Summary
Här används multispectral bildflödescytometri med en analysfunktion som jämför ljusa detaljbilder av 3 autofagmarkörer och kvantifierar deras samlokalisering, tillsammans med LC3-spoträkning, användes för att mäta autofagi på ett objektivt, kvantitativt och statistiskt robust sätt.
Abstract
Autophagy är en katabolisk väg där normala eller dysfunktionella cellulära komponenter som ackumuleras under tillväxt och differentiering bryts ned via lysosomen och återvinns. Under autofag lipideras cytoplasmatiskt LC3-protein och rekryteras till de autofagosomala membranen. Autofagosomen smälter sedan med lysosomen för att bilda autolysosomen, där nedbrytningen av autofagosomvesikeln och dess innehåll inträffar. Det ubiquitin-associerade proteinet p62, som binder till LC3, används också för att övervaka autofagiskt flöde. Celler som genomgår autofagi bör visa samlokalisering av p62-, LC3- och lysosomala markörer. Immunofluorescensmikroskopi har använts för att visuellt identifiera LC3 puncta, p62 och / eller lysosomer per cell-basis. En objektiv och statistiskt noggrann bedömning kan emellertid vara svår att erhålla. För att övervinna dessa problem användes multispectral bildbehandling flödescytometri tillsammans med en analytisk egenskap som jämför de ljusaSvansbilder från tre autofagmarkörer (LC3, p62 och lysosomal LAMP1) och kvantifierar deras samlokalisering i kombination med LC3-spoträkning för att mäta autofag på ett objektivt, kvantitativt och statistiskt robust sätt.
Introduction
Makroautofagi, nedan kallad autofagi, är en katabolisk väg där skadade eller dysfunktionella komponenter, långlivade proteiner och organeller nedbryts via lysosomen och återvinns 1 . Autophagy är en dynamisk process med flera steg som innebär bildandet av en autofagosom; Fusionen av autophagosomen med lysosomen, bildande autolysosomen; Och nedbrytningen av innehållet i autolysosomen 2 . Den avgörande biologiska markören som används för att identifiera autofagi i däggdjursystem är den mikrotubulära associerade proteinet 1A / 1B-lätta kedjan 3 (LC3), som utgör autofagosomalmembranet. Under autofag konjugeras cytosoliskt LC3-1 till fosfatidyletanolamin för att bilda LC3-II; LC3-II införlivas därefter i autophagosomalmembranet 3 . En annan allmänt använd markör för autofagiskt flöde är autophagy receptor-sekvestosom 1 (SQSTM1, p62) som fysiskt liNks autofagisk last till det autophagiska membranet 4 , 5 .
Metoder som traditionellt har använts för att mäta autofagi är Western blots och fluorescensmikroskopi 7 . Men ingen av dessa metoder anses vara "guldstandarden" 2 , 6 eftersom det finns utmaningar förknippade med båda dessa tekniker. Western blottar ger bara ett medel eftersom de använder ett homogenatprov, så observatörer kan inte se vad som händer i enskilda celler. Å andra sidan ger fluorescensmikroskopi en observatörsinformation på encellsnivå men saknar genomströmningsförmåga, vilket gör det svårt att erhålla objektiva och statistiskt noggranna bedömningar. Under de senaste åren har mätningen av LC3 och p62 genom multispectral imaging flow cytometry (MIFC, se Materialet ) ökat popuLärdhet på grund av sin kvantitativa kraft, hög kapacitet, multiplexeringspotential och förmåga att bilda varje cell. En av de mest använda metoderna för att mäta autofagi med hjälp av MIFC, tillsammans med dess följeslagsanalysprogramvara (se Materialetabellen ), är genom spoträkning av LC3 puncta eller autofagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En ökning av autofagosomer betyder emellertid inte nödvändigtvis att det finns en ökning av autofagi, eftersom det också kan utgöra en blockad i processen 2 . LC3-II omsättning är en användbar parameter för att mäta autofagiskt flöde genom att analysera celler i närvaro ochFrånvaro av en lysosomal nedbrytningsinhibitor, såsom klorokin. Klokokin inhiberar fusionen av autofagosomen till lysosomen, vilket möjliggör kvantifiering av autofagosombildningen som ett mått på graden av autofag genom att stoppa autofagiskt flöde innan lysosomal nedbrytning kan inträffa 18 . Dessutom försämras p62 huvudsakligen av autofagi, och om den lysosomala nedbrytningen av autofagosomen och dess innehåll blockeras, förväntas en ackumulering av p62 17 , 19 .
Autophagy är en multistep-process, och mätningen av LC3 eller P62 ensam ger inte en komplett bild av vad som händer i cellerna. Tidigare publikationer har betonat behovet av att undersöka den samtidiga bildningen av autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC ären unik möjlighet att mäta bildningen av autolysosome genom avbildning av samlokalisering av den autophagosome till lysosomen 15-17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Dessutom har samlokaliseringen av p62 och LC3 med användning av MIFC också undersökts för att mäta autofagiskt flöde 5 . I den refererade analysprogramvaran kallas "funktionen" som mäter samlokalisering "Bright Detail Similarity R3" (BDS) och var specifikt utformad för att jämföra de små, ljusa bilduppgifterna för två bilder. BDS är den logtransformerade Pearsons korrelationskoefficient för de lokaliserade ljuspunkterna med en radie av 3 pixlar eller mindre; Med andra ord beräknar BDS graden av oFörskjutning av pixlar från två olika fluorescerande kanaler. De ljusa fläckarna är antingen korrelerade ( dvs samma rumsliga plats) eller okorrelerade ( dvs olika rumsliga platser). Därför varierar korrelationskoefficienten mellan 0 (okorrelerad) och 1 (perfekt korrelation). Koefficienten är log-transformerad för att öka intervallet mellan noll och oändlighet 26 , 27 . BDS ensam kan inte vara tillräckligt. Rajan et al. Fann att användandet av enbart BDS kan leda till falskt positiva eller falskt negativa resultat 21 . BDS utvärderar samlokaliseringen av två markörer av autofagi men beaktar inte antalet autofagosomer. För att redogöra för antalet autofagosomer, beskriver Rajan et al. Inkluderade spoträkning av LC3 puncta 21 . Rajan et al. Föreslagna med användning av ett bivariat scatterplot av LC3 spot count jämfört med BDS. Med hjälp av denna bivariate plot, två populationer werE identifierades först: ett med celler som har en hög nivå av LC3-fläckar och en med celler som har en låg nivå av LC3-fläckar. High-LC3-spotpopulationen klassificerades vidare i två populationer: celler med låg samlokalisering ( dvs. ackumulering av autofagosomer) och celler med hög samlokalisering ( dvs. ackumulering av autolysosomer). Denna bivariate plot gör det möjligt att skilja mellan celler med väldigt få autophagosomer och celler med ackumulering av autofagosomer och / eller autolysosomer 21 .
Hittills var den samtidiga samlokaliseringen av LC3, p62 och LAMP1 (lysosomal markör) inte möjlig med en enda "Feature Type" i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funktion, som nyligen introducerades i version 6.1, kallas dock Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 jämför de ljusa detaljbilderna från var och en av de tre bilderna (i det här fallet LC3, p62 och LAMP1) och kvantifierar samlokaliseringen av de tre sonderna ( dvs LC3, p62 och LAMP1). BDC3-funktionen beräknar Pearsons korrelationskoefficient som är modifierad för att sträcka sig till tre bilder. Eftersom de ljusa fläckarna i de tre bilderna antingen är korrelerade eller okorrelerade varierar korrelationskoefficienten mellan 0 (okorrelerad) och 1 (perfekt korrelation). Koefficienten är log-transformerad för att öka det dynamiska intervallet mellan 0 och oändligheten. Genom att byta ut BDS-funktionen med BDC3-funktionen, presenterades analysmetoden som presenterades av Rajan et al. Kan nu införliva de tre mest använda markörerna för att mäta autophagy i ett system samtidigt. Möjligheten att co-lokalisera dessa tre markörer av autofagi i en enda analys kan leda till nya insikter i induktion och reglering av autofagi. Följande protokoll beskriver stegen för att inducera autofagi i Jurkat-celler; Märka cellerna med LC3-, p62- och LAMPl-antikroppar; Skaffa data på en multispEktral imaging flödescytometer; Och analysera data för att bedöma autofagiskt flöde.
Protocol
1. Framställning av kulturmedium och lysosomal nedbrytningsinhibitor
- 1,1. Gör ~ 500 ml 1x RPMI-odlingsmedium. Tillsätt 5 ml MEM-icke-essentiella aminosyror (100x), 5 ml natriumpyruvat (100 mM), 5 ml penicillin-streptomycin-glutamin (100x) och 25 ml fetalt bovint serum (FBS) till en 500 ml Flaska RPMI - 1640 1x medium. Mediet bör beredas i ett biosäkerhetsskåp. Förvara RPMI-odlingsmediet vid 2-8 ° C. Värm RPMI-odlingsmediet till 37 ° C före tillsättning av det till Jurkat-cellerna.
- Gör 100 mM klorokin, den lysosomala nedbrytningsinhibitorn. Väg ut 0,05 g klorokindifosfatsalt och tillsätt det till 1 ml vatten av cellkulturvatten i ett 15 ml centrifugrör. Virvel tills klorokinet har upplösts.
2. Odling av celler
- Kultur 80 ml Jurkatceller klon E6-1 i RPMI-odlingsmedium vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS: När man odlar cellerEller arbetar med Jurkat-celler före fixering, bör allt arbete ske i biosäkerhetskåpan. - Före inducering av autofagi, räkna Jurkat-cellerna med en hemocytometer eller annan cellräknare för att bestämma cellerna / ml.
3. Inducering Autophagy in Cells
- Ta Jurkat-cellerna i exponentiell tillväxtfas och dela dem i fyra prov på 20 ml vardera i 50 ml centrifugrör. Märka rören som "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" och "Starved + Chloroquine."
OBS: Jurkat-celler ska ha en koncentration på 2,5-5 x 10 5 celler / ml. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 30 ml Hank Balanced Salt Solution utan Ca 2+ eller Mg 2+ (HBSS) till varje prov. Centrifugera vid 250 xg i 10 min. Häll supernatanten i en avfallsbägare.
- Resuspendera kontrollproverna i 20 ml RPMI-odlingsmedium genom pipettering upp och ner med användning av 25 ml sTerile engångspipett följt av att utföra lätt vortexing. På liknande sätt resuspenderar de svältproverna i 20 ml Earles balanserade saltlösning utan Ca 2+ eller Mg 2+ (EBSS).
- Använd en 25 ml steril engångspipett, överför kontrollen och svältproverna till T75-kolvar som har märkts "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" och "Starved + Chloroquine."
- Tillsätt 20 μl 100 mM klorokin till 20 ml cellodlingsmedium i "Control + Chloroquine" och "Starved + Chloroquine" -flaskorna. Blanda i klorokin genom att vrida flaskan försiktigt. Placera alla kolvar i en 37 ° C och 5% CO 2 inkubator under 2 timmar.
4. Framställning av buffertar för fixering och märkning av LC3, LAMP1 och p62
- Förbered 10 ml 4% formalinfixeringslösning i PBS. Tillsätt 4 ml 10% formalinlager till 1 ml 10x Dulbeccos fosfatbuffertKoksaltlösning utan Ca 2+ eller Mg 2+ (PBS) och 5 ml ultralätt vatten i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: VARNING. Formalin / formaldehyd är giftigt vid inandning eller förtäring; Irriterar ögonen, andningsorganen och huden. Och kan ge allergi vid inandning eller hudkontakt. Det finns risk för allvarliga ögonskador. Det är ett potentiellt cancerframkallande ämne. - Förbered 10 ml 1% formalin slutlig resuspensionslösning i PBS. Tillsätt 1 ml 10% formalinlager till 9 ml 1x PBS i ett 15 ml centrifugrör.
- Förbered 500 ml tvättbuffert genom att tillsätta 10 ml FBS till en 500 ml flaska 1x PBS.
- Förbered 50 ml permeabiliseringsbuffert i ett 50 ml centrifugrör genom att tillsätta 0,5 ml 10% triton X-100 till 49,5 ml tvättbufferten framställd i steg 4.3.
- Förbered anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) antikropp / permeabiliseringsbuffertarbetslösning genom att tillsätta 5 | il anti-SQSTM1 / p62-AF488 till 495 | il av permeabiliseringsbufferten som tillverkas i sTep 4.4. Se till att den slutliga antikroppskoncentrationen är 5 μg / ml.
OBS! Gör arbetslösning för antikroppspermeabiliseringsbufferten precis innan du lägger den i provet. Skydda lösningen från ljus. - Förbered mus-anti-LC3 / permeabiliseringsbuffertarbetslösning genom att tillsätta 5 | il mus anti-LC3 till 495 | il av permeabiliseringsbufferten framställd i steg 4.4. Se till att den slutliga antikroppskoncentrationen är 20 μg / ml.
OBS: Gör lösningsmedel för antikroppspermeabiliseringsbufferten precis innan du lägger den i provet. Skydda lösningen från ljus. - Förbered espel anti-mus-Alexa 647 (AF647) / permeabiliseringsbuffertarbetslösning genom att tillsätta 5 | il AF647-märkt åsnor-anti-mus-IgG till 495 | il av permeabiliseringsbufferten som framställts i steg 4.4. Se till att den slutliga antikroppskoncentrationen är 20 μg / ml.
OBS! Gör arbetslösningen för antikroppspermeabiliseringsbufferten precis innan du lägger den i provet. Skydda tHan lösning från ljus. - Förbered anti-human CD107a (LAMP1) -PE antikropp / permeabiliseringsbuffertarbetslösning genom att tillsätta 25 | il anti-CD107a (LAMP1) -PE till 475 | il av permeabiliseringsbufferten framställd i steg 4.4. Se till att den slutliga antikroppskoncentrationen är 21 μg / ml.
OBS! Gör arbetslösningen för antikroppspermeabiliseringsbufferten precis innan du lägger den i provet. Skydda lösningen från ljus. - Förbered 10x DAPI-nukleär fläck genom att tillsätta 4 | il 5 mg / ml DAPI och 100 | il 10% triton X-100 till 896 | il av 1x PBS.
5. Märkning av Jurkat-cellerna med LC3, LAMP1 och p62
- Ta bort 2 x 10 6 celler per prov (räkna cellerna som i steg 2.2). Placera varje prov i ett 15 ml centrifugrör som har märkts med lämpligt provnamn ( dvs. Control, Control + Chloroquine, Starved eller Starved + Chloroquine).
- Lägg till tvättbuffert så att jag därEn total volym av 15 ml i varje 15 ml centrifugrör. Centrifugera proverna vid 250 xg under 10 minuter. Aspirera av supernatanten.
- Tillsätt 100 μl 4% formalinfixeringslösning till var och en av cellpelletsna. Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Under fixeringssteget överför proverna till märkta, silikoniserade polypropenmikrocentrifugrör.
OBS: Överrätta inte cellerna; Detta kan leda till dåliga märkningsresultat. - Efter 10 min fixeringssteget, tillsätt 1 ml tvättbuffert till varje prov. Pipettera upp och ner med en P1000 pipett för att blanda provet. Centrifugera vid 250 xg i 5 min. Aspirera av supernatanten.
- Tillsätt 100 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 antikropp / permeabiliseringsbuffertarbetslösning till varje prov. Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett. Inkubera i 30 minuter i mörkret vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mlPermeabiliseringsbuffert till varje prov. Pipettera upp och ner med en P1000 pipett för att blanda provet. Centrifugera vid 250 xg i 5 min. Aspirera av supernatanten.
- Upprepa steg 5.4-5.5 för var och en av antikroppens arbetslösningar.
OBS: Arbetslösningarna för antikroppar är lösningsmedel för anti-LC3 / permeabiliseringsbuffert för mus, anti-mus-åsna - AF647 / permeabiliseringsbuffertarbetslösning och anti-human CD107a (LAMP1) - PE-antikropp / permeabiliseringsbuffertarbetslösning. Varje antikropp bör göras separat och i den angivna ordningen. Ordern valdes för att minimera oönskad korsreaktivitet mellan antikroppar. - Tillsätt 100 μl 1% formalinlösning. Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett. Tillsätt 10 μL av 10x DAPI-nukleär fläck till varje prov. Lätt vortexa varje prov för att blanda. Inkubera i 10 minuter i mörkret vid rumstemperatur innan du kör någon av proven på instrumentet.
OBS: Vid denna tidpunkt kan provet antingen bE köra på MIFC eller lagras skyddad från ljus vid 2-8 ° C i upp till en vecka.
6. Märkning av enkelfärgskontroller
- För varje enskild färgkontroll ( dvs. AF488, PE, AF647 och DAPI), ta 1 x 10 6 Jurkat-celler, som kan vara från någon av provpopulationerna. Sätt 1 x 10 6 celler i 15 ml centrifugrör märkta som antingen AF488, PE, AF647 eller DAPI.
- Tillsätt tvättbuffert så att det finns en total volym på 15 ml i varje 15 ml centrifugrör. Centrifugera proverna vid 250 xg under 10 minuter. Aspirera av supernatanten.
- Tillsätt 100 μl tvättbuffert till AF488, PE och AF647 rören.
OBS! För DAPI-röret, gå till steg 6.8.- Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett. Överför till 1,5 ml rör.
- Tillsätt 5 μl av antingen anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE eller anti-CD45-AF647 till respektive AF488, PE eller AF647-rören. Blanda genom vortexing lightly.
- Inkubera AF488, PE och AF647 rören i 30 minuter i mörkret vid rumstemperatur.
OBS! Andra markörer kan användas, såsom LC3-, p62- och LAMP-1-antikroppar istället för anti-CD45-antikroppar. CD45 är dock en pålitlig markör för enfärgskontroller. - Tvätta AF488, PE och AF647 celler genom att tillsätta 1 ml tvättbuffert till varje prov.
- Pipettera upp och ner med en P1000 pipett för att blanda provet. Centrifugera vid 250 xg i 5 min. Aspirera av supernatanten.
- Tillsätt 100 μl 1% formalinlösning. Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett.
OBS: Vid denna tidpunkt kan provet antingen köras på MIFC eller lagras skyddat från ljus vid 2-8 ° C i upp till en vecka. - Tillsätt 100 μl 1% formalinfixeringslösning till DAPI-röret.
- Resuspenderas genom pipettering upp och ner med en P200 pipett. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg till 101; L av 10x DAPI-nukleär fläck till DAPI-provet. Lätt virvel för att blanda. Inkubera i 10 minuter i mörkret vid rumstemperatur innan du kör på instrumentet.
OBS: Vid denna tidpunkt kan provet antingen köras på MIFC eller lagras skyddat från ljus vid 2-8 ° C i upp till en vecka.
7. Starta och kalibrera MIFC
- Kontrollera att manteln, systemkalibreringsreagenset (se materialtabellen ), debubbler, rengöringsmedel och steriliseringsbehållare är fulla och spilltanken är tom. Om inte, fyll behållarna och töm av spilltanken.
- Kör på systemet och dubbelklicka på programvaran (se ikonen för materialet s) för att starta programmet. Detta kommer att starta MIFC-programvaran.
- Klicka på Start- knappen och se till att Starta alla kalibreringar och test är markerade. Detta kommer att spola systemet, ladda manteln, systemkalibreringsreagenset,Och kalibrera systemet.
8. Köra proverna och enfärgskontrollerna på MIFC
- Ladda standardmallen genom att gå till fliken Fil och välj Load Default Template .
OBS! Standardmallan innehåller de rika pixelpunkterna för raka pixlar. - Slå på 488 nm, 405 nm, 642 nm och SSC lasrar genom att klicka på respektive knapp. Ställ in laserkraften genom att ange önskad effekt bredvid varje laserknapp. Se figur 1 .
OBS! För detta experiment är laserkraften 200 mW, 20 mW, 150 mW och 5 mW (Ch06) för respektive 488 nm, 405 nm, 642 nm respektive SSC. MIFC-standardmallförstoringen är inställd på 40X, standardkänsligheten är Hej , och alla kanaler är aktiverade. - Bekräfta att förstoringsreglaget är inställt på 40X, högkänslighetsläget är valt och alla kanaler visas i bildgalleriet. Figur 1
- Ladda "Starved + Chloroquine" -provet genom att klicka på Load- knappen och ladda 1,5 ml röret på instrumentet.
ANMÄRKNING: Detta försöksprov ska ha den högsta signalen för alla prov för AF488, PE och AF647 (DAPI-signalen bör ha ungefär samma signalstyrka för alla försöksprover, inklusive "Starved + Chloroquine" -provet). - Använd "Starved + Chloroquine" -provet för att bekräfta att lämpliga laserstyrkor för 488 nm, 405 nm, 642 nm och SSC lasrar är inställda. Använd de raka max pixelpunkten i standardmallen för att justera laserstyrkan så att signalerna är starka men inte uppnår ett rått max pixelvärde på 4,096, vilket skulle mätta CCD-kameran på instrumentet. Använd denna laserinställning för alla försöksprover.
- Klicka på ikonen Skapa prickplottar för att skapa en ny prickplot. Välj "Area_M01 "på X-axeln och" Aspect Ratio_M01 "på Y-axeln för" alla "populationen. Klicka på ikonen Skapa polygon Region . Rita en region runt cellerna. Namn på denna region" Cell. "
OBS! Användare kan lägga till ytterligare tomter och regioner för att begränsa de celler som samlas in. En gemensam extra tomt att lägga till skulle vara Gradient RMS för att identifiera celler som är i fokus. - Ställ in förvärvsparametrarna. Ange filnamn och destinationsmapp, ändra antalet händelser till "5000" och välj "Cell" -samlingspopulationen. Klicka på Acquire- knappen för att skaffa filen. Efter att ha samlat filen, returnera provet genom att klicka på Retur- knappen. Ta bort provröret från instrumentet.
- För de tre följande proverna ("Starved", "Control" och "Control + Chloroquine"), ladda provet, mata in provnamnet, hämta provet och returnera provet med samma inställningar somFör "Starved + Chloroquine" -provet ovanför.
- Efter det att proven har förvärvats, kör enkelfärgskontrollproverna och skaffa data så att en kompensationsmatris kan göras. Stäng av SSC-lasern genom att klicka på SSC- knappen. Stäng av Brightfield-kanalerna genom att klicka på Brightfield- knappen och välja OFF .
OBS! Om kanalerna togs bort från bildgalleriet för provtagning av prov, aktivera alla kanaler igen. Alternativt kan enfärgskontroller förvärvas genom att klicka på fliken Kompensation och välja Skapa matris ; Detta öppnar kompensationsguiden, som kommer att gå igenom steget att samla in filer och göra en kompensationsmatris. - Ladda DAPI-färgkontrollen genom att klicka på Load-knappen och ladda 1,5 ml röret i instrumentet. Ange provnamnet (endast DAPI), sätt in samlingspopulationen till "Alla" och ändra antalet händelserS till "500."
- Klicka på Acquire- knappen för att skaffa enfärgskontrollfilen.
- När filsamlingen är klar returnerar du provet genom att klicka på Retur- knappen. Ta bort provröret från instrumentet.
- Efter DAPI-provet, ladda 10% blekmedel precis som ett prov genom att klicka på Load- knappen och ladda 100 μL 10% blekmedel i ett 1,5 ml rör. Låt provet springa i ~ 15 s. Detta tar bort eventuella resterande DAPI från röret.
- Kör 100 μl 1x PBS, som gjort i 8.10.3, för att avlägsna resterande 10% blekmedel. Instrumentet är nu redo att köra AF488, PE och AF647 enfärgskontroller.
- Upprepa steg 8.10-8.10.2 för varje enskild färgkontroll ( dvs. AF488, PE och AF647).
OBS! Det är inte nödvändigt att köra 10% blekmedel eller PBS mellan dessa prov, först efter DAPI-färgkontrollen.
9. Dataanalys i MIFC AnAlysis-programvara
- Starta MIFC-analysprogrammet (se materialet ).
- Klicka på Start analys för att starta guiden Öppna fil . Välj den datafil som ska öppnas genom att bläddra till "Starved + Chloroquine" råbildsfilen (.rif). Välj filen och klicka på Öppna- knappen. Klicka på Nästa .
- Ansök kompensation. Välj en tidigare skapad kompensationsmatris och klicka på Nästa . Alternativt, skapa en ny kompensationsmatris genom att klicka på knappen Ny matris .
OBS! Steg 9.2.1.1-9.2.1.2 är stegen för att skapa en ny matris.- Tillsätt enfärgade styrfiler (dvs DAPI endast AF488 bara, PE och AF647) för att kontroll listan Filer genom att klicka på Lägg till filer, välja filerna och klicka på knappen Öppna. Klicka på Nästa .
- Fönstret Skapa kompensationsmatris visas för detta experiment. EnsurE att Ch02, Ch03, Ch07 och Ch11 väljs och klicka på Nästa . Kompensationsmatrisen kommer att skapas. Klicka på Slutför för att spara kompensationsmatrisen. Lägg till kompensationsfilen i Open File Wizard och klicka på Next .
- Applicera analysmallen. I det här skedet finns det ingen analysmall att tillämpa, så klicka på Nästa .
OBS! För de andra experimentfilerna kan den här filen "Starved + Chloroquine.daf" användas som en mall. - Namn filen (filnamnen som motsvarar "rif" -namnen genereras automatiskt) och klicka på Nästa . Ställ in bildvisningsegenskaperna genom att välja "02," "03", "07" och "11" kanalerna; Kanaler 01, 06 och 09 är förinställda. Klicka på Nästa .
- Ansök kompensation. Välj en tidigare skapad kompensationsmatris och klicka på Nästa . Alternativt, skapa en ny kompensationsmatris genom att klicka på knappen Ny matris .
- I slutet av Open File Wizard , välj apoptosguiden . Klicka på ikonen Apoptosguiden och sedan påVälj Wizard- knappen för att öppna apoptosguiden .
- Välj den kärntekniska bildkanalen (Ch07) och klicka på Nästa . Stick in cellerna i bästa fokus. Klicka på ikonen Skapa radregion och dra en region på Gradient RMS_M01_Ch01 från 60-90. Namn på denna region "Fokusera", klicka på OK och klicka på Nästa .
- Pojka de enskilda cellerna. Klicka på ikonen Skapa polygonregion . Rita en region runt de enskilda cellerna, namnge regionen "Singel", klicka på OK och klicka på Nästa . Klicka på Nej för "Vill du analysera delpopulationer?"
- Stick in de kärnbildade cellerna. Klicka på ikonen Skapa radregion och dra en region som innehåller alla kärnbildade celler. Namn regionen "Nucleated." Klicka på OK och Nästa .
- Porta de apoptotiska cellerna. Klicka på ikonen Skapa polygonregion . Rita en region runt de apoptotiska cellerna; Dessa är cellerMed låg nukleär Area_T50% och hög ljusfältkontrast. Klicka på Slutför . Lägg till en andra region genom att klicka på ikonen Skapa polygonregion och dra en region runt de icke-apoptotiska cellerna. Kalla den här regionen "celler".
- Välj celler som är positiva för LAMP1, P62 och LC3. Klicka på ikonen Byggstenar , välj Fluorescens Positives - One Color , och välj "Cells" -populationen och Intensity_MC_Ch03 . Märk X-Axis "Intensity LAMP1." Rita en region som innehåller celler med intensiteter större än 10 000 genom att klicka på ikonen Skapa radregion och dra i regionen. Märk denna region "LAMP1 +." Följ samma steg som i 9.4 för att välja celler positiva för p62 och LC3.
- För p62 + välj "LAMP1 +" -populationen och Intensity_MC_Ch02 . Märk X-axeln "Intensitet p62" och regionen p62 + celler "LAMP1 + / p62 +."; För LC3 +, välj "LAMP1 + / p62 +" -populationen och Intensity_MC_Ch11. Märk X-Axis "Intensity LC3" och regionen LC3 + celler "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." Använd den här "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populationen för resten av analysen.
- Skapa en spot-count-funktion för att räkna LC3-fläckarna.
OBS! Detta ska skapas med hjälp av "Starved + Chloroquine" -provet.- Klicka på fliken Analys och välj Mask . Klicka på knappen Ny och sedan på funktionen . Under Funktion väljer du Peak ; Mask , välj M11 ; Och kanal , välj Ch11 . Ställ platsen till cellens bakgrundsförhållande till 4 . Klicka på OK för att stänga fönstret Definiera maskeringsfunktion och OK för att lägga till det i masklistan . Klicka på Stäng för att avsluta Maskhanteraren .
- Klicka på fliken Analys och välj
OBS! Spot- guiden kan också användas för att skapa en spot-count-funktion. Platsen-count-funktionen som används i detta experiment är kanske inte lämplig för andra experiment och / eller celllinje. Användaren bör testa flera fläckräknare / -funktioner när man bestämmer om en mask / funktion för en viss dataset. Pugsley 2017 har ytterligare detaljer om spoträkning med hjälp av MIFC-analysprogrammet 26 . - Klicka på ikonen New Histogram . Välj "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populationen. Markera Spot Count LC3-funktionen och klicka på OK .
- Skapa BDC3-funktionen.
- CSläcka fliken Analys och välj Egenskaper . Klicka på knappen Ny . Under Funktionstyp väljer du Bright Detail Colocalization 3 ; Mask , välj MC ; Bild 1 , välj Ch02 (p62); Bild 2 , välj Ch03 (LAMP1); Och jag mage 3 , välj Ch11 (LC3). Skriv "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" för namnet och klicka på OK och Stäng för att avsluta Funktionschef .
- Klicka på ikonen New Histogram . Välj "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populationen. Välj funktionen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 och klicka på OK .
- Klicka på ikonen New Scatterplot . Välj "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" -populationen. Välj BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 för X-axeln. Välj Spot Count LC3- funktionen för Y-axeln. Klicka på OK .
- Spara thE "Starved + Chloroquine" -filen. Klicka på Arkiv och välj Spara dataanalysfil (.daf) . Klicka på Spara och Ja för att ersätta den tidigare versionen av filen. Den här filen kan nu användas som en mall.
- Öppna "Control" -filen. Klicka på Arkiv och öppna sedan . Välj filen "Control.rif" och klicka på Öppna . Välj kompensationsmatrisen från steg 9.2.1 och filen "Starved + Chloroquine.daf" som mall. Klicka på OK .
- Skapa regioner för ackumulering av autofagosom och ackumulering av autolysosom med hjälp av "Control" -provet för att ställa in regionerna.
- Klicka på ikonen Skapa rektangelområde . Rita en region från X-koordinater av -0,1 till 3 och Y-koordinater av 1,5 till -0,3. Namn på denna region "Låga platser". Klicka på Skapa rektangulär regionikon. Rita en region från X-koordinater av -0,1 till 1 och Y-koordinatAtes av 17,5 till 1,5. Namn på denna region "High Spot / Low BDC3."
- Klicka på ikonen Skapa rektangelområde. Rita en region från X-koordinaterna 1 till 3 och Y-koordinaterna 17,5 till 1,5. Namn på denna region "High Spots / High BDC3."
- Spara "Control" -filen. Klicka på Arkiv och välj Spara dataanalysfil (.daf ) . Klicka på Spara och Ja för att ersätta den tidigare versionen av filen. Den här filen kan nu användas som en mall.
- Öppna "Control + Chloroquine" -filen genom att klicka på Arkiv och sedan Öppna . Välj filen "Control + Chloroquine.rif" och klicka på Öppna . Välj kompensationsmatrisen från steg 9.2.1 och "Control.daf" -filen som mall. Klicka på OK . Upprepa detta för "Starved" och "Starved + Chloroquine" -filerna.
OBS! Batchfunktionen i analysprogrammet kan också användas för att applicera kompensatornTionmatris och / eller mall till de andra filerna. Slutgitteringsstrategin visas i figur 2 .
Representative Results
Denna analysmetod använder flera funktioner för att bedöma autofagiskt flöde. För att fullständigt förstå det slutliga bivariatritet måste de enskilda analysegenskaperna först undersökas. Räkningen av autophagosomer är ett logiskt sätt att mäta autofagi; LC3 punctas storlek / form / ljushet kan emellertid variera drastiskt mellan cellerna. Variation kan göra det svårt att räkna autofagosomer manuellt eller använda en spot-count-funktion i analysprogrammet. Därför kommer ingen spot-count-funktion att vara perfekt på grund av denna stora variation i autofagosomer. En bra spot-count-funktion kommer dock att fungera på de flesta celler 26 . Figur 3 visar exempel på punktmaskering av LC3 puncta i Jurkat-celler med användning av olika fläckmaskar. Spot-count-funktionen vald för denna dataset är Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, vilket betyder att spot count-funktionen räknade de punkter som peAK-mask identifierad i standardkanal 11-masken (M11) på kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) med ett bakgrundsförhållande mellan 4 och 4 (Bright, 4). Figur 4 visar spot-count-histogram och representativa bilder för medelvärdet för kontroll, kontroll + kloroquin, starved och Starved + Chloroquine Jurkat-celler märkta med anti-LC3-AF647. Kontrollen och Starved mean spot counten är inte signifikant olika; Med tillsats av klorokin, är det en stor skillnad i medelvärdet av kontroll + klokokinet jämfört med Starved + klokokin.
Nästa funktion att undersöka är BDC3. BDC3 är en mätning av samlokalisering av tre markörer / sonder, i detta fall LC3, p62 och LAMP1. Figur 5A- 5D visar BDC3-histogram för kontroll-, kontroll + klorookin-, starved- och starved + kloroquin Jurkat-celler märkta med anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE och anti-LC3-AF647. Det finns ett skifte mellan kontrollmedelvärdet för det Starved-medelvärdet, såväl som kontrollen + kloroquininet för Starved + Chloroquine-medelvärdet. Men när man tittar på bilderna från celler från de genomsnittliga BDC3-poängen i Figur 5E- 5H , är det en större skillnad mellan proven än histogrammen kan leda till att man tror. Detta beror på att BDC3 inte beaktar antalet autofagiska organeller som samlokaliserar, vilket resulterar i stor variation i antalet autofagosomer för samma BDC3-poäng. I de flesta fall finns överlapp mellan alla tre sonder, eftersom även vid basala nivåer, p62, LAMP1 och LC3, i viss utsträckning ska lokaliseras eller uppehålla sig i liknande områden i cellerna. Som en kontrast är ett exempel på tre prober som inte bör lokaliseras anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 och DAPI-kärnfärg för Starved + Chloroquine-provet, som visas i figur 6. </ P>
När spot count-funktionen och BDC3-funktionen kombineras, är närvaron av olika subpopulationer som förbättrar förmågan att särskilja mellan de olika proverna / tillstånden uppenbara. Figur 7 visar det bivariära diagrammet av spotantalet av LC3 mot BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 för de fyra proven: Kontroll, Kontroll + Klokokin, Starved och Starved + Chlorokin. Kontrollprovet användes för att ställa in gatingstrategin för tre populationer: Låga punkter, High Spots / Low BDC3 och High Spots / High BDC3. Kontrollproverna visade att mer än 98% av cellerna hade 1 eller färre fläckar. Gränsen mellan High Spots / Low BDC3 och High Spots / High BDC3 sattes till ett BDC3-poäng på 1 eftersom mer än 91% av kontrollprovet hade ett BDC3-poäng på mindre än 1. En sammanfattning av resultaten för de bivariata tomterna Visas i tabell 1 .
ålder = "1"> 
Figur 1: MIFC Instrument Setting. En skärmdump av MIFC-instrumentinställningarna som används för detta experiment, som skisseras i steg 8 i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys programvara Gating strategi. En skärmdump av analysprogramvarugivningssystemet, som skisseras i steg 9 i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Fig3.jpg "/>
Figur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat cellbilder och masker brukade skapa spot-count-funktionen. Visas är BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) och Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Den mask som fungerade bäst för alla celler som visades var Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: LC3 Spot-Count Histograms. Med hjälp av spot count-funktionen Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 och LC3-AF647 spot-count-histogrammen för Control ( A , ljusblå), Control + ChloroquinE ( B , blå), Starved ( C , rosa) och Starved + Chlorokin ( D , röd). Medelpunkten för kontroll, kontroll + klokokin, starved och starved + klokokin är 0,07, 1,13, 0,10 respektive 2,77. BF, LC3-AF647 (röd), DAPI-kärnfärg (blå) och en komposit av LC3-AF647- och DAPI-bilderna av representativa celler för medelvärdesräkningstalet visas för kontroll ( E , 0 fläckar), kontroll + klokokin F , 1 fläck), Starved ( G , 0 fläckar) och Starved + Chlorokin ( H , 3 fläckar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: BDC3-histogram av p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogram foR Kontroll ( A , ljusblå), Kontroll + Klokokin ( B , Blå), Starved ( C , Rosa) och Starved + Klokokin ( D , röd). Den genomsnittliga BDC3-poängen för Control, Control + Chlorokin, Starved och Starved + Chlorokin är 0,57, 0,82, 0,74 och 0,98. BF; P62-AF488 (grön); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (röd); Och en sammansättning av p62-AF488-, LAMP1-PE- och LC3-AF647-bilderna av representativa celler för den genomsnittliga BDC3 visas för kontroll ( E ), kontroll + kloroquin ( F ), starved ( G ) och starved + klokokin ( H ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: BDC3-histogram av p62 / LC3 / DAPI för Starved + Chloroquine-provet. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram för Starved + Chloroquine-provet visas. Den genomsnittliga BDC3-poängen är 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grön); LC3-AF647 (röd); DAPI (blå); Och en sammansättning av p62-AF488-, LC3-AF647- och DAPI-bilderna av representativa celler för den genomsnittliga BDC3 visas för Starved + Chloroquine-provet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bivariate Plots av LC3 Spot Count jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariatgrader av LC3-spotantal jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 för kontroll, kontroll + kloroquin, starved och starved + kloroquine Jurkat-celler. ( B ) BF; P62-AF488 (grön); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (röd); Och en sammansättning av bilderna p62-AF488, LAMP1-PE och LC3-AF647 från tre regioner ( dvs låga punkter, höga punkter / låga BDC3 och High Spots / High BDC3) visas för Starved + Chloroquine-provet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Cellräkning | Bright Detail Colocalization 3 Mean | Spotantal LC3 Medelvärde | % Lågpunkt | % High Spot / Low BDC3 | % High Spot / High BDC3 | |
| Kontrollera | 439 | 0,57 | 0,07 | 98,2 | 1,8 | 0,0 |
| Kontroll + klokokin | 1432 | 0,82 | 1,13 | 68,9 19,5 | 11,7 | |
| Utsvulten | 1204 | 0,74 | 0,10 | 98,4 | 0,6 | 1,0 |
| Starved + klokokin | 1811 | 0,98 | 2,77 | 32,1 | 36,9 | 31,0 |
Tabell 1: Sammanfattning av Jurkat LC3 Spot Count jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot
Discussion
Vid analysen finns det några saker att tänka på. Det är viktigt att ha lämpliga kontrollprover. För detta experiment användes två olika kontroller: Kontroll och kontroll + klokokin. Kontrollprovet användes för att ställa in tröskeln för regionerna. Det representerar den basala nivån av autophagy utan att stoppa lysosomal nedbrytning och är kontrollen för det Starved-provet. Kontrollprovet är dock inte en lämplig kontroll för att jämföras med resultaten från Starved + Chloroquine-provet eftersom klorokin själv påverkar kontrollprovet. Därför var det nödvändigt att ha ett kontroll + kloroquinprov.
Före analysen av autofagi är det viktigt att endast analysera / grinda på enskilda celler som ligger i fokus ( dvs gradient RMS större än 60), eftersom resultaten kan påverkas om det finns mer än en cell eller bilderna är ur fokus. Det är avgörande att autofagosomEs och lysosomer är i fokus för korrekt spoträkning och BDC3-analys. Apoptotiska celler måste avlägsnas före autofaganalys, eftersom de kan skryta resultat och inte inkluderas. Det bör finnas lämplig färgning för alla tre markörerna ( dvs. LC3, P62 och LAMP1). Till exempel är alla tre markörer intracellulära och bör ha en punktsignal; Om signalen inte punkteras eller om den befinner sig på cellens yta, skulle färgningen inte vara lämplig och experimentet / färgningen bör omformas. Dessutom, för att BDC3 ska vara korrekt, är det viktigt att grinda på celler som är ljusa för alla tre fluorescerande markörer av intresse. Gating på positiva händelser behövs för att förhindra mätning av BDC3 på icke-specifik bindning, bildartefakter och / eller ljud. Detta är avgörande, eftersom BDC3 potentiellt kan förstärka artefakter som inte är sanna signaler. Eftersom BDC3 endast kan utföras på ljusa positiva händelser, kan många celler inte inkluderas i den slutliga analysen; Det här är specielltJag är verkligen sant för kontrollceller som inte har någon ackumulering av LC3, P62 och / eller LAMP1. Således är en begränsning av denna analys att BDC3 endast undersöker celler som är positiva för alla tre markörer, vilket kanske inte är lämpliga för alla autofagiska experiment.
Liksom BDS, som tidigare rapporterats 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , tar BDC3 inte ens hänsyn till antalet autofagorganeller som samlokaliserar, vilket resulterar i en stor grad Av variationen i antalet autofagosomer. Därför är det bivariatiska tillvägagångssättet som presenteras av Rajan et al. Användes. Titta på de bivariata tomterna kan man fråga omCellerna måste vara positiva för LC3, p62 och LAMP1; Varför finns det så många celler som har 0 fläckar? Detta beror på att LC3-signalen kan vara tillräckligt ljus för samlokalisering, men det kanske inte uppfyller tröskeln som fastställts av toppmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) som krävs för att den ska betraktas som en fläck.
Protokollet som presenteras här använde MIFC för att räkna LC3 puncta och samlokalisering av tre autofagmarkörer för att mäta autofagiskt flöde. Under basala förhållanden (kontrollprov) var antalet autofagosomer låga och få celler hittades med "High Spots". Med tillsatsen av klorokin, som hämmar autofagosom / lysosomfusion, var det en ökning av antalet LC3-fläckar. Eftersom lysosomen inte kan bryta ner autofagosomen och p62, som ligger i autofagosomen, leder detta till en ökning av samlokaliseringen av ackumuleringen av LC3, p62 och LAMP1 autolysosom. Denna effekt förstärktes under näringsstärkelseJon, vilket inducerar autofagi. Men utan tillsats av klorokin var det inte en signifikant ökning av antalet autofagosomer, troligen på grund av en ökning av autofagisk omsättningshastighet. När cellerna svälte i närvaro av klorokin var det en ökning av samlokalisering och antal autofagosomer, vilket stöder slutsatsen att svält ökar autofagiskt flöde. EBSS är känt för att vara en kraftfull inducer av autofagi. Därför förväntas ökningen vara stor. Om en annan metod, såsom läkemedelsinduktion, används för att inducera autofagi, kan skillnaden mellan kontroll och behandlade prover vara subtilare.
Detta speciella protokoll utformades för att mäta autofagi i humana cellinjer, men analysen kunde anpassas till andra arter genom att växla till antikroppar för den specifika arten. Dessutom kan analysmetoden användas för vilken intracellulär applikation som helst som kräver samlokaliseringAv tre sonder / markörer.
Disclosures
Jag är anställd av MilliporeSigma, tillverkaren av Amnis-märket ImageStream, som användes i denna studie.
Acknowledgments
Jag vill tacka mina medarbetare på MilliporeSigma, Philip J. Morrissey och Sherree L. Friend, för deras stöd och vägledning under åren. Jag vill också tacka Vidya Venkatachalam och Bryan R. Davidson för deras hjälp med BDC3 funktion i IDÉER programvara, Ryan P. Jessup för att få hjälp att redigera detta manuskript, Raymond Kong för att få hjälp på dagen för skytte, och ett särskilt tack Till makeup artist Cynthia Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
- Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
- Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
- Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
- Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
- Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
- Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
- Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
- Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
- Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
- Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
- Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
- Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
- Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
- Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
- Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
- Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
- Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
- Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
- Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
- Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
- IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).
