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Developmental Biology

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

Este protocolo descreve análises histológicas dos fígados de larvas de peixe-zebra que foram tratadas com etanol a 2% durante 24 h. Tal tratamento com etanol agudo resulta em esteatose hepática e inchaço da vasculatura hepática.

Abstract

Doença hepática alcoólica (ALD) refere-se a danos ao fígado devido ao abuso de álcool agudo ou crônico. É uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool e afeta mais de 2 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à lesão hepática induzida pelo álcool é crucial para o desenvolvimento de tratamento eficaz para a ALD. As larvas de peixe-zebra exibem esteatose hepática e fibrogênese após apenas 24 horas de exposição a etanol a 2%, tornando-as úteis para o estudo da lesão hepática alcoólica aguda. Este trabalho descreve o procedimento para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e mostra que causa esteatose e inchaço dos vasos sanguíneos hepáticos. Um protocolo detalhado para hematoxilina e Eosina (H & E) coloração que é otimizado para a análise histológica do zebrafish larval do fígado, também é descrito. A coloração de H & E tem várias vantagens únicas em relação à imunofluorescência,Er células e componentes extracelulares simultaneamente e pode facilmente detectar lesão hepática, como esteatose e fibrose. Dado o uso crescente de peixe-zebra na modelagem de toxinas e lesões hepáticas induzidas por vírus, bem como doenças hepáticas hereditárias, este protocolo serve de referência para as análises histológicas realizadas em todos estes estudos.

Introduction

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A doença hepática alcoólica (ALD), que é causada pelo consumo excessivo de álcool, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool. Nos Estados Unidos, quase metade das mortes por doença hepática envolve álcool 1 , e a ALD é responsável por quase 1 em cada 3 transplantes de fígado 2 . ALD tem um amplo espectro. A esteatose, que se caracteriza pelo excesso de acumulação de lípidos nos hepatócitos, ocorre no estágio inicial de consumo excessivo de álcool e é reversível após a cessação do uso de álcool. Sob a influência de fatores genéticos e ambientais ea ingestão contínua de álcool, a esteatose hepática pode evoluir para hepatite alcoólica e, eventualmente, cirrose 3 . Estudos usando os modelos de ALD de roedores forneceram insights substanciais sobre a doença, mas eles têm limitações (revisado na referência 3 ). A alimentação oral de uma dieta com álcool só causa esteatose em roedores 4 , </ Sup> 5 . O desenvolvimento de inflamação e fibrose requer um segundo insulto 6 , 7 ou infusão intragástrica crônica, que é invasiva e tecnicamente desafiadora 8,9 . O tele-peixe-zebra também desenvolve lesão hepática em resposta ao tratamento crônico e álcool agudo 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Em particular, o peixe-zebra larval representa um organismo modelo complementar atractivo no qual se estuda a lesão hepática alcoólica aguda 10 , 11 , 13 , 15 . O fígado zebrafish é funcional e produz enzimas-chave para o metabolismo de etanol por 4 dias(Dpf) 13,16,17. O etanol pode ser adicionado diretamente à água ea exposição a etanol a 2% por 24 h é suficiente para induzir esteatose hepática e respostas fibrogênicas em larvas de peixe-zebra 13,15.

Tem sido relatado que o tratamento com etanol a 2% durante 24 horas resultou numa concentração de etanol tecidual de 80 mM em larvas de peixe-zebra 13 . Outros demonstraram que as larvas toleram esta concentração e que os fenotipos do fígado observados nos animais tratados são específicos da exposição ao etanol 11 , 13 , 15 , 18 . No entanto, como 80 mM é quase letal em seres humanos 19 , é importante avaliar a histologia do fígado do zebrafish tratado com etanol e deteImportância fisiológica para os seres humanos.

O rápido desenvolvimento externo e translucência das larvas de peixe-zebra permitem caracterizar a ação do álcool no fígado em tempo real e em amostras fixas. A disponibilidade de linhas transgênicas fluorescentes específicas de células e os recentes avanços na microscopia confocal facilitam o estudo de como diferentes tipos de células hepáticas modificam sua morfologia e comportamento em resposta ao tratamento agudo com etanol 11,15. No entanto, a imagem confocal do peixe-zebra transgénico fluorescente não pode substituir completamente a coloração com Hematoxilina e Eosina (H & E) quando se estuda a histologia do fígado. A marcação de todos os tipos de células hepáticas ao mesmo tempo utilizando peixes-zebra transgênicos requer a geração de linhas transgênicas individuais, cada uma rotulando um tipo de célula hepática com um fluoróforo único. A introdução de diferentes fundos transgênicos no mesmo peixe requerG gerações múltiplas, o que é demorado e oneroso. É necessária uma imunofluorescência adicional para detectar os componentes da matriz extracelular. A coloração de H & E, por outro lado, rotula simultaneamente todos os tipos de células hepáticas e componentes de matriz extracelular, proporcionando assim uma visão geral do fígado 20 . Além disso, revela prontamente várias características histopatológicas de doenças hepáticas, tais como morte de hepatócitos, esteatose e fibrose. Embora H & E é uma mancha de rotina na histologia do fígado de mamíferos, não é comumente usado na pesquisa de fígado zebrafish, eo protocolo é menos bem estabelecida.

Este trabalho descreve um protocolo para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e para as análises histológicas de seguimento com coloração de H & E. O protocolo de coloração de H & E pode ser usado em todos os estudos de desenvolvimento e função do fígado. Além disso, as seções de parafina podem ser usadas para imuno-histoquímica, bem como para outrasIns na patologia hepática, incluindo a mancha tricrômica, mancha reticulina, etc.

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Protocol

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AB WT adultos e larvas de peixe-zebra foram mantidos em condições padrão 21 de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health publicação 86-23, revisto em 1985); Sua utilização foi aprovada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC).

1. Preparação de Soluções

  1. Prepare a água do ovo.
    1. Preparar a solução salina de reserva dissolvendo 40 g de sal marinho comercial em 1 L de água duplamente destilada (ddH 2 O). Agitar até todos os sais terem sido completamente dissolvidos.
    2. Preparar solução de azul de metileno a 0,1% por adição de 0,1 g de pó a 100 mL de ddH2O.
      CUIDADO: O azul de metileno é irritante se entrar em contacto com os olhos ou com a pele. Use sempre um casaco de laboratório e luvas ao manusear o pó.
    3. Combinar 28,125 mL de sal deE 7 mL de solução de azul de metileno em um tubo cônico de 50 mL. Misture bem. Adicionar esta mistura a 15 L de ddH 2 O. Agitar bem e armazenar à temperatura ambiente.
  2. Preparar 100 mL de Tris-HCl 1 M adicionando 12,1 g de Tris em pó a 100 mL de ddH2O. Ajustar o pH para 9,0 usando ácido clorídrico (HCl).
    CUIDADO: O HCl pode causar queimaduras graves e irritação das mucosas se inalado. Sempre usar um laboratório de casaco e luvas e lidar com a garrafa de estoque em uma capa química.
  3. Preparar 0,4% de tricaína (3-aminobenzoato metanossulfonato).
    1. Dissolver 2 g de tricaína em pó em 489,5 mL de ddH2O. Adicionar 10,5 mL da solução de Tris-HCl, pH 9. Misture com uma barra de agitação até todo o pó dissolvido. Ajustar para pH 7,0.
      CUIDADO: Tricaine em pó pode ser um irritante respiratório. Sempre use uma máscara de pó quando manusear o pó.
    2. Alicuotar 45 mL da solução de tricaína em tubos cônicos de 50 mL. Mantenha a soluçãoN a 4 ° C para uso imediato e a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
  4. Prepare o fixador de Dietrich combinando 30 mL de etanol a 95%, 10 mL de formaldeído a 37%, 2 mL de ácido acético glacial e 58 mL de ddH 2 O em um frasco de vidro. Misturar bem rodando e armazenar à temperatura ambiente.
    CUIDADO: O formaldeído é um carcinógeno suspeito, e qualquer solução com formaldeído deve ser usado em um capuz químico. O ácido acético glacial pode causar graves queimaduras na pele e lesões oculares. Use sempre um revestimento de laboratório e luvas e lidar com a solução-mãe em uma capa química. O formaldeído, o ácido acético glacial e o etanol a 95% são todos líquidos inflamáveis ​​e devem ser armazenados em um gabinete inflamável designado.
    NOTA: O fixador de Dietrich é estável à temperatura ambiente por 1 ano.
  5. Preparar 1 L de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS) adicionando 80 g de cloreto de sódio (NaCl), 2 g de cloreto de potássio (KCl), 14,4 g de fosfato dissódico (Na2HPO4) e 2.4 g de fosfato monopotássico (KH2PO4) até 800 mL de ddH2O. Ajustar para pH 7,4 utilizando hidróxido de sódio (NaOH) e adicionar ddH2O a um volume final de 1 L. Armazenar esta solução à TA após autoclavagem num ciclo líquido que purga durante 1 min e incuba a 121 ° C durante 20 min.
  6. Fazer 1 L de 1x PBS diluindo 100 mL da solução 10x PBS em 900 mL de ddH 2 O. Misture bem por agitação e armazene à temperatura ambiente após autoclavagem.
  7. Preparar 3% de agarose em uma garrafa de vidro para a montagem do embrião.
    1. Adicionar 3 g de agarose a 100 mL de ddH 2 O e misturar por turbilhão. Aquecer a mistura por microondas para dissolver a agarose, e observar cuidadosamente durante o aquecimento para garantir que haja mínimo de ebulição.
      CUIDADO: O frasco provavelmente estará quente quando removido do microondas, apesar do curto aquecimento. Use uma luva ou uma luva protetora para remover a garrafa do microondas.
    2. Retire a garrafa do microondas.Enquanto roda suavemente, procure por cristais que não estejam completamente dissolvidos; Se não houver cristais, a solução está pronta para uso. Armazenar o 3% de agarose à RT e aquecer novamente antes de usar.
  8. Filtrar a solu�o stock de hematoxilina de Harris para remover quaisquer s�idos que tenham precipitado.
    1. Dobre um filtro de café ao meio para que o filtro crie um cone. Abra o painel lateral para que o líquido passe pelo filtro, permitindo que os detritos sejam capturados.
    2. Coloque o filtro dentro de um funil e do funil em um frasco de vidro de mídia. Gradualmente despeje a hematoxilina em estoque através do filtro.
      CUIDADO: A hematoxilina é perigosa em caso de contato com os olhos, ingestão e inalação. Use sempre um revestimento de laboratório e luvas e lidar com a solução-mãe em uma capa química.
  9. Preparar HCl a 0,05% por adição de 125 μL de HC1 12 N a 250 mL de ddH2O.
  10. Preparar a mistura de solução de eosina Y-floxina B combinando 25 mL de 1% eOsin Y (aq), 2,5 mL de 1% de fxxina B (aq), 195 mL de etanol a 95% e 1 mL de ácido acético glacial num frasco de vidro. Misture bem ao rodar e armazenar à temperatura ambiente
    CUIDADO: A eosina Y é perigosa no caso de contato com os olhos, ingestão e inalação. Use sempre um revestimento de laboratório e luvas e lidar com a solução-mãe em uma capa química.
  11. Preparar 2% de etanol por adição de 2 mL de álcool etílico puro a 98 mL de água de ovo.
    CUIDADO: O álcool etílico é irritante para os olhos. Use sempre equipamento de protecção adequado quando manusear álcool etílico. Também é inflamável e deve ser manuseado e armazenado em conformidade.
    NOTA: Prepare cada vez 2% de etanol fresco antes de realizar o tratamento com etanol agudo.

2. Realizar tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra

  1. Para gerar embriões, estabelecer cruzes com um macho de tipo selvagem e um peixe fêmea WT por tanque de acasalamento. Separá-los, inserindo um divisor de plástico no tanque de acasalamento.
    NOTA: DefinirUp após a alimentação final do dia para que os peixes são bem alimentados.
    1. Às 8 horas da manhã seguinte, puxe o divisor para permitir que o par acople.
    2. Após 1 h, devolva o peixe adulto ao seu tanque original. Recolher os embriões, despejando a água contendo os embriões em um filtro. Vire o filtro em uma placa de Petri de 100 mm e lave os embriões no prato usando um frasco de lavagem contendo água de ovo. Coloque o prato com os embriões em uma incubadora a 28 ° C.
    3. Quando os embriões atingem pelo menos o estágio de 4 células (1 hpf), remova quaisquer embriões e detritos não fertilizados na água com uma pipeta Pasteur e coloque o prato com os embriões fertilizados em uma incubadora a 28 ° C. Manter os embriões na incubadora a 28 ° C até 96 horas após a fecundação.
    4. Anestesiar o peixe larval adicionando a solução de tricaína à água de ovo a uma razão de 1-10 (volume / volume).
    5. Selecione até quarenta larvas de 96 hpf que tenham uma bexiga inflada usandoUma pipeta Pasteur e dividi-los uniformemente em duas novas placas de Petri.
    6. Retire o máximo de água de ovo residual possível. Em uma densidade de uma larva por mL, adicione água de ovo contendo etanol a 2% a um prato. Adicione a mesma quantidade de água do ovo ao outro prato para servir como o controle.
    7. Manter o controle e as larvas tratadas com etanol na sala de peixes por 24 h.
      NOTA: Realizar o tratamento com etanol em uma sala de peixes com um ciclo de 14 h de luz / 10 h de escuro resulta em lesões hepáticas mais consistentes e robustas do que a condução do experimento no escuro em uma incubadora.
    8. Recolher as larvas em um tubo de centrifugação de 1,5 mL com não mais de 20 larvas por tubo.
    9. Retire o máximo de líquido possível das larvas e adicione pelo menos 1 mL (10x volume de tecido) do fixador de Dietrich no capô químico. Permitir que o peixe para fixar em um nutator à temperatura ambiente durante pelo menos 24 h.
      NOTA: Os peixes são estáveis ​​no fixador de Dietrich durante várias semanas.
<P class = "jove_title"> 3. Preparação de cassetes de tecidos e processamento

  1. Definir o número necessário de cassetes de tecido e duas almofadas de biópsia azul por cassete. Coloque um bloco de biópsia na parte inferior de cada cassete. Rotule cada cassete a lápis, identificando claramente a amostra.
    NOTA: Não use caneta ou marcador para rotular as cassetes, porque a rotulagem será perdida em etapas posteriores.
  2. Incorporar as larvas em agarose a 3% para assegurar a orientação consistente de todas as amostras.
    1. Remover o fixador dos tubos em uma capa química e lavar as larvas 3 vezes durante 5 min cada com 1 mL de 1x PBS. Colocar os tubos num nutator à RT durante as lavagens.
    2. Durante as lavagens, aquecer a agarose preparada a 3% em água utilizando um microondas para derreter o sólido. Aqueça durante 30 s de cada vez e observe cuidadosamente para minimizar a fervura. Manter a agarose líquida sobre uma placa quente ajustada para 90 ° C com agitação suave.
    3. Usando uma pipeta de transferência, transfira até 8 lArvae a um molde plástico da histologia e remova tanto PBS quanto possível. Utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada, encha completamente o molde com 3% de agarose.
    4. Usando uma seringa de insulina, recolher as larvas para o centro do molde e empurrá-los para o fundo. Para seções sagitais, posicione as larvas em uma linha, com as cabeças em direção ao topo do molde. Para assegurar que os fígados são orientados de uma maneira consistente, vire as larvas de modo que o lado esquerdo do corpo fique voltado para baixo e plana contra o fundo do molde.
      NOTA: Como o fígado está localizado no lado esquerdo do corpo, tal posicionamento minimiza o número de seções que precisam ser cortadas antes de atingir o fígado. Mantenha as larvas o mais próximas possível uma da outra.
    5. Definir o molde para o lado por 4-5 min para permitir que a agarose para definir completamente. Remover o bloco de agarose do molde e usar uma lâmina de barbear para aparar a agarose em torno das larvas. Stand o bloco na extremidade e cortar a espessura em metade sO que o bloco final é cerca de 2-3 mm de espessura.
    6. Transferir o pequeno bloco de agarose para a cassete de tecido preparada (passo 3.1) e colocar a segunda placa de biópsia sobre o bloco. Feche a cassete e coloque a cassete totalmente montada em um recipiente vedável com etanol 70% preparado recentemente em ddH2O.
      NOTA: Se as cassetes não forem processadas imediatamente, coloque-as em etanol a 70% num recipiente a 4 ° C para evitar uma perda de fixação. As cassetes são estáveis ​​a 4 ° C por até 3 dias.
  3. Processamento de tecidos
    NOTA: As amostras podem ser submetidas a um laboratório de histologia ou patologia equipado com um processador de tecido para processar as cassetes em parafina. Solicite um programa de processamento O / N padrão ao invés de um programa curto para que a parafina possa penetrar completamente a agarose.
    1. Processar as cassetes de tecido, transferindo-as através de uma série de diluição de etanol, com uma quantidade crescente de álcool, paraDesidratar o tecido, como se segue: 70% de etanol 2 vezes, 45 min cada; Etanol a 80%, 45 min; 95% de etanol, 2 vezes, 45 min cada; 100% etanol, 2 vezes, 45 min cada.
    2. Substituir o álcool por um solvente (100% xileno, 2 vezes, 45 min cada) para que a parafina infiltre no tecido.
      CUIDADO: Xileno é irritante e é nocivo se inalado. Certifique-se sempre de usar um exaustor químico. Xileno é inflamável e deve ser armazenado em conformidade.
    3. Incubar as cassetes em parafina O / N num incubador a 60-65 ° C. Mantenha as cassetes aquecidas até a incorporação.
  4. Incorporar os blocos de agarose processados ​​em parafina.
    1. Retire uma cassete da gaveta de aquecimento da máquina de encaixe e remova a tampa da cassete e a almofada de biópsia superior da cassete. Preencher um molde de histologia com parafina líquida e mantê-lo sobre a placa quente na máquina de incorporação.
    2. Usando fórceps quentes, pegue o bloco de agarose do cassettE transferi-lo para o molde histológico com parafina. Certifique-se de que o lado do bloco de agarose com o peixe mais próximo da superfície está virado para baixo. Jogue fora a almofada inferior da biópsia e transfira o molde inteiro da histologia à placa fresca na máquina incorporando.
    3. Usando fórceps, posicione rapidamente o bloco de agarose no centro do molde; Coloque o bloco na parte inferior do molde. Uma vez que o bloco está devidamente colocado, coloque o fundo da cassete em cima do molde de histologia e preenchê-lo meio com parafina líquida. Coloque o molde diretamente na placa de 4 ° C e não perturbe os blocos por pelo menos 10-15 min para permitir que a parafina se solidifique. Enquanto o primeiro bloco estiver configurado, repita este processo para os blocos restantes.
    4. Uma vez que a parafina é definida para todos os blocos, retire o molde de histologia do bloco de parafina pressionando suavemente sobre o molde para soltá-lo. Estes blocos de parafina podem ser armazenados a temperatura ambiente indefinidamente.
  5. 4. Corte de blocos de parafina

    1. No dia anterior à seccionamento, faça face no bloco de parafina usando um micrótomo para remover o excesso de parafina cobrindo o tecido. Seção 5 μm de cada vez até que o tecido seja exposto na superfície do bloco de parafina. Pare e descarte todas as seções que são cortadas. Mergulhe os blocos com a face voltada para baixo em 1x PBS a 4 ° CO / N.
      NOTA: Os blocos devem ser embebidos durante pelo menos 8 h. Comece a imersão no final do dia. Se os blocos são deixados em 1x PBS por muito tempo, o tecido pode inchar e tornar-se distorcida.
    2. Remover um bloco de cada vez a partir do 1x PBS e cortar 5 μ m seções usando um microtome. Separe a fita das seções da lâmina puxando suavemente a última seção para longe da lâmina usando pinças ou uma escova. Pegue a fita pela última seção usando o fórceps e transferi-lo para um banho de água a 42 ° C. Permitir que as fitas para flutuar na superfície da água durante pelo menos 5 min.
      NOTA:N transferindo seções, não deixe o fórceps tocar a água enquanto ainda em contato com a parafina. Caso contrário, a parafina irá derreter sobre a pinça e tornar a separação muito difícil. Se necessário, separe as seções em grupos menores usando pinças limpas para que possam encaixar facilmente nas lâminas. Toque delicadamente a costura entre as seções para criar a separação sem danos.
    3. Coloque um slide carregado na água em um ângulo de 45 graus e cuidadosamente colocá-lo debaixo do grupo de seções a serem coletadas. Levante cuidadosamente a lâmina da água e deixe que as seções se encaixem na lâmina.
    4. Blot qualquer excesso de água das seções usando tecido sem fiapos. Coloque a lâmina em um porta-lâminas ou caixa. Continue a seccionar o bloco até que o tecido desejado tenha sido recolhido. Repita o processo de corte para todos os blocos.
    5. Asse as lâminas em uma incubadora a 55 ° C ou forno por 3-16 h para derreter a parafina. Retire as lâminas do forno eO esfriar antes de começar a coloração.
      NOTA: As secções de parafina podem ser armazenadas à RT indefinidamente, antes e depois do cozimento.

    5. Coloração com Hematoxilina e Eosina de Secções de Parafina

    1. Desparafinar as lâminas mergulhando-as em xileno a 100% durante 15 min; Alterá-lo para 100% xileno fresco por mais 15 min.
    2. Rehydrate as lâminas mergulhando-os através da seguinte série de etanol graduado até que o líquido corre limpo das lâminas. Para cada solução mergulhar 8-10 vezes, 2 s por dip: etanol a 100%, etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 95%, etanol a 70%, etanol a 50%, etanol desionizado e água desionizada.
      NOTA: O protocolo pode ser parado aqui, e os slides podem ser deixados à temperatura ambiente em água por várias horas. Se necessário, as lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C em água O / N.
    3. Colocar as lâminas em hematoxilina Harris filtrada a 100% durante 4 min. Imediatamente transferi-los de volta para o recipiente com água desionizada. Executar água desionizada em tCanto traseiro do recipiente mais distante das seções. Esvazie o recipiente periodicamente até que a água não seja mais púrpura.
      NOTA: Não deixe a água correr diretamente sobre as lâminas, pois as seções podem sair das lâminas.
    4. Verifique rapidamente a intensidade de hematoxilina em um microscópio de dissecação usando luzes gooseneck; Não permita que os slides seque. Se a mancha tiver atingido a intensidade desejada, passe para a próxima etapa. Se a cor não for suficientemente escura, coloque as lâminas em hematoxilina a 100% durante 1 min e repita as lavagens com água antes de verificar novamente.
      NOTA: A hematoxilina precisa ser escura o suficiente para que a cor não seja perdida durante a coloração com eosina. Contudo, se a coloração com hematoxilina for observada no citoplasma, as secções são sobrecarregadas.
    5. Mergulhar as lâminas duas vezes em HCl a 0,05% e imediatamente transferi-los de volta para o recipiente com água deionizada limpa. Esvazie a água e encher o recipiente com água duas vezes.
    6. Transfira os slides para 95% etHanol durante 30 s e depois transferi-los para um novo recipiente com etanol a 95% durante 30 s.
    7. Colocar as lâminas na solução de eosina Y-phloxine B durante 2 min. Transferir as lâminas de volta para o recipiente de 95% de etanol anterior e verificar rapidamente a intensidade da cor sob o microscópio de dissecação. Se a coloração for suficiente, prossiga para a próxima etapa. Caso contrário, volte à solução de eosina por 30 s, verifique novamente e repita conforme necessário.
      NOTA: A coloração com suficiente eosina é cor de rosa brilhante e aparece em contraste distinto à mancha de hematoxilina. Certifique-se de limpar qualquer solução fora da parte de trás dos slides quando a verificação sob o microscópio para que nenhuma cor falsa é observada. Como a eosina é composta de etanol a 95%, períodos de tempo prolongados em etanol a 95% enquanto se verifica a intensidade da cor pode lixiviar algumas das cores.
    8. Transferir as lâminas para 100% de isopropanol durante 15 s. Substituir por isopropanol 100% fresco e colocar as lâminas de volta no isopropanol por mais 15 s. Repita este pPara um total de 6 lavagens de isopropanol.
      CUIDADO: O isopropanol é irritante para os olhos e as vias respiratórias. Certifique-se sempre de usar equipamento de proteção adequado e evitar salpicos. Também é altamente inflamável e deve ser armazenado e manuseado adequadamente.
      NOTA: Para economizar em reagentes, descarte somente a primeira (mais rosa) lavagem de isopropanol. Manter as outras cinco soluções de lavagem em garrafas numeradas de 1 a 5, para serem reutilizadas para a próxima coloração. Quando reutilizar lavagens, comece com a garrafa numerada "1" e descarte após o uso. Uma vez que a lavagem "2" foi usada, despeje-a na garrafa "1", e assim por diante. A lavagem final deve ser sempre isopropanol fresco.
    9. Colocar as lâminas em xilenos a 100% durante 3 min. Remova um slide de cada vez e coloque um lamínula.
      1. Adicionar meio de montagem suficiente para cobrir as secções e mergulhá-los em xileno a 100%.
        NOTA: Esta etapa irá alisar a superfície do meio de montagem e remover todas as bolhas.
      2. Aplicar uma lamelaPara o fundo do slide.
        NOTA: O meio de montagem deve puxar a corrediça para a posição. Se o lamínula não estiver em linha reta ou completamente assentado, bata delicadamente no lugar.
      3. Blot qualquer excesso médio de montagem em uma toalha de papel até que apenas uma linha fina é visto. Mergulhe um lenço de papel no xileno e limpe a parte traseira da lâmina para remover qualquer meio que tenha pingado. Coloque o slide plana sobre uma superfície resistente mas móvel, como um pedaço de papelão. Coverslip todos os slides restantes na mesma moda. Permitir que o xileno para evaporar no capô por 10 min.
        NOTA: Todos os materiais contaminados com xileno devem ser removidos e descartados em um recipiente selado no capuz para evitar qualquer escape de vapores.
    10. Permitir que o meio de montagem endurecer em RT O / N.

    6. Imaging e armazenamento de slides manchados

    1. Seções de imagem em um microscópio invertido composto 18 .
      NOTA: As lâminas podem ser mantidas na sala teIndefinidamente.

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Representative Results

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10% de formalina tamponada e 4% de paraformaldeído (PFA) são dois dos fixadores mais comuns utilizados para as práticas histológicas. Contudo, não proporcionam resultados de fixação óptimos para o tecido hepático do peixe-zebra ( Figura 1 e Tabela 1 ). A fixação com formalina a 10% ou PFA a 4% resulta frequentemente em retracções, criando grandes lacunas entre o fígado e os tecidos circundantes ( Figura 1A , B , a Figura 1B fornece um exemplo de encolhimento de tecido). Porções do tecido do fígado também podem cair fora da seção. O citoplasma dos hepatócitos é frequentemente perdido ( Figura 1A , 1B ). Ambos os fixadores podem causar distorção dos hepatócitos, pois eles encolhem ou incham e não mantêm mais a morfologia colunar que é característica das células epiteliais. Uma questão adicional com a fixação da PFA éQue existem espaços entre os hepatócitos que não são reais, o que faz com que o tecido pareça fraturado ( Figura 1B ). Além disso, quando um destes dois fixadores é utilizado, os hepatócitos são bem corados com hematoxilina, mas menos com a eosina ( Figura 1A ). O fixador Dietrich baseado em ácido supera as questões com os fixadores de formalina e PFA ( Figura 1C ).

Na ALD humana, a esteatose, que é composta de gordura de pequenas e grandes gotículas, é mais proeminente perto da veia central e se estende para fora em direção à tríade portal com gravidade crescente 22 . No peixe-zebra, o tratamento com etanol a 2% de 96-120 hpf também induz estatose hepática, o que está implicado pela deposição excessiva de gotículas redondas nos hepatócitos ( Figura 2B , setas). No entanto, as gotas não apresentamTa padrão de distribuição semelhante ao observado em ALD humano, porque não há distinção clara de veias portal e central no fígado zebrafish [ 23] . Os vasos sanguíneos hepáticos no fígado larval tratado com etanol estão inchados em comparação com os do fígado de controlo ( Figura 2B , asteriscos).

figura 1
Figura 1 : Comparações da coloração de H & E nos fígados de larvas de peixe-zebra que foram fixadas com fixadores de Differert a 120 hpf. ( A ) 10% de formalina a RT O / N; ( B ) PFA a 4% a 4 ° CO / N; ( C ) fixador de Dietrich � TA durante 24 h. Com 10% de formalina, os hepatócitos muitas vezes perdem seu citoplasma (A). O tecido não é manchado corretamente com eosina e parece roxo. Depois de fixaCom 4% de PFA, observam-se lacunas entre os hepatócitos (B). 4% PFA faz com que o tecido hepático encolher, por isso parece haver uma grande lacuna entre o fígado e os tecidos circundantes. A linha tracejada em B marca a borda dos tecidos circundantes. O fixador de Dietrich fornece o resultado ideal entre os três (C). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 : Tratamento agudo com etanol causa esteatose hepática e inchaço do vaso sanguíneo em Zebrafish Larval Fígados. ( A ) coloração de H & E do fígado numa larva de controlo, não tratada, WT. ( B ) coloração de H & E do fígado numa larva de tipo wil que foi tratada com 2% de ethaNol de 96 - 120 hpf. Ambos os animais foram fixados com fixador Dietrich em 120 hpf. As setas em (B) apontam para os hepatócitos com deposição excessiva de gotas redondas. Os asteriscos marcam os vasos sanguíneos hepáticos inchados. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10% de formalina 4% PFA Fixador de Dietrich
Condições de fixação Pelo menos 24 h à RT 3 h a RT ou O / N a 4 ° C Pelo menos 24 h à RT
Fixação pós-armazenamento de amostras Indefinidamente em RT Até 2 semanas a 4 ° C Até 2 meses à RT
CompatibCom extração de DNA genômico sim sim Não
Encolhimentos sim sim Mínimo
Distorção de células sim sim Mínimo
Perda de detalhes de celular sim Modesto Mínimo
Mancha equilibrada de H & E Fraca mancha de eosina Fraca mancha de eosina sim
Compatibilidade com imunohistoquímica sim sim sim

Tabela 1: Comparações de formalina a 10%, PFA a 4% e fixadores de Dietrich para histologia hepática de peixe-zebra.

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Discussion

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O protocolo atual descreve um procedimento detalhado para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e as análises histopatológicas subsequentes com coloração de H & E. O tratamento agudo com etanol deve ser realizado não antes de 96 h após a fecundação, pois esta é a fase em que o fígado zebrafish começa a expressar enzimas metabolizadoras de álcool 13 . 2% de etanol é a dose máxima que as larvas podem tolerar 13 , 14 . As larvas tratadas com etanol começam a apresentar esteatose hepática por 8 h de tratamento e as percentagens de esteatose em desenvolvimento de larvas continuam a aumentar até 24 h de tratamento contínuo 14 . Zebrafish larvas absorver nutrientes exclusivamente a partir da gema até 120 hpf. Portanto, o tratamento com etanol além de 120 hpf não é recomendado, pois o jejum também pode contribuir para a esteatose 14 . Comparado com protocolos publicados por outros laboratóriosOratórios 13 , 24 , a principal modificação feita no protocolo atual é que o tratamento com etanol é conduzido em uma instalação de peixe que tem um ciclo de 14 h de luz / 10 h de escuro. Isto resulta em respostas esteat�icas mais consistentes e robustas do que aquelas vistas quando o tratamento � conduzido no escuro numa incubadora. Isso pode estar relacionado ao fato de que os genes metabólicos lipídicos no fígado zebrafish mostram a expressão do ritmo diário em resposta ao ciclo claro / escuro 25 .

ALD é uma doença crônica e leva anos de abuso de álcool. A limitação crítica do atual protocolo de tratamento do etanol é que ele só aciona os efeitos agudos do álcool no fígado. O tratamento com uma concentração tão alta de etanol durante mais de 48 horas causa alta mortalidade, impedindo o estudo da lesão hepática crônica. Um estudo recente descobriu que o tratamento contínuo de peixe-zebra adulto com etanol a 1% por até trêsMeses levou a esteatose, esteatohepatite e fibrose 12 . Uma direção futura promissora poderia ser identificar um potencial modulador de ALD usando o protocolo de tratamento de etanol agudo e depois validar seu efeito no modelo de lesão crônica.

A coloração de H & E é realizada para avaliar os danos hepatocelulares induzidos pelo tratamento agudo com etanol. Devido à facilidade de realização de imagens de fluorescência em zebrafish, H & E coloração não é rotineiramente utilizado em zebrafish histologia do fígado, eo procedimento é menos bem descrito. O protocolo atual fornece uma descrição passo a passo da coloração de H & E no fígado larval. Escolhendo o fixador correto é a primeira e mais essencial etapa para H & E coloração. Embora 10% de formalina tamponada e 4% de PFA sejam comummente utilizados na histologia, ambos causam retrações teciduais e porções do fígado caindo da secção. A fixação de formalina a 10% leva à perda de citoplasma no hepatOcytes. A fixação de 4% de PFA resulta em intervalos artificiais entre os hepatócitos. A coloração com eosina parece ser muito mais fraca do que a coloração com hematoxilina nos fígados que são fixados com qualquer fixador. O fixador à base de ácido Dietrich é mais adequado para H & E coloração do fígado peixe-zebra, uma vez que preserva detalhes celular e minimiza encolhimento. Também parece penetrar tecido adiposo, como o fígado, mais rápido do que a formalina e PFA. A coloração com hematoxilina e eosina é mais equilibrada. Uma advertência do fixador de Dietrich é que não é compatível com a extração de DNA genômico. Numa experiência de ensaio, o ADN genómico foi extraído das larvas que foram fixadas utilizando formalina a 10%, PFA a 4% ou fixador de Dietrich 26 . As larvas foram incubadas em 50 μL de NaOH 50 mM a 95 ° C durante 20 min e depois foram arrefecidas a 4 ° C. Adicionaram-se então 5 μL de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 para neutralizar a solução básica. Após uma breve centrifugação, o sobrenadante wComo utilizado em PCR. Com os mesmos iniciadores de PCR e programa de PCR, o ADN genómico tanto das larvas fixadas com formalina como PFA produziu produtos de PCR com os tamanhos previstos, enquanto que o ADN genómico das larvas fixadoras fixas de Dietrich não conseguiu produzir quaisquer produtos de PCR.

A coloração de H & E pode ser realizada tanto em secções de parafina como em secções congeladas. No entanto, as secções de parafina têm as seguintes vantagens em relação às secções congeladas: 1) Considerando que as secções de parafina podem ser armazenadas a temperatura ambiente indefinidamente, as secções congeladas só podem ser armazenadas a -80 ° C durante um período máximo de um ano. 2) Para secções congeladas, a formação de cristais de gelo dentro das células pode perturbar a morfologia celular e detalhe subcelular. Além disso, as secções congeladas são frequentemente mais espessas do que as secções de parafina. Isto pode resultar em imagens pobres da morfologia do tecido em comparação com aqueles produzidos a partir de seções de parafina.

Ao preparar blocos de parafina para tecidos do fígado, o protocolo atualIncorpora as larvas em agarose. As larvas são posicionadas lateralmente, com o lado esquerdo do corpo virado para baixo e deitado de encontro ao fundo do molde. Isto assegura a orientação consistente dos fígados, de modo que quando as secções são cortadas sequencialmente, regiões equivalentes do fígado podem ser comparadas de peixe a peixe 27 . Outra etapa fundamental que garante o sucesso H & E coloração é o desenvolvimento de cores. É crucial verificar a coloração com freqüência até que a intensidade de cor desejada seja atingida.

A coloração de H & E deve ser usada para obter uma avaliação preliminar da lesão hepática. As larvas tratadas com etanol apresentam deposição excessiva de gotículas redondas nos hepatócitos, sugestivos de esteatose 13,14,18. A marcação com corantes lipídicos, tais como óleo vermelho O e vermelho do Nilo, é necessário para confirmar que estas gotículas são realmente lipídios. Os vasos sanguíneos hepáticosOs animais tratados aparecem dilatados e inchados. Microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão devem ser realizadas para examinar as alterações ultraestruturais nos sinusóides. Tem sido relatado anteriormente que a deposição de proteína da matriz extracelular é aumentada no fígado zebrafish tratado com etanol, como detectado por imunofluorescência 18 . No entanto, dado que os níveis de expressão dos genes fibrogénicos são apenas modestamente aumentados no peixe tratado 18 , H & E pode não ser sensível o suficiente para detectar uma quantidade tão pequena de proteínas da matriz extracelular. Os mesmos métodos fixadores e de coloração foram testados nos fígados de peixe-zebra adulto cronicamente lesados ​​e foram suficientes para detectar fibrose (Yin, dados não publicados).

Embora o protocolo atual é adaptado para o exame da histologia do fígado em larvas de peixe-zebra, ele tem uma aplicação mais ampla para a comunidade de pesquisa zebrafish, como o samE protocolo pode ser aplicado a outros tecidos e adultos zebrafish.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Dra. Katy Murray no Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert e Kari Huppert no CCHMC, pelos seus conselhos úteis sobre o protocolo; E serviço veterinário CCHMC, para o cuidado com peixes. Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R00AA020514 e uma bolsa de investigação do Centro de Genómica Pediátrica no CCHMC (para CY). Foi também apoio em parte pelo NIH concessão P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) do Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas Core em Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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References

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Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra
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Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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