Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdere autophagic Flux ved å måle LC3, p62 og LAMP1 Co-lokalisering ved hjelp av flerspektral bildeflow-cytometri

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55637
Automatic Translation
1
1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Summary

Her, multispectral bildebehandling flow cytometri med en analytisk funksjon som sammenligner lyse detaljbilder av 3 autophagy markører og kvantifiserer deres co-lokalisering, sammen med LC3 spot telling, ble brukt til å måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måte.

Abstract

Autophagy er en katabolisk vei hvor normale eller dysfunksjonelle cellulære komponenter som akkumuleres under vekst og differensiering nedbrytes via lysosomet og resirkuleres. Under autofagi lipopseres cytoplasmatisk LC3-protein og rekrutteres til autofagosomale membraner. Autofagosomet smelter deretter sammen med lysosomet for å danne autolysosomet, hvor nedbrytningen av autofagosom vesikel og dens innhold forekommer. Det ubiquitin-assosierte proteinet p62, som binder til LC3, brukes også til å overvåke autofagisk flux. Celler som gjennomgår autofagi, skal demonstrere samlokalisering av p62, LC3 og lysosomale markører. Immunofluorescensmikroskopi har blitt brukt til å visuelt identifisere LC3 puncta, p62 og / eller lysosomer på en per-cell basis. Imidlertid kan en objektiv og statistisk streng vurdering være vanskelig å oppnå. For å overvinne disse problemene ble multispectral bildebehandlingsstrømcytometri brukt sammen med en analytisk funksjon som sammenligner den lyse deHale bilder fra tre autophagy markører (LC3, p62 og lysosomal LAMP1) og kvantifiserer deres co-lokalisering, i kombinasjon med LC3 spot telling for å måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måte.

Introduction

Makroautofagi, heretter kalt autofagi, er en katabolisk vei hvor skadede eller dysfunksjonelle komponenter, langlivede proteiner og organeller nedbrytes via lysosomet og resirkuleres 1 . Autophagy er en dynamisk, multistep prosess som involverer dannelsen av et autophagosom; Fusjonen av autophagosomet med lysosomet, som danner autolysosomet; Og nedbrytning av innholdet i autolysosomet 2 . Den avgjørende biologiske markøren som brukes til å identifisere autofagi i pattedyrsystemer, er mikrotubulærassosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3), som utgjør autofagosomalmembranen. Under autophagy er cytosolisk LC3-1 konjugert til fosfatidyletanolamin for å danne LC3-II; LC3-II innlemmes deretter i autophagosomalmembranen 3 . En annen mye brukt markør for autophagic flux er autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) som fysisk liNks autophagic frakt til autophagic membranen 4 , 5 .

Metoder som tradisjonelt har blitt brukt til å måle autophagy er Western blots og fluorescensmikroskopi 7 . Imidlertid er ingen av disse metodene ansett for å være "gullstandarden" 2 , 6 da det er utfordringer knyttet til begge disse teknikkene. Western blots gir bare et gjennomsnitt fordi de bruker en homogenatprøve, slik at observatører ikke kan se hva som skjer i individuelle celler. På den annen side gir fluorescensmikroskopi observatørinformasjon på enkeltcellnivå, men det mangler gjennomstrømningsmuligheter, noe som gjør det vanskelig å oppnå objektive og statistisk strenge vurderinger. I de siste årene har måling av LC3 og p62 ved multispectral imaging flow cytometry (MIFC, se Table of Materials ) blitt å få popuÅpenhet på grunn av sin kvantitative kraft, høye gjennomstrømningsmuligheter, multiplekspotensial og evne til å bilde hver celle. En av de mest brukte metodene for å måle autophagy ved hjelp av MIFC, sammen med sin ledsageranalyseprogramvare (se Materialetabellen ), er gjennom punkttelling av LC3 puncta eller autophagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En økning i autofagosomer betyr imidlertid ikke nødvendigvis at det er en økning i autofagi, da det også kan representere en blokkad i prosessen 2 . LC3-II omsetning er en nyttig parameter for å måle autofagisk fluss ved å analysere celler i nærvær ogFravær av en lysosomal nedbrytningsinhibitor, slik som klorokin. Klokokin hemmer fusionen av autofagosomet til lysosomet, og derved tillater kvantifisering av autofagosomdannelsen som et mål for graden av autofagi ved å arrestere autofagisk fluss før lysosomal nedbrytning kan forekomme 18 . I tillegg nedbrytes p62 primært av autofagi, og hvis lysosomal nedbrytning av autofagosomet og dets innhold er blokkert, forventes en akkumulering av p62 17 , 19 .

Autophagy er en multistep-prosess, og måling av LC3 eller p62 alene gir ikke et komplett bilde av hva som skjer i cellene. Nylige publikasjoner har understreket behovet for å undersøke samtidig dannelse av autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC erunikt i stand til å måle dannelsen av autolysosome med CCD-ko-lokalisering av autophagosome til lysosomet 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. I tillegg har co-lokalisering av p62 og LC3 ved hjelp av MIFC blitt utforsket for å måle autofagisk flux 5 . I den refererte analysesoftware kalles "funksjonen" som måler co-lokalisering, "Bright Detail Similarity R3" (BDS) og ble spesifikt utformet for å sammenligne de små, lyse bildedetaljer av to bilder. BDS er den log-transformerte Pearsons korrelasjonskoeffisient for de lokaliserte lyse flekkene med en radius på 3 piksler eller mindre; Med andre ord, beregner BDS graden av oForlapping piksler fra to forskjellige fluorescerende kanaler. De lyse flekkene er enten korrelerte ( dvs. samme romlige plassering) eller ukorrelerte ( dvs. forskjellige romlige steder). Korrelasjonskoeffisienten varierer derfor mellom 0 (uncorrelated) og 1 (perfekt korrelasjon). Koeffisienten er loggetransformert for å øke området til mellom null og uendelig 26 , 27 . BDS alene kan ikke være tilstrekkelig; Rajan et al. Fant at bruk av bare BDS kan føre til falsk-positive eller falsk-negative resultater 21 . BDS evaluerer co-lokalisering av to markører av autofagi, men vurderer ikke antall autophagosomer. For å ta hensyn til antall autofagosomer, rajan et al. Inkludert spottelt av LC3 punkt 21 . Rajan et al. Foreslått å bruke en bivariate scatter plot av LC3 spot count versus BDS. Ved hjelp av denne bivariate plottet, to populasjoner werE først identifisert: en med celler som har et høyt nivå av LC3 flekker og en med celler som har lavt nivå av LC3 flekker. Høy-LC3-spotpopulasjonen ble videre klassifisert i to populasjoner: celler med lav co-lokalisering ( dvs. akkumulering av autofagosomer) og celler med høy co-lokalisering ( dvs. akkumulering av autolysosomer). Denne bivariate plottet tillater en å skille mellom celler med svært få autophagosomer og celler med akkumulering av autophagosomer og / eller autolysosomer 21 .

Inntil nå var det ikke mulig å bruke samtidige samlokalisering av LC3, p62 og LAMP1 (lysosomal markør) ved bruk av en enkelt "Feature Type" i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funksjon, nylig introdusert i versjon 6.1, kalles imidlertid Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 sammenligner de lyse detaljbildene fra hver av de tre bildene (i dette tilfellet LC3, p62 og LAMP1) og kvantifiserer samlokaliseringen av de tre probene ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). BDC3-funksjonen beregner Pearson korrelasjonskoeffisient modifisert for å strekke seg til tre bilder. Siden lyspunktene i de tre bildene er enten korrelerte eller ukorrelerte, varierer korrelasjonskoeffisienten mellom 0 (uncorrelated) og 1 (perfekt korrelasjon). Koeffisienten er loggetransformert for å øke det dynamiske området mellom 0 og uendelig. Ved å bytte ut BDS-funksjonen med BDC3-funksjonen, ble analysemetoden presentert av Rajan et al. Kan nå innlemme de tre mest brukte markørene for å måle autophagy i ett system samtidig. Evnen til å co-lokalisere disse tre markørene av autofagi i en enkelt analyse kan føre til ny innsikt i induksjon og regulering av autofagi. Følgende protokoll beskriver trinnene for å indusere autofagi i Jurkat-celler; Merk cellerne med LC3, p62 og LAMP1 antistoffer; Skaffe data på et multispillEktral imaging flow cytometer; Og analysere dataene for å vurdere autofagisk flux.

Protocol

1. Fremstilling av kulturmedium og lysosomal nedbrytningsinhibitor

  1. 1.1. Lag ~ 500 ml 1x RPMI dyrkningsmedium. Tilsett 5 ml MEM-ikke-essensielle aminosyrer (100x), 5 ml natriumpyruvat (100 mM), 5 ml penicillin-streptomycin-glutamin (100x) og 25 ml føtalt bovint serum (FBS) til en 500 ml Flaske RPMI - 1640 1x medium. Mediet bør fremstilles i et biosikkerhetsskap. Oppbevar RPMI-kulturmediet ved 2-8 ° C. Varm RPMI-kulturmediet til 37 ° C før du legger det til Jurkat-cellene.
  2. Lag 100 mM klorokin, den lysosomale nedbrytningsinhibitoren. Vekt 0,05 g klorkinndifosfatsalt og legg det til 1 ml cellekulturvann i et 15 ml centrifugerør. Vortex til klorokinet er oppløst.

2. Kultivering av celler

  1. Kultur 80 ml av Jurkat-celler klon E6-1 i RPMI-dyrkningsmedium ved 37 ° C og 5% CO2.
    MERK: Når du dyrker cellerEller arbeider med Jurkat-cellene før fiksering, bør alt arbeid gjøres i biosikkerhetsskapet.
  2. Før du inducerer autofagi, telle Jurkat-cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en annen celle tellende enhet for å bestemme cellene / ml.

3. Inducing Autophagy in Cells

  1. Ta Jurkat-cellene i eksponentiell vekstfase og del dem i fire prøver på 20 ml hver i 50 ml sentrifugerør. Merk rørene som "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" og "Starved + Chloroquine."
    MERK: Jurkat-celler skal ha en konsentrasjon på 2,5-5 x 10 5 celler / ml.
  2. Vask cellene ved å tilsette 30 ml Hank Balanced Salt Solution uten Ca 2+ eller Mg 2+ (HBSS) til hver prøve. Sentrifuger ved 250 xg i 10 minutter. Hell supernatanten i et avfallsbeker.
  3. Resuspender kontrollprøvene i 20 ml RPMI-dyrkningsmedium ved pipettering opp og ned ved bruk av en 25 ml sTerile engangs pipette etterfulgt av å utføre lett vortexing. Tilsvarende resuspender de sultede prøvene i 20 ml Earle's Balanced Salt Solution uten Ca 2+ eller Mg 2+ (EBSS).
  4. Bruk en 25 ml steril engangspipette, overfør kontrollen og sultede prøver til T75-kolber som er merket "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" og "Starved + Chloroquine."
  5. Tilsett 20 μl 100 mM klorokin til 20 ml cellekulturmedium i "Control + Chloroquine" og "Starved + Chloroquine" -flaskene. Bland i klorokinen ved å svulle kolben forsiktig. Legg alle kolber i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator i 2 timer.

4. Fremstilling av buffere for fiksering og merking av LC3, LAMP1 og p62

  1. Tilbered 10 ml 4% formalin-fikseringsoppløsning i PBS. Tilsett 4 ml 10% formalinlager til 1 ml 10x Dulbecco's fosfatbuffertSalineoppløsning uten Ca 2+ eller Mg 2+ (PBS) og 5 ml ultrapure vann i et 15 ml sentrifugerør.
    MERK: FORSIKTIG. Formalin / formaldehyd er giftig ved innånding eller svelging; Irriterer øynene, luftveiene og huden. Og kan gi allergi ved innånding eller hudkontakt. Det er fare for alvorlig skade på øynene. Det er et potensielt kreftfremkallende middel.
  2. Tilbered 10 ml 1% formalin sluttresuspensjonsoppløsning i PBS. Tilsett 1 ml 10% formalinlager til 9 ml 1 x PBS i et 15 ml sentrifugerør.
  3. Tilbered 500 ml vaskebuffer ved å tilsette 10 ml FBS til en 500 ml flaske 1x PBS.
  4. Tilbered 50 ml permeabiliseringsbuffer i et 50 ml sentrifugerør ved å tilsette 0,5 ml 10% triton X-100 til 49,5 ml vaskebuffer fremstilt i trinn 4.3.
  5. Forbered anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) antistoff / permeabiliseringsbufferbehandlingsløsning ved å tilsette 5 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 til 495 μl av permeabiliseringsbufferen laget i sTep 4.4. Sørg for at den endelige antistoffkonsentrasjonen er 5 μg / ml.
    MERK: Gjør antistoffpermeabiliseringsbuffer-arbeidsløsning like før du legger den til prøven. Beskytt løsningen mot lys.
  6. Forbered mus-anti-LC3 / permeabiliseringsbufferbehandlingsløsning ved å tilsette 5 ul mus anti-LC3 til 495 μl av permeabiliseringsbufferen fremstilt i trinn 4.4. Sørg for at den endelige antistoffkonsentrasjonen er 20 μg / ml.
    MERK: Gjør antistoffpermeabiliseringsbuffer arbeidsløsninger like før du legger den til prøven. Beskytt løsningen mot lys.
  7. Klargjør eske-anti-mus-Alexa 647 (AF647) / permeabiliseringsbufferbehandlingsløsning ved å tilsette 5 μl AF647-merket esel-anti-mus-IgG til 495 μl av permeabiliseringsbufferen fremstilt i trinn 4.4. Sørg for at den endelige antistoffkonsentrasjonen er 20 μg / ml.
    MERK: Gjør antistoffpermeabiliseringsbufferens arbeidsløsning like før du legger den til prøven. Beskytt tHan løsning fra lys.
  8. Forbered anti-humant CD107a (LAMP1) -PE antistoff / permeabiliseringsbuffer-arbeidsoppløsning ved å tilsette 25 μl anti-CD107a (LAMP1) -PE til 475 μl av permeabiliseringsbufferen fremstilt i trinn 4.4. Kontroller at den endelige antistoffkonsentrasjonen er 21 μg / ml.
    MERK: Gjør antistoffpermeabiliseringsbufferens arbeidsløsning like før du legger den til prøven. Beskytt løsningen mot lys.
  9. Klargjør 10x DAPI-nukleær flekk ved å tilsette 4 μl 5 mg / ml DAPI og 100 μl 10% triton X-100 til 896 μl 1x PBS.

5. Merking av Jurkat-cellene med LC3, LAMP1 og p62

  1. Fjern 2 x 10 6 celler per prøve (telle cellene som i trinn 2.2). Plasser hver prøve i et 15 ml-sentrifugerør som er merket med riktig prøvenavn ( dvs. Control, Control + Chloroquine, Starved eller Starved + Chloroquine).
    1. Legg til vaskebuffer slik at jeg iEt totalt volum på 15 ml i hvert 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger prøvene ved 250 xg i 10 minutter. Aspirer av supernatanten.
  2. Tilsett 100 μl 4% formalin-fikseringsløsning til hver av cellepellets. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Under fikseringstrinnet, overfør prøvene til merkede, silikoniserte polypropylenmikrocentrifugerør.
    MERK: Ikke overfiks cellene; Dette kan resultere i dårlige merkingsresultater.
  3. Etter 10 min fikseringstrinn, tilsett 1 ml vaskebuffer til hver prøve. Pipetter opp og ned med en P1000 pipette for å blande prøven. Sentrifuge ved 250 xg i 5 min. Aspirer av supernatanten.
  4. Tilsett 100 μl anti-SQSTM1 / p62 - AF488 antistoff / permeabiliseringsbuffer arbeidsløsning til hver prøve. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette. Inkuber i 30 minutter i mørket ved romtemperatur.
  5. Vask cellene ved å legge til 1 mlPermeabiliseringsbuffer til hver prøve. Pipetter opp og ned med en P1000 pipette for å blande prøven. Sentrifuge ved 250 xg i 5 min. Aspirer av supernatanten.
  6. Gjenta trinn 5.4-5.5 for hver av antistoff-arbeidsløsningene.
    MERK: Arbeidsløsningene for antistoff er mus-anti-LC3 / permeabiliseringsbuffer-arbeidsløsning, esel-anti-mus-AF647 / permeabiliseringsbuffer-arbeidsløsning og anti-human CD107a (LAMP1) - PE-antistoff / permeabiliseringsbuffer-arbeidsoppløsning. Hvert antistoff bør gjøres separat og i den oppførte rekkefølgen. Ordren ble valgt for å minimere uønsket kryssreaktivitet mellom antistoffer.
  7. Tilsett 100 μl 1% formalinløsning. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette. Tilsett 10 μL av 10x DAPI-atomflekken til hver prøve. Lett vortex hver prøve å blande. Inkuber i 10 minutter i mørket ved romtemperatur før du kjører noen av prøvene på instrumentet.
    MERK: På dette tidspunktet kan prøven enten bE kjøre på MIFC eller lagres beskyttet mot lys ved 2-8 ° C i opptil en uke.

6. Merking av enkeltfargekontroller

  1. For hver enkeltfargekontroll ( dvs. AF488, PE, AF647 og DAPI), ta 1 x 10 6 Jurkat-celler, som kan være fra noen av prøvepopulasjonene. Sett 1 x 10 6 celler i 15 ml sentrifugerør merket som enten AF488, PE, AF647 eller DAPI.
  2. Tilsett vaskebuffer slik at det er et totalt volum på 15 ml i hvert 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger prøvene ved 250 xg i 10 minutter. Aspirer av supernatanten.
  3. Tilsett 100 μl vaskebuffer til AF488, PE og AF647 rørene.
    MERK: For DAPI-røret, gå til trinn 6.8.
    1. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette. Overfør til 1,5 ml rør.
  4. Tilsett 5 μL av enten anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE eller anti-CD45-AF647 til henholdsvis AF488, PE eller AF647-rørene. Bland ved vortexing lforsiktig skrå.
  5. Inkuber AF488, PE og AF647 rørene i 30 minutter i mørket ved romtemperatur.
    MERK: Andre markører kan brukes, for eksempel LC3, p62 og LAMP-1 antistoffer istedenfor anti-CD45 antistoffer. CD45 er imidlertid en pålitelig markør for enkeltfargekontroller.
  6. Vask AF488, PE og AF647 celler ved å tilsette 1 ml vaskebuffer til hver prøve.
    1. Pipetter opp og ned med en P1000 pipette for å blande prøven. Sentrifuge ved 250 xg i 5 min. Aspirer av supernatanten.
  7. Tilsett 100 μl 1% formalinløsning. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette.
    MERK: På dette tidspunktet kan prøven enten kjøres på MIFC eller lagres beskyttet mot lys ved 2-8 ° C i opptil en uke.
  8. Tilsett 100 μl 1% formalin-fikseringsløsning til DAPI-røret.
    1. Resuspender ved pipettering opp og ned med en P200 pipette. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
    2. Legg til 101; L av 10x DAPI-nukleær flekk til DAPI-prøven. Lett vortex å blande. Inkuber i 10 minutter i mørket ved romtemperatur før du kjører på instrumentet.
      MERK: På dette tidspunktet kan prøven enten kjøres på MIFC eller lagres beskyttet mot lys ved 2-8 ° C i opptil en uke.

7. Start og kalibrering av MIFC

  1. Kontroller at kappen, systemkalibreringsreagens (se materialetabell ), debubbler, rengjøringsmiddel og sterilisatorbeholdere er fulle og avfallstanken er tom. Hvis ikke, fyll beholderne og tøm avfallstanken.
  2. Slå på systemet og dobbeltklikk på programvaren (se ikonet Table of Material s) for å starte programmet. Dette vil starte MIFC-programvaren.
  3. Klikk på Oppstart- knappen og kontroller at Start alle kalibreringer og tester er valgt. Dette vil spyle systemet, laste skjede, systemkalibreringsreagens,Og kalibrere systemet.

8. Kjører prøvene og fargekontrollene på MIFC

  1. Last inn standardmalen ved å gå til fanen Filer og velg Last inn standardmal .
    MERK: Standardmalen inneholder de røde, maksimale pixelpunktdiagrammene.
  2. Slå på 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC lasere ved å klikke på de respektive knappene. Still inn laserkraften ved å taste inn ønsket strøm ved siden av hver laserknapp. Se figur 1 .
    MERK: For dette eksperimentet er laserkrefter 200 mW, 20 mW, 150 mW og 5 mW (Ch06) for henholdsvis 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC. MIFC-standardmallforstørrelsen er satt til 40X, standard følsomhet er Hei , og alle kanalene er aktivert.
  3. Bekreft at forstørrelsesglasset er satt til 40X, høy følsomhetsmodus er valgt, og alle kanalene vises i bildegalleriet; Figur 1
  4. Legg inn "Starved + Chloroquine" -prøven ved å klikke på Load- knappen og laster 1,5 ml rør på instrumentet.
    MERK: Denne eksperimentelle prøven skal ha det høyeste signalet for alle prøver for AF488, PE og AF647 (DAPI-signalet skal ha omtrent samme signalstyrke for alle eksperimentelle prøver, inkludert "Starved + Chloroquine" -prøven).
  5. Bruk "Starved + Chloroquine" -prøven for å bekrefte at de riktige laserstrømmene for 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC lasere er innstilt. Bruk de raske, maksimale pixelpunktdiagrammene fra standardmalen til å justere laserkraftene slik at signalene er sterke, men ikke når en rå maks pixelverdi på 4.096, som vil mette CCD-kameraet på instrumentet. Bruk denne laserinnstillingen for alle eksperimentelle prøver.
  6. Klikk på ikonet Create Dot Plots for å opprette en ny prikkplott. Velg "Area_M01 "på X-aksen og" Aspect Ratio_M01 "på Y-aksen for" hele "befolkningen. Klikk på Create Polygon Region- ikonet. Tegn en region rundt cellene. Navn denne regionen" Cell. "
    MERK: Brukere kan legge til flere tomter og regioner for å begrense cellene som samles inn. Et felles tilleggstegn å legge til, ville være Gradient RMS for å identifisere celler som er i fokus.
  7. Still inn oppkjøpsparametrene. Angi filnavn og destinasjonsmappe, endre antall hendelser til "5000", og velg "Cell" -samlingspopulasjonen. Klikk på Acquire- knappen for å skaffe filen. Når du har samlet filen, returnerer du prøven ved å klikke på Retur- knappen. Fjern prøverøret fra instrumentet.
  8. For de neste tre prøvene ("Starved", "Control" og "Control + Chloroquine"), laster du prøven, skriver inn prøvenavnet, henter prøven og returnerer prøven med de samme innstillingene somFor "Starved + Chloroquine" -prøven, over.
  9. Etter at prøvene er kjøpt, kjør enkeltfargestyringsprøvene og kjøp data slik at en kompensasjonsmatrise kan utføres. Slå av SSC-laseren ved å klikke på SSC- knappen. Slå av kanalene ved å klikke på Brightfield- knappen og velg AV .
    MERK: Hvis kanalene ble fjernet fra bildegalleriet for eksperimentell prøveoppkjøp, må du aktivere alle kanalene på nytt. Alternativt kan enkeltfarger kontrolleres ved å klikke på kategorien Kompensasjon og velge Opprett matrise ; Dette åpner kompensasjonsveiviseren, som vil gå gjennom trinnet med å samle filer og lage en kompensasjonsmatrise.
  10. Last inn DAPI-fargekontrollen ved å klikke på Load-knappen og legge inn 1,5 ml-røret i instrumentet. Angi prøvenavn (kun DAPI), sett innsamlingspopulasjonen til "Alle", og endre antall hendelserS til "500."
    1. Klikk på Acquire- knappen for å skaffe enfargekontrollfilen.
    2. Når filsamlingen er fullført, returnerer du prøven ved å klikke på Retur- knappen. Fjern prøverøret fra instrumentet.
    3. Etter DAPI-prøven fyller du 10% blekemiddel, akkurat som et eksempel ved å klikke på Load- knappen og laster 100 μL 10% blekemiddel i et 1,5 ml rør. La prøven løpe i ~ 15 s. Dette vil fjerne eventuelle resterende DAPI fra røret.
    4. Kjør 100 μl 1x PBS, som gjort i 8.10.3, for å fjerne resterende 10% blekemiddel. Instrumentet er nå klar til å kjøre AF488, PE og AF647 enkeltfargekontroller.
    5. Gjenta trinn 8.10-8.10.2 for hver enkeltfargekontroll ( dvs. AF488, PE og AF647).
      MERK: Det er ikke nødvendig å løpe 10% blekemiddel eller PBS mellom disse prøvene, først etter DAPI-fargekontrollen.

9. Dataanalyse i MIFC AnAlysis programvare

  1. Start MIFC analyse programvare (se Materialetabellen ).
  2. Klikk på Start analyse for å starte Veiviser for åpen fil . Velg datafilen som skal åpnes ved å bla til «Starved + Chloroquine» -rådenfilen (.rif). Velg filen og klikk på Åpne- knappen. Klikk på Neste .
    1. Bruk kompensasjon. Velg en tidligere opprettet kompensasjonsmatrise og klikk på Neste . Alternativt kan du lage en ny kompensasjonsmatrise ved å klikke på knappen Ny matrise .
      MERK: Trinn 9.2.1.1-9.2.1.2 er trinnene for å opprette en ny matrise.
      1. Tilsett ensfargede kontroll filer (dvs. DAPI bare, AF488 bare, bare PE, og AF647 only) til kontroll filer listen ved å klikke på Legg til filer, velge filene, og klikker på Åpne. Klikk på Neste .
      2. Vinduet Create Compensation Matrix vises for dette eksperimentet. ensurE at Ch02, Ch03, Ch07 og Ch11 er valgt, og klikk Neste . Kompensasjonsmatrisen vil bli opprettet. Klikk Fullfør for å lagre kompensasjonsmatrisen. Legg til kompensasjonsfilen i Åpne filveiviseren og klikk på Neste .
    2. Bruk analysemalen. På dette stadiet er det ingen analysemal å søke, så klikk Neste .
      MERK: For de andre eksperimentelle filene kan denne "Starved + Chloroquine.daf" -filen brukes som en mal.
    3. Navngi filen (filnavnene som svarer til "rif" -navnene genereres automatisk) og klikker på Neste . Still inn bildevisningsegenskapene ved å velge "02," "03," "07," og "11" kanaler; Kanaler 01, 06 og 09 er forhåndsvalgt. Klikk på Neste .
  3. På slutten av Open File Wizard , velg Apoptosis Wizard . Klikk på Apoptosis Wizard- ikonet og deretter påVelg veiviseren for å åpne Apoptosis-veiviseren .
    1. Velg den kjernefysiske bildekanalen (Ch07), og klikk på Neste . Port celler i beste fokus. Klikk på ikonet Create Line Region og trekk en region på Gradient RMS_M01_Ch01 fra 60-90. Navn denne regionen "Fokus", klikk OK , og klikk Neste .
    2. Port de enkelte cellene. Klikk på ikonet Create Polygon Region . Tegn en region rundt enkeltcellene, navnet regionen "Enkelt", klikk OK , og klikk Neste . Klikk Nei for "Vil du analysere delpopulasjoner?"
    3. Port de kjernefysiske cellene. Klikk på Create Line Region- ikonet og tegne et område som inneholder alle kjernefysiske celler. Navn regionen "Nucleated." Klikk på OK og Neste .
    4. Port de apoptotiske cellene. Klikk på ikonet Create Polygon Region . Tegn en region rundt apoptotiske celler; Disse er cellerMed lavt nukleart Area_T50% og høy lysfeltkontrast. Klikk Fullfør . Legg til et annet område ved å klikke på ikonet Create Polygon Region og tegne en region rundt de ikke-apoptotiske cellene; Ring denne regionen "Cells."
  4. Velg celler som er positive for LAMP1, P62 og LC3. Klikk på Building Blocks- ikonet, velg Fluorescence Positives - One Color , og velg "Cells" -populasjonen og Intensity_MC_Ch03 . Merk X-aksen "Intensity LAMP1." Tegn en region som inneholder celler med intensiteter større enn 10 000 ved å klikke på ikonet Create Line Region og tegne regionen. Merk denne regionen "LAMP1 +." Følg de samme trinnene som i 9.4 for å velge celler positive for p62 og LC3.
    1. For p62 + velg "LAMP1 +" -populasjonen og Intensity_MC_Ch02 . Merk X-aksen "Intensitet p62" og regionen p62 + celler "LAMP1 + / p62 +."; For LC3 +, velg "LAMP1 + / p62 +" -populasjonen og Intensity_MC_Ch11. Merk X-aksen "Intensity LC3" og regionen LC3 + -celler "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." Bruk denne "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populasjonen for resten av analysen.
  5. Lag en spot-count-funksjon for å telle LC3-punktene.
    MERK: Dette skal opprettes ved hjelp av "Starved + Chloroquine" -prøven.
    1. Klikk kategorien Analyse og velg Mask . Klikk på Ny og deretter Funksjon- knappen. Under Funksjon , velg Peak ; Mask , velg M11 ; Og Kanal , velg Ch11 . Sett Spot til Cell Background Ratio til 4 . Klikk OK for å lukke vinduet Definer mask Funksjon og OK for å legge det til Mask listen. Klikk på Lukk for å avslutte Mask Manager .
    2. Klikk kategorien Analyse og velg Ny knappen. Under Funksjonstype velger du Spot Count og under Mask , velg Peak (M11, Ch11, Bright, 4). Skriv "Spot Count LC3" for Navn og klikk OK og Lukk for å gå ut av Funksjonsbehandling .
      MERK: Spot- veiviseren kan også brukes til å opprette en spot-count-funksjon. Spot-count-funksjonen som brukes i dette eksperimentet, er kanskje ikke egnet for andre eksperimenter og / eller cellelinjer. Brukeren bør teste flere spot-telling masker / funksjoner når de bestemmer seg for en maske / funksjon for et bestemt datasett. Pugsley 2017 har ytterligere detaljer om spot telling ved hjelp av MIFC analyse programvare 26 .
    3. Klikk på ikonet New Histogram . Velg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populasjonen. Velg Spot Count LC3-funksjonen og klikk OK .
  6. Opprett BDC3-funksjonen.
    1. CLick fanen Analyse og velg Egenskaper . Klikk på Ny knappen. Under Funksjonstype velger du Bright Detail Colocalization 3 ; Mask , velg MC ; Bilde 1 , velg Ch02 (p62); Bilde 2 , velg Ch03 (LAMP1); Og jeg har 3 , velg Ch11 (LC3). Skriv "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" for Navn og klikk OK og Lukk for å avslutte Feature Manager .
    2. Klikk på ikonet New Histogram . Velg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populasjonen. Velg BDC3 p62 / LAMP1 / LC3- funksjonen og klikk OK .
  7. Klikk på ikonet New Scatterplot . Velg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populasjonen. Velg BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for X-aksen. Velg Spot Count LC3- funksjonen for Y-aksen. Klikk på OK .
  8. Lagre thE "Starved + Chloroquine" -filen. Klikk på Fil og velg Lagre data analyse fil (.daf) . Klikk på Lagre og Ja for å erstatte den forrige versjonen av filen; Denne filen kan nå brukes som en mal.
  9. Åpne "Kontroll" -filen. Klikk på Fil og deretter Åpne . Velg "Control.rif" -filen og klikk på Åpne . Velg kompensasjonsmatrisen fra trinn 9.2.1 og filen "Starved + Chloroquine.daf" som mal. Klikk på OK .
  10. Opprett områder for autophagosom akkumulering og autolysosom akkumulering ved hjelp av "Control" -prøven for å angi regionene.
    1. Klikk på ikonet Opprett rektangelområde . Tegn en region fra X-koordinater på -0,1 til 3 og Y-koordinater på 1,5 til -0,3. Navn denne regionen "Low Spots." Klikk på Opprett rektangulært områdeikon. Tegn en region fra X-koordinater på -0,1 til 1 og Y-koordinatAtes på 17,5 til 1,5. Navn denne regionen "High Spot / Low BDC3."
    2. Klikk på ikonet Opprett rektangelområde. Tegn en region fra X-koordinater på 1 til 3 og Y-koordinater på 17,5 til 1,5. Navn denne regionen "High Spots / High BDC3."
  11. Lagre "Kontroll" -filen. Klikk på Fil og velg Lagre data analyse fil (.daf ) . Klikk på Lagre og Ja for å erstatte den forrige versjonen av filen; Denne filen kan nå brukes som en mal.
  12. Åpne "Control + Chloroquine" -filen ved å klikke på File og deretter Åpne . Velg "Control + Chloroquine.rif" filen og klikk Åpne . Velg kompensasjonsmatrisen fra trinn 9.2.1 og "Control.daf" -filen som mal. Klikk på OK . Gjenta dette for "Starved" og "Starved + Chloroquine" -filene.
    MERK: Batchfunksjonen i analysesoftware kan også brukes til å bruke kompensaMatrise og / eller mal til de andre filene. Den endelige gatingstrategien er vist i figur 2 .

Representative Results

Denne analysemetoden bruker flere funksjoner for å asses autophagic flux. For å kunne forstå det endelige bivariate plottet, må de individuelle analysefunksjonene først undersøkes. Telling av autofagosomer er en logisk måte å måle autophagy på; Størrelsen / formen / lysstyrken til LC3 puncta kan imidlertid variere drastisk mellom cellene. Variasjon kan gjøre det vanskelig å telle autofagosomer manuelt eller bruke en spot-count-funksjon i analysesoftwaren. Derfor vil ingen spot-count-funksjon være perfekt på grunn av denne store variasjonen i autophagosomer. Imidlertid vil en god spot-count-funksjon fungere på de fleste celler 26 . Figur 3 viser eksempler på punktmaskering av LC3 puncta i Jurkat-celler ved bruk av forskjellige spotmasker. Spot-count-funksjonen som er valgt for dette datasettet, er Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, noe som betyr at spot-count-funksjonen teller stedene som peAK-mask identifisert i standardkanal 11-masken (M11) på kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) med et bakgrunnsforhold mellom 4 (Bright, 4). Figur 4 viser spot-count-histogrammer og representative bilder for gjennomsnittlig spottelling for kontroll-, kontroll + klokokin, sultet og starved + klokokin-Jurkat-celler merket med anti-LC3-AF647. Kontroll- og sultede gjennomsnittlige spot-teller er ikke signifikant forskjellige; Med tillegg av klorokin, er det stor forskjell i gjennomsnittet av kontroll + klokokin sammenlignet med starved + klokokin.

Den neste funksjonen for å undersøke er BDC3. BDC3 er en måling av co-lokalisering av tre markører / sonder, i dette tilfellet LC3, p62 og LAMP1. Figur 5A - 5D viser BDC3 histogrammer for kontroll, kontroll + klokokin, sultet og starved + klokokin Jurkat-celler merket med anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE og anti-LC3-AF647. Det er et skifte mellom kontrollmiddelet til starved-middelet, så vel som kontrollen + klokokinetin betyr for Starved + Chloroquine-gjennomsnittet. Men ser på bildene av celler fra de gjennomsnittlige BDC3-scoreene i Figur 5E - 5H , det er en større forskjell mellom prøvene enn histogrammerne kan føre til å tro. Dette skyldes at BDC3 ikke vurderer antall autophagy organeller som co-lokaliserer, noe som resulterer i en stor grad av variabilitet i antall autophagosomer for samme BDC3-poengsum. I de fleste tilfeller er det overlapping mellom alle tre sondene fordi, til og med ved basale nivåer, p62, LAMP1 og LC3, i en viss grad skal lokaliseres eller oppholde seg i lignende områder i cellene. Som en kontrast, er et eksempel på tre prober som ikke skal lokaliseres anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 og DAPI-kjernekarfargestoff for Starved + Chloroquine-prøven, vist i figur 6. </ P>

Når spot-count-funksjonen og BDC3-funksjonen er kombinert, er tilstedeværelsen av forskjellige subpopulasjoner som forbedrer evnen til å skille mellom de ulike prøvene / betingelsene, tydelige. Figur 7 viser den bivariate plottet av spottall av LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for de fire prøvene: Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine. Kontrollprøven ble brukt til å angi gatingstrategien for tre populasjoner: Low Spots, High Spots / Low BDC3 og High Spots / High BDC3. Kontrollprøvene viste at mer enn 98% av cellene hadde 1 eller færre flekker. Grensen mellom High Spots / Low BDC3 og High Spots / High BDC3 ble satt til en BDC3-score på 1 fordi mer enn 91% av kontrollprøven hadde en BDC3-poengsum på mindre enn 1. En oppsummering av resultatene for de bivariate tomter Er vist i tabell 1 .

alder = "1"> Figur 1
Figur 1: MIFC Instrument Setting. Et skjermbilde av MIFC-instrumentinnstillingene som brukes for dette eksperimentet, skissert i trinn 8 i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Analyse Programvare Gating Strategy. Et skjermbilde av analyseprogramvaren, som er skissert i trinn 9 i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fig3.jpg "/>
Figur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat-cellebilder og masker pleide å skape spot-count-funksjonen. Vist er BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) og Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Masken som fungerte best for alle cellene vist var Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: LC3 Spot-Count Histogrammer. Ved hjelp av spot-count-funksjonen Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 og LC3-AF647 spot-count histogrammer for kontroll ( A , lyseblå), Control + ChloroquinE ( B , blå), Starved ( C , rosa) og Starved + Chloroquine ( D , rød). Den gjennomsnittlige spottellingen for Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine er henholdsvis 0,07, 1,13, 0,10 og 2,77. BF, LC3-AF647 (rød), DAPI-nukleær fargestoff (blå) og en sammensetning av LC3-AF647- og DAPI-bilder av representative celler for gjennomsnittlig spottelling er vist for Control ( E , 0 spots), Control + Chlorokin ( F , 1 punkt), Starved ( G , 0 flekker), og Starved + Chloroquine ( H , 3 flekker). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: BDC3 Histogrammer av p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogrammer foR Kontroll ( A , lyseblå), Kontroll + Klokokin ( B , Blå), Starved ( C , Rosa), og Starved + Klokokin ( D , rød). Den gjennomsnittlige BDC3-poengsum for kontroll, kontroll + klokokin, starved og starved + klokokin er henholdsvis 0,57, 0,82, 0,74 og 0,98. BF; P62-AF488 (grønn); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (rød); Og en sammensetning av p62-AF488, LAMP1-PE og LC3-AF647 bilder av representative celler for den gjennomsnittlige BDC3 er vist for Control ( E ), Control + Chlorokin ( F ), Starved ( G ) og Starved + Chlorokin ( H ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: BDC3 Histogrammer av p62 / LC3 / DAPI for starved + klokokinprøven. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram for Starved + Chloroquine-prøven er vist. Den gjennomsnittlige BDC3-poengsummen er 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grønn); LC3-AF647 (rød); DAPI (blå); Og en sammensetning av p62-AF488, LC3-AF647 og DAPI-bilder av representative celler for den gjennomsnittlige BDC3 er vist for Starved + Chloroquine-prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7
Figur 7: Bivariate Plots av LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate plott av LC3 spot count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine Jurkat celler. ( B ) BF; P62-AF488 (grønn); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (rød); Og en kompositt av p62-AF488-, LAMP1-PE- og LC3-AF647-bildene fra tre regioner ( dvs. Low Spots, High Spots / Low BDC3 og High Spots / High BDC3) vises for Starved + Chloroquine-prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Cell Count Bright Detail Colocalization 3 Mean Spot Count LC3 Mean % Lavpunkt % Høypunkt / Lav BDC3 % High Spot / High BDC3
Kontroll 439 0,57 0,07 98.2 1.8 0.0
Kontroll + klokokin 1432 0,82 1,13 68.9 19.5 11.7
Starved 1204 0,74 0,10 98,4 0.6 1.0
Sultet + klokokin 1811 0,98 2,77 32.1 36.9 31,0

Tabell 1: Sammendrag av Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Discussion

Når du utfører denne analysen, er det noen ting å vurdere. Det er viktig å ha passende kontrollprøver. For dette eksperimentet ble to forskjellige kontroller brukt: Kontroll og kontroll + klokokin. Kontrollprøven ble brukt til å angi terskelen for regionene. Det representerer det basale nivået av autofagi uten å stoppe lysosomal nedbrytning og er kontrollen for den sårede prøven. Kontrollprøven er imidlertid ikke en hensiktsmessig kontroll for å sammenligne med resultatene fra Starved + Chloroquine-prøven fordi klorokin selv påvirker kontrollprøven. Derfor var det nødvendig å ha en kontroll + klokokinprøve.

Før du utfører en analyse for autofagi, er det viktig å bare analysere / gate på enkelte celler som er i fokus ( dvs. gradient RMS større enn 60), da resultatene kan bli påvirket hvis det er mer enn en celle eller bildene er ute av fokus. Det er avgjørende at autophagosomEs og lysosomer er i fokus for riktig spot telling og BDC3 analyse. Apoptotiske celler må fjernes før autofaganalyse, da de kan skje resultater og bør ikke inkluderes. Det bør være passende farging for alle tre markørene ( dvs. LC3, P62 og LAMP1). For eksempel er alle tre markørene intracellulære og skal ha et punkteringssignal; Hvis signalet ikke punkterer, eller hvis det er på overflaten av cellen, vil fargingen ikke være hensiktsmessig, og forsøket / fargingen skal redoneres. I tillegg, for at BDC3 skal være nøyaktig, er det viktig å gate på celler som er lyse for alle tre fluorescerende markører av interesse. Gating på positive hendelser er nødvendig for å forhindre måling av BDC3 på ikke-spesifikk binding, bildefaktorer og / eller støy. Dette er avgjørende, da BDC3 potensielt kan forsterke artefakter som ikke er sanne signaler. Siden BDC3 kun kan utføres på lyse positive hendelser, kan mange celler ikke inkluderes i den endelige analysen; Dette er spesieltJeg er virkelig sant for kontrollceller som ikke har noen akkumulering av LC3, p62 og / eller LAMP1. En begrensning av denne analysen er således at BDC3 bare undersøker celler som er positive for alle tre markørene, noe som kanskje ikke passer for alle autofagiske eksperimenter.

Som BDS, som tidligere er rapportert 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , tar ikke BDC3 alene hensyn til antallet autofagorganeller som samlokaliserer, noe som resulterer i en stor grad Av variabilitet i antall autofagosomer. Derfor er den bivariate tilnærmingen presentert av Rajan et al. Ble ansatt. Ser man på de bivariate tomtene, kan man spørre omCellene må være positive for LC3, p62 og LAMP1; Hvorfor er det så mange celler som har 0 flekker? Dette skyldes at LC3-signalet kan være sterkt nok til samlokalisering, men det kan ikke oppfylle terskelen som er fastsatt av toppmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) som er nødvendig for at den skal betraktes som en få øye på.

Protokollen som presenteres her, brukte MIFC til å telle LC3 puncta og co-lokalisering av tre autophagy markører for å måle autophagic flux. Under basale forhold (kontrollprøve) var antallet autofagosomer lave, og få celler ble funnet med "High Spots." Med tillegg av klorokin, som hemmer autofagosom / lysosomfusjon, var det en økning i antall LC3 flekker. Siden lysosomet ikke klarer å bryte ned autofagosomet og p62, som ligger i autofagosomet, fører dette til en økning i co-lokalisering av LC3, p62 og LAMP1 autolysosom akkumulering. Denne effekten ble forsterket under næringsstjernenIon, som induserer autofagi. Imidlertid, uten tillegg av klorokin, var det ikke en signifikant økning i antall autofagosomer, trolig på grunn av økning i autofagisk omsetningsrate. Når celler ble sultet i nærvær av klorokin, var det en økning i co-lokalisering og antall autophagosomer, som støtter konklusjonen om at sulten øker autofagisk flux. EBSS er kjent for å være en kraftig inducer for autofagi. Det er derfor forventet at økningen vil være stor. Hvis en annen metode, så som medikamentinduksjon, brukes til å indusere autofagi, kan forskjellen mellom kontroll og behandlede prøver være subtilere.

Denne spesifikke protokollen ble utformet for å måle autophagy i humane cellelinjer, men analysen kunne tilpasses andre arter ved å bytte til antistoffer for den spesielle arten. I tillegg kan analysemetoden brukes til hvilken som helst intracellulær applikasjon som krever samlokaliseringAv tre prober / markører.

Disclosures

Jeg er ansatt av MilliporeSigma, produsent av Amnis-merke ImageStream, som ble brukt i denne studien.

Acknowledgments

Jeg vil gjerne takke mine kolleger på MilliporeSigma, Philip J. Morrissey og Sherree L. Friend, for deres støtte og veiledning gjennom årene. Jeg vil også gjerne takke Vidya Venkatachalam og Bryan R. Davidson for deres hjelp med BDC3 funksjon i IDEER programvare, Ryan P. Jessup for hjelp til å redigere dette manuskriptet, Raymond Kong for å få hjelp på dagen av skyting, og en spesiell takk Til makeup artist Cynthia Xamonthiene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
50 mL centrifuge tube Falcon 352070
AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG  Invitrogen A-31571 Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-human CD107a-PE (LAMP1) BioLegend 328607 Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-human CD45- AF488 BioLegend 304017 Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-human CD45- PE  BioLegend 304008 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-human CD45-AF647  BioLegend 304018 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 MBL International Corporation M152-3 Clone 4E+12.  Concentration 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) abcam ab185015 Clone EPR4844.  Concentration 0.5 mg/mL.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Chloroquine diphosphate Salt Sigma-Aldrich C6628-25G
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mL MilliporeSigma 508741 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x MilliporeSigma BSS-2010-B  Ca++Mg++ Free 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x MilliporeSigma BSS-1006-B PBS Ca++Mg++ Free 
Earle's Balanced Salt Solution 1x Gibco 14155
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Balanced Salt Solution 1x Gibco 14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Non-Essential Amino Acids 100x HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II MilliporeSigma 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS 6.2 MilliporeSigma 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS version 6.2
MIFC software - INSPIRE MilliporeSigma 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 BioLegend 328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x HyClone SV30082.1
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes Fisherbrand 02-681-320 Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Sodium Pyruvate solution (100 mM) HyClone SH30239.01
Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead MilliporeSigma 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 flask Falcon 353136
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered MilliporeSigma 648463-50ML http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Water, Cell Culture Grade  HyClone SH30529.03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Tags

Cellular Biology Autophagy multispectral imaging flow cytometry (MIFC) ImageStream autophagosome autolysosom LC3 p62 LAMP1
Vurdere autophagic Flux ved å måle LC3, p62 og LAMP1 Co-lokalisering ved hjelp av flerspektral bildeflow-cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic… More

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55637, doi:10.3791/55637 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter