Summary
模擬微小重力状態での培養細胞には行列を使用して組織を生成するための非常に有望な技術を構築します。卵胞の成長と卵成熟卵胞生存、形態、成長、そして模擬微小重力条件下で卵母細胞機能の面で回転式培養システムを使用する調べたと思う。
Abstract
14 日齢マウス卵巣組織と同じ高齢者マウスから分離した前胞状卵胞模擬微小重力培養システム培養しました。私たちは定量的包生存、測定された卵胞、卵母細胞径の評価し、システムから生成された卵母細胞の微細構造を調べた。減少した卵胞の生存を見ました、増殖の表現の細胞の核抗原と増殖分化因子 9、顆粒膜細胞と卵母細胞の開発のための指標として, と卵母細胞の微細構造模擬微小重力条件下での異常。模擬微小重力実験装置は、卵母細胞/卵胞の体外発育に関与するメカニズムの調査のためのモデルを提供するために最適化する必要があります。
Introduction
卵巣の卵胞発育の in vitroと卵成熟は、ペトリ皿とアルギン酸ゲルで1 などの 3 次元 (3 D) マトリックスの表面に 2次元の文化の伝統的な方法を使って実現しています、2,3。3次元培養システムは効果的に卵胞組織のような構造を維持し4包生体内と類似の遺伝子発現プロファイルを保持し、meiotically 主務卵5,6を生産します。無料の行列状態で 3次元培養システムを確立もできます、たとえば、ハンギング ドロップ懸濁液および圧延の船。国立航空宇宙局 (NASA) で開発された回転壁容器 (RWV) は、容器7内で培養された細胞の模擬微小重力 (s μg) を生成します。この模擬微小重力条件は対流の沈降の不足のための細胞の増殖と分化独特の文化システムを提供します。その模擬微小重力推進内皮細胞8,9, 甲状腺細胞10、および脂肪由来の軟骨から組立甲状腺組織から血管内皮血管の形成が示されています。RWV デバイス11の幹細胞。しかし、他の研究の模擬微小重力が胃の細胞にアポトーシスを誘導し、B リンパ芽球12,13,14の影響を示唆しているシミュレート細胞傷害の微小重力を示しています。携帯型の依存ファイルがあります。模擬微小重力邪魔スピンドル組織で報告された、超微細構造レベルでの変更原因も、15卵母細胞の細胞質のブレブを誘発しました。さらに調査が必要な最適化された模擬微小重力環境とシステムの下で組織工学や細胞傷害を誘発するメカニズム。RWV デバイスを使用して卵巣卵胞・卵子の体外実験では、卵母細胞の遺伝子発現と卵母細胞の細胞小器官の微細構造に関する貴重な情報を提供できます。卵巣組織の前胞状卵胞、前胞状卵胞の分離を含む模擬微小重力の影響を検討するために本研究では包開発と卵母細胞の成熟にします。
本研究では、卵巣組織の前胞状卵胞、前胞状卵胞の分離を含む卵胞の開発と卵母細胞の成熟に模擬微小重力の影響を調査するため使用されました。RWV、私たちの研究では、模擬微小重力デバイス、5% CO2インキュベーター内部水平軸の周りを回転は、効率的な酸素と非常に低いせん断応力と模擬微小重力状態を提供しています。顆粒膜細胞と卵母細胞の開発のための指標としてそれぞれ増殖細胞核抗原 (PCNA) の成長の微分の要因 9 遺伝子発現 (GDF-9) を行った。PCNA と GDF 9 式がそれぞれ、この顆粒膜細胞と卵母細胞、抑制され RWV デバイスで培養した場合、s μ下培養卵胞の卵母細胞の微絨毛透明帯からの撤退を示したことを示しましたg GDF 9 欠損マウス卵胞16のそれに類似した条件。
Protocol
この研究のための倫理的な承認は、動物研究倫理委員会の文周医学部から得られました。
1. 文化メディアとアルギン酸ヒドロゲルの準備
- 卵巣組織と 10% 牛胎児血清、100 IU/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと L-15 媒体を用いた包取扱い媒体を準備します。2 週間 4 ° C で保存します。
- 卵巣組織とアルファ最小必須培 [α-MEM] 5% ウシ胎児血清 [FB] から成る卵胞培養培地準備 1% インシュリン-セレン-トランスフェリン、10 の美羽/ml rFSH、100 IU/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 μ g/mL。2 週間 4 ° C で保存します。
- 滅菌 PBS で 0.8% (w/v) アルギン酸ナトリウム溶液を用いたアルギン酸ヒドロゲルを準備し、アルギン酸ビーズを作成するためのカプセル化ソリューション (140 mM NaCl 50 mM CaCl2) にこの溶液 10 μ L をドロップします。
注: アルギン酸ビーズのサイズは、直径約 3 mm だった。
2. マウス卵胞分離とカプセル化
- はさみや鉗子を使用して無菌削除卵巣子宮頸の転位で 14 日齢の icr 系雌マウスを処分、2 mL の処理中に卵巣を置きます。
- 卵巣をメスを使用して半分にカットします。半分の大きさの卵巣組織は培養培地における文化の厚さ約 1 mm だった
- 手動で 2-4 X 顕微鏡下 26 1/2 ゲージ針を使用して卵巣から卵胞を分離し、培養培地における文化の選択した卵胞を収集します。
注: 卵胞選択基準: 1) 卵胞は中高 2 卵母細胞を取り巻く顆粒膜細胞の 2-3 層の卵母細胞のラウンドでした) 卵胞があったいくつかの卵胞膜細胞付けそのまま基底膜と 3) 卵胞のサイズは 90-100 μ m - 手順 1.3 あたりアルギン酸ビーズを作成します。アルギン酸溶液で毛包を洗浄し、すべてのビーズに顕微鏡の下で単一卵胞が含まれているようにそれぞれのアルギン酸ビーズの真ん中に単一卵胞をピペットします。培地、文化、アルギン酸で培地 35 × 150 μ L にビーズを洗浄した後 10 mm 皿または RWV デバイスの文化.
3. 卵巣組織または模擬微小重力下で卵胞文化
- 模擬微小重力の生成に RWV デバイスを使用します。光パラフィン オイル (~ 10 mL) 容器を埋める、油に液滴の 150 μ L の培地を配置し、中の液滴に卵巣組織の 1 つの部分またはカプセル化された包 3 つアルギン酸ビーズを転送します。船ポート キャップを閉じ、デバイスの回転のベースの上に容器を修正します。
- コントロールのグループ毛包を含むアルギン酸ビーズを配置または 10 mm 培養皿 35 × 光パラフィン油で覆われた液滴の培地の 150 μ L に卵巣の組織。
- 培養皿と 5% CO2空気中を 37 ° C で加湿のインキュベーターで RWV デバイスの両方を孵化させなさい。
- RWV デバイスで培養液を変更する: 150 × 20 mm 培養皿にオイルと容器から媒体を注ぐ、卵巣の組織およびアルギン酸塩ビーズを培養液中で培養皿に転送します。ステップ 3.1 あたり容器文化システムを再確立します。
4. カプセル化解除と卵胞検索
- 培養 4 日後 150 × 20 mm 培養皿にオイルと容器から媒体を注ぐ。処理培 37 ° C で 30 分間 10 U/mL アルギン酸リアーゼの孵化によってアルギン酸ビーズとアルギン酸ビーズからカプセル化解除包を拾う
- 包を収集し、顕微鏡の下で媒体の処理でそれらを洗浄します。
5. 卵巣組織と卵胞評価
- セル実行可能性の試金
- D-PBS のカプセル化解除される卵胞を 3 回洗浄し、結合されたセル実行可能性の試金の試薬の 150 μ L の間孵化させなさいそれら (2 μ M カルセイン AM と 4 μ M EthD 1) 45 分間室温で。
- 10 きれいな顕微鏡スライドに卵胞を転送 μ L、D PBS、coverslip でカバーし、明確な指の爪マニキュアで封印します。
- カウント グリーンと赤細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡 (400 倍) でのスライドで。
注: この実行可能性の試金で緑の細胞は生きているセルと赤の細胞は死んだ細胞です。未満 10% 赤血球 (死者) の卵胞は、生き残った卵胞としてと見なされます。
- ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 卵胞や卵巣組織の染色
- 新鮮な 14 日齢マウス卵巣と 0 日サンプルとして Bouin のソリューションで 14 日齢マウスから分離した前胞状卵胞を修正します。実験サンプルとして 2 日間または 4 日間のいずれかのカルチャ、およびアルギン酸ビーズの中の個々 の卵胞後 4 日間培養後の培養の卵巣組織を修復します。
- パラフィン セクション 5 μ m の厚みで連続的にすべてのサンプルを埋め込むし、H で汚れ & 製造元の指示に従って E。
- 卵胞を数えると直径の測定
- H に染まった卵巣切片で & E、すべての卵胞と顕微鏡 (倍率 400 X) 組織断面積内健康の前胞状卵胞を数えます。卵胞の総数によって前胞状卵胞の数を割ることによって卵胞の密度を計算します。
注: 健康の前胞状卵胞顆粒膜細胞の少なくとも 2 つの層で、です。 - 包 0 日目と 4 日目のメジャー卵胞と卵母細胞径は培養卵胞です。
- H に染まった卵巣切片で & E、すべての卵胞と顕微鏡 (倍率 400 X) 組織断面積内健康の前胞状卵胞を数えます。卵胞の総数によって前胞状卵胞の数を割ることによって卵胞の密度を計算します。
- 免疫組織化学
- 4% のパラホルムアルデヒドの卵巣組織を修正、パラフィン、5 μ m 厚のセクションに埋め込むし、スライドの台紙はティッシュ セクション。Dewax セクション、水分補給と 15 分ブロック用クエン酸バッファーのそれらの 3% 過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼを孵化させなさい、5% ヤギ血清内の抗原の正体を暴露し、3 時間室温で一次抗体とインキュベートします。
- 3 分間、PBS で洗浄し、希釈 1: 500 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) のスライド-共役ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 室温で 1 時間。
注: 一次抗体の研究に使用されたウサギ抗 GDF 9 抗体 (1: 500 希釈) とウサギ抗 PCNA 抗体 (希釈 1: 200)。
- 3 分間、PBS で洗浄し、希釈 1: 500 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) のスライド-共役ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 室温で 1 時間。
- メディアを水性マウントをスライド ガラスに 3, 3'-ジアミノベンジジン パーオキシダーゼ活性とマウントを検出する [軽打] 卵巣セクション スライドを孵化させなさい。
- 400 倍の倍率での顕微鏡下で卵巣のセクションのスライドを確認します。
- 4% のパラホルムアルデヒドの卵巣組織を修正、パラフィン、5 μ m 厚のセクションに埋め込むし、スライドの台紙はティッシュ セクション。Dewax セクション、水分補給と 15 分ブロック用クエン酸バッファーのそれらの 3% 過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼを孵化させなさい、5% ヤギ血清内の抗原の正体を暴露し、3 時間室温で一次抗体とインキュベートします。
- 透過型電子顕微鏡 [TEM]
- 室温で 3 h の 2.5% グルタルアルデヒドで卵胞を修正し、37 ° C で 1 時間 1% オスミウム四酸化で修正後
6. 統計解析
- 平均 ± SEM 形式ですべてのデータを表示します。一方向の分散分析 (ANOVA) によるグループ間の違いは続いてテューキーの多重比較検定を決定します。テスト結果の有意性 α しきい値設定されたp < 0.05。
Representative Results
図 1 aは、容器内の油と、RWV を示しています。卵巣組織のワンピースまたはカプセル化された包 3 つアルギン酸ビーズを含む 150 μ L 中の液滴は、油に入れていた。中の液滴は、液滴の中の模擬微小重力 (s μg) 状態を生成、毎分 25 回転の速度で回転の油の流体抗力のための終末速度の状態で保たれました。コントロール実験では、卵巣組織またはカプセル化の包は 35 × 10 mm で鉱物油で覆われている 150 μ L 中の液滴で培養した生成 1 - 料理 (図 1 b)gコンディション。
前胞状卵胞開発生体外模擬微小重力の影響を研究する我々 は培養 14 日齢マウス卵巣組織下 1-g (コントロール実験) または s μ g 条件。我々 は H で健常な卵胞の数を数えられる & E 文化 (図 2) の 0、2、および 4 日後の 2 つの条件のセクションを染色します。S μg条件で扱われる卵巣組織の包生存が有意に低下 1 - 分かったg 2 日目と 4 日目の培養条件 (p < 0.05、ANOVA)。さらに、我々 はないの PCNA の肯定的な信号は s μg条件 (図 3) の下で卵巣組織で検出されたが分かった。アルギン酸ビーズ カプセル分離前胞状卵胞の文化、私たちは明らかに、かなりより多くの卵胞は生き残った下 1 -g条件 (76.8% ± 5.3%、n = 227) s μg条件より (54.4% ± 6.7%、n = 249) 培養 4 日目.さらに、卵母細胞のサイズの培養 4 日後有意な増加もあった卵胞サイズが大幅に増加 (図 4) の両方の重力の条件の下で。しかし、濾胞の未満 10% 死んだ顆粒膜細胞 (図 5) に比べ明らかに低かった [1 -g条件 (81.5 ± 5%、n = 10) より s μg条件下 (90 ± 8%、n = 10) (p < 0.05)。
模擬微小重力の卵母細胞機能に及ぼす影響を調べるためには、GDF 9、卵母細胞特異的マーカーの発現を検討しました。GDF 9 式の μg条件 (図 6) の下で卵巣組織で著しくダウン規制というデモンストレーションを行った。さらに、s μg条件 (図 7) 文化の 4 日目でカプセル化された卵胞の卵母細胞の細胞小器官の頻繁な微細構造異常を示しました。
図 1: セットアップの s -μg と 1g 文化条件。(A) s μg回転壁容器移動オイル内で一定の自由落下の状態で文化教育科目を保つことによって作成されました。(B) 1 -g条件が卵巣の組織や鉱物油で覆われてペトリ皿の表面に卵胞を培養によって作成されました。矢印の中の液滴。スケール バー = 1 cm。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: S μ g の効果卵巣の組織文化。卵巣組織の (A) セクション培養下で 1-0、2、および 4 日間の条件をgまたは s μg 。スケールバー = 50 μ m。 (B) 卵胞卵巣切片の密度。エラー バーの表す 1 SEM *: p < 0.05。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: PCNA の免疫組織化学。卵胞の顆粒膜細胞の PCNA 発現を調べた培養下で 1-0、2、および 4 日間の条件をgまたは s μg 。スケールバー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: アルギン酸ビーズにカプセル化された前胞状卵胞の文化に及ぼすの μg .(A) 形態の前胞状卵胞培養下で 1-0 日、4 日の条件をgまたは s μg 。スケールバー = 50 卵径 μ m。 (B) と (C) 卵胞径が 1 g と s μg条件と比較しました。エラー バーの表す 1 SEM *: p < 0.05。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:セル実行可能性の試金。代表的な画像は、400 倍の倍率での顕微鏡の下で撮影されました。アッセイ使用カルセイン AM 生きているセルを視覚化するが緑で染色し、死んだ細胞の核を視覚化する EthD 1 の赤で染まっています。(A): ~ 100% ライブ顆粒膜細胞 (緑) と卵胞。(B): 以上 10% 死んだ細胞 (赤) と同様、(緑)、生きている顆粒膜細胞と卵胞。スケールバー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: GDF 9 の免疫組織化学。GDF 9 蛋白質の表現を調べた卵胞の卵母細胞の培養下で 1-0、2、および 4 日間の条件をgまたは s μg 。スケールバー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 分離前胞状卵胞の微細構造の解析が培養下 1 -gまたは s μg文化の 4 日目条件。(A) 微絨毛 (矢印) を透明帯に拡張する卵 (1 -g条件)。(B F)大きな空胞 (*) 多重体と卵母細胞 (#)、脂質 (矢印)、胞ミトコンドリア クリステ (矢印) に欠けているとゴルジ装置 (矢印) をそれぞれ分散 (s μg条件)。O: 卵;ZP: 透明帯。この図は、張らから変更されています。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
前胞状卵胞培養に成功のための重要なステップは、: 1) 正しくプロトコル本文 2.1 で説明された選択基準によると前胞状卵胞の選択);2) 懐疑的な状態のすべてのプロシージャを予備成形し、無菌培養;・ 3) RWV 文化システムを正しく設定します。
複製の実験の実験観測の整合性の保護、類似または同一の材料を使用します。マウス前胞状卵胞の選択基準では、卵胞が 1 を持っていたことを明らかにした) に囲まれて、薄いオスミウム酸; 卵核胞崩壊 (GVBD) 段階で健康な卵子2) 2-3 層の顆粒層細胞、基底膜で囲まれました。・ 3) いくつかの莢膜細胞は基底膜に接続されています。したがって、選択卵胞があっただけではなくすべて卵胞卵子の成長だけでなく、90 〜 100 μ m の直径の同じような形態学的同定を支援するための 3 つの機能的な区画。
これは、3 D 疑似微小重力下培養の方法でマウス前胞状卵胞を成長させる最初の試みです。マウス前胞状卵胞のいくつかの培養システムを開発されています。ペトリ皿、いわゆる二次元文化の平らな面に培養卵胞から卵子は受精することができるし、ライブ子孫を生産します。さらに、アルギン酸ビーズ内卵胞の文化など、3 D の文化は組織構造を体が割合が高い meiotically 主務卵母細胞で生成するよう維持します。しかし、ゼロ重力場卵巣卵胞・卵子の開発プロセスは知られているではありません。RWV、組織工学の相当な関心を集めているデバイスことができます模擬微小重力環境を生成し、卵巣の卵胞・卵子発育に及ぼす模擬微小重力の影響を調査するための理想的な環境を提供生体外で。
細胞培養のために正しく RWV 装置を設定することが重要です。容器内の空気の泡を削除する必要があります。空気の泡を削除するメソッド、容器内に生成される場合は次のように: 各注射器 2 ポートで油 0.5 ml 注射器 2 本を配置。注射器ポートを制御するバルブを開きます。注射器ポートの下に空気の泡を操縦します。他の注射器ポートを介したメディアの約同じ量を注入しながら、注射器に泡を引き出します。すべてのバブルを削除した後、バルブを閉じます、注射器を削除し、シリンジ ポート キャップを置き換えます。また、一定回転でセトリングから細胞を防ぐ正しい回転を見つけるために重要です。回転速度の最適化、セル、流体の密度と粘度の比重によって決まります。
GDF 9 欠損マウス卵胞16のそれらに類似していた、PCNA と GDF-9 の発現プロファイルでは、その模擬微小重力した顆粒膜細胞と卵母細胞の開発に有害な影響を明らかにしました。効率的な酸素とは可能性が高い非常に低のせん断応力を提供する背部の膜の間で酸素と炭酸ガスの透過を可能にする 5% CO2インキュベーター内部水平軸造ります RWV デバイスの容器、包/卵母細胞傷害の原因。有害な影響のメカニズムを調査する実験のセットアップ、さらに分析の最適化が必要です。
RWV 培養系から派生した生体外で卵子の発達の可能性を調査するためにさらなる研究が必要です。MII 期に卵母細胞の体外成熟が行われている現在。この文化システムの最終的な検証は、取得した卵子の受精能力によって検討されます。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、博士嵩トウ彼の批判的にこの原稿を読んで組織サンプルの準備で彼女の援助のチャン チャンと動物を維持するために、援助の岩林趙儀隴王に感謝したいです。この作品は、浙江省の自然科学財団によって支えられた (許可番号: LY13C120002)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
| L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
| Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
| Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
| Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
| Alginate | Sigma | W201502 | |
| alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
| Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
| Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
| Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
| 26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
| 35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
| Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
| 3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
| Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
| Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
| Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
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