Summary
この2部構成の研究では、非常に柔軟なポリジメチルシロキサン（PDMS）カンチレバーおよび生存筋細胞（心筋細胞）を用いて生物学的アクチュエータを開発し、特徴付けた。生物学的アクチュエータは、自己安定化したスイミングビオロボを構築するために、改変されたPDMS材料で作られた基材と組み合わされた。
Abstract
ビオロボットと呼ばれることが多い生物機械は、生きている成分の収縮活性のみによって駆動される、生きている細胞または組織ベースのデバイスである。その固有の利点のために、ビオロボは伝統的な完全人工ロボットの代替として関心を集めています。様々な研究が生物学的アクチュエータの力を利用することに焦点を当ててきたが、近年の研究では、ビオロボットの性能を定量的に特徴づけ、機能性と効率を高めるためにジオメトリを研究した。ここでは、外部からの介入なしにピッチ、深さ、ロールを維持できる自立型スイミングバイオロボットの開発を紹介します。生物学的アクチュエータおよびバイオロボットのためのPDMS足場の設計および製作に続いて、フィブロネクチンによる機能化がこの第1部に記載されている。この2部構成の記事の第2部では、心筋細胞の取り込みを詳述し、生物学的作用を特徴付けるatorとbiorobotの機能。両方とも、フィンベースの推進力を生成するベースとテール（カンチレバー）を組み込んでいます。テールは、PDMSとレーザー彫刻を使用してソフトリソグラフィ技術で構築されています。尾部をデバイス基部に組み込んだ後、それを細胞接着タンパク質で機能化し、心筋細胞とコンフルエントに播種する。生物学的アクチュエータの基部は、中央ガラスビーズ（重量として作用する）を有する固体PDMSブロックからなる。ビオロボットの基部は、2つの複合PDMS材料、Ni-PDMSおよびマイクロバルーン-PDMS（MB-PDMS）からなる。ニッケル粉末（Ni-PDMS中）は、細胞の播種中および移動中の安定性の間、バイオロボットの磁気制御を可能にする。 Microballoons（MB-PDMS）は、MB-PDMSの密度を低下させ、ビオロボットを浮動させて着実に泳ぐことを可能にする。異なる質量密度を有するこれらの2つの材料の使用は、重量分布に対する正確な制御を可能にして、ビオロボの任意の角度で確実な復元力を確保した。この技術磁気的に制御された自己安定型スイミングビオロボを生成する。
Introduction
生物学的アクチュエータおよびバイオロボットは、従来のロボットに代わるものを多くの用途に提供するために積極的に研究されている。歩く5,6,7,8、スイム1,2,3,4 、ポンプ9,10 、またはグリップ11,12,13を歩くボルボボット すでに開発されている。同様に、筋肉細胞は3D圧延PDMS構造14に組み込むことができる。しばしば、ビオロボ骨格は、ヒドロゲルおよびPDMS（ポリジメチルシロキサン）などの材料を用いたソフトリソグラフィ技術を用いて製造される。これらは、その柔軟性のために魅力的な選択肢です、biocompatib柔軟性、および容易に調整可能な剛性。生活筋肉細胞は、収縮による力発生を提供するために、通常、これらの材料と組み合わされる。哺乳動物の心筋細胞（心筋細胞）および骨格筋細胞が、主に作動のために使用されている。これらの2つの他に、昆虫の筋肉組織は、室温でビオロボットを操作するために使用されている3 。この2回の研究では、自発収縮のために心筋細胞を選択した6 。
ビオロボに関する初期の研究の多くは、生物学的アクチュエータの開発に焦点を当てていたが、ビオロボー構造の最適化とビオロボットの本質的機能の開発は、ほとんど無視されていた。最近、いくつかの報告は、自然界に見られる推進モードに触発された様々な水泳モードの実施を実証した。これらの方法は、様々な天然推進方法を模倣するためにPDMSフィルムおよび筋肉細胞を組み込む。例えば、鞭毛ベースの推進1 、生体模倣のクラゲ推進2 、バイオハイブリッド光4 、および薄膜PDMS水泳装置13が報告されている。
本論文では、浸水深さとピッチとロールを維持できる自己安定水泳用ビオロボの製造プロセスを紹介する。ビオロボットは、その表面に付着した心筋細胞を有する単一のカンチレバーによって推進される固体の基体または本体を有する。心筋細胞は、収縮するとカンチレバーを縦方向に曲げる。この水泳の形態は、奇妙な水泳に分類されます。ベースに追加の機能を追加する機能は、奇妙な水泳のユニークな利点です。例えば、基部は、心筋細胞の収縮のために追加の貨物または制御回路を運ぶために余分な浮力を提供するために利用され得る。
安定以前に行われたビオロボの研究では、しばしば見落とされていました。この研究では、異なる質量密度の複合PDMS材料を用いてベースを設計することによって自己安定化を実現しました。このように、ビオロボットは外乱に対する耐性を示し、浸水深さ、ピッチおよびロールを助けずに維持する。第1の層はマイクロバルーンPDMS（MB-PDMS）、 すなわちマイクロバルーンと混合されたPDMSであり、これはビオロボットの密度を低下させ、媒体中に浮遊することを可能にする。第2の層は、PDMSカンチレバーであり、その厚さは、心筋細胞によって生成される力がカンチレバーを45°から90°まで劇的に曲げることができるように調整される。最下層はニッケル-PDMS（Ni-PDMS）、 すなわち PDMSとニッケル粉末を混合したものである。このレイヤーは複数の機能を実行します。それは磁気であり、従って、バイオロボットは、細胞の播種中に、磁石を用いて培地の底に固定することができる。ニッケル混合物はMB-PDMSよりも高密度であり、浮遊している間にビオロボの直立姿勢を確保します。この層の重量は、任意のピッチおよびロールでバイオロボットに復元トルクを生成する。また、Ni-PDMSとMB-PDMSとの体積比は浸漬深さを維持する。提示されたプロトコールは、筋細胞および組織の鼓動力ならびに水泳用ビオロボットを構築することを望む人々の鼓動力を特徴付けることに関心を持つ研究者にとって非常に有用であろう。
機能化された生物学的アクチュエータおよびバイオロボットデバイスのシーディング、細胞の機械的および生化学的特徴付け、およびデバイス機能の定量的分析は、この2部構成の論文のパート2および最近の研究15に詳細に記載されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PDMSと添加剤の質量を計算する
- 以下の式を使用して、以下の手順で特定の高さに必要なPDMSの質量を求めます。
M =ρ* V =ρ*高さ*面積（1）、
「高さ」は層の高さ、「面積」はPDMSが硬化する容器の面積、「ρ」は混合物の密度、「V」は体積である。
注：高さ計算の密度は、PDMS = 0.965g / mL、Ni-PDMS = 1.639g / mL、MB-PDMS = 0.648g / mLである。 - 式（1）を用いて、生物学的アクチュエータの基部の特定の高さ（5mm）を得るために所与の容器に対して必要とされるPDMSの質量を推定する。得られるPDMSの密度は0.965g / mLである。
注記：比率は硬化剤対重量比で10：1です。
M base =ρ* V =ρ* V *（
）（2）
M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（
） - 式（1）を用いて、所定の容器について、ビオロボの底部の特定の高さ（1.5mm）を得るのに必要なNi-PDMSの質量を求める。
注：比は1：1.88（ニッケル粉末対PDMS重量）および1：1.71：0.171（PDMSベースからPDMS硬化剤へのニッケル粉末の質量）。得られるNi-PDMSの密度は1.639g / mLとなる。
M ニッケル =ρ* V =ρ* V *（
）（3）
M base =ρ* V =ρ* V *（
）
M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（
） - 同様に、式（1）~f特定の容器について、ビオロボの上部基部の特定の高さ（3.5mm）を得るのに必要なMB-PDMSの質量を表示する。
注：比は1：5（マイクロバルーンからPDMS重量）および1：4.54：0.454（PDMSベースからPDMS硬化剤へのマイクロバルーンから重量）です。得られるMB-PDMSの密度は0.648g / mLとなる。
M Microballoon =ρ* V =ρ* V *（
）（4）
M base =ρ* V =ρ* V *（
）
M 硬化剤 =ρ* V =ρ* V *（
） - biorobotの動的安定性を、分析スクリプトを使用して所望の寸法とジオメトリでチェックします。補足情報、「Biorobot_dynamic_stability.m」および「CG_CB_calculation.m」を参照してください。
）（2） 
） 
）（3） 
） 
） 
）（4） 
） 
） 注記：図1aを参照してください。
- PDMSの薄膜をスピンコートします（図1a-1およびa2参照）。得られるPDMSフィルムの厚さは25μmである。
- フォトレジストスピナーにシリコンウェーハを置き、ポンプスイッチをオンにして吸引します。
注：シリコンウェーハは、直径4インチ、厚さ500μmです。 - ウェハが完全に覆われるまで、ポジ型フォトレジスト（ 例えば、 S1808）をシリコンウェハ上に注ぐ。 20秒間2,000rpmで回転するようにスピナーをプログラムする。次に、フットペダルを踏んでスピナーを係止します。回転後吸引を止める。
- ホットプレートを120℃まで加熱します。ウェーハピンセットを使用してスピンナーからシリコンウェーハをピックアップし、シリコンウェーハをホットプレート上に直接配置します。ウェーハを浅いペトリ皿で覆い、10分間ベークする。
注：オーブンを使用してbaにすることができます同じ温度および時間を使用してウェハを洗浄する。 図1a-1にこのプロセスを示します。 - プラスチック容器を計量台に置き、ゼロにします。容器にPDMSベース6gを注ぎ、PDMS硬化剤0.6gを加える。 PDMSを5分間完全に混合する。
注：混合後、混合物は気泡とコンフルエントになるはずです。 - 混合したPDMSの容器を真空チャンバーに入れる。真空チャンバの圧力を100ミリバールに下げ、容器をチャンバ内に30分間放置する。真空を壊し、容器を取り除く。使用するまで容器を覆ったままにしておきます。
- ベーキングされたフォトレジスト層を有するシリコンウェハをスピナー上に置く。ゆっくりとウェーハ上に脱気したPDMS混合物を注ぎます。
注：新しい泡が混合物に導入されないようにゆっくりと注ぎます。 - スピナーを1,200rpmに5分間セットする。スピナーの吸引をオンにし、スピナーを使用します。回転後吸引を止める。
注：T厚さの設定は、PDMSの厚さ25μmの層をもたらす。 - オーブンを40℃に加熱する。ウェハーピンセットを使用してスピナーからシリコンウェーハを取り出し、オーブンに入れます。ウェハを一晩焼き、次に室温でウェハを冷却する。
注： 図1a-2にこのプロセスを示します。
- フォトレジストスピナーにシリコンウェーハを置き、ポンプスイッチをオンにして吸引します。
- 薄膜PDMS層のレーザー彫刻。
- レーザー彫刻機の電源スイッチとその排気口を入れます。レーザー彫刻機に接続されたコンピュータの電源を入れます。レーザー彫刻ソフトを開きます。
- 「ファイル」オプションの下で、図2eに示す生物学的アクチュエータ設計ファイルを開きます。
- 「設定」ボタンを押します。 「青」をクリックし、電源設定を3％に変更し、速度を4％に変更します。 「設定」をクリックします。 「黒」をクリックし、「モード」をスキップするように変更します。次に、「設定」をクリックします。 「赤」についても同じことをします。 「適用」ボタンを押して終了する設定。 "
- 右上にある「彫刻機の起動」ボタンを押します。
- 「再配置」ボタンを押すと、デザインがソフトウェアの画面の中央に移動します。
- プログラムの "Focus View"ボタンを押し、画面上のbiorobotの端をクリックします。これにより、レーザー刻印機のガイディングレーザードットが対応するポイントに移動します。
- 2.2.4でクリックしたポイントに対応するウェーハ上のポイントがガイドレーザードットの直下に来るように、ピンセットで手動でウェーハを移動します。
- "彫刻を開始する"ボタンを押して、彫刻プロセスを開始します。彫刻が完了したら、ウェーハを取り出します。すべての機器の電源を切ります。
注：「前のジョブの彫刻を開始する」ボタンは、大きな緑の三角です。レーザーが目を損傷する可能性があるため、彫刻プロセスを直接見てはいけません。 図1a-3にこのプロセスを示します。 - 生物学的アクチュエータベースの調製および製造。
- ガラスビーズ（直径3 mm）を15 mLチューブに注ぎます。ビーズを脱イオン水に70％エタノールで24時間浸します。エタノールを除去し、DI水で24時間チューブを満たしてください。 DI水を注ぎ、チューブを50℃のホットプレート上に置き、ガラスビーズの乾燥を促進します。
- 注入中に容器の側面に粘着するPDMSを説明するために、式（1）に見られるPDMSの量に3gを加える。式（2）を使用して、PDMSベースおよび硬化剤の量を求める。
- プラスチック容器を計量台に置き、ゼロにします。ステップ2.3.2で見つかったPDMSベースの量を容器に注ぎ、ゼロにします。次に、ステップ2.3.2で見つかった量のPDMS硬化剤を容器に注ぎます。
- PDMSを5分間完全に混合する。
注記：PDMSは硬化剤に対して10：1の割合で使用されます。混合物は多くの気泡を有するべきである。 - 場所スケールで焼くために使用される容器で、ゼロを出します。慎重に、ステップ2.3.2で見つけられた（そしてステップ2.3.4で混合された）PDMSの正しい量を容器に注ぎます。洗浄したガラスビーズを定期的にPDMS混合物全体に滴下する。生物学的アクチュエータベースのための各ビーズを囲むスペースは、少なくとも5mm以上離してください。
- 容器を真空チャンバー内に置く。真空圧力を100 mbarに減圧し、真空ポンプを停止します。 30分後、真空を破って容器を取り出します。使用までカバーしてください。
注：チャンバー内の圧力は、混合物が脱気され、真空チャンバーがリークすると、時間の経過と共にゆっくりと上昇することがあります。圧力が100ミリバールを大幅に上回る場合は、真空ポンプをオンにして圧力を100 mbarに戻します。 - ホットプレートを40℃に加熱する。慎重にPDMSの容器とガラスビーズをホットプレート上に置きます。容器を覆い、一晩焼く。
- 生物学的アクチュエータアセンブリ。 注：次の手順は肉眼で行うことができます。
- 剃刀を使用して、パート2.3で作成したバルクPDMSから立方体（5 mm x 5 mm x 5 mm）を切り取ってください。
注：1つのビーズが各キューブの中央にある必要があります。 - ベースをテープに押し込んで取り除くことによって、ベースプレート表面の汚染物質を除去するために、各生物学的アクチュエータベースのすべての側面を清掃してください。それぞれの面を繰り返します。
- 少量の液体PDMSを作るために2.3.2から2.3.6までの手順をやり直してください。針の先端を液体PDMSに浸す。ステップ2.2でパターン化されたウエハの彫刻されたベース領域上に液体PDMSを滴下する。 5mm×5mmのベース領域を完全に覆うように、PDMSの液滴を汚す。
注：基本領域は、 図2aの中央の正方形のセクションです。 - ピンセットを使用して、液体PDMSで覆われたベースエリアにステップ2.4.2の清掃された立方体を置きます。
- 「液体PDMSの滴を1つ置きにする」の手順2.4.3をend、および2.4.4項を参照してください。
- ホットプレートを40℃に加熱する。シリコンウェーハを注意深くホットプレート上に配置します。ウェーハを覆い、一晩焼きます。
注：使用するまでアセンブリを取り付けたままにしておきます。 図1a-4に最終デバイスを示します。
- 剃刀を使用して、パート2.3で作成したバルクPDMSから立方体（5 mm x 5 mm x 5 mm）を切り取ってください。
3.ビオロボットの作製（図1b）
- 薄いPDMSフィルムのスピンコーティングとレーザー彫刻
- 新しいシリコンウェーハを使用して、2.1および2.2のすべての手順を繰り返します。これにより、PDMSの薄膜とフォトリソグラフィーの薄膜が形成されたシリコンウェーハが得られ、ビオロボ設計で彫刻される。
注記：ステップ2.2を繰り返しながら、以前に使用した生物学的アクチュエータ設計ではなく、レーザー彫刻用のビオロボーデザインを使用します。 図1b-1およびb-3は、これらのプロセスを示す。
- 新しいシリコンウェーハを使用して、2.1および2.2のすべての手順を繰り返します。これにより、PDMSの薄膜とフォトリソグラフィーの薄膜が形成されたシリコンウェーハが得られ、ビオロボ設計で彫刻される。
- PDMSコンポの準備と製造サイト。
注：次の手順は肉眼で行うことができます。- フェノールマイクロバルーンを50 mLチューブにフルになるまで注ぎます。 DI水中の70％エタノールで管を満たし、24時間放置する。エタノールを注ぎ、脱イオン水を加え、24時間放置する。 DI水を注ぎ、チューブを50℃のホットプレート上に置き、使用前にマイクロバルーンの乾燥を容易にします。
- 必要なPDMSの量を見出すために、MB-PDMS密度と3.5mmの高さとの式（1）を使用する。注入後に容器に残る材料を考慮して、総量に3gを加えます。式（3）を使用して、PDMSベースおよび硬化剤の量を見つける。スケールを使用してPDMSベース、硬化剤、およびマイクロバルーンの適切な量を測定する。
- Ni-PDMS密度と1.5mmの高さの式（1）を使用して、必要なPDMSの量を求めます。ステップ3.2.2のように全量に3gを加える。式（2）を使用してPDMSベースを見つけ、金額。スケールを使用してPDMSベース、硬化剤、およびニッケルパウダーの適切な量を測定する。
- MB-PDMSおよびNi-PDMSの各混合物を5分間混合する。 3.2.2と3.2.3で計算された正しい量のMB-PDMSとNi-PDMSを秤を使って別々の容器に慎重に注ぎます。
注：混合物は、混合容器の底面を傷つけることなく、金属またはガラスロッドによって完全に混合されるべきである。混合物は気泡と合流する。 - 両方の容器を真空チャンバーに入れます。圧力を100 mbarに30分間低下させます。真空を解除して容器を取り除く。使用までカバーしてください。
- ホットプレートを40℃に加熱する。 MB-PDMSとNi-PDMSを入れた容器をホットプレートに置きます。各容器を覆い、一晩焼く。
注：使用するまで蓋を付けて保管してください。
- バイオロボットアセンブリ。
- Ni-Pから各ビオロボサイズに対応する寸法のビオロボベースを切断するDMSおよびMB-PDMSを使用しています。ベースデザインについては、 図2b-2dを参照してください。
注：Ni-PDMSの厚さは1.5 mmで、MB-PDMSの厚さは3.5 mmです。 - ビオロボットベースのすべての側面を清掃して、ベースにテープを押し付けて取り除くことで、表面の汚れを取り除きます。それぞれの面を繰り返します。
- コロナ放電器をオンにします。コロナ放電器の先端をクリーンルームティッシュを挟んで金属板の上に置かれたNi-PDMSベースの上に1cmほど持ちます。先端をベースの周りに動かし、表面を処理するために15秒間続ける。
注：コロナ放電器とウェハの間で放電が発生するはずです。そうでない場合は、放電が発生するまでチップを近づけてください。 - ステップ3.3.3を繰り返して、ステップ3.1で彫刻したビオロボの底面を同じ時間処理する。ピンセットを使用してNi-PDMS処理面をフィルムの処理面に置く。装置を5分間放置させる。
注：これはストロン2つの部分を結合する。 図1b4を参照してください。 - シャープなピンセットを使用して、biorobotカンチレバーをウェーハから剥がし、Ni-PDMSベースの底に置きます。ピンセットを使用して、アセンブリ全体をウェーハから取り外します。
注記：カンチレバーはNi-PDMSベースに取り付けられます。 図1b-5および図 b-6はこれを示しています。 - MB-PDMSベースの上部に、硬化していないPDMS（硬化剤に10：1の塩基）を少し滴下します。ピンセットを使用して、未硬化PDMSを有するMB-PDMS上の薄膜PDMSを有するNi-PDMSの側面を配置する。アセンブリをプラスチックのペトリ皿に置き、40℃のホットプレート上に置き、一晩硬化させます。
注： 図1b-7に最終デバイスを示します。
- Ni-Pから各ビオロボサイズに対応する寸法のビオロボベースを切断するDMSおよびMB-PDMSを使用しています。ベースデザインについては、 図2b-2dを参照してください。
4.デバイスの機能化
注：以下では、細胞播種のための装置を調製するプロセスを説明する。
- 準備フィブロネクチン溶液（50μg/ mL）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％ペニシリン抗生物質（DMEM完全）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）が必要である。
- フィブロネクチン溶液100μLをT-25培養フラスコ（フラスコが直立しているときの底面）の中央に置く。各装置のために別々のフラスコを維持する。
- バイオロボットまたは生物学的アクチュエータをフィブロネクチン溶液の液滴の上に下に置く。カンチレバーが展開され、液滴に浸されていることを確認します。 37℃で30分間インキュベートする。
- インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を除去し、PBSで2回洗浄する。
- PBSを除去し、10mLのDMEMをフラスコに充填する。 37℃で1時間インキュベートし、PDMSの脱気を促進する。ビオロボットを10 mLの培地に浸すには、磁石を使用して装置をフラスコの底に保持します。フラスコをサムに置きます超音波処理浴に5分間吹き込み、気泡を除去する。
注：インキュベーション期間中、気泡がPDMS表面に形成されます。これはここでは脱気と呼ばれます。ビオロボアセンブリに使用されるNi-PDMSは磁性である。生物学的アクチュエータは、ガラスビーズの重量のためにフラスコの底に残るため、磁石を必要としない。バイオロボットまたは生物学的アクチュエータアセンブリは、ここでパート2で詳細に説明するシーディングの準備が整いました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
生物学的アクチュエータおよびバイオロボットは、バイオロボットが生物学的アクチュエータの自然な延長部であるので、非常に類似した製造プロセスを有する（ 図1 ）。生物学的アクチュエータは、最初に、バイオロボットに必要な技術を確立し、細胞によって生成された力を分析し、細胞熟成を機械的および生化学的に特徴づけるために開発された。私たちの最近の出版物15でもそうです。
アクチュエータのばね定数を評価し、心筋細胞シートが完全に収縮している間のカンチレバーの曲率半径の大きな変化について調整した。次に、ビオロボットを設計し、その安定性、細胞播種中の制御、および移動の容易性に特に配慮した。当初、いくつかのデザインが選択されました図2b-2dでは、どの属性が設計要件に最も寄与しているかを評価するために、異なる特性を用いている。ビオロボットは、短い、長い、および広いカンチレバーならびに複数のカンチレバーを用いて、バイオロボット機能に対するアクチュエータの変化の影響を試験するために設計および試験された。我々はまた、異なるサイズの浮遊ベースを考慮した。ベースの幾何学的形状は、方向性の動きをもたらす非対称性を作り出すので、三角形として維持された。
ビオロボットの安定性は設計プロセスの重要な要素でした。トップMB-PDMS層は装置に浮力を提供するために使用され、下部Ni-PDMS層は安定性および磁気制御のために使用された。より高い密度のために、ニッケル製のベース層は、バイオロボットに、それを直立に保ち、外乱に曝された後も元の位置に戻る能力を提供する。 図3に示す
次の式は、媒体表面上のビオロボの高さを表すことができる。 
ここで、 H Ni 、 H Mb 、 ρ 媒体 、 ρMb 、およびρ
各複合層の適切な厚さを決定するために、Ni-PDMSおよびMB-PDMSを用いて様々な混合比を試験した。 図3aに示すように、容易に混合できる最大および最小密度は、MB-PDMSについては0.648g / cm 3であり 、Ni-PDMSについては1.64g / cm 3であった。全てのビオロボの高さは、任意の傾斜角度でのビオロボの復元モーメントが水平位置に戻すのに十分なほど強くなるように設計されている。流体力学的抗力を減少させるために三角形が用いられた。最終寸法は図3dに示されている。コンピュータスクリプトを使用して、 図3eに示すように、安定性が数値解析され、2層法を用いて強い復元モーメントを有することが証明された。資料および補足情報の表を参照n使用されているコンピュータプログラムの場合。
図1：生物学的アクチュエータおよびバイオホロボの製造プロセスフロー。各図は、生物学的アクチュエータおよびバイオロボット作製のためのプロトコールセクション2および3における材料および方法のステップを表す。 PDMSカンチレバーは、スピンコーティングおよびレーザー彫刻によって製造される。次いで、カンチレバーは、生物学的アクチュエータ（ a ）のためのガラスビーズまたはビオロボ（ b ）のための自己安定化浮動基盤を用いて静止ベースに取り付けられる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：この研究で作製された生物学的アクチュエータおよびビオロボット、ならびに生物学的アクチュエータおよび様々なタイプのビオロボの彫刻のためのCADファイル。 （ a ）生物学的アクチュエータ。 （ b ）双腕カンチレバービオロボ。 （ c ）ワイドアームカンチレバービオロボ。 （ d ）シングルアームバイオロボット。 （ e ）レーザー彫刻のための生物学的アクチュエータのCAD図面。 （ f ）レーザー彫刻のためのビオロボットのCAD図面。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：Ni-PDMSとMB-PDMSの混合密度とビオロボットの安定性 （ a ）混合比および得られる密度。 （ b ）密度とはさみメディアに関連した基地の数（ c ）ビオロボットを傾けたときの回転および復元。重心（CG）と浮力中心（CB）との間のミスアライメントは、回転モーメントを生成する。この瞬間は、ビオロボットを元に戻すか、それ以上傾けさせます。 （ d ）ミリメートルスケールのシングルアームビオロボの寸法。 （ e ）単層（MB-PDMS）対2層（Ni-PDMSおよびMB-PDMS）を使用して、（b）の傾斜条件下でパート（c）に示された単一腕バイオロボットについて復元力をシミュレートした。グラフは、45度以上傾けられていれば、単層のビオロボットは元の状態に戻りませんが、二重層のビオロボットは常にビオボットを直立状態に保ちながら正の復元力を持ちます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
水泳選手の間では様々な移動機構が見られます16 。この研究でのビオロボの運動機構は、フィンベースの運動、具体的には並置運動を使用する。騎乗的な水泳者は、尾を振って（片持ち）、剛体（層状の基部） 16を持って自らを推進します。ボクフやカウフィッシュなどの魚は、このタイプの移動を使用します。扇動的なスイマーは、典型的には遅く、非効率な体格を有する。奇妙な泳ぎには速度がありませんが、このような泳ぎはエンジニアがさまざまな機能（動的安定性など）をベースまたはボディに実装できるようにします。この研究で開発されたビオロボット設計は、推進機構として自己作動カンチレバーを用いて、浮揚と安定性のための頑強な基盤に基づいている。この研究でのビオロボットの製造における最も重要なステップの1つは、薄膜PDMSおよびレーザー彫刻プロセスであって、レバー。クリーンなカンチレバーがなければ、PDMS（弾性）、正確な厚さ（バネ定数）、および寸法（動きを生じさせるための心筋細胞のコンフルエントな接着のための十分な面積を有する）の適切な混合物では、ビオロボットは作動しない。さらに、心筋細胞の付着のための生存可能な表面を作り出すために、超音波処理によってカンチレバー表面から全ての気泡を除去することも必要である。
開発されたPDMS複合材料、MB-PDMSおよびNi-PDMSは、浸水深さを正確に制御し、ビオロボットの動的安定性を首尾よく生成するために使用することができる。 図3aに示すように、これらの材料の質量密度は細かく調整することができます。さらに、これらの物質は、我々の最近の研究15に示されているように、心筋細胞の成熟および収縮に対していかなる悪影響も示さない。したがって、開発された材料は、自己安定化および浮動構造を実現するために広く使用することができますbiorobotsや他のアプリケーションのためのe。
現在のプロトコールでは、自律的にスイミングバイオロボットを構築することができたが、それにはいくつかの制限がある。第1に、カンチレバーがウェーハから手動で剥がされるにつれて、プロセス中にカンチレバーが変形され、ビオロボット性能の再現性が影響される。これは、カンチレバーがウェーハから容易に除去されるように、フォトレジスト層の代わりに水溶解犠牲層を用いることによって対処することができる。より大きいカンチレバーもより高いパワーのために使用することができる。第2に、手順は主に手動操作に依存します。製造手順を合理化して効率を高めることができる。例えば、心筋細胞播種を含む組み立てプロセスは、個々のデバイスレベルの代わりにウェーハレベルで実施するように改変することができる。最後に、ビオロボットの三角形ベースの形状を最適化することで、水泳の方向性と安定性を高めることができます。
<生きている筋肉細胞によって生成されたパワーを利用するビオロボットは、従来の完全人工ロボットの代替としてかなりの関心を集めています。pior = "jove_content"このプロトコルでは、ソフトリソグラフィとバイオMEMS技術を使用して、自立したスイミングバイオノットを作ります。特定のデザインをさらに洗練させることができます。アクチュエータの効率は、カンチレバー表面上の心筋細胞のアラインメント・キューをパターニングすることによって増加させることができる。これは、細胞の配向を促進し、絨毛膜の力発生を増加させることができる17 。寸法はまた、同期された収縮から正味の力をさらに増加させるために、変化させることができ、または複数の片持ちアームを取り付けることができる。前述したように、多層ベースは、メディア表面上のビオロボの高さの調整を可能にする。これは、最大の運搬荷重と安定性を決定します。さらに、我々はカンチレバーに導電性材料を代用または追加して、f電気刺激を促進する。電気刺激を用いて、細胞の収縮速度およびビオロボットの速度を制御することができる。提示された方法は、小型パッケージ納品のような用途向けの高性能ビオロボットの開発に使用できると考えられる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない
Acknowledgments
MT HolleyはLouisiana Board of RegentsのGraduate Fellowsプログラムによって支持されており、C. DanielsonはHoward Hughes Medical Institute教授プログラムの支援を受けています。この研究は、NSFグラント番号：1530884で支持されています。著者は、先端微細構造デバイスセンター（CAMD）のクリーンルームのサポートに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 sil elast kit 0.5kg | Sylgard 184 |
| Nickel Powder | Sigma-Aldrich | 266981-100G | |
| Phenolic microballoons | US Composites | BJO-0930 | |
| Silicon wafers | 4 inch diameter | ||
| PWM101 light-duty spinner | Spin- coater | ||
| Positive photoresist (S1808) | Dow Corning | DEM-10018197 | |
| Hotplate | |||
| Vacuum chamber | |||
| M206 mechanical convection oven | Convection oven | ||
| Laser engraver | Universal Laser System | VLS2.30 | Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser |
| Universal Laser Systems Application | Universal Laser System | Application for running the VLS 2.30 | |
| Matlab | MathWorks | Numerical analysis program | |
| Scotch Tape | Scotch Brand | ||
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich | Z265926-1EA | Soda-lime glass, diameter 3 mm |
| Scale | Mettler Toledo | EL303 | |
| BD-20AC Laboratory Corona Treater | Electrotechnic Products | 12051A | Corona Discharger |
| Ultrasonic Bath 1.9 L | Fisher Scientific | 15-337-402 | 40 kHz industrial transducer |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate. |
| Fetalclone III serum | Hyclone Industries, GE | 16777-240 | Fetal bovine serum |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 |
References
- Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
- Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
- Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
- Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
- Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
- Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
- Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
- Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
- Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
- McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
