Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

Detta protokoll beskriver histologiska analyser av lever från zebrafisklarver som har behandlats med 2% etanol i 24 timmar. Sådan akut etanolbehandling resulterar i leverstatos och svullnad i den hepatiska vaskulaturen.

Abstract

Alkoholhaltig leversjukdom (ALD) avser leverskador på grund av akut eller kronisk alkoholmissbruk. Det är bland de främsta orsakerna till alkoholrelaterad sjuklighet och dödlighet och drabbar mer än 2 miljoner människor i USA. En bättre förståelse för cell- och molekylära mekanismer som ligger till grund för alkoholframkallad leverskada är avgörande för att utveckla effektiv behandling för ALD. Sebrafisklarver uppvisar leverstatos och fibrogenes efter bara 24 timmars exponering för 2% etanol, vilket gör dem användbara för studier av akut alkoholhaltig leverskada. Detta arbete beskriver förfarandet för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och visar att det orsakar steatos och svullnad i de leverblodkärlen. Ett detaljerat protokoll för hematoxylin och Eosin (H & E) färgning som är optimerad för den histologiska analysen av zebrafisk larvleveren beskrivs också. H & E-färgning har flera unika fördelar gentemot immunofluorescens, eftersom det markerar allt livCeller och extracellulära komponenter samtidigt och kan lätt detektera leverskada, såsom steatos och fibros. Med tanke på den ökande användningen av zebrafisk i modelleringstoxin och virusinducerad leverskada, såväl som ärftliga leversjukdomar, tjänar detta protokoll som referens för de histologiska analyserna som utförts i alla dessa studier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alkoholhaltig leversjukdom (ALD), som orsakas av alkoholöverkonsumtion, är en viktig orsak till alkoholrelaterad sjuklighet och mortalitet. I USA innebär nästan hälften av leversjukdomsdöd alkohol 1 , och ALD ansvarar för nästan 1 av 3 levertransplantationer 2 . ALD har ett brett spektrum. Steatos, som kännetecknas av överflödig lipidackumulering i hepatocyter, förekommer i det tidiga skedet av tung dricks och är reversibel vid upphörande av alkoholanvändning. Under påverkan av genetiska och miljömässiga faktorer och fortsatt alkoholintag kan hepatisk steatos utvecklas till alkoholhepitit och slutligen cirros 3 . Studier som använder ALD-modellerna för gnagare har gett väsentliga insikter i sjukdomen, men de har begränsningar (ses i referens 3 ). Oral utfodring av en alkoholdiet orsakar bara steatos hos gnagare 4 , </ Sup> 5 . Utveckling av inflammation och fibros kräver antingen en andra förolämpning 6 , 7 eller kronisk intragastrisk infusion, vilket är invasiv och tekniskt utmanande 8 , 9 . Den teleosta zebrafisken utvecklar också leverskada som svar på både kronisk och akut alkoholbehandling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . I synnerhet representerar larvalzebrafisken en attraktiv komplementärmodellorganisme för att studera akut alkoholhaltig leverskada 10 , 11 , 13 , 15 . Zebrafish lever är funktionell och producerar viktiga enzymer för etanol metabolism med 4 dagarS post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direkt tillsättas till vattnet och exponering för 2% etanol i 24 timmar är tillräcklig för att inducera leverstatos och fibrogena svar i zebrafisklarver 13 , 15 .

Det har rapporterats att behandling med 2% etanol i 24 h resulterade i en vävnad etanolkoncentration av 80 mM i zebrafisklarver 13 . Andra har visat att larver tolererar denna koncentration och de leverfenotyper som ses i de behandlade djuren är specifika för etanolexponering 11 , 13 , 15 , 18 . Eftersom 80 mM är nästan dödligt hos människor 19 är det emellertid viktigt att utvärdera levern histologi hos den etanolbehandlade zebrafisken och detaRmine den fysiologiska relevansen för människor.

Den snabba externa utvecklingen och translucensen av zebrafisk larver gör det möjligt att karakterisera alkoholens verkan i levern i realtid och i fasta prover. Tillgängligheten av celltypsspecifika fluorescerande transgena linjer och de senaste framstegen inom konfokalmikroskopi underlättar studien av hur olika levercellsarter ändrar deras morfologi och beteende som svar på akut etanolbehandling 11 , 15 . Emellertid kan konfokal avbildning av den fluorescerande transgena zebrafisken inte helt ersätta hematoxylin och Eosin (H & E) -färgning vid studier av leverhistologi. Markering av alla levercellstyper samtidigt som transgena zebrafiskar kräver generering av individuella transgena linjer, var och en märkning av en levercellstyp med en unik fluorofor. Att introducera olika transgena bakgrunder i samma fisk kräver rasinG flera generationer, vilket är tidskrävande och dyrt. Ytterligare immunofluorescensfärgning behövs för att detektera extracellulära matriskomponenter. H & E-färgning, å andra sidan, märker samtidigt alla levercellstyper och extracellulära matriskomponenter, vilket ger en överblick över levern 20 . Dessutom avslöjar det lätt flera histopatologiska särdrag hos leversjukdomar, såsom hepatocytdöd, steatos och fibros. Fastän H & E är en rutinmässig fläck i däggdjursleverhistologi, används den inte vanligtvis i sebrafiskleverforskning, och protokollet är mindre väl etablerat.

I detta arbete beskrivs ett protokoll för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och för uppföljning av histologiska analyser med H & E-färgning. H & E-färgningsprotokollet kan användas i alla studier av leverutveckling och funktion. Dessutom kan paraffinsektionerna användas för immunhistokemi såväl som för andra speciella staIns i leverpatologi, inkluderande trichrom-fläcken, reticulinfärgningen, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AB WT vuxna och larvalzebrafisk bibehölls under standardbetingelser 21 i enlighet med handledningen för vård och användning av laboratoriedjur (National Institute of Health publication 86-23, reviderade 1985); Deras användning godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC).

1. Framställning av lösningar

  1. Förbered äggvatten.
    1. Förbered lagersaltlösningen genom att lösa 40 g kommersiellt havsalt i 1 liter dubbeldestillerat vatten (ddH20). Rör om tills alla salter är helt upplösta.
    2. Framställ 0,1% metylenblå lösning genom att tillsätta 0,1 g pulver till 100 ml ddH20 .
      VARNING: Methylenblå är irriterande om den kommer i kontakt med ögonen eller huden. Använd alltid labbrock och handskar när du hanterar pulveret.
    3. Kombinera 28.125 ml lager salt såLution och 7 ml metylenblå lösning i ett 50 ml koniskt rör. Blanda väl. Tillsätt denna blandning till 15 liter ddH 2 O. Skaka noggrant och förvara vid RT.
  2. Förbered 100 ml 1 M Tris-HCl genom att tillsätta 12,1 g Tris-pulver till 100 ml ddH20 . Justera pH till 9,0 med användning av saltsyra (HCl).
    VARNING: HCl kan orsaka allvarliga brännskador och slemhinnorirritation vid inandning. Använd alltid labbrock och handskar och hantera lagerflaskan i en kemisk huva.
  3. Framställ 0,4% tricin (etyl 3-aminobensoatmetansulfonat) lösning.
    1. Lös upp 2 g tricinpulver i 489,5 ml ddH20 . Tillsätt 10,5 ml av lösningen av Tris-HCl, pH 9. Blanda med omröringsstång tills hela pulvret har löst sig. Justera till pH 7,0.
      VARNING: Trikainpulver kan vara andningsirriterande. Använd alltid en dammmask när du hanterar pulvret.
    2. Aliquot 45 ml av tricinlösningen i 50 ml koniska rör. Håll solutioN vid 4 ° C för omedelbar användning och vid -20 ° C för långvarig lagring.
  4. Förbered Dietrichs fixativ genom att kombinera 30 ml 95% etanol, 10 ml 37% formaldehyd, 2 ml isättika och 58 ml ddH20 i en glasmediumflaska. Blanda väl genom att virvla och lagra vid RT.
    VARNING: Formaldehyd är ett misstänkt cancerframkallande ämne, och en lösning med formaldehyd bör användas i en kemisk huva. Isättika kan orsaka svåra hudförbränningar och ögonskador. Använd alltid labbrock och handskar och hantera stamlösningen i en kemisk huva. Formaldehyd, isättika och 95% etanol är alla brandfarliga vätskor och bör förvaras i ett utsatt brandfarligt skåp.
    OBS: Dietrichs fixativ är stabil vid RT i 1 år.
  5. Förbered 1 liter lösning av 10 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g dinatriumfosfat (Na 2 HPO 4 ) och 2.4 g monokaliumfosfat (KH 2 PO 4 ) till 800 ml ddH 2 O. Justera till pH 7,4 med natriumhydroxid (NaOH) och tillsätt ddH20 till en 1 liter slutvolym. Förvara denna lösning vid RT efter autoklavering på en vätskecykel som renar i 1 min och inkuberar vid 121 ° C under 20 minuter.
  6. Gör 1 liter 1x PBS genom att späda 100 ml av 10x PBS-lösningen i 900 ml ddH2O. Blanda väl genom att skaka och lagra vid RT efter autoklavering.
  7. Förbered 3% agaros i en glasmediaflaska för embryonmontering.
    1. Tillsätt 3 g agaros till 100 ml ddH20 och blanda genom virvling. Värm blandningen genom mikrovågor för att lösa agarosen och titta noggrant under uppvärmning för att säkerställa att det är minimal kokning.
      VARNING: Flaskan kommer sannolikt att bli varm när den tas ur mikrovågsugnen, trots kort uppvärmning. Använd en skyddshandske eller mitt för att ta bort flaskan från mikrovågsugnen.
    2. Ta bort flaskan från mikrovågsugnen.Medan du rör dig försiktigt, leta efter kristaller som inte är helt upplösta. Om det inte finns några kristaller är lösningen klar för användning. Förvara 3% agarosen vid RT och värma igen före användning.
  8. Filtrera Harris hematoxylin stamlösning för att avlägsna eventuella fasta ämnen som har utfällt.
    1. Vik ett kaffefilter i halv så att filtret skapar en kon. Öppna sidopanelen så att vätskan går igenom filtret, så att eventuella skräp kan fångas.
    2. Placera filtret inuti en tratt och tratten i en glasmediumflaska. Häll lagret hematoxylin gradvis genom filtret.
      VARNING: Hematoxylin är farligt vid ögonkontakt, intag och inandning. Använd alltid labbrock och handskar och hantera stamlösningen i en kemisk huva.
  9. Framställ 0,05% HCl genom att tillsätta 125 pl av 12 N HCl till 250 ml ddH20 .
  10. Beredning av eosin Y-phloxin B lösning blandning genom att kombinera 25 ml 1% eOsin Y (aq), 2,5 ml 1% phloxin B (aq), 195 ml 95% etanol och 1 ml isättiksyra i en glasflaska. Blanda väl genom att virvla och lagra vid RT
    VARNING: Eosin Y är farligt vid ögonkontakt, intag och inandning. Använd alltid labbrock och handskar och hantera stamlösningen i en kemisk huva.
  11. Förbered 2% etanol genom att tillsätta 2 ml ren etylalkohol till 98 ml äggvatten.
    VARNING: Etylalkohol är ett ögonirriterande. Använd alltid lämplig skyddsutrustning vid hantering av etylalkohol. Det är också brandfarligt och bör hanteras och lagras i enlighet med detta.
    OBS! Förbered färsk 2% etanol varje gång innan akut etanolbehandling genomförs.

2. Utför akut etanolbehandling i zebrafisk Larver

  1. För att generera embryon, ställ in kors med en vildtyps man och en WT kvinnlig fisk per parningstank. Separera dem genom att sätta in en plastdelare i parningstanken.
    OBS: Ställ inUpp korsar efter den sista utfodringen av dagen så att fisken är välfödd.
    1. Vid 8 AM nästa morgon, dra delaren så att paret kan kompisera.
    2. Efter 1 timme returnerar du den vuxna fisken till sin ursprungliga tank. Samla embryon genom att hälla vattnet som innehåller embryon i en sil. Vänd silen över i en 100 mm petriskål och tvätta embryonerna i disken med en tvättflaska innehållande äggvatten. Placera disken med embryon i en inkubator vid 28 ° C.
    3. När embryon når åtminstone 4-cellsteget (1 hpf), ta bort eventuella obefruktade embryon och skräp i vattnet med en Pasteur pipette och placera skålen med befruktade embryon i en inkubator vid 28 ° C. Underhålla embryon i inkubatorn vid 28 ° C till 96 h efter befruktning.
    4. Bedöv larverfisken genom att tillsätta tricinlösningen till äggvatten med ett förhållande 1-10 (volym / volym).
    5. Välj upp till fyrtio 96 hpf larver som har en uppblåst simmarblåsa medEn Pasteur pipette och dela dem jämnt i två nya petriskålar.
    6. Ta ut så mycket resterande äggvatten som möjligt. Vid en densitet av en larva per ml, tillsätt äggvatten innehållande 2% etanol till en maträtt. Tillsätt samma mängd äggvatten till den andra maträtten för att fungera som kontroll.
    7. Håll kontrollen och etanolbehandlade larver i fiskrummet i 24 timmar.
      OBS: Genomförandet av etanolbehandling i ett fiskrum som har en 14 h ljus / 10 h mörkcykel resulterar i mer konsekvent och robust leverskada än att utföra experimentet i mörkret i en inkubator.
    8. Samla larverna i ett 1,5 ml centrifugrör med högst 20 larver per rör.
    9. Ta bort så mycket vätska som möjligt från larverna och tillsätt minst 1 ml (10x vävnadsvolym) Dietrichs fixativ i kemikaliehuven. Låt fisken fixa på en nutatör vid rumstemperatur i minst 24 timmar.
      OBS: Fisken är stabil i Dietrichs fixativ i flera veckor.
<P class = "jove_title"> 3. Framställning av vävnadskassetter och bearbetning

  1. Ange det nödvändiga antalet vävnadskassetter och två blå biopsipadar per kassett. Placera en biopsypanna längst ned på varje kassett. Märk varje kassett i penna, tydligt identifiera provet.
    OBS! Använd inte penna eller markörer för att märka kassetterna, eftersom märkningen kommer att gå vilse i senare steg.
  2. Bädda in larverna i 3% agaros för att säkerställa en konsekvent orientering av alla prover.
    1. Ta bort fixativet från rören i en kemisk huva och tvätta larven 3 gånger i 5 minuter vardera med 1 ml 1x PBS. Placera rören på en nutator vid RT under tvättarna.
    2. Under tvätten värms den preparerade 3% agarosen i vatten med hjälp av en mikrovågsugn för att smälta fastämnet. Värm i 30 s i taget och titta noga på för att minimera koka. Håll flytande agaros på en hetplatta som är inställd till 90 ° C med försiktig omröring.
    3. Överför upp till 8 l med en överföringspipettArvae till en plast histologi mögel och ta bort så mycket PBS som möjligt. Använd en överföringspipett med spetsen avskuren, fyll fyllningen helt med 3% agaros.
    4. Använd en insulinspruta och samla larverna till mitten av formen och skjut dem till botten. För sagittala sektioner, placera larverna i en linje, med huvudet mot mitten av formen. För att säkerställa att levarna är orienterade på ett konsekvent sätt, vrid larverna så att kroppens vänstra sida är vänd nedåt och platt mot botten av formen.
      OBSERVERA: Eftersom levern ligger på vänster sida av kroppen, minimerar sådan positionering antalet sektioner som måste klippas innan de når levern. Håll larverna så nära varandra som möjligt.
    5. Ställ formen på sidan i 4-5 min för att låta agarosen ställa in helt. Ta bort agarosblocket från formen och använd ett rakblad för att trimma agarosen runt larverna. Stå blocket på änden och skär tjockleken i halv sO att det sista blocket är ungefär 2-3 mm tjockt
    6. Överför det lilla agarosblocket till den beredda vävnadskassetten (steg 3.1) och placera den andra biopsipuden ovanpå blocket. Stäng kassetten och placera den fullt monterade kassetten i en tätbar behållare med nyberedd 70% etanol i ddH2O.
      OBS! Om kassetterna inte ska behandlas omedelbart, placera dem i 70% etanol i en behållare vid 4 ° C för att undvika förlust av fixering. Kassetterna är stabila vid 4 ° C i upp till 3 dagar.
  3. Vävnadsbehandling
    OBS: Prover kan skickas till ett laboratorium för histologi eller patologi utrustad med en vävnadsprocessor för behandling av kassetterna i paraffin. Be om ett standard O / N-bearbetningsprogram snarare än ett kort program så att paraffinen helt kan penetrera agarosen.
    1. Bearbeta vävnadskassetterna genom att överföra dem genom en utspädningsserie etanol, med en ökande mängd alkohol, tillDehydrera vävnaden, enligt följande: 70% etanol 2 gånger, 45 min vardera; 80% etanol, 45 minuter; 95% etanol, 2 gånger, 45 min vardera; 100% etanol, 2 gånger, 45 min vardera.
    2. Byt alkoholen med ett lösningsmedel (100% xylen, 2 gånger, 45 min vardera) för att paraffin ska infiltrera vävnaden.
      VARNING: Xylen är irriterande och är skadligt vid inandning. Var noga med att alltid använda en kemisk huva. Xylen är brandfarligt och måste förvaras i enlighet med detta.
    3. Inkubera kassetterna i paraffin O / N i en inkubator vid 60-65 ° C. Håll kassetterna varma tills de är inbäddade.
  4. Bädda in de bearbetade agarosblocken i paraffin.
    1. Ta ut en kassett från inbyggnadsmaskinens uppvärmningsskiva och ta bort kassettlocket och den övre biopsiputen från kassetten. Fyll en histologi mögel med flytande paraffin och håll den på den varma plattan på inbäddningsmaskinen.
    2. Använda varma tångar, plocka upp agarosblocket från kassettenE och överför den till histologiska mögel med paraffin. Se till att sidan av agarosblocket med fisken närmast ytan är vänd nedåt. Släng bottenbiopsypoten och överför hela histologiska mögel till den svala plattan på inbäddningsmaskinen.
    3. Med hjälp av tång placerar du agarosblocket i mitten av formen. Placera blocket på botten av formen. När blocket är ordentligt placerat, sätt botten på kassetten ovanpå histologiska mögel och fyll den halvvägs med flytande paraffin. Placera formen direkt på 4 ° C-plattan och störa inte blocken i minst 10-15 minuter för att paraffinen ska stelna. Medan det första blocket är inställt, upprepa den här processen för de återstående blocken.
    4. När paraffinen är inställd för alla block, ta bort histologiformen från paraffinblocket genom att trycka försiktigt på formen för att lossa den. Dessa paraffinblock kan lagras vid rumstemperatur på obestämd tid.
  5. 4. Sektionering av paraffinblock

    1. Dagen före snittning in mot paraffinblocket med användning av en mikrotom för att avlägsna överskott av paraffin som täcker vävnaden. Sektion 5 μm i taget tills vävnaden exponeras vid paraffinblockets yta. Stoppa och kassera alla sektioner som klipps. Blöt blocken nedåt med 1x PBS vid 4 ° C / N.
      OBS: Blocken ska blötläggas i minst 8 timmar. Börja blötläggning i slutet av dagen. Om blocken lämnas i 1x PBS för länge, kan vävnaden svälla och förvrängas.
    2. Ta bort ett block i taget från 1x PBS och skär 5 μm sektioner med hjälp av en mikrotom. Separera bandet av sektioner från bladet genom att försiktigt dra det sista avsnittet bort från bladet med hjälp av tång eller en pensel. Plocka upp bandet genom det sista avsnittet med tang och överför det till ett vattenbad vid 42 ° C. Låt banden flyta på ytan av vattnet i minst 5 minuter.
      OBS: VemN överför sektionerna, låt inte tången röra vattnet när det fortfarande är i kontakt med paraffinen. Annars smälter paraffinen på tången och gör separation väldigt svår. Skär omedelbart avdelningarna i mindre grupper med rena tångar så att de lätt kan passa på glidbanorna. Tryck försiktigt på sömmen mellan sektionerna för att skapa separation utan skada.
    3. Sätt en laddad glid i vattnet i 45 grader vinkel och placera den försiktigt under den grupp av sektioner som ska samlas in. Lyft försiktigt gliden från vattnet och låt sektionerna fästa på glidlampan.
    4. Ta bort eventuellt överskott av vatten från sektionerna med luddfri vävnad. Placera bilden i en glidhållare eller en låda. Fortsätt att sektionen blockera tills önskad vävnad har samlats in. Upprepa snittprocessen för alla block.
    5. Baksida diabilderna i en 55 ° C inkubator eller ugn i 3-16 h för att smälta paraffinen. Ta bort bilderna från ugnen och låt dem tO kyla innan du börjar färgningen.
      ANMÄRKNING: Parafinsektionerna kan lagras vid RT på obestämd tid, både före och efter bakning.

    5. Hematoxylin och Eosinfärgning av paraffinsektioner

    1. Deparaffinize glidbanorna genom att doppa dem i 100% xylen i 15 minuter; Byt till frisk 100% xylen i ytterligare 15 minuter.
    2. Rehydrera glidbanorna genom att doppa dem genom följande serie av graderad etanol tills vätskan löper rent av glidarna. Doppa 8-10 gånger, 2 s per dopp: 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 30% etanol och avjoniserat vatten för varje lösning.
      OBS! Protokollet kan stoppas här, och bilderna kan lämnas vid RT i vatten i flera timmar. Om det behövs kan glidbanorna förvaras vid 4 ° C i vatten O / N.
    3. Placera bilderna i 100% filtrerad Harris hematoxylin i 4 minuter. Överför dem omedelbart till behållaren med avjoniserat vatten. Kör avjoniserat vatten i tHan tillbaka hörnet av behållaren längst bort från sektionerna. Töm behållaren periodiskt tills vattnet inte längre är lila.
      OBS! Låt inte vattnet springa direkt på glidbanorna, eftersom sektionerna kan komma från glidbanorna.
    4. Kontrollera snabbt hematoxylintensiteten på ett dissekeringsmikroskop med hjälp av glödlampor. Låt inte glidorna torka. Om fläcken har nått önskad intensitet fortsätter du till nästa steg. Om färgen inte är tillräckligt mörk, lägg glidorna i 100% hematoxylin i 1 min och upprepa vattnet tvättar innan du kontrollerar igen.
      OBS: Hematoxylinet behöver vara tillräckligt mörkt så att färgen inte går förlorad under eosinfärgningen. Om emellertid hematoxylinfärgning ses i cytoplasmen är sektionerna överskridna.
    5. Doppa glidarna två gånger i 0,05% HCl och omedelbart överföra dem tillbaka till behållaren med rent avjoniserat vatten. Töm vattnet och fyll på behållaren med vatten två gånger.
    6. Överför objektglasen till 95% etHanol i 30 s och sedan överföra dem till en ny behållare med 95% etanol i 30 s.
    7. Placera bilderna i eosin Y-phloxin B-lösningen under 2 minuter. Överför objektglasen tillbaka till föregående 95% etanolbehållare och kontrollera snabbt färgens intensitet under dissekeringsmikroskopet. Om färgningen är tillräcklig, fortsätt till nästa steg. Om inte, återvänd till eosinlösningen i 30 s, kontrollera igen och upprepa vid behov.
      OBS: Tillräcklig eosinfärgning är ljusrosa och framträder i distinkt kontrast till hematoxylinfläcken. Var noga med att torka bort någon lösning från baksidan av bilderna när du kontrollerar under mikroskopet så att ingen falsk färg observeras. Eftersom eosin består av 95% etanol, kan förlängda tidsperioder i 95% etanol under kontroll av färgintensitet läcka ut lite av färgen.
    8. Överför glidbanorna till 100% isopropanol i 15 s. Byt ut med färsk 100% isopropanol och lägg tillbaka glidbanorna i isopropanol i ytterligare 15 s. Upprepa detta sFör totalt 6 isopropanol tvättar.
      VARNING: Isopropanol är ett ögon och andningsirriterande. Var alltid säker på att bära lämplig skyddsutrustning och undvik stänk. Det är också mycket brandfarligt och bör förvaras och hanteras i enlighet med detta.
      OBS! För att spara på reagens, kassera endast den första (pinkest) isopropanol tvätten. Håll de övriga fem tvättlösningarna i flaskor numrerade 1 till 5, för att återanvändas för nästa färgning. Börja med flaskan numrerad "1" vid återanvändning, och kassera efter användning. När tvätten "2" har använts, häll den i flaska "1" och så vidare. Den slutliga tvätten bör alltid vara färsk isopropanol.
    9. Placera bilderna i 100% xylener i 3 minuter. Ta bort en bild i taget och placera en täckglas.
      1. Lägg till tillräckligt med monteringsmedium för att täcka sektionerna och doppa dem i 100% xylen.
        OBS: Detta steg släpper ytan på monteringsmediet och tar bort eventuella bubblor.
      2. Applicera en täckglasTill botten av bilden.
        OBS! Monteringsmediet ska dra gliden i läge. Om täckglaset inte är rakt eller helt sitter, tryck försiktigt på det på plats.
      3. Ta bort allt överskottsmedium på en pappershandduk tills endast en tunn linje syns. Doppa en vävnad i xylen och torka baksidan av objektglaset för att avlägsna allt droppmedium. Placera bilden på en stabil men rörlig yta, som en bit papp. Omsluter alla resterande bilder på samma sätt. Låt xylenet indunstas i huven i 10 minuter.
        OBS! Eventuella material som är förorenade med xylen ska avlägsnas och kasseras i en sluten behållare i huven för att förhindra att några ångor släpper ut.
    10. Låt monteringsmediet härda vid RT O / N.

    6. Bildbehandling och lagring av färgade bilder

    1. Bildsektioner på ett sammansatt inverterat mikroskop 18 .
      OBS: Slides kan hållas på rummet teTemperaturen i obestämd tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

10% buffrad formalin och 4% paraformaldehyd (PFA) är två av de vanligaste fixativen som används för histologipraxis. De ger emellertid inte optimala fixeringsresultat för zebrafisklevervävnad ( Figur 1 och Tabell 1 ). Fixering med 10% formalin eller 4% PFA resulterar ofta i krympningar, vilket skapar stora gap mellan levern och omgivande vävnader ( Figur 1A , B ; Figur IB visar ett exempel på vävnadsminskning). Delar av levervävnaden kan också falla ut ur sektionen. Cytoplasman hos hepatocyterna förloras ofta ( Figur 1A , IB ). Båda fixativen kan orsaka förvrängning av hepatocyterna, eftersom de antingen krymper eller svullnar och inte längre upprätthåller den kolumnära morfologin som är karakteristisk för epitelceller. Ett ytterligare problem med PFA-fixeringen ärAtt det finns mellanrum mellan de hepatocyter som inte är verkliga, vilket gör att vävnaden ser ut brottad ( Figur 1B ). Vidare färgas hepatocyterna väl med hematoxylin, men mindre med eosin ( Figur 1A ) när någon av dessa två fixeringsmedel används. Det syrabaserade Dietrichs fixativet övervinner problemen med formalin- och PFA-fixativet ( Figur 1C ).

I human ALD är steatos, som består av små och stora droppfett, mest framträdande nära den centrala venen och sträcker sig utåt mot portadriaden med ökande svårighetsgrad 22 . I zebrafisk inducerar behandling med 2% etanol från 96-120 hpf också leverstatos, vilket är implicerat av överdriven avsättning av runda droppar i hepatocyterna ( Figur 2B , pilar). Dropparna uppvisar dock inteTa liknande fördelningsmönster som sedd i människans ALD, eftersom det inte finns någon klar skillnad mellan portalen och centrala venerna i zebrafisklever 23 . De hepatiska blodkärlen i den etanolbehandlade larveleveren är svullna jämfört med de i kontrollleveren ( Figur 2B , asterisker).

Figur 1
Figur 1 : Jämförelser av H & E-färgning i leverna av zebrafisklarven som var fasta med olika fixativ vid 120 hpf. ( A ) 10% Formalin vid RT O / N; ( B ) 4% PFA vid 4 ° C / N; ( C ) Dietrichs fixativ vid RT i 24 timmar. Med 10% formalin förlorar hepatocyterna ofta sin cytoplasma (A). Vävnaden är inte färgad ordentligt med eosin och verkar lila. Efter fixaTion med 4% PFA, finns luckor mellan hepatocyterna (B). 4% PFA orsakar levervävnaden att krympa, så det verkar finnas ett stort gap mellan levern och de omgivande vävnaderna. Den streckade linjen i B markerar gränsen för de omgivande vävnaderna. Dietrichs fixativ ger det optimala resultatet bland de tre (C). Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : Akut etanolbehandling orsakar hepatostatisk och blodkärl svullnad i sebrafisk larvleveranser. ( A ) H & E-färgning av levern i en kontroll, obehandlad, WT larva. ( B ) H & E-färgning av levern i en wil-typ larva som behandlades med 2% ethaNol från 96 till 120 hpf. Båda djuren fixerades med Dietrichs fixativ vid 120 hpf. Pilarna i (B) pekar på hepatocyterna med överdriven avsättning av runda droppar. Asteriskar markerar de svullna leverblodkärlen. Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

10% formalin 4% PFA Dietrichs fixativ
Fixeringstillstånd Minst 24 timmar vid RT 3 h vid RT eller O / N vid 4 ° C Minst 24 timmar vid RT
Provlagring efter fixering Obestämd vid RT Upp till 2 veckor vid 4 ° C Upp till 2 månader vid RT
CompatibMed genomisk DNA extraktion Ja Ja Nej
krympningar Ja Ja Minimum
Förvrängning av celler Ja Ja Minimum
Förlust av cellulära detaljer Ja Blygsam Minimum
Balanserad H & E fläck Svag eosinfärg Svag eosinfärg Ja
Kompatibilitet med immunhistokemi Ja Ja Ja

Tabell 1: Jämförelser av 10% formalin, 4% PFA och Dietrichs fixativ för Zebrafish Liver Histology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det aktuella protokollet beskriver en detaljerad procedur för akut etanolbehandling i zebrafisklarver och de efterföljande histopatologiska analyserna med H & E-färgning. Akut etanolbehandling bör utföras vid tidpunkten 96 h efter befruktning, eftersom detta är det stadium då zebrafisklever börjar uttrycka alkoholmetaboliserande enzymer 13 . 2% etanol är den maximala dosen som larverna kan tolerera 13 , 14 . De etanolbehandlade larverna börjar visa leverstatos vid 8 timmars behandling, och procentsatserna av larver som utvecklar steatos fortsätter att stiga till 24 timmars kontinuerlig behandling 14 . Zebrafish larver absorberar näringsämnen uteslutande från äggula till 120 hpf. Därför rekommenderas etanolbehandling över 120 hpf, eftersom fastning också kan bidra till steatos 14 . Jämfört med protokoll som publicerats av andra laboratorierOratorierna 13 , 24 , är huvudändringen som gjorts i det nuvarande protokollet att etanolbehandlingen genomförs i en fiskanläggning som har en 14 h ljus / 10 h mörkcykel. Detta resulterar i mer konsekventa och robusta steatotiska svar än de som ses när behandlingen utförs i mörkret i en inkubator. Detta kan relateras till det faktum att de lipidmetaboliska generna i zebrafiskleveren visar dagligt rytmuttryck som svar på ljus / mörkcykeln 25 .

ALD är en kronisk sjukdom och tar år av alkoholmissbruk. Den kritiska begränsningen av det nuvarande etanolbehandlingsprotokollet är att det bara utlöser akuta effekter av alkohol på levern. Behandling med en sådan hög etanolkoncentration i mer än 48 timmar medför hög mortalitet, vilket förhindrar studier av kronisk leverskada. En ny studie visade att kontinuerlig behandling av vuxen zebrafisk med 1% etanol för upp till treMånader ledde till steatos, steatohepatitis och fibros 12 . En lovande framtida riktning kan vara att identifiera en potentiell modulator av ALD med användning av det akuta etanolbehandlingsprotokollet och sedan validera dess effekt i kronisk skademodell.

H & E-färgning utförs för att utvärdera de hepatocellulära skador som induceras genom akut etanolbehandling. På grund av den lätta att utföra fluorescensavbildning i zebrafisk används H & E-färgning inte rutinmässigt i zebrafiskleverhistologi, och förfarandet är mindre väl beskrivet. Det nuvarande protokollet ger en steg-för-steg beskrivning av H & E-färgning i larvallever. Att välja rätt fixativ är det första och mest nödvändiga steget för H & E-färgning. Även om 10% buffrad formalin och 4% PFA vanligen används i histologi, orsakar de båda vävnads krympningar och delar av levern som faller ut ur sektionen. 10% formalinfixering leder till förlust av cytoplasma i hepatocytes. 4% PFA-fixering resulterar i artificiella gap mellan hepatocyterna. Eosinfärgning verkar vara mycket svagare än hematoxylinfärgning i de lever som är fixerade med antingen fixativ. Den syrabaserade Dietrichs fixativet är mer lämpad för H & E-färgning av zebrafisklever, eftersom den bevarar cellulära detaljer och minskar krympningen. Det verkar också penetrera fettvävnad, såsom levern, snabbare än formalin och PFA. Färgningen med hematoxylin och eosin är mer balanserad. En försiktighet av Dietrichs fixativ är att den inte är kompatibel för genomisk DNA-extraktion. I ett försöksexperiment extraherades genom-DNA från larverna som fixerades med användning av 10% formalin, 4% PFA eller Dietrichs fixativ 26 . Larverna inkuberades i 50 | il 50 mM NaOH vid 95 ° C under 20 minuter och kyldes sedan till 4 ° C. 5 | il av 1 M Tris-HCl, pH 8,0 tillsattes sedan för att neutralisera baslösningen. Efter en kort centrifugering, övervätskan wSom används i PCR. Med samma PCR-primers och PCR-program gav det genomiska DNA-värdet från både formalin- och PFA-fixerade larver PCR-produkter med de förutspådda storlekarna, medan det genomiska DNA från Dietrichs fixativa fixerade larver inte lyckades ge några PCR-produkter.

H & E-färgning kan utföras på både paraffinsektioner och frysta sektioner. Parafinsektionerna har emellertid följande fördelar över frysta sektioner: 1) Parafinsektioner kan förvaras vid rumstemperatur i obestämd tid, frusna sektioner kan endast förvaras vid -80 ° C i upp till ett år. 2) För frysta sektioner kan bildandet av iskristaller i cellerna störa cellmorfologin och subcellulär detalj. Dessutom är frusna sektioner ofta tjockare än paraffinsektioner. Detta kan resultera i dåliga bilder av vävnadsmorfologi jämfört med de som framställs av paraffinsektioner.

Vid framställning av paraffinblock för levervävnader, det nuvarande protokolletInbjuder larverna i agaros. Larverna är placerade i sidled, med vänster sida av kroppen vänd nedåt och ligger platt mot botten av formen. Detta säkerställer leveransens konsekventa orientering, så att när sektioner skärs i följd kan ekvivalenta regioner i levern jämföras från fisk till fisk 27 . Ett annat viktigt steg som säkerställer framgångsrik H & E-färgning är färgutvecklingen. Det är viktigt att kontrollera färgningen ofta tills önskad färgintensitet uppnås.

H & E-färgning bör användas för att få en preliminär bedömning av leverskador. De etanolbehandlade larverna visar överdriven avsättning av runda droppar i hepatocyterna, vilket tyder på steatos 13 , 14 , 18 . Märkning med lipidfärgämnen, såsom Oljerapp O och Nile Red, är nödvändig för att bekräfta att dessa droppar verkligen är lipider. Det levera blodetEls i de behandlade djuren visas dilaterade och svullna. Skanningelektronmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi bör utföras för att undersöka de ultrastrukturella förändringarna i sinusoiderna. Det har tidigare rapporterats att extracellulär matrisproteinavsättning ökar i den etanolbehandlade zebrafiskleveren, vilket detekteras genom immunofluorescens 18 . Med tanke på att uttrycksnivåerna av fibrogena gener endast ökar måttligt i den behandlade fisken 18 , kan H & E emellertid inte vara känslig nog för att detektera en så liten mängd extracellulära matrisproteiner. Samma fixativa och färgningsmetoder testades på kroniskt skadade vuxna zebrafiskleverantörer och var tillräckliga för detektering av fibros (Yin, obublicerad data).

Även om det nuvarande protokollet är skräddarsytt för undersökning av leverhistologi i zebrafisklarver, har den en bredare ansökan till zebrafiskforskningsgruppen, som samE-protokollet kan appliceras på andra vävnader och till vuxen sebrafisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja erkänna Dr Katy Murray vid Zebrafish International Resource Center; Dr Stacey Huppert och Kari Huppert på CCHMC, för deras användbara råd om protokollet; Och CCHMC veterinärservice, för fiskvården. Detta arbete stöddes av NIH-stipendiet R00AA020514 och ett forskningsbidrag från Center for Pediatric Genomics at CCHMC (to CY). Den var också delvis stödd av NIH-bidrag P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) i Cement Center för Digestive Disease Research Centre i Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95, (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52, (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56, (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277, (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3, (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5, (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35, (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10, (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6, (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33, (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279, (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19, (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78, (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2, (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131, (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32, (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43, (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (11), 4358-4363 (2011).
Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter