Summary
Un protocole est présenté pour la production de l'ARNt (UUU) et l'analyse de l'ARNt (UUU) en complexe avec l'enzyme TcdA par des essais de retard de gel d'agarose.
Abstract
Nous démontrons des méthodes pour l'expression et la purification de l'ARNt (UUU) dans Escherichia coli et l'analyse par des essais de retard de gel de la liaison de l'ARNt (UUU) à TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladénosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise le thréonylcarbamoyle Chaîne latérale attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) des tRNAs à t 6 A cyclique (ct 6 A). La transcription du gène synthétique codant pour l'ARNt (UUU) est induite chez E. coli avec 1 mM de ß-D-1-thiogalactopyranoside isopropylique (IPTG) et les cellules contenant de l'ARNt sont récoltées 24 heures après l'induction. La fraction d'ARN est purifiée en utilisant la méthode d'extraction du phénol acide. L'ARNt pur est obtenu par une Chromatographie de filtration sur gel qui sépare efficacement les molécules d'ARNt de petite taille des plus grands acides nucléiques intacts ou fragmentés. Pour analyser la liaison TcdA à l'ARNt (UUU), TcdA est mélangé avec l'ARNt (UUU) et séparé sur un gel d'agarose natif à 4 ° C.L'ARNt libre (UUU) migre plus rapidement, tandis que les complexes TcdA-ARNt (UUU) subissent un retard de mobilité qui peut être observé lors de la coloration du gel. Nous démontrons que TcdA est une enzyme de liaison à l'ARNt (UUU). Ce test de retard de gel peut être utilisé pour étudier les mutants TcdA et les effets des additifs et d'autres protéines sur la liaison.
Introduction
Le test de retard de gel 1 (également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité électrophorétique, EMSA) est une méthode électrophorétique conçue pour étudier et caractériser les interactions protéines-acides nucléiques. Il permet l'analyse de l'ADN protéique ainsi que des interactions protéine-ARN et, en particulier, des interactions entre les protéines de liaison à l'ARNt et à l'ARNt, en utilisant soit des composants purifiés, soit des mélanges complexes de protéines ( par exemple , des lysats cellulaires) ou des acides nucléiques ( p . Ex . ARNt Piscines). Nous avons appliqué des essais de retard de gel à l'étude de l'interaction entre l'ARNt purifié (UUU) et TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladenosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise la chaîne latérale de thréonylcarbamoyle attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) Des tRNAs à t 6 cyclique (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA est également connu sous le nom CsdL 3 ,F "> 4. Le gène tcdA / csdL forme une grappe avec les gènes csdA et csdE 5 , qui codent pour la cysteine desulfurase et l'accepteur de soufre du système de désulfinase de cysteine sulfinase (CSD) et est nécessaire pour maintenir la fonction TcdA in vivo 3 .
La raison d'être des tests de retard de gel est que, bien que les molécules d'acide nucléique libres migrent rapidement vers l'avant de l'acrylamide ou des gels d'agarose en raison de leur grande charge négative, la mobilité électrophorétique des complexes de protéines des mêmes acides nucléiques est considérablement réduite. La réduction de la mobilité est visualisée comme un «décalage» dans les complexes acide nucléique-protéine, qui se résolvent sous forme de bandes discrètes. Un complexe de protéines d'acide nucléique et de charge positif et plus large montre un déplacement plus important ou une réduction de la mobilité sur un gel.
Puisque la neutralisation des charges du complexe est un phénomène universelPour les complexes protéine-acide nucléique, l'essai de retard de gel peut être appliqué à une large gamme de complexes et de types d'acides nucléiques. La méthode est simple, peu coûteuse et peut être effectuée dans des laboratoires avec un équipement minimum. Il ne nécessite que de petites quantités de protéines et d'ARNt. C'est un avantage par rapport à d'autres techniques biophysiques, qui habituellement consomment de plus grandes quantités d'échantillons.
Le test de retard de gel a été largement utilisé pour l'étude des facteurs de transcription. Le test a été utilisé pour analyser la cinétique de liaison, la force et la spécificité des facteurs de transcription pour de nombreuses séquences d'ADN différentes. C'est en effet dans ce domaine que l'EMSA a été développée pour la première fois 6 , 7 . Des essais de retard de gel avec des molécules d'ARN 8 , 9 , 10 , 11 et tRNA ont également été utilisés dans la recherche sur les ribosomesEt d'analyser, comme nous le faisons ici, les enzymes qui modifient les nucléosides d'ARNt post-transcriptionnellement.
De nombreux paramètres différents affectent le résultat d'un essai de retard de gel tel que la température, la qualité de l'échantillon de protéines et d'ARNt et la force de la liaison. Une planification minutieuse et l'exécution de l'expérience est cruciale pour l'interprétation des résultats de l'acide nucléique et des espèces liées aux protéines. Ici, nous avons utilisé le gène synthétique codant pour l'ARNt (UUU) clone dans un vecteur d'expression dont le promoteur n'a pas le site de liaison au ribosome Shine-Dalgarno, ce qui conduit à la synthèse de grandes quantités d'ARNt 2 . Ce protocole détaillé est destiné à fournir un guide clair pour effectuer des expériences de retard de gel d'ARNt tout en évitant les erreurs courantes.
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Protocol
Attention: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et corrosifs. Utiliser les pratiques appropriées lors de l'extraction de l'ARNt à l'aide de phénol, y compris l'utilisation d'une hotte et d'un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées, etc. ). Ce protocole utilise une tache d'acide nucléique non toxique. L'utilisation d'autres taches peut nécessiter des précautions supplémentaires et une élimination spécialisée de l'agent de coloration si elles sont toxiques ou cancérogènes ( p . Ex ., Bromure d'éthidium).
1. Préparation du gel d'agarose
- Peser 2 g d'agarose et l'ajouter à une bouteille en verre pour préparer un gel d'agarose à 2% p / v.
- Ajouter 100 ml d'un tampon de liaison 1x-tris-borate-éthylènediaminetétracétique (EDTA) (TBE) à la bouteille contenant de l'agarose. Faire fondre par chauffage dans un micro-ondes. À intervalles de 30 s, tourbillonner le contenu pour mélangerBien et répétez cette étape jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Laisser refroidir la solution d'agarose à environ 50-60 ° C.
- Tapez les bords ouverts d'un bac en gel pour créer un moule, placez un peigne approprié pour créer les puits et jeter l'agarose fondu dans celui-ci. Éviter la formation de bulles et laisser la solidifier à température ambiante.
- Une fois solidifié, placer le bac en gel dans une unité d'électrophorèse et le remplir avec un tampon TBE jusqu'à ce que le gel soit complètement recouvert.
2. Préparation de l'ARNt
- Express tRNA (UUU) à E. coli
- Dans la matinée, utiliser un flacon de E. coli BL21 congelé (DE3) transformé avec le vecteur d'expression pET23d-EcUUU 2 (héberge le gène codant pour l'ARNt de E. coli (UUU)), pour obtenir un Luria Broth (LB) à faible teneur en sel, Plaque additionnée de 100 μg / ml d'ampicilline. Inverser la plaque et la placer dans un incubateur de 37 ° C jusqu'à ce que les colonies apparaissent (fin de l'après-midiOon).
- Inoculer une colonie unique cultivée dans 5 ml de LB plus 100 μg / mL d'ampicilline et faire pousser toute une nuit à 220 tr / min à 37 ° C.
- Le lendemain matin, granuler les cellules (6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C), remplacer le milieu par 5 mL de LB fraîche plus 100 μg / mL d'ampicilline et réusiner. Utilisez cette suspension pour inoculer 200 mL de LB plus 100 μg / mL d'ampicilline. Cultiver pendant 5 h à 220 tr / min à 37 ° C.
- Lorsque la densité optique de la culture à 590 nm (OD 590 ) a atteint 0,6 - 0,8, ajouter 1 mM d'IPTG à la culture pour déclencher l'expression du gène de l'ARNt (UUU). Incuber à 37 ° C pendant 3 h.
- Récolte les cellules en centrifugant la culture à 6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Lysis and extraction
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse de 5 ml (acétate de sodium 0,3 M, EDTA 10 mM). À partir de ce moment-là, utilisez des tampons autoclavés et gardez tous les échantillons contenant de l'ARNt à 4 ° C pour éviter que tDégradation de l'ARN.
- Ajouter 1 volume de phénol acide (pH 4,3) à la pastille de cellules ressuscité dans la hotte. Mélanger pendant 1 min par inversion pour lyser les cellules et centrifuger à 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
- Recueillir la phase aqueuse supérieure contenant l'ARNt soluble (UUU) (et des concentrations plus faibles des autres pools d'ARNt) en utilisant une pipette en prenant soin de ne pas aspirer la phase organique (inférieure). Jeter la couche inférieure et la pastille, qui consiste en la phase organique et les débris cellulaires, dans un récipient adéquat.
- Précipiter l'ARNt en mélangeant soigneusement la phase soluble (aqueuse) avec 2,5 volumes d'éthanol à 100% v / v par inversion pendant 1 h à 4 ° C. Centrifuger le mélange à 15 000 xg (30 min, 4 ° C).
- Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot riche en ARNt dans 4 ml de tampon de filtration sur gel (phosphate de sodium 20 mM ou phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Exécuter 5 μL du pool d'ARNt resuspendu sur un gel d'agarose à 2% p / v.
REMARQUE:L'ARNt de bonne qualité apparaît comme une bande unique (taille moléculaire comprise entre 50 et 100 pb).
- Purification de l'ARNt (UUU)
- En suivant la pratique chromatographique standard 12 , charger l'ARNt ressuscité (UUU) sur une colonne de filtration sur gel préparative haute résolution (dimensions: 16 x 600 mm, volume du lit: 120 ml, plage de résolution: 1 000 à 70 000 Da) préalablement équilibrée dans un tampon de filtration sur gel (phase mobile). Réglez le débit à 1 mL / min pour éluer les échantillons.
REMARQUE: Le sommet de l'ARNt (UUU) élue approximativement à 75,5 ml. Typiquement, on peut obtenir un rendement de 0,5-1,0 mg / L d'ARNt de culture. - Analyser les échantillons à des volumes d'élution représentatifs par électrophorèse de 5 à 10 μl de chaque échantillon sur un gel d'agarose à 2% p / v.
- En suivant la pratique chromatographique standard 12 , charger l'ARNt ressuscité (UUU) sur une colonne de filtration sur gel préparative haute résolution (dimensions: 16 x 600 mm, volume du lit: 120 ml, plage de résolution: 1 000 à 70 000 Da) préalablement équilibrée dans un tampon de filtration sur gel (phase mobile). Réglez le débit à 1 mL / min pour éluer les échantillons.
3. Préparation de l'échantillon
- Exprimer et purifier TcdA selon López-Estepa et al . 2 .
REMARQUE: jusqu'à 250 μMTcdA peut être utilisé pour l'étude. - Pipettez la quantité correspondante de TcdA selon le tableau 1 dans des tubes de centrifugation de 1,5 mL correctement étiquetés. Ajouter 1,6 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) (concentration finale) et mélanger doucement à l'aide d'une pipette. Fermer le couvercle et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 10 μM de triphosphate d'adénosine (ATP) et 50 mM de MgCl 2 (concentrations finales). Mélanger avec une pipette et incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante.
- Ajouter l'ARNt purifié (UUU) (section 2.3) selon le tableau 1 , mélanger avec une pipette et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à 100 μL de volume final. Mélanger correctement et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% v / v.
- Vortez l'échantillon et essorez brièvement le contenu du tube (10 000 xg, 1 min, 4 ° C).
4. Développement de chargement de gel et d'électrophorèse
- Placez l'unité d'électrophorèse dans un plateau rempli de glace écrasée pour maintenir la chambre à 4 ° C pendant l'opération d'électrophorèse.
- Soigneusement, faites pipeter 5 μL de chaque échantillon dans le puits correspondant. Ajouter un marqueur de taille d'ADN approprié.
- Branchez les électrodes dans les fentes correspondantes de l'unité d'alimentation. Allumez le bloc d'alimentation et réglez la tension à 100 V et faites fonctionner le gel pendant 90 min.
5. Coloration du gel pour observer l'interaction de l'ARNt-protéine
- Préparer la solution de coloration en mélangeant 50 mL de TBE avec 1x d'une tache d'ADN appropriée. Évitez d'exposer la solution de coloration à la lumière du soleil en recouvrant le récipient de coloration avec du papier d'aluminium.
NOTE: Les taches d'ADN sont habituellement stockées sous forme de 10 000 ou 20 000 fois de concentrés. - Après 90 minutes d'électrophorèse, retirez soigneusement le gel du bac et placez-le dans un récipient avec une solution de coloration. Placez-le sur un bascule à faible vitesse de basculement à la température ambianteUre pendant 30 min.
- Retirez le gel d'agarose du récipient de coloration, tapez-le soigneusement sur un morceau de papier de cellulose ou de filtre pour enlever l'excès de liquide et placez-le directement sur un transilluminateur. Allumez la lumière UV pour visualiser les bandes contenant de l'ARNt. Prenez une photo du gel.
- Coloration des protéines (facultatif).
- Jeter la solution de coloration à l'ADN en toute sécurité (selon les procédures de sécurité) et la remplacer par une solution de 50 ml de bleu brillant (CBB) de Coomassie. Placez le plateau sur un basculeur à température ambiante et tachez la nuit (> 12 h). Jeter la solution de coloration CBB et la remplacer par 50 ml de PBS pour éliminer l'excès de colorant. Déterminez pendant 1 h sur un rocker.
- Visualisez les complexes d'ARNt contenant des protéines sous un transilluminateur léger et prenez des photos du gel pour comparer avec la photo de gel UV de l'ARNt.
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Representative Results
De grandes quantités d'ARNt (UUU) peuvent être obtenues en exprimant le gène de l'ARNt dans E. coli sous le contrôle d'un promoteur T7 inducible fort. L'ARNt exprimé (UUU) s'accumule dans le cytoplasme et est enrichi sur le pool d'ARNt naturellement abondants. Un procédé de purification en deux étapes consistant en une étape de capture / extraction et une étape de filtration / polissage sur gel a été utilisé pour obtenir l'ARNt EMSA. L'étape de capture / extraction utilise pH 4.3 phénol pour obtenir la précipitation simultanée de protéines, de débris cellulaires, d'ADN et l'extraction de l'ARNt (et d'autres molécules d'ARN). A cette étape, la quantité de pool d'ARNt total peut être évaluée par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% p / v. La deuxième étape comprend une chromatographie par filtration sur gel qui sépare les espèces d'ARN selon leur taille moléculaire. La trace UV à 254 nm est utilisée pour surveiller la séparation et identifier les principaux pics d'élution ( figure 1Haut). Des aliquotes représentatives de fractions de pics ont été exécutées sur un gel d'agarose à 2% p / v pour analyse ( figure 1 en bas ). La majorité des molécules d'ARNt co-éluent en un seul pic (le milieu) du cycle de chromatographie (ici 75,5 ml dans une colonne de taille de lit de 120 ml). Lors de la séparation des pools contenant une seule espèce surexprimée, comme l'ARNt (UUU), plus de 90% des molécules d'ARNt dans le pool appartiennent à cet ARNt spécifique, tandis que les molécules restantes correspondent aux ARNt naturellement abondants. Les pics secondaires sont observés avant et après le pic central contenant l'ARNt. Le (s) pic (s) avant contient des molécules d'ARN plus grandes partiellement dégradées (fractions 26 et 32; barres de la Figure 1 ) et le (s) pic (s) à la fin de l'opération de purification contiennent de très petits ARN et contaminants (fractions 45 et 51; Barres de la figure 1 ). Après avoir regroupé les fractions sous le pic central (fractions 39-43; Barres sur la figure 1 ), la quantité d'ARNt purifié peut être quantifiée par spectroscopie UV et / ou par comparaison avec des standards de taille moléculaire sur un gel d'agarose à 2% p / v.
Les échantillons TcdA et tRNA (UUU) peuvent être mélangés à différents rapports molaires de 1,0 à 10,0 en utilisant un schéma d'échantillonnage semi-logarithmique ( tableau 1 ) et séparés sur des gels d'agarose à 2% p / v ( figure 2 ). Selon la stabilité des complexes protéine-ARNt et la stoechiométrie de la liaison, une ou plusieurs bandes peuvent être visualisées sur le gel. Pour TcdA-tRNA (UUU), un complexe stoechiométrique est formé qui fonctionne comme une bande isolée contenant à la fois la protéine et l'ARNt. Typiquement, l'ARNt gratuit migre plus rapidement et peut être observé au fond du gel, tandis que les complexes protéine-ARNt, moins chargés de manière négative et de plus grande taille, ont tendance à migrer plus lentement. La figure 2 montre une représentation Un gel d'agarose à 2% p / v de complexes TcdA-ARNt (UUU). Dans la figure 2 , les bandes TcdA-only et tRNA-only servent de témoins négatifs. Au fur et à mesure que le rapport molaire TcdA: tRNA (UUU) augmente, la quantité de complexes TcdA-ARNt (UUU) formée au détriment de la bande libre d'ARNt augmente. Notez que l'intensité de l'ARNt libre diminue à mesure que la quantité de TcdA augmente. Le premier complexe à former est un complexe stoechiométrique 2: 1 contenant une molécule d'ARNt par dimère de TcdA (visible dans les voies avec 10, 20 ou 30 μM de TcdA). À la saturation en TcdA, un complexe de TcdA-ARNt (UUU) de masse moléculaire plus large développe un complexe stoechiométrique 2: 2, où les deux sous-unités de TcdA sont liées à une molécule d'ARNt (UUU) chacune (visible dans les voies avec 30, 50 ou 75 μM). Les deux dernières voies avec TcdA (50 ou 75 μM) ont lié tout l'ARNt dans la réaction et n'ont pas de bande d'ARNt libre.
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Figure 1: Purification de l'ARNt (UUU) par Gel Filtration. Chromatogramme (en haut) de la filtration sur gel d'ARNt (UUU) sur une colonne de filtration sur gel préparative à haute résolution enregistrée à 254 nm. Le pic le plus élevé, contenant le pool d'ARNt enrichi en ARNt (UUU), est élué à ~ 75,5 ml. Un gel d'agarose à 2% p / v (fond) a été administré avec des aliquotes provenant des différentes fractions d'élution d'ARNt. M, échelle de taille moléculaire. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: dosage de retard de gel avec TcdA et tRNA (UUU). EMSA fournit des preuves de la liaison physique de l'ARNt à TcdA. Les échantillons ont été soumis à un gel d'agarose à 2% p / v à 4 ° C pendant 90 minutes. Une quantité fixe d'ARNt (UUU), 7,5 μM, a été mélangé avec des quantités variables de TcdA (voir tableau 1 ), et les complexes protéine-ARNt ont été séparés lors de l'opération d'électrophorèse. Le gel a été coloré et visualisé sur un transilluminateur UV. Chaque voie contient 5 μl d'échantillon. M, échelle de taille moléculaire. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'essai de retard de gel de protéine-ARNt d'agarose décrit ici peut être modifié de plusieurs manières. Tout d'abord, le pourcentage d'agarose dans le gel peut être réduit pour permettre la séparation et la visualisation des complexes protéine-ARNt significativement plus importants que ceux analysés ici (120 kDa). Deuxièmement, si la protéine cible est thermolabile, des précautions supplémentaires doivent être prises pour que la température soit maintenue en dessous de la température maximale acceptable en déplaçant l'appareil d'électrophorèse dans une chambre froide ou en utilisant des paquets de glace à l'intérieur de la chambre d'électrophorèse pour dissiper immédiatement la chaleur produite Pendant la course. D'autres compositions de tampon ( p . Ex . 0,5 x TB, tris-borate) et les paramètres de fonctionnement (> 20 V / cm) peuvent être modifiés pour raccourcir le temps d'exécution si nécessaire ou acceptable pour les échantillons 11 . La concentration suggérée de MgCl 2 peut être réduite si la dégradation de l'ARN est observée pendant l'étape de préparation de l'échantillon, puisque la cati divalenteOns peut catalyser le clivage des acides nucléiques.
La principale limitation de la technique est que les bandes de protéines-ARNt sont typiquement légèrement plus diffuses que celles observées dans les méthodes de retardement de gel à base d'acrylamide, qui ont tendance à être plus nettes et plus claires. Une autre limitation est que des gels plus larges et plus longs peuvent être nécessaires pour l'analyse simultanée de multiples échantillons et si des complexes protéine-ARNt de différentes tailles et charges doivent être résolus.
Par rapport aux méthodes existantes, l'essai de retard de gel d'agarose-protéine-ARNt permet une réduction significative du temps de travail et du temps, de la préparation de l'échantillon à l'analyse. Les gels d'acrylamide, contiennent des produits chimiques nocifs, sont laborieux à préparer et à prendre plus longtemps pour polymériser. En revanche, les gels d'agarose sont simples, rapides à couler et à mettre en place, et ne comportent pas de produits chimiques toxiques. L'expérience peut être complétée en 2 h. Cela comprend 30 minutes pour que le gel soit réglé, 15 min pour la préparation de l'échantillon (qui peut êtreFait pendant le refroidissement de l'agarose), 90 min pour l'électrophorèse et la visualisation.
Les applications futures de la méthode peuvent affiner les méthodes de détection utilisées dans ce protocole et l'appliquer à la détection d'espèces d'ARN moins abondantes, plus instables ou à des complexes de protéines qui ne peuvent être exprimés qu'en très petites quantités. L'étiquetage de l'ARN ou du composant protéique avec des fluorophores hautement sensibles permettrait de détecter de plus petites quantités de complexes protéine-ARN. En outre, l'utilisation de fluorophores avec des pics d'émission / excitation non chevauchants pourrait permettre des expériences de multiplexage où différentes espèces de protéines et / ou d'ARN pourraient être visualisées simultanément dans une seule expérience.
Il existe trois étapes essentielles dans ce protocole. La première et la plus critique étape critique est l'expression et la purification de l'ARNt (UUU). Si la quantité d'ARNt purifié (UUU) est inférieure à une limite de détection minimale (entre 25-200 ng d'ARNt par bande), Ou les bandes de dégradation deviennent apparentes comme des contaminants de taille moléculaire inférieure, l'ARNt doit être jeté et purifié. L'utilisation de phénol acide (pH 4,3) pendant l'extraction de l'ARNt est essentielle puisqu'il précipite sélectivement l'ADN tout en conservant l'ARN soluble. La deuxième étape critique concerne la préparation des échantillons de protéines-ARNt à des fins d'analyse. Des quantités suffisantes de protéines et d'ARNt doivent être utilisées pour permettre la détection robuste de tous les complexes formés. Les rapports molaires protéine-ARNt doivent être ajustés pour déplacer l'équilibre vers la formation du complexe. La troisième étape critique est l'électrophorèse. Le tampon TBE doit être utilisé frais (non réutilisé) et il est nécessaire de conserver les gels d'agarose à des températures où les complexes protéine-ARNt sont stables et ne se dénaturent pas (typiquement 4-10 ° C). Il faut veiller à garder le gel d'agarose froid pendant toute l'électrophorèse, par exemple, en entourant la chambre d'électrophorèse avec de la glace et, chaque fois que cela est possible, le fonctionnement de l'expérienceT dans une chambre froide à 4 ° C.
Nous avons démontré une méthode simple pour analyser, caractérisant les complexes protéine-ARNt en utilisant l'ARNt TcdA (UUU) comme système modèle, et en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose au lieu de l'électrophorèse à l'acrylamide. Ce dernier prend plus de temps à compléter et est considérablement plus laborieux. En utilisant cette méthode, la séparation électrophorétique sur des gels d'agarose à 2% p / v (formats de gel de 8 cm) peut être réalisée en moins de 90 min. C'est un outil pratique pour l'analyse des interactions protéine-ARNt et permet l'analyse simultanée de multiples échantillons. Des variantes d'ARNt et / ou de protéines mutantes peuvent être criblées pour la liaison et la stabilité en utilisant cette méthode.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
MCV est membre du programme Intramural CIB «Molecular Machines for Better Life» (MACBET). La recherche menant à ces résultats a été financée par l'Institut espagnol de santé Carlos III (PI12 / 01667 à MCV), le Ministère espagnol de l'Économie et de la Compétitivité (CTQ2015-66206-C2-2-R et SAF2015-72961-EXP à MCV ), Le gouvernement régional de Madrid (S2010 / BD-2316 à MCV) et le projet ComplexINC (contrat n ° 279039 à MCV) de la Commission européenne (programme-cadre 7 (7e PC)). Les bailleurs de fonds n'ont eu aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
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- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
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