Summary
Uma técnica altamente promissora para gerar tecido constrói sem usar matriz é a células de cultura em uma condição de microgravidade simulado. Usando um sistema rotativo de cultura, nós examinamos o crescimento do folículo ovariano e a maturação do oócito em termos de função oócito sob a condição de microgravidade simulado, morfologia, crescimento e sobrevivência do folículo.
Abstract
14 tecido ovariano de rato do dia anterior e folículo pré-antral isolado de ratos da mesma idade foram incubado em um sistema de cultura de microgravidade simulado. Nós quantitativamente avaliada a sobrevivência do folículo, medido do folículo e oócito diâmetros e examinou a ultra-estrutura dos oócitos produzidos a partir do sistema. Observou-se folículo diminuição da sobrevivência, downregulation de expressões de proliferação celular antígeno nuclear e fator de diferenciação de crescimento 9, como indicadores para o desenvolvimento de células da granulosa e ovócitos, respectivamente e o oócito ultraestrutural anormalidades sob a condição de microgravidade simulado. A instalação experimental de microgravidade simulado precisa ser otimizado para fornecer um modelo para investigação dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do oócito/folículo em vitro .
Introduction
Em vitro desenvolvimento do folículo ovariano e a maturação do oócito foram atingidos utilizando métodos tradicionais de cultura 2-dimensional, como na superfície de placas de Petri e três de matriz dimensional (3D), tais como alginato e hidrogel1 ,2,3. Um sistema de cultura 3D efetivamente mantida folículos em uma estrutura de tecido e manteve os perfis de expressão de gene semelhante como na vivo4 folículos e produzido ovócitos competente meiotically5,6. Sistemas de cultura 3D também podem ser estabelecidos em um estado livre de matriz, por exemplo, suspensão drop suspensão e rolamento de navios. O navio de parede rotativo (RWV) desenvolvido pela National Aeronautics and Space Administration (NASA) gera uma simulado microgravidade (s-µg) para as células cultivadas dentro o navio7. Este simulado microgravidade condição fornece um sistema de cultura única para a proliferação e diferenciação celular por causa da falta de sedimentação por convecção. Tem sido demonstrado que microgravidade simulada promovido formação de vasos endotelial das células endoteliais8,9, montagem de células de tireoide10e condrogênese do adiposo-derivado de tecido da tireoide células-tronco mesenquimais em RWV dispositivos11. No entanto, outros estudos têm mostrado que simulado microgravidade induzida apoptose em células gástricas e simulado de B linfoblastos12,13,14, sugerindo que os efeitos da microgravidade na lesão celular pode ser a célula tipo-dependente. Microgravidade simulada também pode causar alterações a nível ultraestrutural, conforme relatado na organização do eixo perturbado e induzida blebbing citoplasmática em oócitos15. As condições de microgravidade simulado otimizado e mecanismos que induzem lesões celulares ou engenharia de tecido sob o sistema necessitam de mais investigação. Experimentos in vitro de folículos ovarianos/oócitos usando dispositivos RWV a crescer podem fornecer informações valiosas sobre expressões de gene do oócito e ultrastructures de organelas do oócito. Neste estudo, tecido ovariano contendo folículos pré-antral e folículo pré-antral isolado foi usado para investigar os efeitos da microgravidade simuladona maturação do folículo de desenvolvimento e o oócito.
Neste estudo, tecido ovariano contendo folículos pré-antral e folículo pré-antral isolado foram usados para investigar os efeitos da microgravidade simulado na maturação de desenvolvimento e do oócito do folículo. Em nosso estudo, o RWV, um dispositivo de microgravidade simulado, gira em torno de um eixo horizontal dentro de um 5% CO2 incubadora, proporcionando uma condição de microgravidade simulado com oxigenação eficiente e muito baixa tensão de cisalhamento. Analisamos as expressões do gene do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e fator de diferenciação de crescimento 9 (GDF-9) como indicadores para o desenvolvimento de células da granulosa e ovócitos, respectivamente. Demonstrámos que expressões PCNA e GDF-9 foram suprimidos nas células da granulosa e ovócitos, respectivamente, quando cultivadas no dispositivo RWV, e nós mostramos a retirada de microvilli oócito da zona pelúcida nos folículos cultivados sob o s-µ g condição, que foi semelhante da GDF-9-deficiente do mouse folículos16.
Protocol
Aprovação ética para este estudo foi obtida o Animal pesquisa ética Comissão de Wen Zhou faculdade de medicina.
1. preparação de meios de cultura e hidrogel de alginato
- Prepare o tecido ovariano e manipulação de folículo médio usando o meio de L-15 com 10% de soro fetal bovino, penicilina 100 UI/mL e 100 µ g/mL Estreptomicina. Armazenar a 4 ° C durante duas semanas.
- Preparar o tecido ovariano e folículo de meio de cultura consiste em meio essencial mínimo-alfa [α-MEM] suplementado com 5% de soro fetal bovino [FBS], 1% insulina-selênio-transferrina, 10 mUI/ml rFSH, 100 UI/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL. Armazenar a 4 ° C durante duas semanas.
- Preparar o hidrogel de alginato usando solução de alginato de sódio 0,8% (p/v) em PBS estéril e, em seguida, cair a solução de encapsulamento (140 mM NaCl 50 mM CaCl2) para criar contas de alginato 10 µ l desta solução.
Nota: O tamanho do grânulo do alginato foi cerca de 3 mm de diâmetro.
2. mouse folículo isolamento e encapsulamento
- 14 ratos fêmeas ICR de dia de idade de reforma por deslocamento cervical, remover os ovários assepticamente, usando uma tesoura e pinça e colocar os ovários em 2 mL de meio de manipulação.
- Corte os ovários ao meio com um bisturi. O tecido ovariano meia-sized foi cerca de 1 mm de espessura para cultura em meio de cultura.
- Manualmente isolar os folículos de ovários usando agulhas de calibre 26 1/2-no sob um estereomicroscópio de X 2-4 e coletar os folículos selecionados para cultura em meio de cultura.
Nota: Critérios de seleção folículo: 1) folículos foram redondos com oócitos no meio e 2-3 camadas de células da granulosa circundantes oócitos, 2) folículos tinham uma membrana basal intacta anexada com algumas células theca, sendo tamanho 3) folículo 90-100 µm de diâmetro - Crie contas de alginato por passo 1.3. Lave os folículos com solução de alginato e depois Pipetar um único folículo no meio de cada grânulo de alginato para certificar-se que cada grânulo contém um único folículo sob um estereomicroscópio. Após enxaguar em meio de cultura, cultura do alginato grânulos em 150 µ l de meio de cultura em um 35 × 10 mm cultura prato ou um dispositivo RWV.
3. tecido ou folículo cultura sob microgravidade simulada
- Use um dispositivo RWV para gerar simulado de microgravidade. Encha o recipiente com óleo parafínico leve (~ 10 mL), coloque 150 µ l de meio de cultura em uma gota do óleo e, em seguida, transferir um pedaço de tecido ovariano ou três pérolas de alginato com folículos encapsulados para o médio droplet. Feche a tampa do bujão de navio e consertar o navio para a base rotativa do dispositivo.
- No controle de grupos, coloque pérolas de alginato contendo folículos ou tecido ovariano em 150 µ l de meio de cultura em um droplet coberto com óleo de parafina luz em 35 × 10 pratos de cultura mm.
- Incube os pratos de cultura e o dispositivo RWV numa incubadora umidificado a 37 ° C com 5% de CO2 no ar.
- Para mudar o meio de cultura em dispositivo RWV: Despeje o óleo e a meio do navio em uma 150 × 20 mm cultura prato, transferir os grânulos de tecido ou alginato ovarianos para um prato de cultura com meio de cultura. Re-estabelecer o sistema de cultura de navio por passo 3.1.
4. o desencapsulamento e recuperação do folículo
- Após 4 dias de cultivo, despeje o óleo e o médio do navio em uma 150 × 20 mm cultura prato. Buscar pérolas de alginato e folículos decapsulate de missanga o alginato incubando na manipulação suplementado com liase de alginato 10 U/mL durante 30 min a 37 ° C.
- Recolher os folículos e depois lavá-los no tratamento médio sob um estereomicroscópio.
5. tecido e avaliação do folículo
- Ensaio da viabilidade celular
- Lave os folículos decapsulated três vezes no D-PBS e incube-os então em 150 µ l dos reagentes ensaio da viabilidade celular combinados (2 µM calceína AM e 4 µM EthD-1) à temperatura de 45 min.
- Transferência de folículos para uma lâmina de microscópio limpa com 10 µ l D-PBS, cobrir com uma lamela e depois selar com unhas claras.
- Contagem de verde e eritrócitos em slides sob um microscópio de fluorescência confocal (400 X).
Nota: Neste ensaio de viabilidade, células verdes são células vivas, e glóbulos vermelhos são células mortas. Folículos com menos de 10% eritrócitos (mortos) são considerados como folículos sobreviventes.
- Hematoxilina e eosina (H & E) coloração de tecido ovariano e folículo
- Corrigi ovários frescos do rato de 14 dias de idade e folículo pré-antral isolado de ratos de 14 dias de idade em solução de Bouin como amostras do dia 0. Corrigi o tecido ovariano cultivado após 2 dias ou 4 dias de cultura e folículos individuais dentro os grânulos de alginato após 4 dias cultura como amostras experimentais.
- Incorporar todas as amostras em parafina, seção serialmente em 5 µm de espessura e em seguida mancha com H & E de acordo com as instruções do fabricante.
- Folículo contagem e medição de diâmetro
- No ovário cortes histologicos corados com H & E, contar todos os folículos e folículos pré-antral saudáveis dentro da área de secção de tecido sob um microscópio (ampliação 400x). Calcule a densidade do folículo, dividindo o número de folículos pré-antral pelo número total de folículos.
Nota: o folículo pré-antral saudável é aqueles com pelo menos duas camadas de células da granulosa. - Medida do folículo e oócito diâmetro dos folículos dia 0 e 4 dia culto folículos.
- No ovário cortes histologicos corados com H & E, contar todos os folículos e folículos pré-antral saudáveis dentro da área de secção de tecido sob um microscópio (ampliação 400x). Calcule a densidade do folículo, dividindo o número de folículos pré-antral pelo número total de folículos.
- Imuno-histoquímica
- Corrigir o tecido ovariano em paraformaldeído 4%, incorporar em parafina, seção de 5 µm de espessura e montar cortes histologicos em slides. Dewax as seções, hidratar e incube-os em tampão de citrato de 15 min. bloco a peroxidase endógena em 3% de peróxido de hidrogênio, desmascarar o antígeno no soro de cabra de 5% e então incubar com anticorpos primários em temperatura ambiente por 3 h.
- Lavagem em PBS por 3 min, em seguida, a incubar com 1: 500 diluído com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados de cabra anti-IgG de coelho (H + L) por 1h à temperatura ambiente.
Nota: Os anticorpos primários utilizados no estudo foram anticorpo de coelho anti-GDF-9 (diluição 1: 500) e anticorpos de coelho anti-PCNA (diluição de 1: 200).
- Lavagem em PBS por 3 min, em seguida, a incubar com 1: 500 diluído com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados de cabra anti-IgG de coelho (H + L) por 1h à temperatura ambiente.
- Incube no ovário seção com 3, 3'-Diaminobenzidine [DAB] para detectar a atividade de peroxidase e montagem em lâminas de vidro com meio de montagem aquoso.
- Observe os slides de ovário seção num microscópio ampliação de 400 X.
- Corrigir o tecido ovariano em paraformaldeído 4%, incorporar em parafina, seção de 5 µm de espessura e montar cortes histologicos em slides. Dewax as seções, hidratar e incube-os em tampão de citrato de 15 min. bloco a peroxidase endógena em 3% de peróxido de hidrogênio, desmascarar o antígeno no soro de cabra de 5% e então incubar com anticorpos primários em temperatura ambiente por 3 h.
- Microscopia eletrônica de transmissão [TEM]
- Corrigir os folículos em glutaraldeído 2,5% para 3h em temperatura ambiente e, em seguida, fixar em tetróxido de ósmio 1% durante 1 h a 37 ° C.
6. análise estatística
- Apresente todos os dados no formato de média ± SEM. Determine que as diferenças entre os grupos por uma forma de análise de variância (ANOVA) seguiram de Tukey, teste de comparação múltipla. O limiar α para o significado do resultado de teste foi fixado em p < 0,05.
Representative Results
A figura 1A mostra um RWV com óleo no interior da embarcação. Uma gotícula de 150 meio de µ l contendo um pedaço de tecido ovariano ou três pérolas de alginato com folículos encapsulados era colocar o óleo. As gotículas médias foi mantida em um estado de velocidade terminal devido a atrito líquido sobre as gotas dentro do óleo rotativo à taxa de 25 rotações por minuto, o que gerou uma condição de microgravidade simulado (s-µg). Em um experimento de controle, tecido ovariano ou folículos capsulados foram cultivados em uma gota de 150 µ l médio, coberto com óleo mineral em 35mm × 10 pratos (figura 1B), que gerou um 1 - condição deg .
Para estudar os efeitos da microgravidade simulado no folículo pré-antral desenvolvimento em vitro, nós cultivadas tecido ovariano 14 dias de idade rato abaixo dos 1 -g (experimento controle) ou s-µ g condições. Nós contamos o número de folículos saudáveis no H & E manchado seções em duas condições após 0, 2 e 4 dias de cultura (Figura 2). Descobrimos que a sobrevivência do folículo no ovário tecido tratado na condição s-µg foi significativamente menor do que sob o 1 -g condição no dia 2 e dia 4 de cultivo (p < 0.05, ANOVA). Além disso, descobrimos que não PCNA positivo sinais foram detectados no tecido ovariano sob a condição deg µ-s (Figura 3). Na cultura dos isolados folículo pré-antral encapsulados em esferas de alginato, nos revelou que significativamente mais folículos sobreviveram abaixo dos 1 - condiçãog (± 76,8% 5.3%, n = 227) do que a condição de s-µg (54,4% ± 6,7%, n = 249) no dia 4 de cultivo . Além disso, oócito tamanho não tinha nenhum aumento significativo após 4 dias de cultivo, porém o folículo tamanho aumentado significativamente em ambas as condições de gravidade (Figura 4). No entanto, folículos com menos de 10% de células granulosa morto (Figura 5) foram significativamente mais baixos sob a 1 -g condição (81,5 ± 5%, n = 10) do que sob a condição de s-µg (90 ± 8%, n = 10) (p < 0,05).
Para investigar os efeitos da microgravidade simulado na funcionalidade do oócito, examinamos a expressão do GDF-9 marcador específicos do oócito. Temos demonstrado que a expressão do GDF-9 foi notavelmente para baixo-regulado no tecido ovariano sob condição de s-µg (Figura 6). Além disso, temos demonstrado frequentes anormalidades ultra-estruturais de organelas oócito nos folículos encapsulados no dia 4 de cultura, sob a condição deg µ-s (Figura 7).
Figura 1 : Instalação de s -µg e 1-g cultura condições. (A) s-µg foi criado pelo vaso parede de giro e mantendo os temas da cultura em um estado de constante queda livre dentro do óleo em movimento. (B) A 1 -g condição foi criada pelo cultivo de tecido ovariano ou folículos na superfície de uma placa de Petri coberta com óleo mineral. A seta indica uma gota do meio. Barra de escala = 1 cm. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Efeitos de s-µ g na cultura de tecido ovariana. (A) seções de tecido ovariano cultivadas sob 1 -g ou s-µg condições para 0, 2 e 4 dias. Barra de escala = 50 µm. (B) folículo densidade nas seções de tecido ovariano. Erro da barra representa 1 SEM, *: p < 0,05. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imuno-histoquímica de PCNA. Expressão de proteínas PCNA examinou-se nas células da granulosa no tecido ovariano cultivadas sob 1 -g ou s-µg condições para 0, 2 e 4 dias. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Efeitos de s-µg sobre a cultura do folículo pré-antral encapsulado em esferas de alginato. (A) morfologia do folículo pré-antral cultivadas sob 1 -g ou s-µg condições para 0 e 4 dias. Barra de escala = 50 µm. (B) diâmetro do oócito e diâmetro do folículo (C) foram comparados entre 1 g e s-µg condições. Erro da barra representa 1 SEM, *: p < 0,05. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Ensaio da viabilidade celular. Imagens representativas foram tiradas sob um microscópio na ampliação de X 400. O ensaio utiliza calceína AM Visualizar células vivas manchadas de verde e EthD-1 para visualizar os núcleos das células mortas manchado de vermelho. (A): um folículo com células da granulosa ao vivo ~ 100% (verde). (B): um folículo com as células da granulosa ao vivo (verde), bem como mais de 10% de células mortas (vermelho). Barra de escala = 50 µm.Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Imuno-histoquímica do GDF-9. Expressão da proteína do GDF-9 foi examinado nos oócitos no tecido ovariano cultivadas sob 1 -g ou s-µg condições para 0, 2 e 4 dias. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Análise ultraestrutural de isolados folículo pré-antral cultivadas sob 1 - g ou s-µ g as condições no dia 4 de cultura. (A), um oócito com microvilli (setas), estendendo-se para a zona pelúcida (1 -g condição). (B-F) Oócitos com grandes vacúolos (*), corpos multilamellar (#), gotículas lipídicas (setas), mitocôndrias vacuolated falta cristas (seta) e dispersão de Golgi (seta), respectivamente (condição de s-µg ). O: oócito; ZP: zona pelúcida. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Os passos críticos para cultivo bem-sucedido do folículo pré-antral são: 1) corretamente, selecionando o folículo pré-antral de acordo com os critérios de seleção que foram descritos no protocolo texto 2.1); 2) todos os procedimentos em uma condição de cético para plástico e manter uma cultura estéril; e 3) configurar corretamente o sistema de cultura RWV.
A salvaguarda da coerência de observações experimentais nas experiências de replicar é usar materiais similares ou idênticos. Os critérios para a seleção do folículo pré-antral rato revelaram que os folículos tem 1) saudáveis oócitos na fase de esgotamento (GVBD) vesícula germinal, rodeado por uma zona pelúcida fina; 2) 2-3 camadas de células da granulosa, delimitadas por uma membrana basal; e 3) algumas células thecal anexado à membrana basal. Assim, os folículos selecionados tinham não só todos os três compartimentos funcionais de um folículo ovariano para apoiar o crescimento do ovócito, mas também de uma identificação morfológica semelhante com um diâmetro de 90-100 µm.
Esta é a primeira tentativa de crescer folículo pré-antral de rato da forma de cultivo sob microgravidade a simulado em 3D. Diversos sistemas de cultura foram desenvolvidos para o folículo pré-antral rato. Oócitos obtidos a partir do folículo cultivado sobre uma superfície plana de placas de Petri, a so-called cultura 2D, podem ser fecundados e produziram a prole ao vivo. Além disso, culturas 3D, tais como culturas de folículos em esferas de alginato, mantenham uma estrutura de tecido semelhante ao que o corpo produz em alta porcentagem de oócitos meiotically competente. No entanto, o processo de desenvolvimento de folículos ovarianos/oócitos em um campo de gravidade zero é desconhecido. RWV, um dispositivo que está atraindo atenção substancial em engenharia de tecidos, pode gerar um ambiente de microgravidade simulado e proporcionar um ambiente ideal para investigar os efeitos da microgravidade simulado sobre o crescimento do folículo ovariano/oócitos em vitro.
É importante configurar o aparelho RWV corretamente para cultura de células. As bolhas de ar no recipiente devem ser removidas. O método para remover as bolhas de ar, se gerado no vaso, é o seguinte: Coloque duas seringas com 0,5 mL de óleo em cada uma das portas duas seringas. Abra as válvulas para controlar as portas a seringa. Manobra de bolhas de ar por baixo da porta seringa. Puxe as bolhas na seringa injetando aproximadamente o mesmo volume de mídia através da outra porta seringa. Após todas as bolhas são removidas, fechar as válvulas, retire as seringas e substitua as tampas de porta seringa. Também é fundamental para descobrir a velocidade de rotação correta, o que impede que as células fixando-se através de uma rotação constante. Otimização da velocidade de rotação é determinada pelo peso específico de células, a densidade do fluido e a viscosidade.
Os perfis de expressão do PCNA e GDF-9, que eram similares do GDF-9-deficiente do mouse folículos16, revelaram a microgravidade simulada teve efeitos negativos para o desenvolvimento de células da granulosa e oócitos. O navio do dispositivo RWV girou em torno de um eixo horizontal dentro de uma incubadora 5% CO2 , permitindo a penetração de oxigênio e dióxido de carbono através de uma membrana nas costas, proporcionando oxigenação eficiente e muito baixa tensão de cisalhamento, o que era pouco provável que seja o causa da lesão do folículo/oócito. Otimização da configuração experimental e análises mais adicionais são necessários para investigar o mecanismo dos efeitos prejudiciais.
Mais estudos são necessários para investigar o potencial do desenvolvimento de oócitos em vitro derivado do sistema de cultura RWV. Maturação in vitro de oócitos para estágio MII está atualmente sendo realizada. A validação final deste sistema de cultura será examinada pela capacidade de fertilização dos oócitos recuperados.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Yilong Wang e o Yanlin Zhao por sua assistência na manutenção dos animais, o Chan Zhang pela sua assistência na preparação das amostras histológicas e o Dr. Songtao He para ler criticamente este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação da ciência Natural da província de Zhejiang (número de concessão: LY13C120002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
| L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
| Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
| Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
| Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
| Alginate | Sigma | W201502 | |
| alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
| Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
| Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
| Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
| 26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
| 35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
| Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
| 3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
| Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
| Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
| Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
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