Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55637
Automatic Translation
1
1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Summary

هنا، يستخدم قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف مع ميزة تحليلية يقارن الصور التفصيلية المشرقة لثلاثة علامات للبلعمة الذاتية ويحدد مدى مشاركتها في التعريب، جنبا إلى جنب مع عد بقعة LC3، لقياس التلقيح الذاتي بطريقة موضوعية وكمية وإحصائية قوية.

Abstract

أوتوفاجي هو مسار تقويضي في المكونات الطبيعية أو خلل التي تتراكم أثناء النمو والتمايز يتم تدهور عن طريق الليزوزوم وإعادة تدويرها. أثناء البلعمة الذاتية، يتم ترطيب البروتين السيتوپلازمي LC3 وتجنيده إلى الأغشية الذاتية. ثم يندمج الأوتوفاجوسوم مع الليزوسوم لتشكيل ال أوتوليسوسوم، حيث يحدث انهيار الحويصلة الذاتية و محتوياته. ويستخدم البروتين المرتبط ب أوبيكيتين p62، الذي يربط LC3، أيضا لمراقبة التدفق الذاتي. يجب أن الخلايا التي تمر البلعمة الذاتية تثبت التوطين المشترك لل p62، LC3، وعلامات الليزوزومية. وقد استخدم المجهر المناعي لتحديد بصريا LC3 بونكتا، p62، و / أو الليزوزومات على أساس كل خلية. ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على تقييم موضوعي ودقيق إحصائيا. للتغلب على هذه المشاكل، تم استخدام قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف جنبا إلى جنب مع ميزة تحليلية يقارن دي مشرق ديالذيل، من ثلاث علامات ذاتية (LC3، p62 و LAMP1 الليزوزومية) ويحدد توطين المشارك، جنبا إلى جنب مع العد بقعة LC3 لقياس البلعمة الذاتية بطريقة موضوعية وكمية، وإحصائيا قوية.

Introduction

ماكرووتوفاجي، ويشار إليها فيما بعد باسم أوتوفاجي، هو مسار تقويضي حيث المكونات المتضررة أو مختلة، والبروتينات طويلة العمر، وعضيات يتم تدهور عن طريق الليزوزوم ويتم إعادة تدويرها 1 . أوتوفاجي هو عملية ديناميكية ومتعددة الخطوات التي تنطوي على تشكيل أوتوفاغوسوم. والانصهار من أوتوفاغوسوم مع ليسوسوم، وتشكيل أوتوليسوسوم. وتدهور محتويات أوتوليسوسوم 2 . علامة بيولوجية حاسمة تستخدم لتحديد التلقيح الذاتي في نظم الثدييات هو البروتين ذات الصلة انيبيب المرتبطة 1A / 1B- سلسلة الخفيفة 3 (LC3)، الذي يشكل غشاء ذاتي تلقائي. أثناء البلعمة الذاتية، مترافق LC3-1 عصاري خلوي إلى فوسفهاتيديليثانولامين لتشكيل LC3-إي. ثم يتم دمج LC3-إي في غشاء ذاتي تلقائي 3 . علامة أخرى تستخدم على نطاق واسع للتدفق الذاتي هو المستقبلة التلقائية سيكستوسوم 1 (SQSTM1، p62) الذي جسديا لينكس الشحنات التلقائية إلى غشاء ذاتي المنشأ 4 ، 5 .

الطرق التي استخدمت تقليديا لقياس البلعمة الذاتية هي البقع الغربية والمضان المجهري 7 . ومع ذلك، فإن أيا من هذه الأساليب تعتبر "المعيار الذهبي" ، 2 ، 6 كما أن هناك تحديات المرتبطة بكل من هذه التقنيات. لا تعطي البقع الغربية إلا متوسطا لأنها تستخدم عينة متجانسة، لذا لا يستطيع المراقبون رؤية ما يحدث في الخلايا الفردية. من ناحية أخرى، المجهر مضان يعطي معلومات مراقب على مستوى خلية واحدة، لكنه يفتقر إلى قدرات الإنتاجية، مما يجعل من الصعب الحصول على تقييمات موضوعية ودقيقة إحصائيا. في السنوات الأخيرة، وقياس LC3 و p62 بواسطة التصوير الخلوي المتعدد التدفق الخلوي (ميفك، انظر جدول المواد ) وقد اكتسب بوبووناريتي بسبب قدرتها الكمية، وقدرات الإنتاجية العالية، وإمكانية تعدد الإرسال، والقدرة على صورة كل خلية. واحدة من الطرق الأكثر استخداما لقياس التلقيح الذاتي باستخدام ميفك، جنبا إلى جنب مع برنامجها تحليل رفيق (انظر جدول المواد )، من خلال العد بقعة من العقدة LC3 أو أوتوفاغوسوميس 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . ومع ذلك، فإن زيادة في أوتوفاغوسوميس لا يعني بالضرورة أن هناك زيادة في البلعمة الذاتية، كما يمكن أن تمثل أيضا حصارا في هذه العملية 2 . LC3-إي دوران هو معلمة مفيدة لقياس التدفق الذاتي من خلال تحليل الخلايا في وجود وغياب مثبط تدهور الليزوزومية، مثل الكلوروكين. الكلوروكوين يمنع انصهار أوتوفاغوسوم إلى ليسوسوم، مما يسمح الكمي لتشكيل أوتوفاغوسوم كمقياس لدرجة البلعمة الذاتية عن طريق القبض على تدفق الذات الذاتي قبل أن يحدث تدهور الليزوزومية 18 . وبالإضافة إلى ذلك، يتم تدهور p62 في المقام الأول عن طريق البلعمة الذاتية، وإذا تم حظر تدهور الليزوزومية من أوتوفاغوسوم ومحتوياته، ومن المتوقع تراكم p62 17 ، 19 .

أوتوفاجي هو عملية متعددة المراحل، وقياس LC3 أو p62 وحدها لا توفر صورة كاملة لما يحدث في الخلايا. وقد أكدت المنشورات الحديثة على الحاجة إلى دراسة التشكيل المتزامن لل أوتيليسوسوم 2 ، 17 ، 20 ، 21 . ميفك هوقادرة بشكل فريد لقياس تشكيل جسيم حال ذاتي من تصوير المشارك توطين جسيم بلعمي ذاتي إلى يحلول 15-17، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا استكشاف التوطين المشترك ل p62 و LC3 باستخدام ميفك لقياس التدفق الذاتي الذاتي 5 . في برنامج التحليل المشار إليه، تسمى "الميزة" التي تقيس التعريب المشترك "تشابه التفاصيل المشرقة R3" (بدس) وتم تصميمها خصيصا لمقارنة تفاصيل الصورة الصغيرة والمشرقة لصورتين. بدس هو معامل ارتباط بيرسون الذي تم تحويله من السجل إلى النقاط المضيئة المترجمة مع نصف قطرها 3 بكسل أو أقل؛ وبعبارة أخرى، بدس بحساب درجة سفرلابينغ بكسل من اثنين من قنوات الفلورسنت مختلفة. أما النقاط المضيئة فهي إما مترابطة ( أي نفس المكان المكاني) أو غير مترابطة ( أي مواقع مكانية مختلفة). لذلك، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). معامل تحويل السجل لزيادة المدى إلى ما بين صفر و إنفينيتي 26 ، 27 . وقد لا تكون خدمات تنمية الأعمال التجارية وحدها كافية؛ راجان وآخرون. وجدت أن استخدام بدس فقط يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة 21 . يقيم بدس التوطين المشترك لعلامتين من البلعمة الذاتية ولكن لا يعتبر عدد الأوتوفاغوسومات. لحساب عدد الأوتوفاغوسومات، راجان وآخرون. وشملت فرز بقعة من L3 بونكتي 21 . راجان وآخرون. اقترح استخدام مؤامرة مبعثر ثنائي المتغير من عدد بقعة LC3 مقابل بدس. باستخدام هذه المؤامرة ثنائية المتغير، واثنين من السكان ورe التي تم تحديدها أولا: واحدة مع الخلايا التي لديها مستوى عال من البقع LC3 واحد مع الخلايا التي لديها مستوى منخفض من البقع LC3. تم تصنيف السكان البقعة العالية ل LC3 إلى مجموعتين: الخلايا ذات التوطين المشترك المنخفض ( أي تراكم الأوتوفاغوسومات) والخلايا ذات التوطين المشترك العالي ( أي تراكم الأوتوليسوسومات). هذه المؤامرة المتغيرين يسمح واحد للتمييز بين الخلايا مع عدد قليل جدا من أوتوفاغوسوميس والخلايا مع تراكم أوتوفاغوسوميس و / أو أوتوليسوسوميس 21 .

حتى الآن، لم يكن ممكنا التوطين المشترك في وقت واحد من LC3، p62، و LAMP1 (علامة الليزوزومية) باستخدام واحد "نوع الميزة" في برنامج تحليل رفيق ميفك (انظر جدول المواد ). ومع ذلك، فإن ميزة جديدة، أدخلت مؤخرا في الإصدار 6.1، ويسمى مشرق التفاصيل كولوكاليزاتيون 3 (BDC3). BDC3 يقارن الصور مشرق التفاصيل من كل من الصور الثلاث (في هذه الحالة، لك3، p62، و LAMP1) ويقيس التوطين المشترك من تحقيقات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). وتحسب ميزة BDC3 معامل ارتباط بيرسون المعدل ليشمل ثلاث صور. وبما أن النقاط المضيئة في الصور الثلاث إما مترابطة أو غير مترابطة، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). يتم تحويل معامل لتحويل السجل إلى زيادة النطاق الديناميكي بين 0 و اللانهاية. من خلال تحويل ميزة بدس مع ميزة BDC3، وطريقة التحليل التي قدمها راجان وآخرون. يمكن الآن دمج ثلاث علامات الأكثر استخداما لقياس البلعمة الذاتية في نظام واحد في نفس الوقت. القدرة على المشاركة في توطين هذه العلامات الثلاثة من البلعمة الذاتية في فحص واحد يمكن أن يؤدي إلى رؤى جديدة في تحريض وتنظيم البلعمة الذاتية. بروتوكول التالية الخطوط العريضة الخطوات للحث على البلعمة الذاتية في خلايا جوركات. تسمية الخلايا مع LC3، p62، و LAMP1 الأجسام المضادة. الحصول على البيانات على متعددةإترال التصوير تدفق مقياس الكريات. وتحليل البيانات لتقييم التدفق الذاتي.

Protocol

1. إعداد الثقافة المتوسطة ومثبط تدهور الليزوزومية

  1. 1.1. جعل ~ 500 مل من 1X ثقافة ثقافة رمي. إضافة 5 مل من الأحماض الأمينية غير الضرورية ميم (100X)، 5 مل من البيروفات الصوديوم (100 ملم)، 5 مل من البنسلين الستربتومايسين الجلوتامين (100X)، و 25 مل من مصل الأبقار الجنين (فبس) إلى 500 مل زجاجة رمي - 1640 1x المتوسطة. وينبغي إعداد الوسيط في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تخزين وسط ثقافة رمي في 2-8 درجة مئوية. تسخين وسط ثقافة رمي إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى خلايا جوركات.
  2. جعل 100 ملي كلوروكين، المانع تدهور الليزوزومية. تزن 0.05 غرام من الملح الكلوروكوين ثنائي الفوسفات وإضافته إلى 1 مل من الخلايا خلية ثقافة الصف في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. دوامة حتى حل الكلوروكين.

2. زراعة الخلايا

  1. ثقافة 80 مل من الخلايا جوركات استنساخ E6-1 في وسط ثقافة رمي عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
    ملاحظة: عندما زراعة الخلاياأو العمل مع الخلايا جوركات قبل التثبيت، وينبغي أن يتم كل عمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
  2. قبل تحريض البلعمة الذاتية، عد الخلايا جوركات باستخدام عدادة الكريات أو جهاز آخر عد الخلايا لتحديد الخلايا / مل.

3. تحريض البلعمة الذاتية في الخلايا

  1. اتخاذ الخلايا جوركات في مرحلة النمو الأسي وتقسيمها إلى أربع عينات من 20 مل لكل منها في أنابيب الطرد المركزي 50 مل. تسمية أنابيب باسم "السيطرة"، "السيطرة + الكلوروكين،" "جوعا"، و "جوعا + الكلوروكين".
    ملاحظة: يجب أن يكون الخلايا جوركات تركيز 2.5-5 × 10 5 خلايا / مل.
  2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 30 مل من حل الملح المتوازن هانك دون كا 2 + أو مغ 2+ (هبس) إلى كل عينة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة. صب قبالة طاف في دورق النفايات.
  3. ريسوسبيند عينات السيطرة في 20 مل من رمي المتوسطة الثقافة بيبتينغ صعودا وهبوطا باستخدام 25 مل sتيريل المتاح ماصة تليها أداء فورتيكسينغ ضوء. وبالمثل، ريسوسبيند العينات جوعا في 20 مل من محلول الملح المتوازن إيرل دون كا 2 + أو مغ 2+ (إبس).
  4. باستخدام 25 مل ماصة معقمة القابل للتصرف، ونقل السيطرة وعينات جوعا إلى قوارير T75 التي تم وصفها "السيطرة"، "السيطرة + الكلوروكين،" "جوعا"، و "ستارفيد + الكلوروكين".
  5. إضافة 20 ميكرولتر من 100 ملي كلوروكين إلى 20 مل من وسط زراعة الخلايا في "السيطرة + الكلوروكين" و "ستارفيد + الكلوروكين" قوارير. مزيج في الكلوروكين عن طريق يحوم بلطف قارورة. وضع جميع القوارير في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة لمدة 2 ساعة.

4. إعداد مخازن لتثبيت وسم من LC3، LAMP1، و p62

  1. إعداد 10 مل من 4٪ الفورمالين حل التثبيت في برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل من 10٪ من الفورمالين الأسهم إلى 1 مل من 10x دولبيكو الفوسفات مخزنةمحلول ملحي دون كا 2 + أو مغ 2+ (بس) و 5 مل من الماء عالى النقاء في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    ملاحظة: تنبيه. الفورمالديهايد / الفورمالديهايد سامة إذا استنشقت أو ابتلعت. هو مزعجة للعيون، الجهاز التنفسي، والجلد. وقد يسبب توعية عن طريق الاستنشاق أو ملامسة الجلد. هناك خطر حدوث أضرار جسيمة للعيون. بل هو مادة مسرطنة محتملة.
  2. إعداد 10 مل من 1٪ الفورمالين حل إعادة تعليق النهائي في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من الأسهم 10٪ الفورمالين إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  3. إعداد 500 مل من غسل العازلة بإضافة 10 مل من فبس إلى زجاجة 500 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  4. إعداد 50 مل من العازلة بيرمابيليزاتيون في أنبوب الطرد المركزي 50 مل بإضافة 0.5 مل من تريتون 10٪ X-100 إلى 49.5 مل غسل العازلة أعدت في الخطوة 4.3.
  5. إعداد المضادة لل SQSTM1 / p62 اليكسا 488 (AF488) الأجسام المضادة / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل بإضافة 5 ميكرولتر من مكافحة SQSTM1 / p62-AF488 إلى 495 ميكرولتر من العازلة بيرمابيليزاتيون المحرز في قتيب 4.4. تأكد من أن تركيز الأجسام المضادة النهائي هو 5 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: جعل الأجسام المضادة بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل فقط قبل إضافته إلى العينة. حماية الحل من الضوء.
  6. إعداد الماوس مكافحة LC3 / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل بإضافة 5 ميكرولتر من الماوس مكافحة LC3 إلى 495 ميكرولتر من العازلة بيرمابيليزاتيون المحرز في الخطوة 4.4. تأكد من أن تركيز الأجسام المضادة النهائي هو 20 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: جعل الأجسام المضادة بيرمابيليزاتيون العازلة حلول العمل فقط قبل إضافته إلى العينة. حماية الحل من الضوء.
  7. إعداد حمار مكافحة الماوس اليكسا 647 (AF647) / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل بإضافة 5 ميكرولتر من AF647 المسمى حمار مكافحة الماوس - مفتش إلى 495 ميكرولتر من العازلة بيرمابيليزاتيون المحرز في الخطوة 4.4. تأكد من أن تركيز الأجسام المضادة النهائي هو 20 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: جعل الأجسام المضادة بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل فقط قبل إضافته إلى العينة. حماية tحل من الضوء.
  8. إعداد مكافحة الإنسان CD107a (LAMP1) -B الأجسام المضادة / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل بإضافة 25 ميكرولتر من مكافحة CD107a (LAMP1) -PE إلى 475 ميكرولتر من العازلة بيرمابيليزاتيون المحرز في الخطوة 4.4. تأكد من أن تركيز الأجسام المضادة النهائي هو 21 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: جعل الأجسام المضادة بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل فقط قبل إضافته إلى العينة. حماية الحل من الضوء.
  9. إعداد 10X دابي وصمة عار النووية بإضافة 4 ميكرولتر من 5 ملغ / مل دابي و 100 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 إلى 896 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.

5. وضع العلامات على الخلايا جوركات مع LC3، LAMP1، و p62

  1. إزالة 2 × 10 6 خلايا لكل عينة (عد الخلايا كما في الخطوة 2.2). وضع كل عينة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل الذي تم وصفه مع اسم العينة المناسبة ( أي السيطرة، التحكم + الكلوروكين، جوعا، أو جوعا + الكلوروكين).
    1. إضافة غسل العازلة بحيث هناك طسا إجمالي حجم 15 مل في كل 15 مل أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي العينات في 250 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح قبالة طاف.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ حل الفورمالين تثبيت لكل من الكريات الخلية. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الخطوة التثبيت، نقل العينات إلى المسمى، سيليكونيزد أنابيب البولي بروبلين ميكروسنتريفوج.
    ملاحظة: لا الإفراط في إصلاح الخلايا. قد يؤدي ذلك إلى نتائج ضعيفة لوضع العلامات.
  3. بعد 10 دقيقة خطوة التثبيت، إضافة 1 مل من غسل العازلة لكل عينة. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 لخلط العينة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. نضح قبالة طاف.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة SQSTM1 / p62 - AF488 الأجسام المضادة / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل لكل عينة. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل منبيرمابيليزاتيون العازلة لكل عينة. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 لخلط العينة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. نضح قبالة طاف.
  6. كرر الخطوات 5.4-5.5 لكل من حلول العمل الأجسام المضادة.
    ملاحظة: حلول العمل الأجسام المضادة هي الماوس مكافحة LC3 / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل، حمار مكافحة الماوس - AF647 / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل، ومكافحة CD107a الإنسان (LAMP1) - بي الأجسام المضادة / بيرمابيليزاتيون العازلة حل العمل. وينبغي أن يتم كل الأجسام المضادة بشكل منفصل وفي الترتيب المذكور. تم اختيار هذا الأمر لتقليل التفاعل المتبادل غير المرغوب فيه بين الأجسام المضادة.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الفورمالين 1٪. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200. إضافة 10 ميكرولتر من 10X دابي وصمة عار النووية لكل عينة. طفيفة دوامة كل عينة لخلط. احتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل تشغيل أي من العينات على الصك.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن للعينة إما بe تشغيل على ميفك أو تخزينها محمية من الضوء في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

6. وضع العلامات على ضوابط أحادية اللون

  1. لكل تحكم لون واحد ( أي AF488، بي، AF647، و دابي)، واتخاذ 1 × 10 6 جوركات الخلايا، والتي يمكن أن تكون من أي من السكان العينة. وضع 1 × 10 6 خلايا في 15 مل أنابيب الطرد المركزي وصفت إما AF488، بي، AF647، أو دابي.
  2. إضافة غسل العازلة بحيث يكون هناك حجم إجمالي 15 مل في كل 15 مل أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي العينات في 250 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح قبالة طاف.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من غسل العازلة إلى AF488، بي، و AF647 أنابيب.
    ملاحظة: بالنسبة إلى أنبوب دابي، انتقل إلى الخطوة 6.8.
    1. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200. نقل إلى أنابيب 1.5 مل.
  4. إضافة 5 ميكرولتر إما لمكافحة CD45-AF488، ومكافحة CD45-بي أو مكافحة CD45-AF647 إلى AF488، بي، أو AF647 أنابيب، على التوالي. مزيج بواسطة فورتيكسينغ لightly.
  5. احتضان AF488، بي، و AF647 أنابيب لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: علامات أخرى يمكن استخدامها، مثل LC3، p62، و لامب-1 الأجسام المضادة بدلا من الأجسام المضادة لمكافحة CD45. ومع ذلك، CD45 هو علامة موثوقة للضوابط لون واحد.
  6. غسل AF488، بي، و AF647 الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من غسل العازلة لكل عينة.
    1. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 لخلط العينة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. نضح قبالة طاف.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الفورمالين 1٪. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن يتم تشغيل العينة إما على ميفك أو المخزنة محمية من الضوء في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من 1٪ حل التثبيت الفورمالين إلى أنبوب دابي.
    1. ريسوسبيند بواسطة بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 101؛ L من 10X دابي وصمة عار النووية لعينة دابي. دوامة بخفة لخلط. احتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل تشغيل على الصك.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن يتم تشغيل العينة إما على ميفك أو المخزنة محمية من الضوء في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

7. بدء ومعايرة مركز ميفك

  1. تحقق للتأكد من غمد، كاشف معايرة النظام (انظر الجدول من المواد )، ديبوبلر، المطهر، وحاويات التعقيم مليئة وخزان النفايات فارغة. إن لم يكن، ملء الحاويات وتفريغ خزان النفايات.
  2. السلطة حتى النظام وانقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج (انظر جدول المواد ق) رمز لإطلاق التطبيق. وهذا سوف يبدأ برنامج ميفك.
  3. انقر فوق زر بدء التشغيل وتأكد من أن يتم بدء كافة المعايرة والاختبارات . هذا سوف مسح النظام، تحميل غمد، نظام معايرة كاشف،ومعايرة النظام.

.8 تشغيل عناصر التحكم في العينات والعناصر أحادية اللون على مركز ميفك

  1. قم بتحميل القالب الافتراضي بالانتقال إلى علامة التبويب ملف واختيار تحميل القالب الافتراضي .
    ملاحظة: يحتوي القالب الافتراضي على النقاط الخام نقطة بكسل ماكس.
  2. بدوره على 488 نانومتر، 405 نانومتر، 642 نانومتر، وأجهزة الليزر سك عن طريق النقر على الأزرار الخاصة بهم. تعيين قوة الليزر عن طريق إدخال الطاقة المطلوبة بجانب كل زر ليزر. انظر الشكل 1 .
    ملاحظة: لهذه التجربة، القوى الليزر هي 200 ميغاواط، 20 ميغاواط، 150 ميغاواط، و 5 ميغاواط (CH06) ل 488 نانومتر، 405 نانومتر، 642 نانومتر، و سك، على التوالي. التكبير مفك الافتراضي قالب تعيينه إلى 40X، والحساسية الافتراضية هي مرحبا ، ويتم تمكين جميع القنوات .
  3. تأكد من تعيين شريط التمرير للتكبير إلى 40X، يتم تحديد وضع حساسية عالية، وتظهر جميع القنوات في معرض الصور. شكل 1
  4. تحميل "ستارفيد + الكلوروكين" عينة عن طريق النقر على زر تحميل وتحميل أنبوب 1.5 مل على الصك.
    ملاحظة: يجب أن يكون لهذه العينة التجريبية أعلى إشارة لجميع العينات ل AF488 و بي و AF647 (ينبغي أن تكون إشارة دابي تقريبا نفس قوة الإشارة لجميع العينات التجريبية، بما في ذلك عينة "ستارفيد + كلوروكين").
  5. استخدام "ستارفيد + الكلوروكين" عينة للتأكد من أن القوى الليزر المناسبة ل 488 نانومتر، 405 نانومتر، 642 نانومتر، وأجهزة الليزر سك يتم تعيين. استخدام الخام ماكس بكسل نقطة المؤامرات من القالب الافتراضي لضبط القوى الليزر بحيث الإشارات قوية ولكن لا تصل إلى قيمة بكسل ماكس الخام من 4،096، والتي من شأنها أن تشبع كاميرا كسد على الصك. استخدام هذا الإعداد ليزر لجميع العينات التجريبية.
  6. انقر على إنشاء نقطة مؤامرات رمز لخلق نقطة مؤامرة جديدة. حدد "Area_M01 "على المحور السيني و" أسبيكت Ratio_M01 "على المحور Y ل" جميع "السكان.انقر على أيقونة إنشاء منطقة المضلع رسم منطقة حول الخلايا اسم هذه المنطقة" خلية ".
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين إضافة المؤامرات والمناطق إضافية لتضييق الخلايا التي يتم جمعها. وهناك مؤامرة إضافية مشتركة لإضافة سيكون التدرج رمز لتحديد الخلايا التي هي في التركيز.
  7. تعيين المعلمات الاستحواذ. حدد اسم الملف والمجلد الوجهة، وتغيير عدد الأحداث إلى "5000"، وحدد مجموعة "الخلية". انقر فوق الزر أكير للحصول على الملف. بعد جمع الملف، قم بإرجاع العينة بالنقر فوق الزر ريتورن . إزالة أنبوب العينة من الصك.
  8. للعينات الثلاث التالية ("جوعا"، "السيطرة"، و "السيطرة + الكلوروكين")، وتحميل العينة، أدخل اسم العينة، والحصول على عينة، والعودة العينة باستخدام نفس الإعدادات كمال "ستارفيد + الكلوروكين" عينة، أعلاه.
  9. بعد الحصول على العينات، تشغيل عينات التحكم لون واحد والحصول على البيانات بحيث يمكن إجراء مصفوفة التعويض. إيقاف الليزر سك عن طريق النقر على زر سك . إيقاف قنوات برايتفيلد عن طريق النقر على زر برايتفيلد وتحديد أوف .
    ملاحظة: إذا تمت إزالة القنوات من معرض الصور للحصول على عينة تجريبية، وإعادة تمكين جميع القنوات. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على الضوابط لون واحد عن طريق النقر على علامة التبويب التعويض واختيار إنشاء مصفوفة ؛ وهذا يفتح معالج التعويض، والتي سوف المشي من خلال خطوة من جمع الملفات وجعل مصفوفة التعويض.
  10. تحميل دابي تحكم لون واحد عن طريق النقر على زر تحميل وتحميل أنبوب 1.5 مل في الصك. أدخل اسم العينة (دابي فقط)، وقم بتعيين مجموعة المجموعات إلى "الكل"، وتغيير عدد الحدثs إلى "500."
    1. انقر فوق الزر أكير للحصول على ملف التحكم أحادي اللون.
    2. عند اكتمال جمع الملف، قم بإرجاع العينة بالنقر فوق الزر ريتورن . إزالة أنبوب العينة من الصك.
    3. بعد عينة دابي، تحميل التبييض 10٪ تماما مثل عينة عن طريق النقر على زر تحميل وتحميل 100 ميكرولتر من 10٪ التبييض في أنبوب 1.5 مل. السماح تشغيل العينة ل ~ 15 ثانية. هذا سوف إزالة أي دابي المتبقية من الأنبوب.
    4. تشغيل 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X، كما فعلت في 8.10.3، لإزالة المتبقية 10٪ التبييض. الصك هو الآن على استعداد لتشغيل AF488، بي، و AF647 الضوابط لون واحد.
    5. كرر الخطوات 8.10-8.10.2 لكل من الضوابط لون واحد ( أي AF488، بي، و AF647).
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لتشغيل 10٪ التبييض أو برنامج تلفزيوني بين هذه العينات، إلا بعد التحكم دابي لون واحد.

9. تحليل البيانات في مركز ميفكأليسيس البرمجيات

  1. إطلاق برنامج تحليل ميفك (انظر جدول المواد ).
  2. انقر فوق " تحليل ابدأ" لبدء تشغيل "معالج فتح الملف" . حدد ملف البيانات لفتح من خلال التصفح إلى "ستارفيد + كلوروكين" ملف الصورة الخام (.rif). حدد الملف وانقر فوق الزر فتح . انقر فوق التالي .
    1. تطبيق التعويض. حدد مصفوفة تعويض تم إنشاؤها مسبقا وانقر فوق التالي . بدلا من ذلك، قم بإجراء مصفوفة تعويض جديدة بالنقر على زر مصفوفة جديد .
      ملاحظة: الخطوات 9.2.1.1-9.2.1.2 هي الخطوات لإنشاء مصفوفة جديدة.
      1. إضافة ملفات التحكم لون واحد ( أي دابي فقط، AF488 فقط، بي فقط، و AF647 فقط) إلى قائمة "ملفات التحكم" عن طريق النقر فوق إضافة ملفات ، وتحديد الملفات، والنقر فوق الزر فتح . انقر فوق التالي .
      2. ستظهر نافذة إنشاء مصفوفة التعويض لهذه التجربة. يكفل لe يتم اختيار CH02 و CH03 و CH07 و Ch11 ثم انقر فوق التالي . وسيتم إنشاء مصفوفة التعويض. انقر فوق إنهاء لحفظ مصفوفة التعويض. قم بإضافة ملف التعويض إلى "معالج الملفات المفتوحة" ثم انقر فوق التالي .
    2. تطبيق قالب التحليل. في هذه المرحلة، لا يوجد قالب تحليل لتطبيق، لذلك انقر فوق التالي .
      ملاحظة: بالنسبة للملفات التجريبية الأخرى، يمكن استخدام هذا الملف "ستارفيد + Chloroquine.daf" كقالب.
    3. قم بتسمية الملف (يتم تلقائيا إنشاء أسماء الملفات التي تتوافق مع أسماء "ريف") ثم انقر فوق التالي . قم بتعيين خصائص عرض الصور عن طريق تحديد القنوات "02" و "03" و "07" و "11"؛ القنوات 01، 06، و 09 يتم اختيارها مسبقا. انقر فوق التالي .
  3. في نهاية معالج الملفات المفتوحة ، حدد معالج أبوبتوسيس . انقر على أيقونة معالج أبوبتوسيس ثم علىزر " تحديد معالج" لفتح معالج أبوبتوسيس .
    1. حدد قناة الصورة النووية (CH07) وانقر فوق التالي . بوابة الخلايا في أفضل التركيز. انقر على أيقونة إنشاء خط المنطقة ورسم منطقة على التدرج RMS_M01_Ch01 من 60-90. اسم هذه المنطقة "التركيز"، انقر فوق موافق ، ثم انقر فوق التالي .
    2. بوابة الخلايا واحدة. انقر على رمز إنشاء منطقة المضلع . رسم منطقة حول الخلايا واحدة، واسم المنطقة "واحد"، انقر فوق موافق ، ثم انقر فوق التالي . انقر على لا "هل تريد تحليل المجموعات السكانية الفرعية؟"
    3. بوابة الخلايا النووية. انقر على رمز إنشاء خط المنطقة ورسم منطقة تتضمن جميع الخلايا النووية. اسم المنطقة "نوكليتد". انقر فوق موافق و التالي .
    4. بوابة الخلايا الأبوطوزية. انقر على رمز إنشاء منطقة المضلع . رسم منطقة حول الخلايا الأبوطوزية. هذه هي الخلايامع منخفضة النووية area_T50٪ وعالية سايتفيلد النقيض من ذلك. انقر فوق إنهاء . إضافة منطقة ثانية عن طريق النقر على أيقونة إنشاء منطقة المضلع ورسم منطقة حول الخلايا غير أبوبتوتيك. اتصل بهذه المنطقة "الخلايا".
  4. حدد الخلايا التي تكون إيجابية ل LAMP1، p62، و LC3. انقر على أيقونة بيلدينغ بلوكس ، وحدد فلورزنس بوسيتيفس - وان كولور ، وحدد "الخلايا" السكان و Intensity_MC_Ch03 . تسمية X- محور "كثافة LAMP1". ارسم منطقة تتضمن خلايا ذات كثافة أكبر من 10000 من خلال النقر على رمز منطقة إنشاء الخط ورسم المنطقة. تصنيف هذه المنطقة "LAMP1 +". اتبع الخطوات نفسها كما في 9.4 لتحديد خلايا إيجابية ل p62 و LC3.
    1. ل p62 + حدد "LAMP1 +" السكان و Intensity_MC_Ch02 . تسمية X- محور "كثافة p62" ومنطقة خلايا p62 + "LAMP1 + / p62 +".. ل LC3 +، حدد "LAMP1 + / p62 +" السكان و Intensity_MC_Ch11. تسمية X- محور "كثافة LC3" ومنطقة خلايا LC3 + "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". استخدام هذا "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" السكان لبقية التحليل.
  5. إنشاء ميزة العد بقعة لحساب البقع LC3.
    ملاحظة: يجب إنشاء هذا باستخدام "ستارفيد + كلوروكين" العينة.
    1. انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد قناع . انقر فوق الزر جديد ثم الزر الدالة . ضمن الدالة ، حدد الذروة ؛ قناع ، حدد M11 . و تشانل ، حدد CH11 . تعيين بقعة إلى نسبة خلفية الخلية إلى 4 . انقر فوق موافق لإغلاق إطار تعريف قناع وظيفة ثم انقر فوق موافق لإضافته إلى قائمة قناع . انقر فوق إغلاق للخروج من ماسك ماناجر .
    2. انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد جديد . ضمن نوع الميزة ، حدد سبوت كونت أند وندر ماسك ، حدد بيك (M11، CH11، برايت، 4). اكتب "سبوت كونت LC3" الاسم ثم انقر فوق موافق ثم أغلق للخروج من "إدارة الميزات" .
      ملاحظة: قد يتم استخدام معالج سبوت أيضا لإنشاء ميزة عد بقعة. قد لا تكون ميزة العد الفوري المستخدمة في هذه التجربة مناسبة للتجارب الأخرى و / أو خط الخلية. يجب على المستخدم اختبار العديد من أقنعة العد / الميزات الموضعية عند اتخاذ قرار بشأن قناع / ميزة لمجموعة بيانات محددة. بوغسلي 2017 لديها مزيد من التفاصيل عن العد الفوري باستخدام برنامج تحليل ميفك 26 .
    3. انقر على أيقونة الرسم البياني الجديد . حدد "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" السكان. حدد ميزة سبوت كونت LC3 ثم انقر فوق موافق .
  6. إنشاء ميزة BDC3.
    1. Cلعق علامة التبويب تحليل وحدد الميزات . انقر على زر جديد . ضمن نوع الميزة ، حدد برايت ديتايل كولوكاليزاتيون 3 ؛ قناع ، حدد ماك . الصورة 1 ، حدد CH02 (p62)؛ الصورة 2 ، حدد CH03 (LAMP1)؛ وأنا ماج 3 ، حدد CH11 ( LC3 ). اكتب "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" للاسم وانقر فوق موافق ثم أغلق للخروج مدير ميزة .
    2. انقر على أيقونة الرسم البياني الجديد . حدد "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" السكان. حدد ميزة pdc3 p62 / LAMP1 / LC3 ثم انقر فوق موافق .
  7. انقر على رمز سكاتربلوت الجديد . حدد "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" السكان. حدد BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 للمحور X. حدد ميزة سبوت كونت LC3 للمحور Y. انقر فوق موافق .
  8. حفظ ثه "ستارفيد + كلوروكين" الملف. انقر على ملف وحدد حفظ ملف تحليل البيانات (.daf) . انقر فوق حفظ و نعم لاستبدال الإصدار السابق من الملف؛ يمكن الآن استخدام هذا الملف كقالب.
  9. افتح ملف "التحكم". انقر على ملف ثم افتح . حدد الملف "Control.rif" ثم انقر فوق فتح . حدد مصفوفة التعويض من الخطوة 9.2.1 وملف "ستارفيد + Chloroquine.daf" كقالب. انقر فوق موافق .
  10. إنشاء مناطق لتراكم أوتوفاغوسوم وتراكم أوتوليسوسوم باستخدام "السيطرة" عينة لتعيين المناطق.
    1. انقر على رمز إنشاء منطقة مستطيل . رسم منطقة من X- إحداثيات -0.1 إلى 3 و Y- إحداثيات 1.5 إلى -0.3. اسم هذه المنطقة "بقع منخفضة". اضغط على إنشاء رمز منطقة مستطيل . رسم منطقة من X- إحداثيات -0.1 إلى 1 و Y- التنسيقمن 17.5 إلى 1.5. اسم هذه المنطقة "ارتفاع بقعة / منخفضة BDC3."
    2. انقر على رمز إنشاء منطقة مستطيل. رسم منطقة من X- إحداثيات من 1 إلى 3 و Y- إحداثيات 17،5-1،5. اسم هذه المنطقة "البقع العالية / عالية BDC3".
  11. حفظ ملف "التحكم". انقر على ملف وحدد حفظ ملف تحليل البيانات (.daf ) . انقر فوق حفظ و نعم لاستبدال الإصدار السابق من الملف؛ يمكن الآن استخدام هذا الملف كقالب.
  12. افتح ملف "كونترول + كلوروكين" من خلال النقر على ملف ثم فتح . حدد ملف "كونترول + Chloroquine.rif" وانقر فوق فتح . حدد مصفوفة التعويض من الخطوة 9.2.1 وملف "CONTROL.daf" كقالب. انقر فوق موافق . كرر هذا لملفات "ستارفيد" و "ستارفيد + كلوروكين".
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الدالة دفعة في برنامج التحليل لتطبيق التعويضو / أو قالب للملفات الأخرى. وترد الاستراتيجية النهائية للابحار في الشكل 2 .

Representative Results

يستخدم هذا الأسلوب تحليل ميزات متعددة لتقويم التدفق الذاتي. من أجل فهم كامل المؤامرة ثنائية المتغير النهائي، يجب أولا التحقيق في ميزات التحليل الفردية. يعد عد الأوتوفاغوسومات طريقة منطقية لقياس البلعمة الذاتية. ومع ذلك، فإن حجم / شكل / سطوع من LC3 بونكتا يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الخلايا. الاختلاف يمكن أن يجعل من الصعب حساب أوتوفاغوسوميس يدويا أو باستخدام ميزة العد بقعة في برنامج التحليل. ولذلك، فإن أي ميزة العد بقعة يكون مثاليا بسبب هذا التباين الكبير في أوتوفاغوسوميس. ومع ذلك، فإن ميزة العد بقعة جيدة تعمل على معظم الخلايا 26 . ويبين الشكل 3 أمثلة على اخفاء بقعة من العقدة LC3 في خلايا جوركات باستخدام أقنعة بقعة مختلفة. إن ميزة العد الفوري المحددة لمجموعة البيانات هذه هي سبوت Count_Peak (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4) _4، بمعنى أن ميزة العد الموضعي تحسب البقع التي يقوم بها بي(M11) على القناة 11 (CH11-LC3-AF647) مع نسبة خلفية من بقعة إلى خلية من 4 (مشرق، 4). ويبين الشكل 4 الرسم البياني العد العد التنازلي وصور تمثيلية لمتوسط ​​عدد بقعة للسيطرة، السيطرة + الكلوروكوين، جوعا، و ستارفيد + كلوروكين جوركات الخلايا المسمى مع مكافحة LC3-AF647. السيطرة و ستارفد متوسط ​​التهم بقعة لا تختلف اختلافا كبيرا؛ مع إضافة الكلوروكين، هناك فرق كبير في متوسط ​​السيطرة + الكلوروكين مقارنة مع ستارفيد + الكلوروكين.

الميزة التالية للتحقيق هي BDC3. BDC3 هو قياس التوطين المشترك لثلاثة علامات / تحقيقات، في هذه الحالة، LC3، p62، و LAMP1. الشكل 5A - 5D يظهر الرسوم البيانية BDC3 للسيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، و ستارفيد + الكلوروكوين جوركات الخلايا المسمى مع مكافحة p62-AF488، ومكافحة LAMP1-بي، ومكافحة LC3-AF647. هناك تحول بين متوسط ​​كونترول إلى المتوسط ​​الجارف، فضلا عن كونترول + كلوروكين يعني إلى ستارفيد + كلوروكين يعني. ومع ذلك، وبالنظر إلى صور الخلايا من متوسط ​​عشرات BDC3 في الشكل 5E - 5H ، وهناك فرق أكبر بين العينات من الرسوم البيانية قد يؤدي واحد إلى الاعتقاد. وذلك لأن BDC3 لا تنظر في عدد من العضيات البلعمة الذاتية التي تشارك في توطين، مما أدى إلى درجة كبيرة من التباين في عدد من الأوتوفاغوسومات لنفس درجة BDC3. في معظم الحالات، هناك تداخل بين تحقيقات الثلاثة لأنه، حتى في المستويات القاعدية، p62، LAMP1، و LC3 ينبغي، إلى حد ما، المشاركة في توطين أو يقيمون في مناطق مماثلة في الخلايا. على النقيض من ذلك، مثال على ثلاثة تحقيقات لا ينبغي أن تشارك في محلية هي المضادة لل p62-AF488، ومكافحة LC3-AF647، و دابي الصبغة النووية لعينة ستارفيد + الكلوروكوين، كما هو مبين في الشكل 6. < / P>

عندما يتم الجمع بين ميزة بقعة العد وميزة BDC3، وجود مجموعات سكانية فرعية مختلفة من شأنها أن تحسن القدرة على التمييز بين مختلف عينات / شروط واضحة. ويبين الشكل 7 مؤامرة ثنائي المتغير من بقعة بقعة من LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 للعينات الأربعة: السيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، ونارفد + الكلوروكين. تم استخدام عينة التحكم لتعيين استراتيجية النابضة لثلاث مجموعات: البقع المنخفضة، البقع العالية / منخفضة BDC3، والبقع العالية / عالية BDC3. وأظهرت عينات السيطرة أن أكثر من 98٪ من الخلايا كان 1 أو أقل البقع. تم تعيين الحدود بين البقع العالية / منخفضة BDC3 والبقع العالية / BDC3 عالية إلى درجة BDC3 من 1 لأن أكثر من 91٪ من العينة السيطرة على درجة BDC3 أقل من 1. ملخص لنتائج المؤامرات ثنائي المتغير في الجدول 1 .

العمر = "1"> شكل 1
الشكل 1: إعداد أداة ميفك. لقطة شاشة لإعدادات أداة ميفك المستخدمة لهذه التجربة، المبينة في الخطوة 8 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشکل 2: إستراتیجیة مباعدة برامج التحلیل. لقطة شاشة من مخطط تحليل البرامج المباعدة، المبينة في الخطوة 9 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

fig3.jpg "/>
الشكل 3: LC3 بقعة اخفاء. جوركات صور الخلايا والأقنعة المستخدمة لإنشاء ميزة العد بقعة. (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 2)، الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4)، الذروة (M11، CH11-LC3-AF647 ، مشرق، 5)، بقعة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 5،3،1)، بقعة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 6،2،1). القناع الذي يعمل بشكل أفضل لجميع الخلايا أظهرت هو الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: رسم بياني لعد التنازلي LC3. باستخدام ميزة العد الفوري سبوت Count_Peak (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4) _4 و الرسم البياني العددي LC3-AF647 العد التنازلي للتحكم ( A ، أزرق فاتح)، كونترول + كلوروكينe ( b ، الأزرق)، ستارفيد ( c ، الوردي)، و ستارفيد + الكلوروكين ( d ، الأحمر). متوسط ​​التعداد الموضعي ل كونترول، كونترول + كلوروكين، ستارفيد، أند ستارفيد + كلوروكين 0.07، 1.13، 0.10، 2.77، على التوالي. LC3-AF647 (الأحمر)، صبغ النووي دابي (الأزرق)، ومركب من الصور LC3-AF647 و دابي للخلايا التمثيلية للعد متوسط ​​البقعة للرقابة ( E ، 0 البقع)، ​​التحكم + الكلوروكين F ، 1 بقعة)، ستارفيد ( G ، 0 البقع)، ​​و ستارفيد + الكلوروكين ( H ، 3 البقع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: الرسم البياني BDC3 من p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 رسوم بيانية فوr التحكم ( A ، الضوء الأزرق)، تحكم + الكلوروكين ( B ، الأزرق)، ستارفيد ( C ، الوردي)، و ستارفيد + الكلوروكين ( D ، الأحمر). متوسط ​​درجة BDC3 للتحكم، التحكم + الكلوروكوين، الجوع، و النجم + الكلوروكين هي 0.57، 0.82، 0.74، و 0.98، على التوالي. BF. p62-AF488 (أخضر)؛ LAMP1-بي (الأصفر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ ويظهر مركب من الصور p62-AF488، LAMP1-بي، و LC3-AF647 للخلايا التمثيلية لمتوسط ​​BDC3 للتحكم ( E )، التحكم + الكلوروكين ( F )، ستارفيد ( G )، و ستارفيد + كلوروكين H ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: الرسم البياني BDC3 من p62 / LC3 / دابي ل ستارفيد + الكلوروكين عينة. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / دابي الرسم البياني ل ستارفيد + الكلوروكين عينة. متوسط ​​درجة BDC3 هو 0.07. ( ب ) بف؛ p62-AF488 (أخضر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ دابي (الأزرق)؛ ويظهر مركب من الصور P62-AF488، LC3-AF647، و دابي للخلايا التمثيلية لمتوسط ​​BDC3 لعينة + جذور الكلوروكين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: قطعتين متغيرتين من عدد البقع LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) المؤامرات ثنائي المتغير من العد بقعة LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 للسيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، وخزف + الكلوروكوين جوركات الخلايا. ( ب ) بف؛ p62-AF488 (أخضر)؛ LAMP1-بي (الأصفر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ ويظهر مركب من الصور p62-AF488، LAMP1-بي، و LC3-AF647 من ثلاث مناطق ( أي البقع المنخفضة، والبقع العالية / منخفضة BDC3، والبقع العالية / BDC3 عالية) لعينة الكلوركين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعداد الخلايا تفاصيل مشرقة كولوكاليزاتيون 3 يعني سبوت كونت LC3 مين ٪ بقعة منخفضة ٪ ارتفاع بقعة / منخفضة BDC3 ٪ عالية بقعة / عالية BDC3
مراقبة 439 0.57 0.07 98.2 1.8 0.0
السيطرة + الكلوروكين 1432 0.82 1.13 68.9 19.5 11.7
ميت من الجوع 1204 0.74 0.10 98.4 0.6 1.0
جارف + الكلوروكين 1811 0.98 2.77 32.1 36.9 31.0

الجدول 1: ملخص جوركات LC3 بقعة العد مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 المتغير ثنائي القطعة

Discussion

عند تنفيذ هذا التحليل، هناك عدد قليل من الأشياء التي يجب مراعاتها. من المهم أن يكون لديك عينات التحكم المناسبة. لهذه التجربة، تم استخدام اثنين من الضوابط المختلفة: السيطرة والسيطرة + الكلوروكين. واستخدمت عينة التحكم لتحديد عتبة المناطق. وهو يمثل المستوى القاعدي من البلعمة الذاتية دون وقف تدهور الليزوزومية وهو السيطرة على عينة ستارفيد. ومع ذلك، فإن عينة التحكم ليست السيطرة المناسبة للمقارنة مع النتائج من ستارفيد + الكلوروكين عينة لأن الكلوروكين نفسه يؤثر على عينة السيطرة. لذلك، كان من الضروري أن يكون لديك عنصر تحكم + الكلوروكين.

قبل إجراء أي تحليل للبلعمة الذاتية، من المهم فقط تحليل / بوابة على الخلايا الفردية التي هي في التركيز ( أي رمز التدرج أكثر من 60)، حيث يمكن أن تتأثر النتائج إذا كان هناك أكثر من خلية واحدة أو الصور هي خارج تركيزي. ومن الأهمية بمكان أن الأوتوفاغوسومإس و ليسوسوميس في التركيز على عد السليم الصحيح وتحليل BDC3. يجب إزالة الخلايا الأبوطوزية قبل تحليل البلعمة الذاتية، لأنها قد تحرف النتائج ويجب عدم تضمينها. يجب أن يكون هناك تلطيخ المناسب لجميع علامات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). على سبيل المثال، جميع العلامات الثلاثة هي داخل الخلايا وينبغي أن يكون إشارة منقط. إذا كانت الإشارة لا منقط، أو إذا كان على سطح الخلية، فإن تلطيخ لا يكون مناسبا، وينبغي أن تجدد التجربة / تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، ل BDC3 لتكون دقيقة، فمن الضروري أن بوابة على الخلايا التي هي مشرقة لجميع علامات الفلورسنت الثلاثة من الفائدة. مطلوب الانطلاق على الأحداث الإيجابية لمنع قياس BDC3 على غير محددة ملزمة، والتحف التصوير، و / أو الضوضاء. هذا أمر بالغ الأهمية، كما يمكن BDC3 تضخيم التحف التي ليست إشارات حقيقية. منذ BDC3 لا يمكن أن يؤديها إلا على أحداث إيجابية مشرقة، قد لا يتم تضمين العديد من الخلايا في التحليل النهائي. هذا هو إسبكإيلي صحيح لخلايا السيطرة التي ليس لديها أي تراكم LC3، p62، و / أو LAMP1. وبالتالي، فإن الحد من هذا الفحص هو أن BDC3 يدرس فقط الخلايا التي هي إيجابية لجميع العلامات الثلاثة، والتي قد لا تكون مناسبة لجميع التجارب التلقائية.

مثل بدس، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا 15 ، 16 ، 17 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، BDC3 وحدها لا تأخذ في الاعتبار عدد عضيات البلعمة الذاتية التي تشارك في توطين، مما أدى إلى درجة كبيرة من التباين في عدد الأوتوفاغوسومات. ولذلك، فإن النهج ثنائي المتغيرات التي قدمها راجان وآخرون. كان موظف. وبالنظر إلى المؤامرات ثنائي المتغير، يمكن للمرء أن يسأل عما إذا كانيجب أن تكون الخلايا إيجابية ل LC3، p62، و LAMP1. لماذا هناك الكثير من الخلايا التي لديها 0 البقع؟ وذلك لأن إشارة LC3 قد تكون مشرقة بما فيه الكفاية للتوطين المشترك، ولكنها قد لا تفي بالعتبة المحددة بواسطة قناع الذروة (الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4)) اللازمة لكي تعتبر بقعة.

بروتوكول المقدمة هنا تستخدم ميفك لحساب LC3 بونكتا والمشاركة في توطين ثلاث علامات التلقيح الذاتي لقياس التدفق الذاتي. في ظل الظروف القاعدية (عينة التحكم)، كان عدد من أوتوفاغوسوميس منخفضة، وتم العثور على عدد قليل من الخلايا مع "البقع العالية". مع إضافة الكلوروكين، الذي يثبط الانصهار الذاتي / الانصهار ليسوسوم، كان هناك زيادة في عدد البقع LC3. منذ ليسوسوم غير قادر على كسر أوتوفاغوسوم و p62، الذي يقيم في أوتوفاغوسوم، وهذا يؤدي إلى زيادة في المشاركة في توطين ل LC3، p62، و LAMP1 تراكم أوتوليسوسوم. تم تضخيم هذا التأثير تحت ستارف المغذياتأيون، الذي يدفع إلى البلعمة الذاتية. ومع ذلك، من دون إضافة الكلوروكين، لم يكن هناك زيادة كبيرة في عدد من الأوتوفاغوسومات، على الأرجح بسبب زيادة في معدل دوران البلعمة الذاتية. عندما جوعت الخلايا في وجود الكلوروكين، كان هناك زيادة في التوطين المشترك وعدد من أوتوفاغوسوميس، وهو ما يدعم الاستنتاج بأن المجاعة تزيد من التدفق الذاتي. ومن المعروف إبس أن يكون محفز قوي من البلعمة الذاتية. ولذلك، من المتوقع أن تكون الزيادة كبيرة. إذا تم استخدام طريقة أخرى، مثل تحريض المخدرات، للحث على البلعمة الذاتية، قد يكون الفرق بين عنصر التحكم والعينات المعالجة أقل سطوعا.

وقد تم تصميم هذا البروتوكول خاصة لقياس البلعمة الذاتية في خطوط الخلايا البشرية، ولكن يمكن تكييف الفحص إلى الأنواع الأخرى عن طريق التحول إلى الأجسام المضادة لهذا النوع معين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام طريقة التحليل لأي تطبيق داخل الخلايا التي تتطلب المشاركة في التعريبمن ثلاثة تحقيقات / علامات.

Disclosures

أنا مستخدم من قبل ميليبوريسيغما، صانع العلامة التجارية أيمنيس إيماجستريم، والذي تم استخدامه في هذه الدراسة.

Acknowledgments

أود أن أشكر زملاء العمل في ميليبوريسيغما، فيليب J. موريسي و شيري L. صديق، على دعمهم وتوجيههم على مر السنين. وأود أيضا أن أشكر فيديا فينكاتاشلام وبريان R. دافيدسون لمساعدتهم مع ميزة BDC3 في برنامج إيدياس ، ريان P. جيسوب للمساعدة في تحرير هذه المخطوطة، ريموند كونغ للمساعدة في يوم اطلاق النار، وشكرا خاصا لك لفنان ماكياج سينثيا زامونتين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
50 mL centrifuge tube Falcon 352070
AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG  Invitrogen A-31571 Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-human CD107a-PE (LAMP1) BioLegend 328607 Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-human CD45- AF488 BioLegend 304017 Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-human CD45- PE  BioLegend 304008 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-human CD45-AF647  BioLegend 304018 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 MBL International Corporation M152-3 Clone 4E+12.  Concentration 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) abcam ab185015 Clone EPR4844.  Concentration 0.5 mg/mL.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Chloroquine diphosphate Salt Sigma-Aldrich C6628-25G
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mL MilliporeSigma 508741 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x MilliporeSigma BSS-2010-B  Ca++Mg++ Free 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x MilliporeSigma BSS-1006-B PBS Ca++Mg++ Free 
Earle's Balanced Salt Solution 1x Gibco 14155
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Balanced Salt Solution 1x Gibco 14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Non-Essential Amino Acids 100x HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II MilliporeSigma 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS 6.2 MilliporeSigma 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS version 6.2
MIFC software - INSPIRE MilliporeSigma 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 BioLegend 328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x HyClone SV30082.1
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes Fisherbrand 02-681-320 Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Sodium Pyruvate solution (100 mM) HyClone SH30239.01
Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead MilliporeSigma 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 flask Falcon 353136
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered MilliporeSigma 648463-50ML http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Water, Cell Culture Grade  HyClone SH30529.03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 125، أوتوفاجي، متعدد القنوات تدفق التدفق الخلوي (ميفك)، إيماجستريم، أوتوفاغوسوم، أوتوليسوسوم، LC3، p62، LAMP1
تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic… More

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55637, doi:10.3791/55637 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter