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Developmental Biology

Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

Este protocolo describe el análisis histológico de los hígados de larvas de pez cebra que se han tratado con etanol al 2% durante 24 h. Este tratamiento agudo con etanol da lugar a esteatosis hepática ya hinchamiento de la vasculatura hepática.

Abstract

Alcoholic Liver Disease (ALD) se refiere al daño al hígado debido al abuso de alcohol agudo o crónico. Está entre las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el alcohol y afecta a más de 2 millones de personas en los Estados Unidos. Una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la lesión hepática inducida por el alcohol es crucial para el desarrollo de un tratamiento eficaz para la ALD. Las larvas de pez cebra presentan esteatosis hepática y fibrogénesis después de sólo 24 horas de exposición a etanol al 2%, lo que las hace útiles para el estudio de la lesión hepática alcohólica aguda. Este trabajo describe el procedimiento para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y muestra que causa esteatosis e hinchazón de los vasos sanguíneos hepáticos. También se describe un protocolo detallado para la tinción con hematoxilina y eosina (H & E) que se optimiza para el análisis histológico del hígado larval del pez cebra. La tinción de H & E tiene varias ventajas únicas sobre la inmunofluorescencia, ya queEr y los componentes extracelulares simultáneamente y pueden detectar fácilmente lesión hepática, tal como esteatosis y fibrosis. Dado el uso creciente de pez cebra en el modelado de la toxina y la lesión hepática inducida por virus, así como las enfermedades hepáticas hereditarias, este protocolo sirve como referencia para los análisis histológicos realizados en todos estos estudios.

Introduction

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La enfermedad hepática alcohólica (ALD), que es causada por el consumo excesivo de alcohol, es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con el alcohol. En los Estados Unidos, casi la mitad de las muertes por enfermedad hepática implican alcohol 1 , y ALD es responsable de casi 1 de cada 3 trasplantes de hígado [ 2] . ALD tiene un amplio espectro. La esteatosis, que se caracteriza por un exceso de acumulación de lípidos en los hepatocitos, se produce en la etapa temprana del consumo intensivo de alcohol y es reversible al cesar el consumo de alcohol. Bajo la influencia de factores genéticos y ambientales y la ingesta continua de alcohol, la esteatosis hepática puede progresar a la hepatitis alcohólica y, finalmente, la cirrosis 3 . Los estudios que usan los modelos ALD de roedores han aportado ideas sustanciales sobre la enfermedad, pero tienen limitaciones (revisadas en la referencia 3 ). La alimentación oral de una dieta con alcohol sólo causa esteatosis en roedores 4 , </ Sup> 5 . El desarrollo de la inflamación y la fibrosis requiere un segundo insulto 6 , 7 o una infusión intragástrica crónica, que es invasiva y técnicamente desafiante 8 , 9 . El pez cebra teleósteo también desarrolla lesión hepática en respuesta al tratamiento de alcohol crónico y agudo 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . En particular, el pez cebra larvario representa un organismo modelo complementario atractivo en el que estudiar la lesión hepática alcohólica aguda 10 , 11 , 13 , 15 . El hígado de pez cebra es funcional y produce enzimas clave para el metabolismo del etanol por 4 días(Dpf) 13 , 16 , 17. El etanol se puede añadir directamente al agua y la exposición a etanol al 2% durante 24 h es suficiente para inducir esteatosis hepática y respuestas fibrogénicas en larvas de pez cebra 13,15.

Se ha informado de que el tratamiento con etanol al 2% durante 24 h dio lugar a una concentración de etanol de tejidos de 80 mM en larvas de pez cebra [ 13] . Otros han demostrado que las larvas toleran esta concentración y los fenotipos hepáticos observados en los animales tratados son específicos de la exposición al etanol 11 , 13 , 15 , 18 . Sin embargo, debido a que 80 mM es casi letal en los seres humanos 19 , es importante evaluar la histología del hígado de zebrafish tratado con etanol y deteDeterminar la relevancia fisiológica para los seres humanos.

El rápido desarrollo externo y la translucencia de las larvas de pez cebra permiten caracterizar la acción del alcohol en el hígado en tiempo real y en muestras fijas. La disponibilidad de líneas transgénicas fluorescentes específicas del tipo de célula y los recientes avances en microscopía confocal facilitan el estudio de cómo diferentes tipos de células hepáticas cambian su morfología y comportamiento en respuesta al tratamiento agudo con etanol 11 , 15 . Sin embargo, la imagen confocal del pez cebra transgénico fluorescente no puede sustituir por completo a la tinción con hematoxilina y eosina (H & E) cuando se estudia la histología del hígado. La marcación de todos los tipos de células hepáticas al mismo tiempo utilizando transgénicos pez cebra requiere la generación de líneas transgénicas individuales, cada una de las etiquetas de un tipo de células del hígado con un único fluoróforo. Introducción de diferentes fondos transgénicos en el mismo pez requiere breedinG generaciones múltiples, lo cual requiere mucho tiempo y es costoso. Se necesita tinción de inmunofluorescencia adicional para detectar componentes de la matriz extracelular. Por otro lado, la tinción con H & E marca simultáneamente todos los tipos de células hepáticas y componentes de la matriz extracelular, proporcionando así una visión general del hígado 20 . Además, revela fácilmente varios rasgos histopatológicos de enfermedades hepáticas, tales como muerte hepatocitaria, esteatosis y fibrosis. Aunque H & E es una mancha de rutina en la histología del hígado de mamíferos, no se utiliza comúnmente en la investigación del hígado de pez cebra, y el protocolo está menos bien establecido.

Este trabajo describe un protocolo para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y para el seguimiento de los análisis histológicos con tinción de H & E. El protocolo de tinción de H & E puede utilizarse en todos los estudios sobre el desarrollo y la función del hígado. Además, las secciones de parafina pueden utilizarse para inmunohistoquímica, así como para otrasIns en la patología hepática, incluyendo la tinción tricrómica, tinción reticulina, etc.

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Protocol

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AB WT adultas y larvas de pez cebra se mantuvieron bajo condiciones estándar 21 de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Institutes of Health, publicación 86-23, revisada en 1985); Su uso fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC).

1. Preparación de Soluciones

  1. Prepare agua de huevo.
    1. Preparar la solución salina madre disolviendo 40 g de sal marina comercial en 1 L de agua doblemente destilada (ddH 2 O). Revolver hasta que todas las sales se hayan disuelto completamente.
    2. Preparar solución de azul de metileno al 0,1% añadiendo 0,1 g de polvo a 100 ml de ddH2O.
      PRECAUCIÓN: El azul de metileno es irritante si entra en contacto con los ojos o la piel. Siempre use una bata de laboratorio y guantes al manipular el polvo.
    3. Se combinan 28,125 ml de sal comúnY 7 ml de solución de azul de metileno en un tubo cónico de 50 ml. Mezclar bien. Añadir esta mezcla a 15 l de ddH 2 O. Agitar bien y almacenar a temperatura ambiente.
  2. Preparar 100 ml de Tris-HCl 1 M añadiendo 12,1 g de polvo Tris a 100 ml de ddH $ ₂ $ O. Ajustar el pH a 9,0 usando ácido clorhídrico (HCl).
    PRECAUCIÓN: El HCl puede causar quemaduras graves e irritación de las membranas mucosas si se inhala. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y maneje la botella común en un capó químico.
  3. Preparar solución de tricaína al 0,4% (metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo).
    1. Disolver 2 g de polvo de tricaína en 489,5 ml de ddH $ ₂ $ O. Añadir 10,5 ml de la solución de Tris-HCl, pH 9. Mezclar con una barra de agitación hasta que todo el polvo se haya disuelto. Ajuste a pH 7,0.
      PRECAUCIÓN: El polvo de Tricaine puede ser un irritante respiratorio. Siempre use una máscara de polvo cuando maneje el polvo.
    2. Alícuota 45 ml de la solución de tricaína en 50 ml de tubos cónicos. Mantener la solutioN a 4 ° C para su uso inmediato ya -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
  4. Prepare el fijador de Dietrich combinando 30 ml de etanol al 95%, 10 ml de formaldehído al 37%, 2 ml de ácido acético glacial y 58 ml de ddH 2 O en una botella de vidrio. Mezclar bien por remolino y almacenar a RT.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es un posible carcinógeno, y cualquier solución con formaldehído debe usarse en un capó químico. El ácido acético glacial puede causar quemaduras severas en la piel y daño ocular. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y maneje la solución madre en un capó químico. El formaldehído, el ácido acético glacial y el etanol al 95% son líquidos inflamables y deben almacenarse en un armario inflamable designado.
    NOTA: El fijador de Dietrich es estable a RT durante 1 año.
  5. Preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato 10 veces (PBS) añadiendo 80 g de cloruro de sodio (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 14,4 g de fosfato disódico (Na2HPO4) y 2.4 g de fosfato monopotásico (KH $ ₂ $ PO $ ₄ $ ) a 800 ml de ddH $ ₂ $ O. Ajustar a pH 7,4 usando hidróxido de sodio (NaOH) y añadir ddH $$ O a un volumen final de 1 L. Guarde esta solución a RT después de autoclavar en un ciclo de líquido que purga durante 1 min y se incuba a 121 ° C durante 20 min.
  6. Hacer 1 L de 1x PBS diluyendo 100 mL de la solución 10x PBS en 900 mL de ddH 2 O. Mezclar bien agitando y almacenar a RT después de autoclave.
  7. Prepare 3% de agarosa en una botella de vidrio para el montaje de embriones.
    1. Añadir 3 g de agarosa a 100 ml de ddH 2 O y mezclar por remolino. Calentar la mezcla por microondas para disolver la agarosa, y vigilar cuidadosamente durante el calentamiento para asegurar que haya un mínimo de ebullición.
      PRECAUCIÓN: Es probable que la botella esté caliente cuando se retira del microondas, a pesar de un calentamiento corto. Use un guante protector o guante para quitar la botella del microondas.
    2. Retire la botella del microondas.Mientras gira con suavidad, busque cualquier cristales que no estén completamente disueltos; Si no hay cristales, la solución está lista para su uso. Almacenar el 3% de agarosa a RT y calentar de nuevo antes de usar.
  8. Filtrar la solución madre de Harris hematoxilina para eliminar cualquier sólido que haya precipitado.
    1. Doble un filtro de café por la mitad para que el filtro crea un cono. Abra el panel lateral de modo que el líquido pase por el filtro, permitiendo que los restos sean atrapados.
    2. Coloque el filtro dentro de un embudo y el embudo en una botella de vidrio. Poco a poco vierta la hematoxilina común a través del filtro.
      PRECAUCIÓN: La hematoxilina es peligrosa en caso de contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y maneje la solución madre en un capó químico.
  9. Preparar HCl al 0,05% añadiendo 125 μl de HCl 12 N a 250 ml de ddH 2 O.
  10. Preparar la mezcla de solución de eosina Y-floxina B combinando 25 ml de 1% de eOsina Y (aq), 2,5 ml de 1% de fl oxina B (aq), 195 ml de etanol al 95% y 1 ml de ácido acético glacial en una botella de vidrio. Mezclar bien por remolino y almacenar a RT
    PRECAUCIÓN: La eosina Y es peligrosa en caso de contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Siempre use una bata de laboratorio y guantes y maneje la solución madre en un capó químico.
  11. Preparar 2% de etanol añadiendo 2 mL de alcohol etílico puro a 98 mL de agua de huevo.
    PRECAUCIÓN: El alcohol etílico es irritante para los ojos. Siempre use equipo de protección adecuado cuando maneje alcohol etílico. También es inflamable y debe ser manipulado y almacenado en consecuencia.
    NOTA: Prepare cada vez 2% de etanol fresco antes de realizar el tratamiento con etanol agudo.

2. Realizar tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra

  1. Para generar embriones, establecer cruces con un macho de tipo salvaje y un pez hembra WT por tanque de apareamiento. Separarlos insertando un divisor de plástico en el tanque de acoplamiento.
    NOTA: SetDespués de la alimentación final del día para que los peces estén bien alimentados.
    1. A las 8 AM de la mañana siguiente, tire del divisor para permitir que el par se acople.
    2. Después de 1 h, regrese el pescado adulto a su tanque original. Recoger los embriones vertiendo el agua que contiene los embriones en un colador. Coloque el colador en una placa de Petri de 100 mm y lave los embriones en el plato usando un frasco de lavado que contiene agua de huevo. Colocar el plato con los embriones en una incubadora a 28 ° C.
    3. Cuando los embriones alcancen por lo menos la fase de 4 células (1 hpf), retire cualquier embrión no fecundado y los desechos en el agua con una pipeta Pasteur y coloque el plato con los embriones fertilizados en una incubadora a 28 ° C. Mantener los embriones en la incubadora a 28 ° C hasta 96 h después de la fecundación.
    4. Anestesiar el pez larvario agregando la solución de tricaína al agua del huevo en una proporción 1-10 (volumen / volumen).
    5. Seleccione hasta cuarenta larvas de 96 hpf que tengan una vejiga natatoria hinchada usandoUna pipeta Pasteur y dividirlos uniformemente en dos nuevas placas de Petri.
    6. Saque la mayor cantidad posible de agua residual de huevo. A una densidad de una larva por ml, agregue agua de huevo que contenga 2% de etanol a un plato. Agregue la misma cantidad de agua de huevo al otro plato para servir como el control.
    7. Mantenga el control y las larvas tratadas con etanol en la sala de pescado durante 24 h.
      NOTA: La conducción del tratamiento con etanol en una sala de pescado que tiene un ciclo de 14 h de luz / 10 h de oscuridad resulta en una lesión hepática más consistente y robusta que la realización del experimento en la oscuridad en una incubadora.
    8. Recoger las larvas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml con no más de 20 larvas por tubo.
    9. Retire la mayor cantidad de líquido posible de las larvas y añada al menos 1 ml (10 veces el volumen del tejido) del fixador de Dietrich en el capó químico. Deje que el pescado se fije en un nutator a temperatura ambiente durante al menos 24 h.
      NOTA: Los pescados son estables en el fijador de Dietrich durante varias semanas.
<P class = "jove_title"> 3. Preparación de Cassettes de Tejidos y Procesamiento

  1. Establezca el número necesario de casetes de tejido y dos almohadillas de biopsia azul por casete. Coloque una almohadilla de biopsia en la parte inferior de cada casete. Etiquetar cada casete a lápiz, identificando claramente la muestra.
    NOTA: No utilice lápiz o rotulador para etiquetar los casetes, porque el etiquetado se perderá en pasos posteriores.
  2. Incrustar las larvas en agarosa al 3% para asegurar la orientación consistente de todas las muestras.
    1. Retire el fijador de los tubos en una campana química y lavar las larvas 3 veces durante 5 minutos cada uno con 1 mL de 1x PBS. Coloque los tubos en un nutator a RT durante los lavados.
    2. Durante los lavados, calentar la agarosa al 3% preparada en agua usando un microondas para fundir el sólido. Caliente durante 30 s a la vez y observe cuidadosamente para minimizar la ebullición. Mantenga la agarosa líquida sobre una placa caliente colocada a 90 ° C con agitación suave.
    3. Utilizando una pipeta de transferencia, transfiera hasta 8 lArvae a un molde plástico de la histología y quitar tanto PBS como sea posible. Utilizando una pipeta de transferencia con la punta cortada, llene completamente el molde con agarosa al 3%.
    4. Usando una jeringa de insulina, recoja las larvas al centro del molde y empuje hacia el fondo. Para las secciones sagitales, coloque las larvas en una línea, con las cabezas hacia la parte superior del molde. Para asegurar que los hígados están orientados de una manera consistente, gire las larvas de manera que el lado izquierdo del cuerpo esté hacia abajo y plana contra el fondo del molde.
      NOTA: Debido a que el hígado se encuentra en el lado izquierdo del cuerpo, este posicionamiento minimiza el número de secciones que necesitan ser cortadas antes de llegar al hígado. Mantenga las larvas tan cerca una de la otra como sea posible.
    5. Establecer el molde a un lado durante 4-5 min para permitir que la agarosa para establecer completamente. Retire el bloque de agarosa del molde y use una hoja de afeitar para recortar la agarosa alrededor de las larvas. Coloque el bloque en el extremo y corte el grosor en la mitad sO que el bloque final tiene aproximadamente 2-3 mm de espesor.
    6. Transferir el pequeño bloque de agarosa a la casete de tejido preparada (paso 3.1) y colocar la segunda almohadilla de biopsia en la parte superior del bloque. Cierre el cassette y coloque el casete completamente montado en un recipiente sellable con etanol 70% preparado recientemente en ddH2O.
      NOTA: Si los casetes no van a ser procesados ​​inmediatamente, colóquelos en etanol al 70% en un recipiente a 4 ° C para evitar una pérdida de fijación. Los casetes son estables a 4 ° C durante un máximo de 3 días.
  3. Procesamiento de tejidos
    NOTA: Las muestras pueden ser sometidas a un laboratorio de histología o patología equipado con un procesador de tejido para procesar los cassettes en parafina. Solicite un programa de procesamiento O / N estándar en lugar de un programa corto para que la parafina pueda penetrar completamente en la agarosa.
    1. Procesar los casetes de tejido transfiriéndolos a través de una serie de dilución de etanol, con una cantidad creciente de alcohol, paraDeshidratar el tejido, como sigue: etanol al 70% 2 veces, 45 minutos cada uno; 80% de etanol, 45 min; 95% de etanol, 2 veces, 45 min cada uno; 100% de etanol, 2 veces, 45 minutos cada uno.
    2. Reemplazar el alcohol con un disolvente (100% de xileno, 2 veces, 45 minutos cada uno) para que la parafina infiltre el tejido.
      PRECAUCIÓN: El xileno es irritante y es dañino si se inhala. Asegúrese de usar siempre un capó químico. El xileno es inflamable y debe almacenarse en consecuencia.
    3. Incubar los casetes en parafina O / N en un incubador a 60-65 ° C. Mantenga los cassettes calientes hasta que se incrusten.
  4. Incorpore los bloques de agarosa procesados ​​en parafina.
    1. Saque un casete del cajón de calentamiento de la máquina de incrustación y retire la tapa del casete y la almohadilla de biopsia superior del casete. Llenar un molde de histología con parafina líquida y mantenerlo en la placa caliente en la máquina de incrustación.
    2. Usando fórceps calientes, recoja el bloque de agarosa del cassettE y transferirlo al molde histológico con parafina. Asegúrese de que el lado del bloque de agarosa con el pez más cercano a la superficie esté hacia abajo. Deseche la almohadilla de biopsia inferior y transfiera el molde de histología entero a la placa fría en la máquina de incrustación.
    3. Usando fórceps, posicione rápidamente el bloque de agarosa en el centro del molde; Coloque el bloque en la parte inferior del molde. Una vez que el bloque se coloca correctamente, coloque la parte inferior del casete encima del molde de histología y llénelo a medio camino con parafina líquida. Coloque el molde directamente sobre la placa de 4 ° C y no altere los bloques durante al menos 10-15 minutos para permitir que la parafina se solidifique. Mientras se está configurando el primer bloque, repita este proceso para los bloques restantes.
    4. Una vez que la parafina se fija para todos los bloques, quite el molde de la histología del bloque de la parafina presionando suavemente en el molde para aflojarlo. Estos bloques de parafina se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente.
4. Corte de los bloques de parafina

  1. El día antes de seccionar, enfríe el bloque de parafina con un micrótomo para eliminar el exceso de parafina que cubre el tejido. Sección 5 μm a la vez hasta que el tejido se expone en la superficie del bloque de parafina. Detenga y deseche todas las secciones cortadas. Remojar los bloques boca abajo en 1x PBS a 4 ° CO / N.
    NOTA: Los bloques deben remojarse durante al menos 8 h. Comience el remojo al final del día. Si los bloques se dejan en 1x PBS durante demasiado tiempo, el tejido puede hincharse y distorsionarse.
  2. Eliminar un bloque a la vez de la 1x PBS y cortar secciones de 5 μm utilizando un microtomo. Separe la cinta de secciones de la cuchilla tirando suavemente de la última sección de la cuchilla con una pinza o un pincel. Recoger la cinta por la última sección usando la pinza y transferirla a un baño de agua a 42 ° C. Deje que las cintas floten en la superficie del agua durante al menos 5 min.
    NOTA:N trasladando secciones, no deje que las pinzas toquen el agua mientras todavía están en contacto con la parafina. De lo contrario, la parafina se fundirá sobre el fórceps y hará la separación muy difícil. Si es necesario, separe las secciones en grupos más pequeños usando pinzas limpias para que puedan encajar fácilmente en los portaobjetos. Suavemente toque la costura entre las secciones para crear separación sin daño.
  3. Coloque una diapositiva cargada en el agua en un ángulo de 45 grados y cuidadosamente la posición debajo del grupo de secciones que se recogerán. Levante con cuidado la corredera del agua y permita que las secciones se fijen a la corredera.
  4. Limpie cualquier exceso de agua de las secciones usando tejido sin pelusa. Coloque la diapositiva en un soporte o caja de diapositivas. Continúe la sección del bloque hasta que se haya recogido el tejido deseado. Repita el proceso de seccionamiento para todos los bloques.
  5. Hornear los portaobjetos en una incubadora a 55 ° C o horno durante 3-16 h para fundir la parafina. Retire los portaobjetos del horno yO enfriar antes de comenzar la tinción.
    NOTA: Las secciones de parafina se pueden almacenar a RT indefinidamente, tanto antes como después de hornear.

5. Tinción con Hematoxilina y Eosina de Secciones de Parafina

  1. Desparafinar los portaobjetos sumergiéndolos en xileno al 100% durante 15 minutos; Cámbielo por 100% de xileno fresco durante otros 15 minutos.
  2. Rehidratar las diapositivas sumergiéndolas a través de las siguientes series de etanol graduado hasta que el líquido salga limpio de las diapositivas. Para cada solución, sumerja 8-10 veces, 2 s por baño: etanol al 100%, etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 95%, etanol al 70%, etanol al 50%, etanol desionizado.
    NOTA: El protocolo se puede detener aquí, y las diapositivas se pueden dejar a RT en agua durante varias horas. Si es necesario, las diapositivas se pueden almacenar a 4 ° C en agua O / N.
  3. Coloque las diapositivas en hematoxilina Harris filtrada al 100% durante 4 min. Vuelva a colocarlos inmediatamente en el recipiente con agua desionizada. Ejecutar el agua desionizada en tLa esquina trasera del contenedor más alejado de las secciones. Vacíe el envase periódicamente hasta que el agua ya no sea púrpura.
    NOTA: No deje que el agua corra directamente sobre los portaobjetos, ya que las secciones pueden salir de los portaobjetos.
  4. Compruebe rápidamente la intensidad de la hematoxilina en un microscopio de disección usando luces de cuello de cisne; No permita que las diapositivas se sequen. Si la mancha ha alcanzado la intensidad deseada, continúe con el paso siguiente. Si el color no es suficientemente oscuro, coloque los portaobjetos en hematoxilina al 100% durante 1 min y repita los lavados con agua antes de comprobar de nuevo.
    NOTA: La hematoxilina debe ser suficientemente oscura para que el color no se pierda durante la tinción con eosina. Sin embargo, si la tinción con hematoxilina se observa en el citoplasma, las secciones se sobrecargan.
  5. Sumerja dos veces las láminas en HCl al 0,05% e inmediatamente transfiéralas de nuevo al recipiente con agua desionizada limpia. Vaciar el agua y rellenar el recipiente con agua dos veces.
  6. Transferir las diapositivas al 95% etHanol durante 30 s y luego transferirlos a un nuevo recipiente con etanol al 95% durante 30 s.
  7. Coloque los portaobjetos en la solución de eosina Y-phloxine B durante 2 min. Vuelva a colocar los portaobjetos en el contenedor de etanol 95% anterior y compruebe rápidamente la intensidad del color bajo el microscopio de disección. Si la tinción es suficiente, proceda al siguiente paso. Si no es así, regrese a la solución de eosina durante 30 s, vuelva a comprobar y repita según sea necesario.
    NOTA: Suficiente coloración con eosina es de color rosa brillante y aparece en distinto contraste con la mancha de hematoxilina. Asegúrese de limpiar cualquier solución de la parte posterior de las diapositivas cuando se comprueba bajo el microscopio para que no se observe ningún color falso. Debido a que la eosina se compone de etanol al 95%, los períodos de tiempo prolongados en etanol al 95% mientras se controla la intensidad del color puede lixiviar algo del color.
  8. Transfiera los portaobjetos a isopropanol al 100% durante 15 s. Reemplazar con isopropanol 100% fresco y colocar los portaobjetos de nuevo en el isopropanol durante otros 15 s. Repita este pPara un total de 6 lavados con isopropanol.
    PRECAUCIÓN: El isopropanol es un irritante ocular y respiratorio. Siempre asegúrese de usar equipo de protección adecuado y evitar salpicaduras. También es altamente inflamable y debe almacenarse y manejarse en consecuencia.
    NOTA: Para ahorrar en los reactivos, deseche sólo el primer (más rosado) lavado con isopropanol. Mantenga las otras cinco soluciones de lavado en botellas numeradas del 1 al 5, para ser reutilizadas para la siguiente tinción. Cuando reutilice los lavados, comience con la botella numerada "1" y deséchela después de usarla. Una vez que el lavado "2" se ha utilizado, vierta en la botella "1", y así sucesivamente. El lavado final debe ser siempre isopropanol fresco.
  9. Colocar los portaobjetos en xilenos al 100% durante 3 min. Retire una diapositiva a la vez y coloque un cubreobjetos.
    1. Añadir suficiente medio de montaje para cubrir las secciones y sumergirlos en xileno al 100%.
      NOTA: Este paso suavizará la superficie del soporte de montaje y eliminará cualquier burbuja.
    2. Aplicar un cubreobjetosA la parte inferior de la diapositiva.
      NOTA: El medio de montaje debe tirar de la corredera en su posición. Si el cubreobjetos no está recto o completamente sentado, golpee suavemente en su lugar.
    3. Limpie cualquier medio de montaje en exceso sobre una toalla de papel hasta que sólo se vea una línea delgada. Sumerja un pañuelo de papel en el xileno y limpie la parte posterior de la corredera para eliminar cualquier medio que haya goteado. Coloque la diapositiva plana sobre una superficie robusta pero móvil, como un pedazo de cartón. Cubiertas Deslice todas las diapositivas restantes de la misma manera. Deje que el xileno se evapore en la campana durante 10 min.
      NOTA: Cualquier material contaminado con xileno debe ser removido y desechado en un recipiente sellado en la capucha para evitar cualquier escape de vapores.
  10. Deje que el medio de montaje se endurezca a RT O / N.

6. Imágenes y almacenamiento de diapositivas teñidas

  1. Secciones de imagen en un microscopio invertido compuesto 18 .
    NOTA: Los portaobjetos se pueden guardar en la habitación teIndefinidamente.

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Representative Results

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10% de formalina tamponada y 4% de paraformaldehído (PFA) son dos de los fijadores más comunes utilizados para las prácticas histológicas. Sin embargo, no dan resultados óptimos de fijación para el tejido del hígado de pez cebra ( Figura 1 y Tabla 1 ). La fijación con formalina al 10% o PFA al 4% a menudo resulta en contracción, creando grandes lagunas entre el hígado y los tejidos circundantes ( Figura 1A , B , la Figura 1B proporciona un ejemplo de contracción del tejido). Porciones del tejido hepático también pueden caer fuera de la sección. El citoplasma de los hepatocitos a menudo se pierde ( Figura 1A , 1B ]. Ambos fijadores pueden causar distorsión de los hepatocitos, ya que se encogen o se hinchan y ya no mantienen la morfología columnar que es característica de las células epiteliales. Un problema adicional con la fijación de PFA esQue hay espacios entre los hepatocitos que no son reales, lo que hace que el tejido se vea fracturado ( Figura 1B ). Además, cuando se usa cualquiera de estos dos fijadores, los hepatocitos se tiñen bien con hematoxilina, pero menos con la eosina ( Figura 1A ). El fijador Dietrich basado en ácido supera los problemas con los fijadores de formalina y PFA ( Figura 1C ).

En la ALD humana, la esteatosis, que se compone de grasa de pequeñas y grandes gotas, es la más prominente cerca de la vena central y se extiende hacia el exterior de la tríada portal con el aumento de la gravedad [ 22] . En el pez cebra, el tratamiento con 2% de etanol de 96-120 hpf también induce la esteatosis hepática, que está implicada por la deposición excesiva de gotitas redondas en los hepatocitos ( Figura 2B , flechas). Sin embargo, las gotitas no exhibenTa un patrón de distribución similar al observado en la ALD humana, ya que no existe una distinción clara de las venas portal y central en el hígado del pez cebra 23 . Los vasos sanguíneos hepáticos en el hígado larval tratado con etanol se hinchan en comparación con los del hígado de control ( Figura 2B , asteriscos).

Figura 1
Figura 1 : Comparaciones de tinción de H & E en los hígados de las larvas de pez cebra que se fijaron con Fijadores Diferentes a 120 hpf. ( A ) 10% de formalina a RT O / N; ( B ) PFA al 4% a 4 ° CO / N; ( C ) fijador de Dietrich a RT durante 24 h. Con formalina al 10%, los hepatocitos a menudo pierden su citoplasma (A). El tejido no está manchado correctamente con eosina y aparece púrpura. Después de arreglarCon PFA al 4%, se observan lagunas entre los hepatocitos (B). 4% PFA hace que el tejido hepático se contraiga, por lo que parece haber una gran brecha entre el hígado y los tejidos circundantes. La línea discontinua en B marca el borde de los tejidos circundantes. El fijador de Dietrich proporciona el resultado óptimo entre los tres (C). Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 : El tratamiento con etanol agudo causa esteatosis hepática y hinchazón de los vasos sanguíneos en los hígados larvales de pez cebra. ( A ) tinción con H & E del hígado en una larva testigo, no tratada, WT. ( B ) tinción con H & E del hígado en una larva de tipo wil que se trató con 2% de ethaNol de 96 - 120 hpf. Ambos animales fueron fijados con fijador de Dietrich a 120 hpf. Las flechas en (B) apuntan a los hepatocitos con deposición excesiva de gotitas redondas. Los asteriscos marcan los vasos sanguíneos hepáticos hinchados. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Formalina al 10% 4% PFA El fijador de Dietrich
Condiciones de fijación Al menos 24 h a TA 3 h a RT o O / N a 4 ° C Al menos 24 h a TA
Almacenamiento de la muestra Indefinidamente en RT Hasta 2 semanas a 4 ° C Hasta 2 meses a la RT
CompatibCon la extracción de ADN genómico No
Retracciones Mínimo
Distorsión de las células Mínimo
Pérdida de detalles de celulares Modesto Mínimo
Mancha equilibrada de H & E Mancha débil de eosina Mancha débil de eosina
Compatibilidad con inmunohistoquímica

Tabla 1: Comparaciones de formalina al 10%, PFA al 4% y fijadores de Dietrich para histología hepática de pez cebra.

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Discussion

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El protocolo actual describe un procedimiento detallado para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y los análisis histopatológicos posteriores con tinción de H & E. Tratamiento agudo de etanol debe llevarse a cabo no antes de las 96 h post-fertilización, ya que esta es la etapa en la que el hígado de pez cebra comienza a expresar las enzimas que metabolizan el alcohol [ 13] . 2% de etanol es la dosis máxima que las larvas pueden tolerar 13 , 14 . Las larvas tratadas con etanol comienzan a mostrar esteatosis hepática a las 8 h de tratamiento, y los porcentajes de larvas que desarrollan esteatosis continúan aumentando hasta 24 h de tratamiento continuo 14 . Las larvas de pez cebra absorben los nutrientes exclusivamente de la yema hasta 120 hpf. Por lo tanto, el tratamiento con etanol más allá de 120 hpf no es recomendable, porque el ayuno también puede contribuir a la esteatosis [ 14] . En comparación con los protocolos publicados por otros laboratoriosOratorios 13 , 24 , la modificación principal hecha en el protocolo actual es que el tratamiento con etanol se lleva a cabo en una instalación de peces que tiene un ciclo de 14 h de luz / 10 h de oscuridad. Esto da lugar a respuestas estatóticas más consistentes y robustas que las observadas cuando el tratamiento se realiza en la oscuridad en una incubadora. Esto puede estar relacionado con el hecho de que los genes metabólicos lipídicos en el hígado de pez cebra muestran la expresión del ritmo diario en respuesta a la luz / oscuridad ciclo [ 25] .

ALD es una enfermedad crónica y lleva años de abuso de alcohol. La limitación crítica del actual protocolo de tratamiento con etanol es que sólo desencadena los efectos agudos del alcohol sobre el hígado. El tratamiento con una concentración tan alta de etanol durante más de 48 horas causa una elevada mortalidad, evitando el estudio de la lesión hepática crónica. Un estudio reciente encontró que el tratamiento continuo de pez cebra adulto con 1% de etanol para un máximo de tresMeses condujo a esteatosis, esteatohepatitis y fibrosis 12 . Una dirección futura prometedora podría ser identificar un potencial modulador de ALD usando el protocolo de tratamiento de etanol agudo y luego validar su efecto en el modelo de lesión crónica.

La tinción de H & E se realiza para evaluar los daños hepatocelulares inducidos por el tratamiento agudo con etanol. Debido a la facilidad de la realización de imágenes de fluorescencia en el pez cebra, la tinción de H & E no se utiliza habitualmente en la histología del hígado de pez cebra, y el procedimiento está menos bien descrito. El protocolo actual proporciona una descripción paso a paso de la tinción de H & E en el hígado larval. Elegir el fijador correcto es el primer y más esencial paso para la tinción de H & E. Aunque 10% de formalina tamponada y 4% de PFA se usan comúnmente en histología, ambos causan encogimientos de tejido y partes del hígado que caen fuera de la sección. La fijación al 10% de formalina conduce a la pérdida de citoplasma en el hepatOcytes. La fijación de 4% de PFA da lugar a huecos artificiales entre los hepatocitos. La tinción con eosina parece ser mucho más débil que la tinción con hematoxilina en los hígados que se fijan con cualquiera de los fijadores. El fijador a base de ácido de Dietrich es más adecuado para la tinción de H & E del hígado de pez cebra, ya que preserva los detalles celulares y minimiza la contracción. También parece penetrar tejido graso, como el hígado, más rápido que la formalina y PFA. La tinción con hematoxilina y eosina es más equilibrada. Una advertencia del fijador de Dietrich es que no es compatible con la extracción de ADN genómico. En un experimento de ensayo, se extrajo ADN genómico de las larvas que se fijaron usando formalina al 10%, PFA al 4% o fijador de Dietrich 26 . Las larvas se incubaron en 50 μl de NaOH 50 mM a 95 ° C durante 20 min y luego se enfriaron a 4 ° C. A continuación se añadieron 5 μl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 para neutralizar la solución básica. Después de una breve centrifugación, el sobrenadante wComo se utiliza en la PCR. Con los mismos cebadores de PCR y el programa de PCR, el ADN genómico de ambas larvas fijadas con formalina y PFA produjo productos de PCR con los tamaños predichos, mientras que el ADN genómico procedente de las larvas fija fijas de Dietrich no produjo ningún producto de PCR.

La tinción con H & E puede realizarse tanto en secciones de parafina como en secciones congeladas. Sin embargo, las secciones de parafina tienen las siguientes ventajas sobre las secciones congeladas: 1) Mientras que las secciones de parafina se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente, las secciones congeladas sólo pueden almacenarse a -80 ° C durante un máximo de un año. 2) Para secciones congeladas, la formación de cristales de hielo dentro de las células puede perturbar la morfología celular y el detalle subcelular. Además, las secciones congeladas son a menudo más gruesas que las secciones de parafina. Esto puede resultar en imágenes pobres de la morfología del tejido en comparación con las producidas a partir de secciones de parafina.

Cuando se preparan bloques de parafina para tejidos hepáticos, el protocolo actualIncrusta las larvas en agarosa. Las larvas se colocan lateralmente, con el lado izquierdo del cuerpo hacia abajo y acostado contra el fondo del molde. Esto asegura la orientación consistente de los hígados, de modo que cuando las secciones se cortan secuencialmente, las regiones equivalentes del hígado se pueden comparar de peces a peces 27 . Otro paso clave que garantiza la tinción exitosa de H & E es el desarrollo del color. Es fundamental comprobar la tinción con frecuencia hasta que se alcance la intensidad de color deseada.

La tinción con H & E debe usarse para obtener una evaluación preliminar de la lesión hepática. Las larvas tratadas con etanol muestran deposición excesiva de gotitas redondas en los hepatocitos, sugerentes de esteatosis 13 , 14 , 18 . El etiquetado con colorantes lipídicos, como el aceite rojo O y rojo Nilo, es necesario para confirmar que estas gotitas son de hecho lípidos. El vaso sanguíneo hepáticoEn los animales tratados aparecen dilatados e hinchados. La microscopía electrónica de barrido y la microscopía electrónica de transmisión deben realizarse para examinar los cambios ultraestructurales en los sinusoides. Se ha informado anteriormente que la deposición de proteínas de la matriz extracelular se incrementa en el hígado zebrafish tratado con etanol, como se detecta por inmunofluorescencia [ 18] . Sin embargo, dado que los niveles de expresión de los genes fibrogénicos sólo aumentan modestamente en el pescado tratado 18 , H & E puede no ser lo suficientemente sensible para detectar una cantidad tan pequeña de proteínas de matriz extracelular. Los mismos métodos de fijación y tinción fueron probados en los hígados de pez cebra adultos crónicamente lesionados y fueron suficientes para detectar fibrosis (Yin, datos no publicados).

Aunque el protocolo actual está adaptado al examen de la histología hepática en larvas de pez cebra, tiene una aplicación más amplia a la comunidad de investigación de pez cebra, como el samEste protocolo se puede aplicar a otros tejidos y al pez cebra adulto.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la Dra. Katy Murray en el Centro Internacional de Recursos de Zebrafish; Dr. Stacey Huppert y Kari Huppert en CCHMC, por sus útiles consejos sobre el protocolo; Y el servicio veterinario del CCHMC, para el cuidado de los peces. Este trabajo fue apoyado por NIH subvención R00AA020514 y una beca de investigación del Centro de Genómica Pediátrica en CCHMC (a CY). También fue apoyado en parte por la subvención NIH P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Centro en Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95, (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52, (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56, (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277, (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3, (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5, (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35, (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10, (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6, (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33, (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279, (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19, (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78, (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2, (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131, (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32, (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43, (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (11), 4358-4363 (2011).
Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra
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Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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