Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Cardiac Spier-Cell Based Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - DEEL 1

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55642
Automatic Translation
*1, *2, 1, *2, *1
1Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame
* These authors contributed equally

Summary

In deze tweedelige studie werd een biologische actuator ontwikkeld met behulp van zeer flexibele polydimethylsiloxaan (PDMS) cantilevers en levende spiercellen (cardiomyocyten) en gekenmerkt. De biologische actuator werd geïntegreerd met een basis gemaakt van gemodificeerde PDMS materialen om een ​​zelfstabiliserende, zwemmende biorobot te bouwen.

Abstract

Biologische machines, vaak aangeduid als biorobots, zijn levende cellen of weefsels gebaseerde apparaten die alleen worden aangedreven door de contractiele activiteit van levende componenten. Vanwege hun inherente voordelen, biorobots krijgen interesse als alternatieven voor traditionele volledig kunstmatige robots. Verschillende studies hebben gericht op het gebruik van de kracht van biologische actuatoren, maar recentelijk hebben studies de kwantitatieve kenmerken van biorobots gekenmerkt en hun geometrie bestudeerd om de functionaliteit en efficiëntie te verbeteren. Hier demonstreert u de ontwikkeling van een zelfstabiliserende zwem biorobot die zijn toonhoogte, diepte en rol kan behouden zonder externe interventie. Het ontwerp en fabricage van de PDMS-steiger voor de biologische actuator en biorobot gevolgd door de functionalisatie met fibronectine wordt beschreven in dit eerste deel. In het tweede deel van dit tweedelig artikel geven we de opneming van cardiomyocyten op en karakteriseren we de biologische actuatorAtor en biorobot functie. Beiden zijn voorzien van een basis en staart (cantilever) die op een gefineerde voortstuwing produceert. De staart is gebouwd met zachte lithografie technieken met behulp van PDMS en lasergravure. Na het inbouwen van de staart met de apparaatbasis, wordt het gefunctionaliseerd met een cel kleef eiwit en gecombineerd met cardiomyocyten gecoördineerd. De basis van de biologische actuator bestaat uit een stevig PDMS blok met een centrale glazen kraal (werkt als een gewicht). De basis van de biorobot bestaat uit twee samengestelde PDMS materialen, Ni-PDMS en microballoon-PDMS (MB-PDMS). Het nikkelpoeder (in Ni-PDMS) zorgt voor magnetische controle van de biorobot tijdens het zaaien en stabiliseren van cellen tijdens de beweging. Microballoons (in MB-PDMS) verminderen de dichtheid van MB-PDMS, en laten de biorobot dadelijk zweven en zwemmen. Het gebruik van deze twee materialen met verschillende massadichtheden zorgde voor een nauwkeurige controle over de gewichtsverdeling om een ​​positieve herstelkracht bij elke hoek van de biorobot te waarborgen. Deze techniekProduceert een magnetisch gestuurde zelfstabiliserende zwem biorobot.

Introduction

Biologische actuatoren en biorobots worden actief onderzocht om een ​​alternatief te bieden voor conventionele robotica voor talrijke toepassingen. Biorobots die 5 , 6 , 7 , 8 lopen , zwemmen 1 , 2 , 3 , 4 , pomp 9 , 10 of greep 11 , 12 , 13 Zijn al ontwikkeld. Op dezelfde manier kunnen spiercellen worden opgenomen in een 3D-gerold PDMS structuur 14 . Vaak worden de biorobot backbones vervaardigd met zachte lithografie technieken met materialen zoals hydrogelen en PDMS (polydimethylsiloxaan). Dit zijn aantrekkelijke keuzes vanwege hun flexibiliteit, biocompatibIlity, en gemakkelijk afstelbare stijfheid. Levende spiercellen worden gewoonlijk in deze materialen ingebouwd om krachtgeneratie door middel van contractie te leveren. Mammale hartspiercellen (cardiomyocyten) en skeletspiercellen zijn dominant gebruikt voor activering. Naast deze twee zijn insectespierweefsels gebruikt om biorobots bij kamertemperatuur 3 te bedienen. In deze tweedelige studie werden cardiomyocyten gekozen door hun spontane samentrekking 6 .

Veel eerder onderzoek naar biorobots was gericht op de ontwikkeling van de biologische actuatoren, terwijl de optimalisatie van de biorobot-architectuur en de ontwikkeling van essentiële functionaliteiten voor de biorobots grotendeels verwaarloosd waren. Onlangs hebben enkele rapporten de implementatie van verschillende zwemmodi aangetoond die geïnspireerd zijn op voortstuwingsmodi die in de natuur voorkomen. Deze methoden omvatten PDMS films en spiercellen om verschillende natuurlijke voortstuwingsmethoden te nabootsen. Bijvoorbeeld zijn flagella-gebaseerde voortstuwing 1 , biomimetische jellyfish propulsion 2 , biohybrid ray 4 en dunne PDMS-zwemmende apparaten 13 gemeld.

In dit document presenteren we het fabricageproces van zelfstabiliserende zwem biorobots die de onderdompeldheid evenals pitch en roll kunnen behouden. De biorobot heeft een solide basis of lichaam, die wordt aangedreven door een enkele cantilever met cardiomyocyten die aan zijn oppervlak zijn bevestigd. De cardiomyocyten veroorzaken dat de cantilever in een longitudinale richting buigt wanneer zij contracten. Deze vorm van zwemmen is geclassificeerd als ostraciiform zwemmen. Het vermogen om extra functionaliteiten op de basis toe te voegen is een uniek voordeel van ostraciiform zwemmen. Bijvoorbeeld kan de basis gebruikt worden om overmatige drijfvermogen te verschaffen om aanvullende ladingen of controlecircuits te dragen voor cardiomyocyt samentrekking.

StabiliteitVan de biorobot werd vaak over het hoofd gezien in eerdere studies van biorobots. In deze studie hebben we zelfstabilisatie geïmplementeerd door de basis te ontwerpen met verschillende samengestelde PDMS materialen met verschillende massadichtheden. De biorobot vertoont dus weerstand tegen externe storingen en handhaaft zijn onderdompeldiepte, toonhoogte en rol, zonder hulp. De eerste laag is microballoon PDMS (MB-PDMS), dat wil zeggen PDMS gemengd met microballonnen, wat de dichtheid van de biorobot verlaagt, waardoor het in de media kan drijven. De tweede laag is de PDMS cantilever, en de dikte ervan is zodanig aangepast dat kracht die door de cardiomyocyten wordt gegenereerd, de cantilever drastisch kan buigen van 45 ° tot 90 °. De onderste laag is nikkel-PDMS (Ni-PDMS), dat wil zeggen PDMS gemengd met nikkelpoeder. Deze laag voert meerdere functies uit. Het is magnetisch, waardoor de biorobot onderaan het medium verankerd kan worden tijdens het zaaien met een magneet. Het nikkelmengsel heeft een hogere dichtheid dan de MB-PDMS enMedium, en zorg ervoor dat de biorobot rechtop staat terwijl u drijft. Het gewicht van deze laag genereert op elke baan en rol een herstelkoppel op de biorobot. Ook houdt de volumeverhouding tussen de Ni-PDMS en de MB-PDMS de submersiediepte vast. De gepresenteerde protocollen zouden zeer nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het karakteriseren van de klopcellen van spiercellen en weefsels, evenals degenen die biorobotten willen bouwen.

Het zaaien van de gefunctionaliseerde biologische actuator en biorobotinrichtingen, de mechanische en biochemische karakterisering van de cellen en de kwantitatieve analyse van de apparaatfunctie worden in detail beschreven in deel 2 van dit twee-delig artikel, evenals in het recente werk 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereken massa van PDMS en additieven

  1. Gebruik de volgende vergelijking om de massa PDMS te vinden die nodig zijn voor specifieke hoogten in de volgende procedures,
    M = ρ * V = ρ * Hoogte * Oppervlakte (1),
    Waar 'Hoogte' de laag van de laag is, 'Gebied' is het gebied van een container waar de PDMS wordt genezen. 'Ρ' is de dichtheid van het mengsel en 'V' is het volume.
    OPMERKING: Digtigheden voor hoogteberekeningen zijn PDMS = 0,965 g / ml, Ni-PDMS = 1,639 g / ml, MB-PDMS = 0.648 g / ml.
  2. Gebruik vergelijking (1) om de benodigde massa PDMS te schatten, voor een bepaalde container, een specifieke hoogte (5 mm) voor de basis van de biologische actuator te verkrijgen. De resulterende dichtheid van PDMS is 0,965 g / ml.
    OPMERKING: De verhouding is 10: 1 basis aan hardingsmiddel volgens gewicht.
    M basis = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )(2)
    M- hardenmiddel = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )
  3. Gebruik vergelijking (1) om de massa van Ni-PDMS te vinden die nodig is voor een bepaalde container om een ​​specifieke hoogte (1,5 mm) van de bodembasis van de biorobot te verkrijgen.
    OPMERKING: De verhoudingen zijn 1: 1,88 (Nikkelpoeder tot PDMS volgens gewicht) en 1: 1,71: 0,171 (Nikkelpoeder naar PDMS Base naar PDMS-hardenmiddel). De resulterende dichtheid van Ni-PDMS zal 1.639 g / ml zijn.
    M Nikkel = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking ) (3)
    M basis = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )
    M- hardenmiddel = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )
  4. Vergelijk ook vergelijking (1) met f In de massa van MB-PDMS die nodig zijn, voor een bepaalde container, een specifieke hoogte (3,5 mm) van de bovenste basis van de biorobot verkrijgen.
    OPMERKING: De verhoudingen zijn 1: 5 (microballonnen tot PDMS per gewicht) en 1: 4,54: 0,444 (microballonnen naar PDMS basis naar PDMS-hardenmiddel op gewicht). De resulterende dichtheid van MB-PDMS zal 0.648 g / ml zijn.
    M Microballoon = ρ * V = ρ * V * (M Vergelijking ) (4)
    M basis = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )
    M- hardenmiddel = ρ * V = ρ * V * ( Vergelijking )
  5. Controleer de dynamische stabiliteit van de biorobot met de gewenste dimensie en geometrie met behulp van de analysescripts; Zie de aanvullende informatie, 'Biorobot_dynamic_stability.m' en 'CG_CB_calculation.m'.
_title "> 2. Fabricage van biologische actuatoren op een stationaire basis

OPMERKING: zie figuur 1a.

  1. Spin-coat een dunne film van PDMS (zie Figuur 1a-1 en a2). De dikte van de resulterende PDMS film zal 25 μm zijn.
    1. Plaats een siliconenwafel op een fotoresistspinner en draai de pompschakelaar aan om zuig te maken.
      OPMERKING : De siliconenwafel heeft een diameter van 4 inch en een dikte van 500 μm.
    2. Giet positieve fotoresist ( bv. S1808) op de siliconenwafel totdat de wafel volledig bedekt is. Programmeer de spinner om gedurende 20 s bij 2000 rpm te draaien. Zet vervolgens de spinner door op het voetpedaal te drukken. Zet de zuigkraan na het draaien uit.
    3. Verhit een kookplaat tot 120 ° C. Gebruik waferpincetten om de siliconenwafel uit de spinner op te halen en plaats de siliconenwafel direct op de kookplaat. Bedek de wafel met een ondiep petrischaaltje en bak voor 10 minuten.
      OPMERKING : een oven kan worden gebruikt om baKe de wafer met dezelfde temperatuur en duur. Figuur 1a-1 laat dit proces zien.
    4. Plaats een plastic container op een weegschaal en doe het nul uit. Giet 6 g PDMS base in de houder en voeg 0,6 g PDMS-verhardingsmiddel toe. Meng de PDMS grondig gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Na het mengen moet het mengsel met bellen samenvloeien.
    5. Plaats de container van gemengde PDMS in een vacuümkamer. Verminder de druk van de vacuümkamer tot 100 mbar en laat de container 30 minuten in de kamer staan. Breek het vacuüm en verwijder de container. Houd de houder bedekt tot gebruik.
    6. Plaats de siliconenwafel met de gebakken fotoresistlaag op de spinner. Giet het gehele afgegasde PDMS-mengsel langzaam op de wafel.
      OPMERKING: Giet langzaam, zodat er geen nieuwe bellen in het mengsel worden ingevoerd.
    7. Stel de spinner in op 1 200 rpm gedurende 5 minuten. Zet de spinnerzuig aan en sluit de spinner aan. Zet de zuigkraan na het draaien uit.
      OPMERKING: TDeze instellingen resulteren in een 25 μm dikke laag PDMS.
    8. Verhit een oven tot 40 ° C. Gebruik wafelpincetten om de siliconenwafel uit de spinner op te halen en plaats deze vervolgens in de oven. Bak de wafel 's nachts bak en doe de wafel af bij de kamertemperatuur.
      OPMERKING: Figuur 1a-2 laat dit proces zien.
  2. Lasergravure van de dunne-film PDMS-laag.
    1. Zet de schakelaar van de lasergraver en zijn uitlaat aan. Zet de computer aan die op de lasergraver is aangesloten. Open de lasergraver software.
    2. Onder de optie "Bestand", open het biologisch actuator ontwerpbestand dat is weergegeven in Figuur 2e.
      1. Druk op de knop 'Instellingen'. Klik op "Blauw" en verander de vermogensinstelling naar 3% en snelheid tot 4%. Klik op "Set". Klik op "Black" en verander de "Mode" om over te slaan. Klik dan op "Set". Doe hetzelfde voor "Red". Druk op de knop 'Toepassen' om af te rondende instellingen."
      2. Druk de knop "Activate the Engraver" rechts bovenaan.
    3. Druk op de knop 'Verplaatsen' om het ontwerp in het midden van het scherm van de software te verplaatsen.
    4. Druk op de knop "Focus View" in het programma en klik op de rand van de biorobot op het scherm. Hierdoor wordt de geleiderlaser van de lasergraver naar het overeenkomstige punt verplaatst.
    5. Verplaats de wafer handmatig met een pincet, zodat het punt op de wafel die overeenkomt met het punt dat in 2.2.4 is geklikt, direct onder de leidende laserpunt staat.
    6. Druk op de knop "Begrafenis beginnen met de vorige job" om het graveren proces te starten. Verwijder de wafer nadat de gravure is afgerond. Zet alle apparatuur uit.
      OPMERKING: De grote groene driehoek is de knop "Begrafenis van de vorige taak". Kijk niet direct bij het graveren proces, omdat de laser de ogen kan beschadigen. Figuur 1a-3 laat dit proces zien.
    7. Voorbereiding en fabricage van de biologische actuatorbasis.
      1. Giet glaskralen (3 mm diameter) in een 15 ml buis. Dompel de kralen met 70% ethanol in DI water gedurende 24 uur. Verwijder de ethanol en vul de buis met DI water gedurende 24 uur. Giet het DI water uit en plaats de buis op een kookplaat bij 50 ° C om het drogen van de glazen kralen te vergemakkelijken.
      2. Voeg 3 g toe aan de hoeveelheid PDMS die in vergelijking (1) wordt gevonden, om rekening te houden met de PDMS die tijdens de gieten aan de kuipjes zullen vallen. Gebruik vergelijking (2) om PDMS basis en verhardingshoeveelheden te vinden.
      3. Plaats een plastic container op een weegschaal en doe het nul uit. Giet de hoeveelheid PDMS-basis die in stap 2.3.2 is gevonden in de houder en vul het uit. Giet dan de hoeveelheid PDMS-verhardingsmiddel die in stap 2.3.2 is gevonden in de houder.
      4. Meng de PDMS grondig gedurende 5 minuten.
        OPMERKING: PDMS wordt gebruikt in een verhouding van 10: 1 basis aan verhardingsmiddel. Het mengsel zou veel bubbels moeten hebben.
      5. PlaatsEen container die gebruikt moet worden voor het bakken op een schaal en nul uit. Giet de juiste hoeveelheid PDMS uit die in stap 2.3.2 (en gemengd in stap 2.3.4) zorgvuldig in de container gieten. Droog gereinigde glazen kralen regelmatig door het PDMS-mengsel. Laat minimaal 5 mm ruimte rond elke kraal voor de biologische actuatorbasis.
      6. Plaats de container in een vacuümkamer. Verminder de vacuümdruk tot 100 mbar en zet de vacuümpomp uit. Na 30 minuten breek het vacuüm af en verwijder de container. Blijf bedekt tot gebruik.
        OPMERKING: De druk in de kamer kan langzaam langzaam stijgen aangezien het mengsel ontgassen en de vacuümkamer lekt. Als de druk aanzienlijk groter is dan 100 mbar, zet u de vacuümpomp in om de druk op 100 mbar te herstellen.
      7. Verhit een kookplaat tot 40 ° C. Plaats de container van PDMS en de glazen kralen voorzichtig op de kookplaat. Bedek de container en bak overnacht.
    8. Biologische actuator assemblage. OPMERKING: De volgende procedure kan met het blote oog worden uitgevoerd.
      1. Knip kubussen (5 mm x 5 mm x 5 mm) uit het bulk PDMS gemaakt in onderdeel 2.3 met een scheermesje.
        OPMERKING: Één kraal moet in het midden van elke kubus zijn.
      2. Reinig alle kanten van elke biologische actuatorbasis om eventuele vervuilingen op de basisoppervlakken te verwijderen, door de basis in de band te drukken en te verwijderen. Herhaal voor elke kant.
      3. Herhaal stappen 2.3.2 tot 2.3.6 om een ​​kleine hoeveelheid vloeibare PDMS te maken. Doop de punt van een naald in de vloeibare PDMS. Plaats een druppel van het vloeibare PDMS op het gegraveerde basisgebied van de wafer die in stap 2.2 is getekend. Smoor de druppel PDMS zodat het het 5 mm x 5 mm basisgebied volledig bedekt.
        OPMERKING: Het basisgebied is het midden vierkant gedeelte in figuur 2a .
      4. Gebruik een pincet om de gereinigde kubus van stap 2.4.2 op het basisgebied te plaatsen dat bedekt is met vloeibare PDMS.
      5. Herhaal stap 2.4.3 van "Plaats een druppel vloeibare PDMS" naar de eNd en stap 2.4.4 voor elk apparaat dat wordt gemaakt.
      6. Verhit een kookplaat tot 40 ° C. Plaats de siliconenwafel voorzichtig met de montages op de kookplaat. Bedek de wafel en bak overnacht.
        OPMERKING : Bewaar de montages tot aan het gebruik. Figuur 1a-4 toont het eindapparaat.

    3. Fabricage van Biorobots (Figuur 1b)

    1. Spincoating en lasergravering van een dunne PDMS-film
      1. Herhaal alle stappen in 2.1 en 2.2 met behulp van een nieuwe siliconenwafel. Dit resulteert in een siliconenwafel met een dunne film van PDMS en een dunne film van de fotoresist, die is gegraveerd met een biorobotontwerp.
        OPMERKING : Gebruik tijdens het herhalen van stap 2.2 het biorobotontwerp voor lasergravering in plaats van het eerder gebruikte biologische actuatorontwerp. Figuren 1b-1 en b-3 tonen deze processen aan.
    2. Voorbereiding en fabricage van PDMS composites.
      OPMERKING : De volgende procedure kan met het blote oog worden uitgevoerd.
      1. Vul fenolische microballonnen in een 50 ml buis tot volle. Vul de buis met 70% ethanol in DI-water en laat het 24 uur zitten. Giet de ethanol uit, voeg DI water toe en laat het 24 uur zitten. Giet het DI water uit en plaats de buis op een kookplaat bij 50 ° C om het drogen van de microballonnen voor gebruik te vergemakkelijken.
      2. Gebruik vergelijking (1) met de MB-PDMS dichtheid en 3,5 mm hoogte om het gewenste volume van PDMS te vinden. Voeg 3 g toe aan het totale bedrag, om rekening te houden met het materiaal dat na het gieten in de container blijft. Gebruik vergelijking (3) om de PDMS-basis en het verhardingsmiddel te bepalen. Meet de juiste hoeveelheid PDMS base, hardenmiddel en microballonnen met behulp van de schaal.
      3. Gebruik vergelijking (1) met Ni-PDMS dichtheid en 1,5 mm hoogte om het gewenste volume PDMS te vinden. Voeg 3 g toe aan het totale bedrag zoals in stap 3.2.2. Gebruik vergelijking (2) om de PDMS-basis te vinden en een a te genezenGent hoeveelheden. Meet de geschikte hoeveelheid PDMS base, uithardingsmiddel en nikkelpoeder met behulp van de schaal.
      4. Meng elk mengsel van MB-PDMS en Ni-PDMS gedurende 5 minuten. Giet de juiste hoeveelheid MB-PDMS en Ni-PDMS, berekend in 3.2.2 en 3.2.3, zorgvuldig in aparte containers met behulp van een schaal.
        OPMERKING : De mengsels moeten grondig gemengd worden met een metalen of glasstaaf zonder het onderoppervlak van de mengbak te krabben. Het mengsel zal samenvloeien met bellen.
      5. Plaats beide containers in een vacuümkamer. Verminder de druk tot 100 mbar gedurende 30 minuten. Breek het vacuüm en verwijder de containers. Blijf bedekt tot gebruik.
      6. Verhit een kookplaat tot 40 ° C. Plaats containers met MB-PDMS en Ni-PDMS op de hete plaat. Bedek elke container en bak overnacht.
        OPMERKING : Bewaar met een deksel tot gebruik.
    3. Biorobot montage.
      1. Cut biorobot bases van afmetingen respectievelijk op elke biorobot grootte van Ni-PDMS en MB-PDMS met een scheermesje. Zie figuur 2b-2d voor basisontwerpen.
        OPMERKING: De dikte van Ni-PDMS is 1,5 mm en dat van MB-PDMS is 3,5 mm.
      2. Reinig alle kanten van de biorobotbasis om eventuele verontreinigingen op de oppervlakken te verwijderen, door de basis in de tape te drukken en te verwijderen. Herhaal voor elke kant.
      3. Schakel een corona ontlader in. Breng de punt van de corona-ontlader 1 cm boven de Ni-PDMS-basis, die op een metalen plaat is geplaatst met een cleanroomweefsel tussenin. Verplaats de tip rond de basis en ga 15 s voor 15 minuten om het oppervlak te behandelen.
        OPMERKING: Er moet een ontlading optreden tussen de corona-ontlader en de wafer. Als dat niet het geval is, breng de tip dichterbij tot er een ontlading optreedt.
      4. Herhaal stap 3.3.3 om de oppervlakte van de basis van een biorobot te behandelen die in dezelfde stap in dezelfde stap is gegraveerd. Gebruik een pincet om de Ni-PDMS-behandelde zijde op de behandelde zijde van de film te plaatsen. Laat het apparaat gedurende 5 minuten zitten.
        OPMERKING : dit zal stronGly de twee delen aan elkaar. Zie figuur 1b4 .
      5. Gebruik scherpe pincet om de biorobot cantilever van de wafel af te plakken en op de bodem van de Ni-PDMS basis te plaatsen. Gebruik een pincet om het gehele montage van de wafel te verwijderen.
        OPMERKING : De cantilever wordt bevestigd aan de Ni-PDMS basis. Figuur 1b-5 en b-6 tonen dit.
      6. Plaats een kleine druppel ongecurveerde PDMS (10: 1 basis op het verhardingsmiddel) op de bovenkant van de MB-PDMS basis. Gebruik een pincet om de zijde van de Ni-PDMS te plaatsen met de dunne film PDMS op de MB-PDMS met de onbekende PDMS. Plaats de montage in een plastic petrienschotel en plaats deze dan op een kookplaat bij 40 ° C om de nacht te genezen.
        OPMERKING: Figuur 1b-7 geeft het definitieve apparaat weer.

    4. Functionalisering van de apparaten

    OPMERKING : Hieronder beschrijven wij het proces van het voorbereiden van de toestellen voor celzaadwerk.

    1. PrepZijn de benodigde materialen: Fibronectin oplossing (50 μg / ml), Fosfaatbuffer Saline oplossing (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Fetal Bovine Serum (FBS) en 1% Penicilline antibioticum (DMEM compleet).
    2. Plaats 100 μl fibronectinoplossing in het midden van een T-25 kweekfles (bodemoppervlak wanneer de fles rechtop zit). Onderhoud afzonderlijke flessen voor elk apparaat.
    3. Plaats de biorobot of de biologische actuator naar beneden gericht over de druppel fibronectine oplossing. Zorg ervoor dat de cantilever ontvouwt en in de druppel wordt gedompeld. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Na de incubatie verwijder de fibronectine oplossing en tweemaal met PBS wassen.
    5. Verwijder de PBS en vul de fles met 10 ml DMEM. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur om ontgassen van de PDMS te vergemakkelijken. Om de biorobots in 10 ml media te onderdompelen, gebruik een magneet om het apparaat onderin de fles vast te houden. Plaats de fles met de samPluk in een ultrasonicatiebad gedurende 5 minuten om de bellen te verwijderen.
      OPMERKING : tijdens de incubatieperiode vormen luchtbellen op het PDMS-oppervlak, waarna hier de ontgassing wordt genoemd. De Ni-PDMS gebruikt in de biorobot-assemblage is magnetisch. De biologische actuator heeft geen magneet nodig omdat het op de bodem van de fles zal blijven door het gewicht van de glazen kraal. De biorobot of het biologische actuatoraggregaat is nu klaar voor het zaaien, dat in detail in detail wordt uitgelegd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De biologische actuator en biorobot hebben zeer vergelijkbare fabricageprocessen, aangezien de biorobot een natuurlijke verlenging van de biologische actuator is ( Figuur 1 ). De biologische actuator werd eerst ontwikkeld om technieken te bepalen die nodig zijn voor de biorobot, de door de cellen gegenereerde kracht te analyseren en de celmaturatie mechanisch en biochemisch te karakteriseren, die beide in detail beschreven worden in deel 2 van dit tweederde artikel als Evenals in ons recent gepubliceerde werk 15 .

De veerkonstante van de actuator werd beoordeeld en afgesteld voor een grote verandering in de krommingsradius van de cantilever tijdens volledige samentrekking van het cardiomyocyteblad. Vervolgens hebben we de biorobot ontworpen, met bijzondere aandacht voor de stabiliteit, de controle tijdens het zaaien van de cellen en het gemak van de voortbeweging. Aanvankelijk werden een paar ontwerpen gekozen, zoals getoondIn figuur 2b-2d , met verschillende eigenschappen om te beoordelen welke attributen het meest bijdragen aan de ontwerpvereisten. Biorobots werden ontworpen en getest met korte, lange en brede cantilevers, evenals met meerdere cantilevers om het effect van veranderingen in de actuator op de biorobotfunctie te testen. We hebben ook verschillende grootte van de zwevende basis beschouwd. De geometrie van de basis werd gehandhaafd als een driehoek, aangezien het de asymmetrie creëert die tot een richtingbeweging zou leiden.

De stabiliteit van de biorobot was een cruciaal onderdeel in het ontwerpproces. De bovenste MB-PDMS-laag werd gebruikt om buoyancy aan het apparaat te geven, terwijl de bodem Ni-PDMS laag werd gebruikt voor stabiliteit en magnetische controle. Door een hogere dichtheid biedt de basislaag van nikkel de biorobot het vermogen om zich rechtop te houden en terug te keren naar zijn oorspronkelijke positie na blootstelling aan externe storingen; Getoond in figuur 3

De volgende vergelijking kan de hoogte van de biorobots boven het oppervlak van het medium beschrijven:
Vergelijking
Waar H Ni , H Mb , ρ medium , ρ Mb en ρ Figuur 3b ). De hoogte van de biorobots is een kritische factor die de maximale belasting kan beïnvloeden en de stabiliteit ervan. Extra gewicht geladen op de basis zal de biorobots in de media verlagen en een groter volume van de basis wordt ondergedompeld. Het extra volume dat ondergedompeld moet worden, heeft een dichtheid lager dan die van het medium en produceert extra drijfvermogen om het toegevoegde gewicht op te tillen. Om de maximale draaglast te verhogen, moeten we h zo veel mogelijk verhogen. Niettemin zal de stabiliteit van de biorobot verminderd worden als h toeneemt. Voor maximale stabiliteit moet het basispunt van de basis zo laag mogelijk zijn. Het verhogen van h zou echter het middelpunt van de biorobot dicht of boven het medium plaatsen, waardoor de biorobot destabiliserend wordt. Daarom is gedetailleerde analyse nodigOm de stabiliteit en de maximale draagbelasting tegelijkertijd te optimaliseren voordat de basisstructuur van de biorobot wordt gewijzigd.

Om de juiste dikte van elke samengestelde laag te bepalen, werden verschillende mengverhoudingen getest met Ni-PDMS en MB-PDMS. De maximale en minimumdichtheid die gemakkelijk gemengd kon worden, was 0.648 g / cm3 voor MB-PDMS en 1,64 g / cm3 voor Ni-PDMS, zoals getoond in Figuur 3a . Alle biorobothoogtes werden zodanig ontworpen dat het herstellende moment van een biorobot bij elke kantelhoek sterk genoeg zou zijn om het terug te brengen naar de horizontale positie. Een driehoekige vorm werd gebruikt om hydrodynamische drag te verminderen. De uiteindelijke afmetingen worden weergegeven in figuur 3d . Met behulp van een computerschrift werd de stabiliteit numeriek geanalyseerd en bleek een sterk herstel moment te hebben met behulp van de tweelaagse methode, zoals getoond in figuur 3e . Zie tabel van materialen en aanvullende informatieN voor het gebruikte computerprogramma.

Figuur 1
Figuur 1: Processtroom voor de fabricage van de biologische actuator en biorobot. Elke tekening vertegenwoordigt de stappen in de materialen en methoden in protocols 2 en 3 voor biologische actuator en biorobot fabricage. PDMS cantilevers zijn vervaardigd door spin-coating en lasergravure. Dan zijn de cantilevers aan een stationaire basis bevestigd met een glazen kraal voor de biologische actuator ( a ) of op een zelfstabiliserende zwevende basis voor de biorobot ( b ). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Afmetingen vanDe Biologische Actuator en Biorobots die in deze studie zijn vervaardigd en de CAD-bestanden voor Gravure, zowel de Biologische Actuator en de verschillende soorten Biorobots. (A) Biologische actuator. B ) Dubbelarm cantilever biorobot. ( C ) Breedarm cantilever biorobot. ( D ) Biorobot met een arm. ( E ) CAD tekening van biologische actuator voor lasergravure. ( F ) CAD tekening van biorobots voor lasergravure. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Mengdichtheden voor Ni-PDMS en MB-PDMS en Stabiliteit van de Biorobots. (A) Mengverhoudingen en resulterende dichtheden. ( B ) de dichtheden en heigHts van de bases in relatie tot de media. ( C ) De rotatie en restauratie van de biorobot wanneer gekanteld. De afwijking tussen het zwaartepunt (CG) en het zwaartepunt (CB) genereert een draaiend moment. Dit moment zal de biorobot herstellen of ervoor zorgen dat het verder kantelt. ( D ) De afmetingen van de enkele arm biorobot in millimeter schaal. E ) Herstellende kracht werd gesimuleerd voor de enkelarm biorobot, getoond in deel (c) onder kantelomstandigheden in (b) met behulp van twee lagen (Ni-PDMS en MB-PDMS) versus enkele laag (MB-PDMS). De grafiek laat zien dat een enkele laag biorobot zich niet zal herstellen als het over 45 ° wordt gekanteld, terwijl de dubbellaagde biorobot altijd positieve herstelkracht zal hebben, waarbij de biorobot rechtop wordt gehouden. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verschillende locomotiemeganismes zijn te vinden onder waterzwemmers 16 . Het bewegingsmechanisme van de biorobot in deze studie maakt gebruik van fin-gebaseerde locomotie, met name ostraciale locomotie. Ostraciiform zwemmers proberen zich door een staart (cantilever) te wagen en een stijf lichaam (gelaagde basis) 16 te hebben . Vissen zoals de bokvissen en veevissen gebruiken dit soort locomotief. Ostraciiform zwemmers zijn typisch traag en hebben inefficiënte lichaamsafmetingen. Hoewel ostraciiform zwemmen geen snelheid heeft, kan deze vorm van zwemmen de ingenieurs in staat stellen verschillende functionaliteiten (zoals dynamische stabiliteit) op de basis of het lichaam te implementeren. Het biorobotontwerp dat in deze studie is ontwikkeld, is gebaseerd op een solide basis voor floatatie en stabiliteit, met een zelfbedienende cantilever als het aandrijfmechanisme. Een van de belangrijkste stappen in de fabricage van de biorobot in deze studie is het dunne film PDMS en lasergraveringsproces om de canti te vormenhefboom. Zonder een schone cantilever, het juiste mengsel van PDMS (voor elasticiteit), de juiste dikte (voor de veerkonstante) en afmetingen (met voldoende ruimte voor samenvloeiende hechting van cardiomyocyten om beweging te veroorzaken), zal de biorobot niet werken. Bovendien is het ook nodig om alle bellen van het cantilever oppervlak door middel van ultrasonicatie te verwijderen om een ​​levensvatbaar oppervlak te maken voor cardiomyocytebinding.

De ontwikkelde PDMS composietmaterialen, MB-PDMS en Ni-PDMS kunnen gebruikt worden om de submersiediepte nauwkeurig te beheersen en de dynamische stabiliteit van de biorobots succesvol te produceren. De massadichtheid van deze materialen kan fijn afgestemd worden, zoals getoond in figuur 3a . Bovendien tonen deze materialen geen negatieve effecten op de rijping en samentrekking van de cardiomyocyten zoals we hebben aangetoond in ons recente werk 15 . Daarom kunnen de ontwikkelde materialen op grote schaal worden gebruikt om een ​​zelfstabiliserende en drijvende structuur te implementerenE voor biorobots en andere toepassingen.

Hoewel het huidige protocol een zelfstabiliserende zwembiorobot kon bouwen, heeft het een paar beperkingen. Ten eerste omdat de cantilever handmatig van de wafel afgeschild wordt, kan de cantilever tijdens het proces vervormd worden en de herhaalbaarheid van de biorobotprestatie wordt beïnvloed. Dit kan worden aangepakt door gebruik te maken van een wateroplossende offerlaag in plaats van de fotoresistlaag, zodat de cantilever gemakkelijk uit de wafel kan worden verwijderd; Grotere cantilevers kunnen ook gebruikt worden voor hogere kracht. Ten tweede berust de procedure voornamelijk op handmatige bediening. De fabricageprocedure kan gestroomlijnd worden voor een hogere efficiëntie. Bijvoorbeeld kan het assemblageproces met inbegrip van de cardiomyocyt-zaadmodificatie zodanig worden aangepast dat het op een waferniveau in plaats van individueel apparaatniveau wordt uitgevoerd. Ten slotte kan de vorm van de driehoekige basis van de biorobot worden geoptimaliseerd om de richting en stabiliteit van het zwemmen te verhogen.

<P class = "jove_content"> Biorobots die de kracht van levende spiercellen gebruiken, zijn van grote belangstelling als een alternatief voor traditionele volledig kunstmatige robots. Dit protocol maakt gebruik van soft lithografie en bio-MEMS technieken om een ​​zelfstabiliserende, zwemmende biorobot te produceren. Het specifieke ontwerp kan verder verfijnd worden. De efficiëntie van de actuator kan worden verhoogd door middel van patreren uitlijning signalen voor de cardiomyocyten op het cantilever oppervlak. Dit bevordert celoriëntatie en kan de krachtgeneratie van de cariomyoctyes 17 verhogen. De afmetingen kunnen ook worden gevarieerd of meerdere cantilever armen kunnen worden bevestigd om de netto kracht verder te verhogen van gesynchroniseerde contracties. Zoals eerder beschreven, kan de meervoudige laag basis voor het aanpassen van de hoogte van de biorobot boven het mediaoppervlak. Dit bepaalt de maximale draagvermogen en stabiliteit. Verder kunnen we geleidende materialen vervangen aan de cantilever om fAciliteer elektrische stimulatie. Elektrische stimulatie kan gebruikt worden om de samentrekkingssnelheid van cellen en de snelheid van de biorobots te regelen. Wij geloven dat de gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om zeer efficiënte biorobots te ontwikkelen voor toepassingen zoals kleine pakketlevering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

MT Holley wordt ondersteund door het programma Graduate Fellows van het Louisiana Board of Regents en C. Danielson wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute Professors Programma. Deze studie wordt ondersteund door NSF Grant No: 1530884. De auteurs bedanken de steun van het cleanroom bij het Center for Advanced Microstructures and Devices (CAMD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 sil elast kit  0.5kg Sylgard 184
Nickel Powder Sigma-Aldrich 266981-100G
Phenolic microballoons US Composites BJO-0930
Silicon wafers 4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner Spin- coater
Positive photoresist (S1808) Dow Corning DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven Convection oven
Laser engraver Universal Laser System VLS2.30 Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser
Universal Laser Systems Application Universal Laser System Application for running the VLS 2.30
Matlab MathWorks Numerical analysis program
Scotch Tape Scotch Brand
Solid-glass beads Sigma-Aldrich Z265926-1EA Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale Mettler Toledo EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater Electrotechnic Products 12051A Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L Fisher Scientific 15-337-402 40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) Sigma-Aldrich D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Hyclone Laboratories 16750-074 With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum Hyclone Industries, GE 16777-240 Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt Sigma-Aldrich P3032

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
  2. Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
  3. Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
  4. Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
  5. Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
  6. Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
  7. Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
  8. Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
  9. Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
  10. Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
  11. Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
  12. Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
  13. Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
  14. Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
  15. Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
  16. Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
  17. McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).

Tags

Bioengineering cardiomyocyten biologische actuator biorobot celcontractie oppervlakspanning cantilever
Cardiac Spier-Cell Based Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - DEEL 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holley, M. T., Nagarajan, N.,… More

Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1. J. Vis. Exp. (125), e55642, doi:10.3791/55642 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter