatosi e gonfiori dei vasi sanguigni epatici. Viene descritto anche un protocollo dettagliato per la colorazione di ematossilina e di Eosin (H & E) ottimizzato per l'analisi istologica del fegato di larve zebrafish. La colorazione H & E ha diversi vantaggi unici rispetto all'immunofluorescenza, in quanto segna tutti i livelliEr cellule e componenti extracellulari contemporaneamente e può facilmente rilevare lesioni epatiche, come la steatosi e la fibrosi. Dato l'aumento dell'uso di zebrafish nella modellizzazione della tossina e della lesione epatica indotta dal virus, nonché delle patologie epatiche ereditarie, questo protocollo serve come riferimento per le analisi istologiche eseguite in tutti questi studi.
Introduction
La malattia alcolica del fegato (ALD), causata dal consumo di alcol, è una delle principali cause della morbilità e della mortalità correlate all'alcol. Negli Stati Uniti, quasi la metà delle morti per malattie epatiche coinvolge l'alcool 1 e l'ALD è responsabile di quasi 1 su 3 trapianti di fegato 2 . ALD ha un ampio spettro. La steatoside, caratterizzata da un eccesso di accumulo lipidico negli epatociti, si verifica nella fase iniziale del consumo pesante ed è reversibile alla cessazione dell'uso dell'alcol. Sotto l'influenza dei fattori genetici e ambientali e dell'assunzione continua dell'alcol, la steatosi epatica può progredire all'epatite alcolica e, alla fine, alla cirrosi 3 . Gli studi che utilizzano i modelli di roditore ALD hanno fornito conoscenze approfondite sulla malattia, ma hanno limitazioni (esaminate nel riferimento 3 ). L'alimentazione orale di una dieta dell'alcool provoca solo steatosi nei roditori 4 , </ Sup> 5 . Lo sviluppo di infiammazione e fibrosi richiede un secondo insulto 6 , 7 o infusione intragastrica cronica, che è invasiva e tecnicamente impegnativa 8 , 9 . Il teleost zebrafish sviluppa anche lesioni epatiche in risposta sia al trattamento alcolico cronico che acuto 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . In particolare, il pesce zebra di larve rappresenta un attraente organismo modello complementare in cui studiare lesioni al fegato alcoliche acute , 10 , 11 , 13 , 15 . Il fegato di zebrafish è funzionale e produce enzimi chiave per il metabolismo dell'etanolo da 4 giorni(Dpf) 13 , 16 , 17. L' etanolo può essere aggiunto direttamente all'acqua e l'esposizione al 2% di etanolo per 24 ore è sufficiente a indurre steatosi epatica e risposte fibrogeniche nelle larve 13 e 15 dello zebrafish.
È stato riportato che il trattamento con 2% di etanolo per 24 ore ha determinato una concentrazione di etanolo tessuto di 80 mM nelle larve 13 di zebrafish. Altri hanno dimostrato che le larve tollerano questa concentrazione ei fenotipi epatici osservati negli animali trattati sono specifici per l'esposizione di etanolo 11 , 13 , 15 , 18 . Tuttavia, poiché 80 mM è quasi letale negli esseri umani 19 , è importante valutare l'istologia epatica del pesce zebra trattato con etanolo e rilevareDistruggere la rilevanza fisiologica dell'uomo.
Il rapido sviluppo esterno e la traslucenza delle larve dello zebrafish permettono di caratterizzare l'azione dell'alcool nel fegato in tempo reale e in campioni fissi. La disponibilità di linee transgeniche fluorescenti specifiche di tipo cellulare e dei recenti progressi nella microscopia confocale facilitano lo studio di come diversi tipi di cellule epatiche cambino la loro morfologia e il loro comportamento in risposta al trattamento acuto di etanolo 11,15. Tuttavia, l'imaging confocale dei pesci zebra transgenici fluorescenti non può completamente sostituire la colorazione di ematossilina e di Eosin (H & E) durante lo studio dell'istologia del fegato. Marcando tutti i tipi di cellule epatiche contemporaneamente utilizzando zebrafish transgenici richiede la generazione di singole linee transgeniche, ciascuna etichettatura di un tipo di cellule epatiche con un unico fluoroforo. Introdurre diversi sfondi transgenici nello stesso pesce richiede la razzaG generazioni multiple, che richiede tempo e sono costosi. È necessaria una colorazione immunofluorescenza aggiuntiva per rilevare componenti di matrice extracellulare. La colorazione H & E, invece, identifica contemporaneamente tutti i tipi di cellule epatiche e le componenti della matrice extracellulare, fornendo così una panoramica del fegato 20 . Inoltre, rivela facilmente varie caratteristiche istopatologiche delle malattie epatiche, come la morte epatocitaria, la steatosi e la fibrosi. Anche se H & E è una macchia di routine nell'istologia del fegato mammifero, non è comunemente utilizzata nella ricerca epatica del zebrafish e il protocollo è meno ben definito.
Questo lavoro descrive un protocollo per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e per le analisi istologiche di follow-up con la colorazione H & E. Il protocollo di colorazione H & E può essere utilizzato in tutti gli studi di sviluppo e funzionalità del fegato. Inoltre, le sezioni di paraffina possono essere utilizzate per immunohistochemistry, come pure per altri sta sta specialiIns nella patologia epatica, tra cui la macchia tricromica, la macchia di reticulina, ecc .
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Protocol
AB WT adulti e larve sono stati mantenuti in condizioni normali 21 secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (National Institutes of Health publication 86-23, revised 1985); Il loro utilizzo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali al Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC).
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare l'acqua di uovo.
- Preparare la soluzione salina di stock dissolvendo 40 g di sale marino commerciale in 1 L di acqua doppia distillata (ddH 2 O). Mescolare fino a quando tutti i sali non sono completamente sciolti.
- Preparare la soluzione 0,1% di blu di metilene aggiungendo 0,1 g di polvere a 100 ml di ddH2O.
ATTENZIONE: il blu metilene è irritante se entra in contatto con gli occhi o con la pelle. Indossare sempre un cappotto di laboratorio e guanti durante la manipolazione della polvere. - Combinare 28,125 ml di sale di riserva cosìE 7 ml di soluzione di blu metilene in un tubo conico da 50 ml. Mescolare bene. Aggiungere questa miscela a 15 L di ddH 2 O. Agitare bene e conservare a RT.
- Preparare 100 ml di 1 M Tris-HCl aggiungendo 12,1 g di polvere di Tris a 100 ml di ddH2O. Regolare il pH a 9,0 utilizzando acido cloridrico (HCl).
ATTENZIONE: L'HCl può causare gravi ustioni e irritazioni della membrana mucosa se inalato. Indossare sempre un cappotto e guanti di laboratorio e maneggiare la bottiglia di riserva in un cappuccio chimico. - Preparare una soluzione di tricaina del 0.4% (etil-3-aminobenzoato metansolfonato).
- Sciogliere 2 g di polvere di tricaina in 489,5 ml di ddH2O. Aggiungere 10,5 ml di soluzione Tris-HCl, pH 9. Mescolare con una barra di stirata fino a quando tutta la polvere si è dissolta. Regolare al pH 7,0.
ATTENZIONE: La polvere di Tricaine può essere irritante per via respiratoria. Indossare sempre una maschera di polvere durante la manipolazione della polvere. - Aliquota 45 ml della soluzione di tricaina in 50 ml di tubi conici. Mantenere la solutioN a 4 ° C per un uso immediato e a -20 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine.
- Sciogliere 2 g di polvere di tricaina in 489,5 ml di ddH2O. Aggiungere 10,5 ml di soluzione Tris-HCl, pH 9. Mescolare con una barra di stirata fino a quando tutta la polvere si è dissolta. Regolare al pH 7,0.
- Preparare il fissativo di Dietrich combinando 30 ml di etanolo al 95%, 10 ml di formaldeide 37%, 2 ml di acido acetico glaciale e 58 ml di ddH2O in una bottiglia di vetro. Mescolare bene avvolgendo e conservando a RT.
ATTENZIONE: la formaldeide è un cancerogeno sospetto e qualsiasi soluzione con formaldeide deve essere usata in un cappuccio chimico. L'acido acetico glaciale può causare gravi ustioni cutanee e danni all'occhio. Indossare sempre un cappotto e guanti di laboratorio e gestire la soluzione di magazzino in un cappuccio chimico. Formaldeide, acido acetico glaciale e etanolo al 95% sono tutti liquidi infiammabili e devono essere conservati in un armadietto infiammabile designato.
NOTA: il fissativo di Dietrich è stabile a RT per 1 anno. - Preparare 1 L di soluzione salina (PBS) tamponata da 10x aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 14,4 g di sodio fosfato (Na 2 HPO 4 ) e 2.4 g di fosfato monopotassium (KH 2 PO 4 ) a 800 mL di ddH 2 O. Adeguarsi al pH 7,4 utilizzando sodio idrossido (NaOH) e aggiungere ddH2O ad un volume finale di 1 L. Conservare questa soluzione a RT dopo autoclave su un ciclo di liquido che si purifica per 1 min e incuba a 121 ° C per 20 minuti.
- Preparare 1 L di 1x PBS diluendo 100 ml della soluzione 10x PBS in 900 ml di ddH2O. Mescolare bene agitando e conservando a RT dopo autoclave.
- Preparare 3% di agarosio in una bottiglia di vetro per il montaggio degli embrioni.
- Aggiungere 3 g di agarosio a 100 ml di ddH2O e mescolare a roteare. Riscaldare la miscela con microonde per dissolvere l'agarosio e guardare attentamente durante il riscaldamento per assicurare che vi sia minima bollitura.
ATTENZIONE: La bottiglia sarà probabilmente calda quando viene rimossa dal forno a microonde, nonostante il corretto riscaldamento. Utilizzare un guanto o un guanto protettivo per rimuovere la bottiglia dal forno a microonde. - Rimuovere la bottiglia dal microonde.Mentre si scoraggia dolcemente, cercare tutti i cristalli che non sono completamente sciolti; Se non ci sono cristalli, la soluzione è pronta per l'uso. Conservare l'agarosio del 3% a RT e riscaldare nuovamente prima dell'uso.
- Aggiungere 3 g di agarosio a 100 ml di ddH2O e mescolare a roteare. Riscaldare la miscela con microonde per dissolvere l'agarosio e guardare attentamente durante il riscaldamento per assicurare che vi sia minima bollitura.
- Filtra la soluzione di stock di Hematoxylin Harris per rimuovere tutti i solidi che hanno precipitato.
- Piegare a metà un filtro del caffè in modo che il filtro crei un cono. Aprire il pannello laterale in modo che il liquido attraversa il filtro, permettendo di catturare eventuali detriti.
- Mettere il filtro all'interno di un imbuto e l'imbuto in una bottiglia di vetro. Versare gradualmente l'ematoxilina di riserva attraverso il filtro.
ATTENZIONE: L'ematossilina è pericolosa in caso di contatto con gli occhi, l'ingestione e l'inalazione. Indossare sempre un cappotto e guanti di laboratorio e gestire la soluzione di magazzino in un cappuccio chimico.
- Preparare 0,05% HCl aggiungendo 125 μL di 12 N HCl a 250 mL di ddH2O.
- Preparare la miscela di soluzione eosina Y-phloxine B combinando 25 ml di 1% eParte Y (aq), 2,5 ml di 1% di phloxine B (aq), 195 ml di etanolo al 95% e 1 ml di acido acetico glaciale in una bottiglia di vetro. Mescolare bene avvolgendo e conservando a RT
ATTENZIONE: Eosin Y è pericoloso in caso di contatto con gli occhi, l'ingestione e l'inalazione. Indossare sempre un cappotto e guanti di laboratorio e gestire la soluzione di magazzino in un cappuccio chimico. - Preparare 2% di etanolo aggiungendo 2 mL di alcool etilico puro a 98 mL di acqua di uovo.
ATTENZIONE: l'alcool etilico è irritante agli occhi. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione durante la manipolazione dell'alcool etilico. È inoltre infiammabile e deve essere gestito e memorizzato di conseguenza.
NOTA: Preparare ogni 2% di etanolo fresco prima di condurre il trattamento acuto dell'etanolo.
Eseguire il trattamento acuto dell'etanolo nelle larve di Zebrafish
- Per generare embrioni, impostare le croci con un maschio selvatico e un pesce femminile WT per serbatoio di accoppiamento. Separarli inserendo un divisore di plastica nel serbatoio di accoppiamento.
NOTA: ImpostareUp attraversa dopo l'alimentazione finale del giorno in modo che i pesci siano ben nutriti.- Alle 8 di mattina la mattina successiva, tirare il divisore per consentire alla coppia di accoppiarsi.
- Dopo 1 ora, restituire il pesce adulto al loro serbatoio originale. Raccogliere gli embrioni versando l'acqua contenente gli embrioni in un filtro. Girare il filtro in un piatto da 100 mm di Petri e lavare gli embrioni nel piatto utilizzando una bottiglia di lavaggio contenente acqua uovo. Posizionare il piatto con gli embrioni in un incubatore a 28 ° C.
- Quando gli embrioni raggiungono almeno lo stadio a 4 celle (1 hpf), rimuovere tutti gli embrioni e detriti non fertili in acqua con una pipetta Pasteur e posizionare il piatto con gli embrioni fecondati in un incubatore a 28 ° C. Mantenere gli embrioni nell'incubatore a 28 ° C fino a 96 h post-fertilizzazione.
- Anestetizzare il pesce larvale aggiungendo la soluzione tricaina all'acqua di uovo ad un rapporto di 1-10 (volume / volume).
- Selezionare fino a quaranta 96 larve di hpf che utilizzano una vescica gonfiataUna pipetta di Pasteur e suddivisi in due nuovi piatti di Petri.
- Togliete quanto più possibile l'acqua di uova residua. Ad una densità di una larva per ml, aggiungere acqua uova contenente 2% etanolo a un piatto. Aggiungere la stessa quantità di acqua di uovo all'altro piatto per servire come controllo.
- Tenere la testa e le larve trattate con etanolo nella stanza dei pesci per 24 ore.
NOTA: condurre il trattamento dell'etanolo in un locale di pesce che ha un ciclo di luce leggero / 10 h scuro da 14 h provoca una lesione epatica più coerente e robusta che conduce l'esperimento al buio in un incubatore. - Raccogliere le larve in un tubo da centrifuga da 1,5 ml con non più di 20 larve per tubo.
- Togliere il più liquido possibile dalle larve e aggiungere almeno 1 mL (10 volte il volume di tessuto) del fissatore di Dietrich nel cappuccio chimico. Lasciare che i pesci si fissino su un nutatore a temperatura ambiente per almeno 24 ore.
NOTA: i pesci sono stabili nel fissativo di Dietrich per diverse settimane.
- Impostare il numero necessario di cassette tissutali e due pastiglie biopsia blu per cassetta. Posizionare uno strato di biopsia nella parte inferiore di ciascuna cassetta. Etichettare ogni cassetta a matita, identificando chiaramente il campione.
NOTA: non utilizzare penna o marcatore per etichettare le cassette, in quanto l'etichettatura sarà persa nei passaggi successivi. - Incorporare le larve nel 3% di agarosio per assicurare l'orientamento coerente di tutti i campioni.
- Rimuovere il fissatore dai tubi in un cappuccio chimico e lavare le larve 3 volte per 5 min ciascuna con 1 ml di 1x PBS. Posizionare i tubi su un nutatore a RT durante le lavaggi.
- Durante le lavaggi, scaldare l'agarosio preparato al 3% in acqua utilizzando un forno a microonde per sciogliere il solido. Scaldare per 30 s alla volta e guardare attentamente per minimizzare la bollitura. Tenere l'agarosio liquido su una piastra calda impostata a 90 ° C con agitazione leggera.
- Usando una pipetta di trasferimento, trasferire fino a 8 lArvae ad uno stampo di istologia plastica e rimuove il più possibile PBS. Usando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata, riempite completamente lo stampo con 3% di agarosio.
- Usando una siringa per insulina, raccogliete le larve al centro dello stampo e spingetele verso il basso. Per le sezioni sagittali, posizionare le larve in una linea, con le teste verso la parte superiore dello stampo. Per assicurare che i fegati siano orientati in modo coerente, ruotare le larve in modo che il lato sinistro del corpo sia rivolto verso il basso e piatto contro il fondo dello stampo.
NOTA: poiché il fegato si trova sul lato sinistro del corpo, tale posizionamento minimizza il numero di sezioni che devono essere tagliate prima di raggiungere il fegato. Mantenere le larve più vicine tra loro il più possibile. - Impostare lo stampo sul lato per 4-5 minuti per consentire l'agarosio di impostare completamente. Rimuovere il blocco agarosio dallo stampo e utilizzare una lama di rasoio per tagliare l'agarosio attorno alle larve. Appoggiare il blocco alla fine e tagliare lo spessore in mezza sChe il blocco finale è di circa 2-3 mm di spessore.
- Trasferire il piccolo blocco di agarosio nella cassetta del tessuto preparato (punto 3.1) e posizionare il secondo tampone bioptico sulla parte superiore del blocco. Chiudere la cassetta e posizionare la cassetta completamente assemblata in un contenitore sigillante con etanolo al 70% in ddH2O appena preparato.
NOTA: Se le cassette non verranno trattate immediatamente, metterle in etanolo al 70% in un contenitore a 4 ° C per evitare una perdita di fissazione. Le cassette sono stabili a 4 ° C per un massimo di 3 giorni.
- Trattamento dei tessuti
NOTA: i campioni possono essere sottoposti ad un laboratorio di istologia o patologia dotato di un processore di tessuto per la lavorazione delle cassette in paraffina. Richiedere un programma di elaborazione O / N standard piuttosto che un programma corto in modo che la paraffina possa penetrare completamente nell'agarosio.- Processare le cassette tissutali trasferendole attraverso una serie di etanolo di diluizione, con una quantità sempre maggiore di alcol, aDeidratare il tessuto, come segue: 70% etanolo 2 volte, 45 minuti ciascuno; 80% etanolo, 45 min; 95% etanolo, 2 volte, 45 minuti ciascuno; 100% etanolo, 2 volte, 45 minuti ciascuno.
- Sostituire l'alcool con un solvente (100% xilene, 2 volte, 45 minuti ciascuno) affinché la paraffina infiltri il tessuto.
ATTENZIONE: Xilene è irritante ed è nocivo se inalato. Assicurarsi di utilizzare sempre una cappa chimica. Xilene è infiammabile e deve essere conservato di conseguenza. - Incubare le cassette in paraffina O / N in un incubatore a 60-65 ° C. Tenere le cassette calde fino all'incollaggio.
- Incorporare i blocchi di agarosio trasformati in paraffina.
- Estrarre una cassetta dal cassetto riscaldante della macchina incorporatrice e rimuovere il coperchio della cassetta e la parte superiore del biopsia dalla cassetta. Riempire uno stampo di istologia con paraffina liquida e tenerlo sulla piastra calda sulla macchina di incasso.
- Usando le pinze calde, raccogliere il blocco agarosio dal cassettoE trasferirlo allo stampo di istologia con paraffina. Assicurarsi che il lato del blocco di agarosio con il pesce più vicino alla superficie sia rivolto verso il basso. Gettare via il cuscinetto di biopsia inferiore e trasferire l'intero stampo di istologia alla piastra fresca sulla macchina incorporatrice.
- Usando le pinze, posizionare rapidamente il blocco agarosio al centro dello stampo; Posizionare il blocco nella parte inferiore dello stampo. Una volta posizionato il blocco, posizionare il fondo della cassetta sulla parte superiore dello stampo di istologia e riempirlo a metà con paraffina liquida. Posizionare lo stampo direttamente sulla piastra di 4 ° C e non disturbare i blocchi per almeno 10-15 minuti per consentire la solidificazione della paraffina. Mentre il primo blocco sta impostando, ripetere questo processo per i blocchi rimanenti.
- Una volta che la paraffina è impostata per tutti i blocchi, rimuovere lo stampo di istologia dal blocco di paraffina premendo delicatamente sullo stampo per allentarlo. Questi blocchi di paraffina possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato.
4. Sezione dei blocchi di paraffina - Il giorno prima della sezionamento, faccia nel blocco di paraffina usando un microtomo per rimuovere l'eccesso di paraffina che copre il tessuto. Sezione 5 μm alla volta finché il tessuto non viene esposto alla superficie del blocco paraffinico. Smettere e scartare tutte le sezioni tagliate. Immergere i blocchi in basso a 1x PBS a 4 ° CO / N.
NOTA: i blocchi devono essere imbevuti per almeno 8 h. Avviare l'ammollo alla fine della giornata. Se i blocchi sono lasciati in 1x PBS per troppo tempo, il tessuto può gonfiarsi e diventare distorto. - Rimuovere un blocco alla volta dal 1x PBS e tagliare le sezioni da 5 μm usando un microtomo. Separare il nastro delle sezioni dalla lama tirando delicatamente l'ultima sezione dalla lama utilizzando una pinza o una spazzola. Raccogliere il nastro dall'ultima sezione usando le pinze e trasferirlo in un bagno d'acqua a 42 ° C. Lasciare che i nastri fluiscano sulla superficie dell'acqua per almeno 5 minuti.
NOTA: WheN, non lasciare che le pinze toccano l'acqua mentre sono ancora in contatto con la paraffina. Altrimenti, la paraffina si scioglierà sulle pinze e renderà molto difficile la separazione. Se necessario, allentare le sezioni in gruppi più piccoli utilizzando pinze pulite in modo che possano facilmente adattarsi alle diapositive. Toccare delicatamente la cucitura tra le sezioni per creare una separazione senza danni. - Mettere un diaframma caricato nell'acqua ad un angolo di 45 gradi e posizionarlo attentamente sotto il gruppo di sezioni da raccogliere. Sollevare con cautela lo scivolo dall'acqua e lasciare che le sezioni siano collegate alla slitta.
- Blot qualsiasi acqua in eccesso dalle sezioni utilizzando tessuto privo di lanugine. Posizionare la diapositiva in un supporto o scatola. Continuare a suddividere il blocco fino a raccogliere il tessuto desiderato. Ripetere il processo di sezionamento per tutti i blocchi.
- Cuocere le vetrate in un incubatore a 55 ° C o in forno per 3-16 h per fondere la paraffina. Rimuovere le diapositive dal forno e lasciarle tO fresco prima di iniziare la colorazione.
NOTA: Le sezioni di paraffina possono essere immagazzinate a RT a tempo indeterminato, sia prima che dopo la cottura. - Deparaffinizzare le diapositive immersandole in 100% di xilene per 15 minuti; Cambiarla al 100% di xilene per altri 15 minuti.
- Ridorrevole le diapositive immersandole attraverso la seguente serie di etanolo classificato fino a quando il liquido scorre pulito dalle diapositive. Per ogni soluzione, immergere 8-10 volte, 2 s per dip: 100% etanolo, 100% etanolo, 95% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, etanolo al 50%, etanolo al 30% e acqua deionizzata.
NOTA: il protocollo può essere fermato qui e le diapositive possono essere lasciate a RT in acqua per diverse ore. Se necessario, le diapositive possono essere conservate a 4 ° C in acqua O / N. - Mettere le diapositive in hematoxylin Harris filtrato al 100% per 4 min. Immediatamente trasferirli nuovamente al contenitore con acqua deionizzata. Eseguire l'acqua deionizzata in tL'angolo posteriore del contenitore più lontano dalle sezioni. Svuotare periodicamente il contenitore finché l'acqua non è più viola.
NOTA: Non far scorrere l'acqua direttamente sulle diapositive, poiché le sezioni possono scendere dalle diapositive. - Controllare rapidamente l'intensità di ematossilina su un microscopio di dissezione usando le luci a gooseneck; Non lasciare asciugare le diapositive. Se la macchia ha raggiunto l'intensità desiderata, passare alla fase successiva. Se il colore non è abbastanza scuro, posizionare le diapositive in ematossilina al 100% per 1 min e ripetere le lavaggi dell'acqua prima di controllare nuovamente.
NOTA: L'ematossilina deve essere abbastanza scura in modo che il colore non venga perso durante la colorazione dell'eosina. Tuttavia, se si osserva la colorazione ematossilina nel citoplasma, le sezioni vengono sovraccaricate. - Immergere le diapositive due volte in 0,05% HCl e trasferirle immediatamente nel contenitore con acqua pulita deionizzata. Svuotare l'acqua e riempire di nuovo il contenitore con acqua due volte.
- Trasferisci le diapositive al 95% etHanol per 30 s e poi trasferirli in un nuovo contenitore con etanolo al 95% per 30 s.
- Posizionare le diapositive nella soluzione eosin Y-phloxine B per 2 min. Trasferisci le diapositive al contenitore precedente del 95% di etanolo e controlla rapidamente l'intensità del colore sotto il microscopio di dissezione. Se la colorazione è sufficiente, procedere al passo successivo. In caso contrario, tornare alla soluzione eosina per 30 s, controllare di nuovo e ripetere se necessario.
NOTA: La colorazione sufficiente di eosina è rosa brillante e appare in contrasto distinto con la macchia di ematossilina. Assicurarsi di eliminare qualsiasi soluzione dalla parte posteriore delle diapositive durante il controllo sotto il microscopio in modo che non venga osservato alcun colore falso. Poiché l'eosina è costituita da etanolo al 95%, prolungati periodi di tempo nel 95% di etanolo, mentre il controllo dell'intensità del colore può perdere alcuni dei colori. - Trasferire le diapositive al 100% di isopropanolo per 15 s. Sostituire con isopropanolo fresco al 100% e riporre le diapositive nell'isopropanolo per altri 15 secondi. Ripetere questo pPer un totale di 6 lavaggi isopropanolo.
ATTENZIONE: Isopropanolo è un occhio e irritante per via respiratoria. Assicurarsi sempre di indossare adeguate attrezzature protettive e di evitare spruzzi. È inoltre estremamente infiammabile e deve essere conservato e trattato di conseguenza.
NOTA: per risparmiare sui reagenti, scartare solo il primo lavaggio isopropanolo (più rosa). Conservare le altre cinque soluzioni di lavaggio in bottiglie numerate da 1 a 5, per essere riutilizzate per la prossima colorazione. Quando riutilizza le lavaggi, iniziare con la bottiglia numerata "1" e scartare dopo l'uso. Una volta lavato "2", versatelo in bottiglia "1" e così via. Il lavaggio finale deve sempre essere isopropanolo fresco. - Posizionare le diapositive in 100% di xileni per 3 min. Rimuovere una diapositiva alla volta e posizionare una copertina.
- Aggiungere un supporto di montaggio sufficiente per coprire le sezioni e immergerle in 100% di xilene.
NOTA: questa fase semplifica la superficie del supporto di montaggio e rimuove eventuali bolle. - Applicare una coverlipAlla parte inferiore della diapositiva.
NOTA: Il supporto di montaggio deve tirare la slitta in posizione. Se il coperchio non è diritto o completamente seduto, toccarlo delicatamente in posizione. - Blot qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso su un tovagliolo di carta fino a quando si vede solo una linea sottile. Immergere una striscia di tessuto nel xilene e strofinare la parte posteriore della diapositiva per rimuovere qualsiasi mezzo che sia sgocciolato. Posizionare lo slittamento su una superficie robusta ma mobile, come un pezzo di cartone. Coprire tutti gli altri diapositive allo stesso modo. Lasciare che il xilene si evapora nella cappa per 10 minuti.
NOTA: Qualsiasi materiale contaminato con xilene deve essere rimosso e scartato in un contenitore sigillato nella cappa per evitare che tutti i vapori sfuggano.
- Aggiungere un supporto di montaggio sufficiente per coprire le sezioni e immergerle in 100% di xilene.
- Lasciare che il supporto di montaggio si indurisca a RT O / N.
- Sezioni di immagine su un microscopio invertito composto 18 .
NOTA: Le diapositive possono essere tenute in camera teMperatura a tempo indeterminato.
5. Colorazione di ematossilina e eosina delle sezioni di paraffina
6. Imaging e storage di diapositive macchiate
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Representative Results
Formalin tampone 10% e 4% paraformaldeide (PFA) sono due dei fixatives più comuni utilizzati per le pratiche istologiche. Tuttavia, non forniscono risultati di fissazione ottimali per i tessuti epatici di zebrafish ( Figura 1 e Tabella 1 ). La fissazione con il 10% di formalina o il 4% di PFA provoca spesso dei restringimenti, creando grandi spazi tra il fegato e i tessuti circostanti ( Figura 1A , Figura 1B fornisce un esempio di ritiro dei tessuti). Parti del tessuto epatico possono anche cadere dalla sezione. Il citoplasma degli epatociti è spesso perduto ( Figura 1A , 1B ). Entrambi i fissativi possono causare distorsioni degli epatociti, in quanto si riducono o si gonfiavano e non mantengono più la morfologia colonnare caratteristica delle cellule epiteliali. Un ulteriore problema con la fissazione PFA èChe ci siano spazi tra gli epatociti che non sono reali, che causano il frattura del tessuto ( Figura 1B ). Inoltre, quando viene utilizzato uno di questi due fissativi, gli epatociti vengono ben macchiati con ematossilina, ma meno con l'eosina ( figura 1A ). Il fissativo di Dietrich a base di acido supera i problemi con i fissativi di formalina e PFA ( Figura 1C ).
Nell'Ald umano, la steatosi, composta da grasso di piccole e grandi goccioline, è più prominente vicino alla vena centrale e si estende verso l'esterno verso la triade del portale con una maggiore severità 22 . In zebrafish, il trattamento con 2% di etanolo da 96-120 hpf induce anche la steatosi epatica, che è implicata dall'eccessiva deposizione di gocce rotonde negli epatociti ( figura 2B , frecce). Tuttavia, le goccioline non esibisconoTa modello di distribuzione simile, come si vede in ALD umano, perché non esiste una chiara distinzione di portale e vene centrali nel fegato di zebrafish 23 . I vasi sanguigni epatici nel fegato larvale trattati con etanolo sono gonfiati rispetto a quelli del fegato di controllo ( figura 2B , asterischi).
Figura 1 : confronti di colorazione H & E nei fegati delle larve di Zebrafish che sono state fissate con Fixatives differenziali a 120 hpf. ( A ) 10% di formalina a RT O / N; ( B ) 4% PFA a 4 ° CO / N; ( C ) il fissatore di Dietrich a RT per 24 h. Con il 10% di formalina, gli epatociti spesso perdono il loro citoplasma (A). Il tessuto non è macchiato correttamente con eosina e sembra viola. Dopo il fixaCon il 4% di PFA, si osservano lacune tra gli epatociti (B). Il 4% di PFA provoca la riduzione del tessuto epatico, quindi sembra esserci un grande divario tra il fegato e i tessuti circostanti. La linea tratteggiata in B segna il confine dei tessuti circostanti. Il fissativo di Dietrich fornisce il risultato ottimale tra i tre (C). Barra di scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Il trattamento acuto di etanolo causa la steatosi epatica e il gonfiore dei vasi sanguigni nei fegati di larve di Zebrafish. ( A ) H & E colorazione del fegato in un controllo, non trattato, larve WT. ( B ) H & E colorazione del fegato in larva tipo wil che è stato trattato con il 2% ethaNol da 96 a 120 hpf. Entrambi gli animali sono stati fissati con il fissativo di Dietrich a 120 hpf. Le frecce in (B) puntano agli epatociti con deposizione eccessiva di gocce rotonde. Gli asterischi contrassegnano i gonfiori dei vasi sanguigni epatici. Barra di scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 10% di formalina | 4% PFA | Il fissativo di Dietrich | |
| Condizione di fissaggio | Almeno 24 ore a RT | 3 ore a RT o O / N a 4 ° C | Almeno 24 ore a RT |
| Fissazione post memorizzazione post | A tempo indeterminato a RT | Fino a 2 settimane a 4 ° C | Fino a 2 mesi a RT |
| CompatibCon estrazione genomica del DNA | sì | sì | No |
| ritiri | sì | sì | Minimo |
| Distorsione delle cellule | sì | sì | Minimo |
| Perdita di dettagli cellulari | sì | Modesto | Minimo |
| H & E macchia bilanciata | Macchia di eosina debole | Macchia di eosina debole | sì |
| Compatibilità con immunohistochemistry | sì | sì | sì |
Tabella 1: confronti del 10% di formalina, del 4% di PFA e di Fixatives di Dietrich per l'istologia epatica del fegato di Zebrafish.
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Discussion
Il protocollo attuale descrive una procedura dettagliata per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e le successive analisi istopatologiche con la colorazione H & E. Il trattamento acuto di etanolo dovrebbe essere effettuato non prima di 96 ore dopo la fecondazione, in quanto questo è il momento in cui il fegato di zebra inizia a esprimere enzimi che metabolizzano l'alcool 13 . 2% di etanolo è la dose massima che le larve possono tollerare 13 , 14 . Le larve trattate con etanolo iniziano a mostrare steatosi epatica per 8 ore di trattamento e le percentuali di steatosi che sviluppano le larve continuano a salire fino a 24 ore di trattamento continuo 14 . Le larve di zebrafish assorbono sostanze nutritive esclusivamente dal tuorlo fino a 120 hpf. Pertanto, il trattamento con etanolo oltre 120 CVF non è raccomandato, perché il digiuno può anche contribuire alla steatosi 14 . Rispetto ai protocolli pubblicati da altri laboratoriOratori 13 , 24 , la principale modifica effettuata nel protocollo attuale è che il trattamento dell'etanolo è condotto in un impianto di pesca che ha un ciclo di luce leggero / 10 h di 14 ore. Ciò comporta risposte steatiche più coerenti e robuste di quelle osservate quando il trattamento viene condotto al buio in un incubatore. Ciò può essere legato al fatto che i geni metabolici lipidici nel fegato di zebrafish mostrano espressione ritmica del ritmo in risposta al ciclo chiaro / scuro 25 .
L'ALD è una malattia cronica e richiede anni di abuso di alcol. La limitazione critica del protocollo di trattamento attuale di etanolo è che innesca solo gli effetti acuti dell'alcool sul fegato. Il trattamento con una concentrazione di etanolo così elevata per più di 48 h provoca elevate mortalità, impedendo lo studio del danno epatico cronico. Un recente studio ha scoperto che il trattamento continuo di zebrafish adulto con 1% di etanolo fino a treMesi hanno portato alla steatosi, alla steatoepatite e alla fibrosi 12 . Una promettente direzione futura potrebbe essere quella di identificare un potenziale modulatore di ALD utilizzando il protocollo acuto di trattamento dell'etanolo e poi di convalidare il suo effetto nel modello di lesioni croniche.
La colorazione H & E viene eseguita per valutare i danni epatocellulari che sono indotti da un trattamento acuto di etanolo. A causa della facilità di eseguire l'imaging di fluorescenza in zebrafish, la colorazione H & E non viene usata abitualmente in istologia del fegato di zebrafish e la procedura è meno descritta. Il protocollo attuale fornisce una descrizione passo per passo della colorazione H & E nel fegato larvale. La scelta del correttivo corretto è il primo e più importante passo per la colorazione H & E. Anche se il 10% di formalina tamponata e il 4% di PFA sono comunemente usati in istologia, entrambi causano ritiro tissutale e porzioni del fegato che esce dalla sezione. La fissazione di formalina del 10% porta alla perdita del citoplasma nel hepatocytes. La fissazione del PFA del 4% determina lacune artificiali tra gli epatociti. La colorazione di Eosin sembra essere molto più debole della colorazione ematossilina nei fegati che vengono fissati con un fissativo. Il fissativo di Dietrich a base di acido è più adatto per la colorazione H & E del fegato di zebrafish, in quanto conserva i dettagli cellulari e minimizza il ritiro. Inoltre sembra penetrare il tessuto adiposo, come il fegato, più veloce di formalina e PFA. La colorazione con ematoxilina ed eosina è più equilibrata. Un caveat del fissativo di Dietrich è che non è compatibile con l'estrazione genomica del DNA. In un esperimento di sperimentazione, il DNA genomico è stato estratto dalle larve fissate utilizzando il 10% di formalina, il 4% di PFA o il fissativo di Dietrich 26 . Le larve sono state incubate in 50 μl di 50 mM NaOH a 95 ° C per 20 minuti e successivamente sono state raffreddate a 4 ° C. Quindi, sono stati aggiunti 5 μl di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 per neutralizzare la soluzione di base. Dopo una breve centrifugazione, il surnatante wCome usato in PCR. Con lo stesso primer di PCR e il programma PCR, il DNA genomico proveniente sia dalle larve formaliniche che da PFA ha prodotto i prodotti PCR con le dimensioni predeterminate, mentre il DNA genomico delle larve fissative fissate da Dietrich non è riuscito a produrre alcun prodotto PCR.
La colorazione H & E può essere effettuata sia sulle sezioni di paraffina che sulle sezioni congelate. Tuttavia, le sezioni di paraffina hanno i seguenti vantaggi rispetto alle sezioni congelate: 1) Mentre le sezioni di paraffina possono essere conservate a temperatura ambiente a tempo indefinito, le sezioni congelate possono essere conservate solo a -80 ° C fino a un anno. 2) Per le sezioni congelate, la formazione di cristalli di ghiaccio all'interno delle cellule può perturbare la morfologia cellulare ei dettagli subcellulari. Inoltre, le sezioni congelate sono spesso più spesse delle sezioni di paraffina. Ciò può portare a cattive immagini della morfologia del tessuto rispetto a quelle prodotte da sezioni di paraffina.
Quando si preparano blocchi di paraffina per i tessuti epatici, il protocollo attualeIncorpora le larve in agarosio. Le larve sono posizionate lateralmente, con il lato sinistro del corpo rivolto verso il basso e sdraiato sul fondo della muffa. Questo assicura l'orientamento coerente dei fegati, in modo che quando le sezioni vengono tagliate in sequenza, le regioni equivalenti del fegato possono essere confrontate dal pesce al pesce 27 . Un altro passo fondamentale che assicura la colorazione H & E di successo è lo sviluppo del colore. È fondamentale controllare spesso la colorazione fino a raggiungere l'intensità del colore desiderata.
La colorazione H & E deve essere utilizzata per ottenere una valutazione preliminare del danno epatico. Le larve trattate con etanolo mostrano un'eccessiva deposizione di gocce rotonde negli epatociti, suggestiva di steatosi 13 , 14 , 18 . L'etichettatura con coloranti lipidici, come l'olio rosso O e il rosso del Nilo, è necessaria per confermare che queste gocce sono in realtà lipidi. Il sangue epatico cennoGli animali trattati sembrano dilatati e gonfiati. La microscopia elettronica di scansione e la microscopia elettronica di trasmissione devono essere eseguite per esaminare le modificazioni ultrastrutturali delle sinusoidi. È stato riportato in precedenza che la deposizione proteica della matrice extracellulare è aumentata nel fegato di zebrafish trattato con etanolo, come rilevato mediante immunofluorescenza 18 . Tuttavia, dato che i livelli di espressione dei geni fibrogeni sono solo modesti aumentati nel pesce trattato 18 , H & E non può essere sensibile abbastanza per rilevare una piccola quantità di proteine della matrice extracellulare. Gli stessi metodi di fissazione e di colorazione sono stati testati sui fegati di zebrafish adulti cronicamente feriti e sono stati sufficienti per rilevare la fibrosi (Yin, dati inediti).
Sebbene il protocollo attuale sia adattato all'esame dell'istologia del fegato nelle larve di zebrafish, ha un'applicazione più ampia alla comunità di ricerca zebrafish, come il samIl protocollo e può essere applicato ad altri tessuti e agli zebrafish adulti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Katy Murray al Centro Risorse Internazionali di Zebrafish; Il dottor Stacey Huppert e Kari Huppert al CCHMC, per i loro consigli utili sul protocollo; E il servizio veterinario CCHMC, per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R00AA020514 e da una borsa di studio del Centro per la Genomica Pediatrica a CCHMC (a CY). È stato anche sostenuto in parte da NIH concedere P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) del Centro di Ricerca Digestiva Disease Core a Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol (EtOH) | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
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