Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Прибор на основе карциномы на мышечной клетке и самостабилизационный биоробот - ЧАСТЬ 1

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55642
Automatic Translation
*1, *2, 1, *2, *1
1Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame
* These authors contributed equally

Summary

В этом двухчастном исследовании биологический исполнительный механизм был разработан с использованием гибких полидиметилсилоксановых (PDMS) кантилеверов и живых мышечных клеток (кардиомиоцитов) и охарактеризован. Биологический привод был включен с основанием из модифицированных материалов PDMS для создания самостабилизирующегося, плавающего биоробота.

Abstract

Биологические машины, часто называемые биороботами, представляют собой живые устройства на основе клеток или тканей, которые питаются исключительно сократительной активностью живых компонентов. Из-за присущих им преимуществ биороботы приобретают интерес как альтернативы традиционным искусственным роботам. В различных исследованиях основное внимание уделялось использованию энергии биологических приводов, но только недавно исследования количественно характеризовали характеристики биороботов и изучали их геометрию для повышения функциональности и эффективности. Здесь мы демонстрируем развитие самостабилизирующегося плавательного биоробота, который может поддерживать свой шаг, глубину и рулон без внешнего вмешательства. В этой первой части описана конструкция и изготовление каркасов PDMS для биологического привода и биоробота с последующей функционализацией с фибронектином. Во второй части этой статьи из двух частей мы подробно описываем включение кардиомиоцитов и характеризуем биологический активАтор и биоробот. Оба включают основание и хвост (кантилевер), которые производят плавучее движение. Хвост построен с использованием методов мягкой литографии с использованием PDMS и лазерной гравировки. После включения хвоста с основанием устройства он функционализован клеточным клеящим белком и засевается слиянием с кардиомиоцитами. Основание биологического привода состоит из твердого блока PDMS с центральным стеклянным шариком (действует как вес). Основание биоробота состоит из двух составных материалов PDMS, Ni-PDMS и microballoon-PDMS (MB-PDMS). Порошок никеля (в Ni-PDMS) позволяет осуществлять магнитный контроль биоробота при посеве клеток и стабильности во время локомоции. Микрошарики (в MB-PDMS) уменьшают плотность MB-PDMS и позволяют биороботу плавать и плавать постоянно. Использование этих двух материалов с разной плотностью массы позволило точно контролировать распределение веса, чтобы обеспечить положительную реставрационную силу под любым углом биоробота. Этот методПроизводит магниторегулируемый самостабилизационный плавающий биоробот.

Introduction

Биологические приводы и биороботы активно изучаются, чтобы обеспечить альтернативу обычной робототехнике для многочисленных применений. Биороботы, которые ходят 5 , 6 , 7 , 8 , плавают 1 , 2 , 3 , 4 , насос 9 , 10 или захват 11 , 12 , 13 Уже разработаны. Аналогично, мышечные клетки могут быть включены в трехслойную структуру 14 PDMS. Часто биооблоточные основы изготавливаются с использованием методов мягкой литографии с такими материалами, как гидрогели и PDMS (полидиметилсилоксаны). Это привлекательный выбор из-за их гибкости, биосовместимостиГибкость и легко настраиваемая жесткость. Живые мышечные клетки обычно включаются в эти материалы, чтобы обеспечить генерацию силы посредством сжатия. Клетки сердечной мышцы млекопитающих (кардиомиоциты) и клетки скелетных мышц преимущественно используются для приведения в действие. Помимо этих двух мышечных тканей насекомых использовались для работы биороботов при комнатной температуре 3 . В этом двухчастном исследовании кардиомиоциты были выбраны из-за их спонтанного сжатия 6 .

Большая часть ранних исследований биороботов была сфокусирована на разработке биологических приводов, в то время как оптимизация архитектуры биоробота и развитие важных функций для биороботов в основном игнорировались. Недавно в нескольких докладах было продемонстрировано внедрение различных режимов плавания, которые были вдохновлены режимами движения, найденными в природе. Эти методы включают ПДМС-пленки и мышечные клетки, имитирующие различные природные двигательные методы, Например, сообщалось о двигателе 1 на основе жгутов, биомаксимальном двигателе-медузе 2 , биогибридном луче 4 и устройствах 13 плавления с тонкой пленкой PDMS.

В этой статье мы представляем процесс изготовления самостабилизирующихся плавающих биороботов, которые могут поддерживать глубину погружения, а также шаг и рулон. Биоробот имеет твердую основу или тело, которое движется одним кантилевером с прикрепленными к его поверхности кардиомиоцитами. Кардиомиоциты заставляют кантилевер изгибаться в продольном направлении, когда они сжимаются. Эта форма плавания классифицируется как ostraciiform плавание. Возможность добавления дополнительных функциональных возможностей на базу является уникальным преимуществом острацифического плавания. Например, основание может быть использовано для обеспечения избыточной плавучести для переноса дополнительных грузов или схем управления для сокращения кардиомиоцитов.

стабильностьБиоробота часто упускали из виду в предыдущих исследованиях биороботов. В этом исследовании мы внедрили самостабилизацию путем проектирования основы с различными композитными материалами PDMS с различной плотностью масс. Таким образом, биоробот демонстрирует устойчивость к внешним возмущениям и поддерживает глубину погружения, шаг и рулон, без посторонней помощи. Первым слоем является PDMS микрошара (MB-PDMS), то есть PDMS, смешанный с микрошариками, что снижает плотность биоробота, позволяя ему плавать в средах. Второй слой представляет собой кантилевер PDMS, и его толщина адаптирована таким образом, что сила, создаваемая кардиомиоцитами, может резко согнуть кантилевер с 45 ° до 90 °. Нижний слой представляет собой никель-PDMS (Ni-PDMS), то есть PDMS, смешанный с порошком никеля. Этот слой выполняет несколько функций. Он магнитный и, следовательно, позволяет закрепить биоробот на дне среды во время клеточного посева магнитом. Смесь никеля имеет более высокую плотность, чем MB-PDMS, иСредний и обеспечить вертикальное положение биоробота во время плавания. Вес этого слоя создает восстанавливающий крутящий момент на биороботе при любом шаге и рулоне. Кроме того, объемное соотношение между Ni-PDMS и MB-PDMS поддерживает глубину погружения. Представленные протоколы были бы очень полезны для исследователей, заинтересованных в характеристике силы биения мышечных клеток и тканей, а также тех, кто хочет строить плавающие биороботы.

Посев функционализированного биологического привода и устройств биоробота, механическая и биохимическая характеристика клеток и количественный анализ функции устройства подробно описаны в части 2 этой статьи из двух частей, а также в недавней работе 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рассчитать массу PDMS и добавок

  1. Используйте следующее уравнение, чтобы найти массу PDMS, необходимую для определенных высот, в следующих процедурах,
    M = ρ * V = ρ * Высота * Площадь (1),
    Где «Высота» - высота слоя, «Площадь» - это площадь контейнера, из которой будет вылечена PDMS, «ρ» - плотность смеси, а «V» - это объем.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Плотности для расчета высоты составляют PDMS = 0,965 г / мл, Ni-PDMS = 1,639 г / мл, MB-PDMS = 0,648 г / мл.
  2. Используйте уравнение (1) для оценки массы PDMS, необходимой для данного контейнера, для получения определенной высоты (5 мм) для основания биологического привода. Полученная плотность PDMS составляет 0,965 г / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Отношение составляет от 10: 1 до отвердителя по весу.
    M base = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )(2)
    M отвердитель = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )
  3. Используйте уравнение (1), чтобы найти массу Ni-PDMS, необходимую для данного контейнера, чтобы получить определенную высоту (1,5 мм) нижней основы биоробота.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Соотношения составляют 1: 1,88 (порошок никеля до PDMS по весу) и 1: 1,71: 0,171 (порошок никеля до основания PDMS для отвердителя PDMS по весу). Результирующая плотность Ni-PDMS составит 1,639 г / мл.
    M Никель = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение ) (3)
    M base = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )
    M отвердитель = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )
  4. Аналогично, используя уравнение (1) - f Чтобы масса MB-PDMS была необходима для данного контейнера для получения определенной высоты (3,5 мм) верхнего основания биоробота.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Соотношения равны 1: 5 (микрошарики до PDMS по весу) и 1: 4,54: 0,454 (микрошарики до основания PDMS к отверждающему средству PDMS). Полученная плотность MB-PDMS будет равна 0,648 г / мл.
    M Microballoon = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение ) (4)
    M base = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )
    M отвердитель = ρ * V = ρ * V * ( Уравнение )
  5. Проверить динамическую стабильность биоробота с требуемым размером и геометрией с помощью сценариев анализа; См. Дополнительную информацию: «Biorobot_dynamic_stability.m» и «CG_CB_calculation.m».
_title "> 2. Изготовление биологических приводов на стационарной основе

ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рис. 1a.

  1. Спиновое покрытие тонкой пленки PDMS (см. Рис. 1a-1 и a2). Толщина получаемой пленки ПДМС составит 25 мкм.
    1. Поместите кремниевую пластину на счетчик фоторезиста и переверните переключатель насоса, чтобы произвести всасывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Кремниевая пластина имеет толщину 4 дюйма и толщину 500 мкм.
    2. Налейте положительный фоторезист ( например, S1808) на кремниевую пластину, пока пластина полностью не будет закрыта. Запрограммируйте прядильщик для вращения со скоростью 2000 об / мин в течение 20 с. Затем включите счетчик, нажав на педаль. Открутите всасывание после вращения.
    3. Нагрейте горячую плиту до 120 ° C. Используйте пластинчатые пинцеты, чтобы забрать кремниевую пластину из прядильщика и поместить кремниевую пластину непосредственно на конфорку. Накройте пластину мелкой чашкой Петри и запекайте в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ . Печь можно использовать для baKe вафли с использованием той же температуры и продолжительности. На рисунке 1a-1 показан этот процесс.
    4. Поместите пластиковый контейнер на весы и обнулите его. Налейте 6 г основания PDMS в контейнер и добавьте 0,6 г отвердителя PDMS. Тщательно перемешайте PDMS в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ. После смешивания смесь должна быть слита с пузырьками.
    5. Поместите контейнер смешанных PDMS в вакуумную камеру. Уменьшите давление вакуумной камеры до 100 мбар и оставьте контейнер в камере в течение 30 мин. Разбейте вакуум и удалите контейнер. Держите контейнер закрытым до использования.
    6. Поместите кремниевую пластину с испеченным слоем фоторезиста на прядильщик. Медленно вылейте всю дегазированную смесь PDMS на пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Медленно налейте таким образом, чтобы в смесь не вводили новые пузырьки.
    7. Установите счетчик до 1200 об / мин в течение 5 мин. Включите всасывание прядильщика и включите прядильщик. Открутите всасывание после вращения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. TПараметры hese приводят к слою PDMS толщиной 25 мкм.
    8. Нагрейте духовку до 40 ° C. Используйте пластинчатые пинцеты, чтобы забрать кремниевую пластину со спиннера, затем поместите ее в духовку. Выпекайте пластину в течение ночи, а затем охладите пластину при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 1a-2 показан этот процесс.
  2. Лазерная гравировка тонкопленочного слоя PDMS.
    1. Включите выключатель питания лазерного гравера и выхлопных газов. Включите компьютер, подключенный к лазерному граверу. Откройте программное обеспечение лазерного гравера.
    2. В разделе «Файл» откройте файл проектирования биологического привода, показанный на рисунке 2е.
      1. Нажмите кнопку «Настройки». Нажмите «Синий» и измените настройку мощности на 3% и скорость до 4%. Нажмите «Установить». Нажмите «Черный» и измените «Режим», чтобы пропустить. Затем нажмите «Установить». Сделайте то же самое для «Красный». Нажмите кнопку «Применить», чтобы закончитьнастройки."
      2. Нажмите кнопку «Активировать гравер» в правом верхнем углу.
    3. Нажмите кнопку «Переместить», чтобы переместить дизайн в центр экрана программного обеспечения.
    4. Нажмите кнопку «Фокусное изображение» в программе и щелкните по краю биоробота на экране. Это приведет к перемещению направляющей лазерной точки лазерного гравера в соответствующую точку.
    5. Переместите пластину вручную с помощью пинцета, так что точка на пластине, соответствующая точке, нажатой в пункте 2.2.4, находится непосредственно под направляющей лазерной точкой.
    6. Нажмите кнопку «Начать гравирование предыдущей работы», чтобы начать процесс гравировки. Удалите пластину после завершения гравировки. Выключите все оборудование.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Кнопка «Начать гравирование предыдущей работы» представляет собой большой зеленый треугольник. Не смотрите прямо на процесс гравировки, так как лазер может повредить глаза. На рисунке 1а-3 показан этот процесс.
    7. Подготовка и изготовление основания биологического привода.
      1. Налейте стеклянные бусины (диаметр 3 мм) в пробирку объемом 15 мл. Погрузите шарики 70% -ным этанолом в воду DI в течение 24 часов. Удалите этанол и залейте трубку водой DI в течение 24 часов. Вылейте воду DI и поместите трубку на конфорку при 50 ° C, чтобы облегчить сушку стеклянных шариков.
      2. Добавьте 3 g к количеству PDMS, найденному в уравнении (1), для учета PDMS, который будет прилипать к сторонам контейнера во время заливки. Используйте уравнение (2) для нахождения базы PDMS и количества отвердителя.
      3. Поместите пластиковый контейнер на весы и обнулите его. Вылейте количество базы PDMS, найденное на шаге 2.3.2, в контейнер и обнулите ее. Затем вылейте в контейнер количество отвердителя PDMS, обнаруженного на этапе 2.3.2.
      4. Тщательно перемешайте PDMS в течение 5 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ. PDMS используется в соотношении 10: 1 к отвердителю. Смесь должна иметь много пузырьков.
      5. МестоКонтейнер, предназначенный для выпечки по шкале и нулевой. Осторожно вылейте правильное количество PDMS, обнаруженное на этапе 2.3.2 (и смешайте на шаге 2.3.4) в контейнер. Постепенно очищайте стеклянные шарики по всей смеси PDMS. Оставьте минимум 5 мм пространства вокруг каждого шарика для основания биологического привода.
      6. Поместите контейнер в вакуумную камеру. Уменьшите давление вакуума до 100 мбар и выключите вакуумный насос. Через 30 минут разбейте вакуум и выньте контейнер. Держите крышку до упора.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Давление в камере может медленно возрастать со временем, когда смесь дегазируется, а вакуумная камера течет. Если давление существенно превышает 100 мбар, включите вакуумный насос, чтобы восстановить давление до 100 мбар.
      7. Нагрейте конфорку до 40 ° C. Осторожно поместите контейнер из PDMS и стеклянных шариков на плиту. Накройте контейнер и запекайте в течение ночи.
    8. Биологический привод. ПРИМЕЧАНИЕ. Следующая процедура может быть выполнена невооруженным глазом.
      1. Вырезать кубики (5 мм x 5 мм x 5 мм) из объемного PDMS, сделанного в части 2.3, с помощью бритвенного лезвия.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Один шарик должен находиться в центре каждого куба.
      2. Очистите все стороны каждого основания биологического привода, чтобы удалить загрязнения на поверхности основания, нажав основание в ленту и выньте. Повторите для каждой стороны.
      3. Повторите шаги с 2.3.2 по 2.3.6, чтобы сделать небольшое количество жидкого PDMS. Опустите наконечник иглы в жидкий PDMS. Поместите каплю жидкого PDMS на выгравированную базовую область пластины, сформированную на этапе 2.2. Намажьте капельку PDMS так, чтобы она полностью покрывала площадь основания 5 мм x 5 мм.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Базовая область представляет собой средний квадрат на рисунке 2a .
      4. Используйте пинцет, чтобы поместить очищенный куб с шага 2.4.2 на базовую область, покрытую жидкой ПДМС.
      5. Повторите шаг 2.4.3 с «Поместите каплю жидкого PDMS» на eNd и шаг 2.4.4 для каждого устройства, которое будет создано.
      6. Нагрейте конфорку до 40 ° C. Осторожно поместите кремниевую пластину с помощью сборок на плиту. Накройте пластину и выпекайте в течение ночи.
        ПРИМЕЧАНИЕ . Храните сборки в сборе до использования. На рисунке 1а-4 изображено окончательное устройство.

    3. Изготовление биороботов (рисунок 1b)

    1. Спин-покрытие и лазерная гравировка тонкой пленки PDMS
      1. Повторите все шаги в 2.1 и 2.2 с использованием новой кремниевой пластины. Это приведет к созданию кремниевой пластины с тонкой пленкой PDMS и тонкой пленкой фоторезиста, которая выгравирована с помощью конструкции биоробота.
        ПРИМЕЧАНИЕ . Повторяя шаг 2.2, используйте дизайн биоробота для лазерной гравировки вместо ранее использованной конструкции биологического привода. На рисунках 1b-1 и b-3 показаны эти процессы.
    2. Подготовка и изготовление PDMS compoместа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Следующая процедура может быть выполнена невооруженным глазом.
      1. Налейте фенольные микрошарики в трубку объемом 50 мл до полного заполнения. Заполните трубку 70% этанолом в DI-воде и дайте ей посидеть в течение 24 часов. Вылейте этанол, добавьте воду DI и дайте ему посидеть в течение 24 часов. Вылейте воду DI, а затем поместите трубку на конфорку при температуре 50 ° C, чтобы облегчить сушку микрошариков перед использованием.
      2. Используйте уравнение (1) с плотностью MB-PDMS и высотой 3,5 мм, чтобы найти необходимый объем PDMS. Добавьте 3 г в общую сумму, чтобы учесть материал, который останется в контейнере после заливки. Используйте уравнение (3), чтобы найти базу PDMS и количество отвердителя. Измерить соответствующее количество базы PDMS, отвердителя и микрошариков с использованием шкалы.
      3. Используйте уравнение (1) с плотностью Ni-PDMS и высотой 1,5 мм, чтобы найти необходимый объем PDMS. Добавьте 3 г к общей сумме, как на этапе 3.2.2. Используйте уравнение (2), чтобы найти базу PDMS и вылечитьСуммы. Измерить подходящее количество основания PDMS, отвердителя и порошка никеля с использованием шкалы.
      4. Смешайте каждую смесь MB-PDMS и Ni-PDMS в течение 5 мин. Осторожно вылейте необходимое количество MB-PDMS и Ni-PDMS, рассчитанных в 3.2.2 и 3.2.3, в отдельные контейнеры с использованием шкалы.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Смеси следует тщательно перемешать металлическим или стеклянным стержнем, не царапая нижнюю поверхность контейнера для смешивания. Смесь будет сливаться с пузырьками.
      5. Поместите оба контейнера в вакуумную камеру. Уменьшите давление до 100 мбар в течение 30 мин. Разбейте вакуум и удалите контейнеры. Держите крышку до упора.
      6. Нагрейте конфорку до 40 ° C. Поместите контейнеры с MB-PDMS и Ni-PDMS на плиту. Накройте каждый контейнер и запекайте в течение ночи.
        ПРИМЕЧАНИЕ . Храните крышку до упора.
    3. Сборка Biorobot.
      1. Обрезать основы биоробота размеров, соответствующих каждому размеру биоробота от Ni-PDMS и MB-PDMS с использованием лезвия бритвы. См. Рисунок 2b-2d для базовых конструкций.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Толщина Ni-PDMS составляет 1,5 мм, а для MB-PDMS - 3,5 мм.
      2. Очистите все стороны оснований биоробота, чтобы удалить загрязняющие вещества на поверхности, нажав основание на ленту и извлеките. Повторите для каждой стороны.
      3. Включите коронный разрядник. Принесите кончик разрядника короны на 1 см выше основания Ni-PDMS, который помещается на металлическую пластину с промежуточной тканью. Переместите наконечник вокруг основания и продолжайте в течение 15 с для обработки поверхности.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Разряд должен происходить между коронарным разрядником и пластиной. Если это не так, доведите наконечник ближе до разряда.
      4. Повторите шаг 3.3.3 для обработки поверхности основания биоробота, выгравированного на этапе 3.1, на ту же самую длительность. Используйте пинцет, чтобы поместить обработанную Ni-PDMS сторону на обработанную сторону пленки. Дайте устройству сидеть в течение 5 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ . Это будетGly связывают две части. См. Рис. 1b4 .
      5. Используйте острые пинцеты, чтобы очистить кантилевер из биоробота от пластины и поместить его на дно основания Ni-PDMS. Используйте пинцет, чтобы удалить всю сборку с пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Кантилевер будет прикреплен к базе Ni-PDMS. На рисунке 1b-5 и b-6 изображено это.
      6. Поместите небольшую каплю неотвержденной PDMS (основание 10: 1 на отвердитель) в верхней части базы MB-PDMS. Используйте пинцет для размещения стороны Ni-PDMS с тонкопленочной PDMS на MB-PDMS с неотвержденным PDMS. Поместите сборку в пластиковую чашку Петри, а затем поместите ее на плиту при температуре 40 ° C, чтобы вылечить всю ночь.
        ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 1b-7 изображено окончательное устройство.

    4. Функционализация устройств

    ПРИМЕЧАНИЕ . Ниже мы описываем процесс подготовки устройств для посева клеток.

    1. приготовительныйЯвляются искомые материалы: раствор фибронектина (50 мкг / мл), раствор солевого раствора фосфатного буфера (PBS), модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиком пенициллина (DMEM complete).
    2. Поместите 100 мкл раствора фибронектина в центр культуральной колбы T-25 (нижняя поверхность, когда колба находится в вертикальном положении). Поддерживайте отдельные колбы для каждого устройства.
    3. Поместите биоробот или биологический привод вниз по капле раствора фибронектина. Убедитесь, что консоль развернута и погружена в капельку. Инкубируйте при 37 ℃ в течение 30 мин.
    4. После инкубации удалите раствор фибронектина и дважды промыйте PBS.
    5. Удалите PBS и заполните колбу 10 мл DMEM. Инкубируйте при 37 ℃ в течение 1 часа для облегчения дегазации PDMS. Чтобы погрузить биороботы в 10 мл среды, используйте магнит, чтобы удерживать устройство на дне колбы. Поместите колбу с помощью samПробирки в ультразвуковой ванне в течение 5 мин для удаления пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ . Во время инкубационного периода на поверхности PDMS образуются пузырьки воздуха, которые здесь называются дегазацией. Ni-PDMS, используемый в сборке биороботов, является магнитным. Биологический привод не нуждается в магните, потому что он останется на дне колбы из-за веса стеклянного шарика. Теперь блок биоробота или биологического привода готов для посева, что подробно объясняется в части 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Биологический привод и биоробот имеют очень похожие процессы изготовления, так как биоробот является естественным продолжением биологического привода ( рис. 1 ). Сначала был разработан биологический исполнительный механизм, чтобы установить методы, необходимые для биоробота, проанализировать силу, создаваемую клетками, и охарактеризовать созревание клеток механически и биохимически, оба из которых подробно описаны в части 2 этой статьи из двух частей, как Как и в нашей недавно опубликованной работе 15 .

Пружинную константу привода оценивали и настраивали для большого изменения радиуса кривизны кантилевера при полном сжатии листа кардиомиоцитов. Затем мы разработали биоробот, уделяя особое внимание его стабильности, контролю во время посева клеток и легкости передвижения. Первоначально было выбрано несколько проектов, как показаноНа рис. 2b-2d , с различными свойствами для оценки того, какие атрибуты в наибольшей степени вписываются в требования к дизайну. Биороботы были спроектированы и испытаны с короткими, длинными и широкими консолями, а также с несколькими кантилеверами для проверки влияния изменений в приводе на функцию биоробота. Мы также рассматривали различные размеры плавающей базы. Геометрия основания поддерживалась как треугольник, поскольку она создавала асимметрию, которая привела бы к направленному движению.

Стабильность биоробота была важным компонентом в процессе проектирования. Верхний слой MB-PDMS использовался для обеспечения плавучести к устройству, тогда как нижний слой Ni-PDMS использовался для стабильности и магнитного контроля. Благодаря более высокой плотности базовый слой, изготовленный из никеля, обеспечивает биороботу способность удерживаться вертикально и возвращаться в исходное положение после воздействия внешних возмущений; Показанный на рисунке 3

Следующее уравнение может описывать высоту биороботов над поверхностью среды:
Уравнение
Где H Ni , H Mb , ρ medium , ρ Mb и ρ Рис. 3b ). Высота биороботов является одним из важнейших факторов, влияющих на максимальную нагрузку, которую она может нести, и ее стабильность. Дополнительный вес, загруженный на базу, приведет к снижению биороботов в среду, и больший объем базы будет погружен в воду. Дополнительный объем, подлежащий погружению, имеет плотность ниже, чем плотность среды, и обеспечивает дополнительную плавучесть для подъема добавленного веса. Следовательно, для увеличения максимальной несущей нагрузки нам нужно как можно больше увеличить h . Тем не менее, стабильность биоробота будет уменьшаться при увеличении h . Для максимальной устойчивости центр веса основания должен быть как можно ниже. Однако увеличение h положило бы центр веса биоробота близко или выше среды, дестабилизируя биоробот. Следовательно, требуется подробный анализДля оптимизации стабильности и максимальной несущей нагрузки одновременно до изменения базовой структуры биоробота.

Для определения правильной толщины каждого композитного слоя были измерены различные соотношения смешивания с Ni-PDMS и MB-PDMS. Максимальная и минимальная плотности, которые могут быть легко смешаны, составляли 0,648 г / см 3 для MB-PDMS и 1,64 г / см 3 для Ni-PDMS, как показано на рисунке 3a . Все высоты биороботов были спроектированы таким образом, чтобы восстанавливающий момент биоробота при любом угле наклона был достаточно сильным, чтобы вернуть его в горизонтальное положение. Для уменьшения гидродинамического сопротивления использовалась треугольная форма. Окончательные размеры показаны на рисунке 3d . Используя компьютерный сценарий, стабильность была численно проанализирована и доказана, что она имеет сильный восстанавливающий момент, используя двухслойный метод, как показано на рисунке 3е . См. Таблицу материалов и дополнительную информациюN для используемой компьютерной программы.

Рисунок 1
Рисунок 1: Технологический поток для изготовления биологического привода и биоробота. Каждый чертеж представляет шаги в материалах и методах в протоколах 2 и 3 для изготовления биологического привода и биоробота. Консоли PDMS изготавливаются с помощью спин-покрытия и лазерной гравировки. Затем кантилеверы прикрепляются к неподвижному основанию со стеклянной шайбой для биологического привода ( a ) или к самостабилизующему плавущему основанию для биоробота ( b ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: РазмерыБиологический привод и биороботы, которые были изготовлены в этом исследовании, и файлы САПР для гравировки как биологического привода, так и различных типов биороботов. ( A ) Биологический привод. ( B ) Двуручный консольный биоробот. C ) широкоугольный кантилеверный биоробот. D ) одноручный биоробот. E ) чертеж САПР биологического привода для лазерной гравировки. ( F ) чертеж САПР биороботов для лазерной гравировки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Плотность смешивания для Ni-PDMS и MB-PDMS и стабильность биороботов. (А) Соотношения смешивания и результирующие плотности. ( Б ) Плотность и плотностьHts оснований относительно среды. ( C ) Вращение и восстановление биоробота при наклоне. Несоосность между центром тяжести (CG) и центром плавучести (CB) генерирует вращающийся момент. Этот момент либо восстановит биоробот, либо заставит его наклониться дальше. ( D ) Размеры биоробота с одной рукой в ​​миллиметровой шкале. ( E ) Сила восстановления силы была смоделирована для биобота с одним плечом, показанного в части (c) в условиях наклона в (b), используя два слоя (Ni-PDMS и MB-PDMS) по сравнению с однослойным (MB-PDMS). График показывает, что однослойный биоробот не будет восстанавливаться, если он наклонена на 45 °, тогда как двуслойный биоробот всегда будет иметь положительную восстанавливающую силу, сохраняя биоробот вертикально. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Среди водных пловцов можно найти различные механизмы передвижения. Механизм локомоции биоробота в этом исследовании использует локомоцию на основе ребер, в частности остраковидную локомоцию. Остракообразные пловцы продвигаются по вилянию хвоста (кантилевера) и имеют жесткое тело (слоистое основание) 16 . Рыба, такая как бокс и рыба, использует этот тип локомоции. Остракообразные пловцы обычно медленны и имеют неэффективные размеры тела. Хотя ostraciiform плавание не имеет скорости, эта форма плавания позволяет инженерам реализовать различные функциональные возможности (например, динамическую стабильность) на основе или в теле. Разработанная в этом исследовании конструкция биоробота основана на твердой базе для плавания и стабильности, с самодвижущимся кантилевером в качестве механизма движения. Одним из наиболее важных этапов изготовления биоробота в этом исследовании является тонкопленочный PDMS и лазерная гравировка для формирования кантирычаг. Без чистого кантилевера правильная смесь PDMS (для эластичности), правильная толщина (для постоянной пружины) и размеры (имеющие достаточную площадь для конфлюентной адгезии кардиомиоцитов для создания движения), биоробот не будет работать. Кроме того, также необходимо удалить все пузырьки с поверхности кантилевера через ультразвук, чтобы создать жизнеспособную поверхность для прикрепления кардиомиоцитов.

Разработанный композитный материал PDMS, MB-PDMS и Ni-PDMS может использоваться для точного управления глубиной погружения и успешного создания динамической устойчивости биороботов. Массовая плотность этих материалов может быть точно отрегулирована, как показано на рисунке 3а . Кроме того, эти материалы не оказывают отрицательного влияния на созревание и сокращение кардиомиоцитов, как мы показали в нашей недавней работе 15 . Следовательно, разработанные материалы могут широко использоваться для реализации самостабилизирующейся и плавающей структурыE для биороботов и других приложений.

Хотя текущий протокол смог построить самостабилизационный плавающий биоробот, он имеет несколько ограничений. Во-первых, когда кантилевер отделяется вручную от пластины, кантилевер может быть деформирован во время процесса, и на него влияет повторяемость характеристик биоробота. Это может быть устранено с использованием водорастворимого жертвенного слоя вместо слоя фоторезиста, так что кантилевер можно легко удалить с пластины; Более крупные кантилеверы также могут использоваться для большей мощности. Во-вторых, процедура в основном основана на ручных операциях. Процедура изготовления может быть упрощена для повышения эффективности. Например, процесс сборки, включающий в себя посев кардиомиоцитов, может быть модифицирован так, чтобы проводить его на уровне пластины, а не на уровне отдельных устройств. Наконец, форма треугольной основы биоробота может быть оптимизирована для повышения направленности и устойчивости плавания.

<P class = "jove_content"> Биороботы, которые используют энергию, вырабатываемую живыми мышечными клетками, представляют значительный интерес в качестве альтернативы традиционным полностью искусственным роботам. В этом протоколе используются методы мягкой литографии и био-MEMS для создания самостабилизирующегося, плавающего биоробота. Конкретный дизайн может быть дополнительно уточнен. Эффективность исполнительного механизма может быть увеличена путем формирования паттерна выравнивания сигналов для кардиомиоцитов на поверхности кантилевера. Это будет способствовать ориентации клеток и может увеличить генерацию силы кариомиоценов 17 . Размеры также могут варьироваться или могут быть прикреплены несколько консольных рычагов, чтобы дополнительно увеличить чистую силу от синхронных сокращений. Как описано выше, многослойная основа позволяет регулировать высоту биоробота над поверхностью носителя. Это определяет максимальную несущую нагрузку и стабильность. Кроме того, мы можем заменить или добавить проводящие материалы в кантилевер, чтобы fУскорить электростимуляцию. Электрическую стимуляцию можно использовать для контроля скорости сокращения клеток и скорости биороботов. Мы считаем, что представленные методы могут быть использованы для разработки высокоэффективных биороботов для таких приложений, как доставка небольших пакетов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgments

MT Holley поддерживается Программой выпускников стипендий Совета регентов штата Луизиана, а С. Даниэльсон поддерживается Программой профессоров Медицинского института Говарда Хьюза. Это исследование поддерживается NSF Grant No: 1530884. Авторы хотели бы поблагодарить поддержку чистой комнаты в Центре усовершенствованных микроструктур и устройств (CAMD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 sil elast kit  0.5kg Sylgard 184
Nickel Powder Sigma-Aldrich 266981-100G
Phenolic microballoons US Composites BJO-0930
Silicon wafers 4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner Spin- coater
Positive photoresist (S1808) Dow Corning DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven Convection oven
Laser engraver Universal Laser System VLS2.30 Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser
Universal Laser Systems Application Universal Laser System Application for running the VLS 2.30
Matlab MathWorks Numerical analysis program
Scotch Tape Scotch Brand
Solid-glass beads Sigma-Aldrich Z265926-1EA Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale Mettler Toledo EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater Electrotechnic Products 12051A Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L Fisher Scientific 15-337-402 40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) Sigma-Aldrich D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Hyclone Laboratories 16750-074 With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum Hyclone Industries, GE 16777-240 Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt Sigma-Aldrich P3032

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
  2. Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
  3. Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
  4. Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
  5. Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
  6. Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
  7. Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
  8. Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
  9. Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
  10. Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
  11. Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
  12. Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
  13. Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
  14. Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
  15. Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
  16. Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
  17. McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).

Tags

Биоинженерия выпуск 125 кардиомиоциты биологический актуатор биоробот сокращение клеток поверхностное напряжение кантилевер
Прибор на основе карциномы на мышечной клетке и самостабилизационный биоробот - ЧАСТЬ 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holley, M. T., Nagarajan, N.,… More

Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1. J. Vis. Exp. (125), e55642, doi:10.3791/55642 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter