Bioengineering

Cardiac Muscle Cell Based Actuator och självstabiliserande Biorobot - DEL 1

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55642

Merrel T. Holley*¹, Neerajha Nagarajan*², Christian Danielson¹, Pinar Zorlutuna*², Kidong Park*¹

¹Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University, ²Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame

* These authors contributed equally

Summary

I denna tvådelade studie utvecklades ett biologiskt manöverdon med användning av mycket flexibla polydimetylsiloxan (PDMS) cantilevers och levande muskelceller (kardiomyocyter) och karakteriserades. Det biologiska manöverdonet inkorporerades med en bas gjord av modifierade PDMS-material för att bygga en självstabiliserande, simma biorobot.

Abstract

Biologiska maskiner som ofta kallas biorobots, är levande cell- eller vävnadsbaserade enheter som drivs enbart av kontraktile aktiviteten hos levande komponenter. På grund av deras inneboende fördelar blir biorobots intressanta som alternativ till traditionella helt artificiella robotar. Olika studier har fokuserat på att utnyttja kraften hos biologiska ställdon, men nyligen har studier kvantitativt karakteriserat biorobots prestanda och studerat sin geometri för att förbättra funktionaliteten och effektiviteten. Här demonstrerar vi utvecklingen av en självstabiliserande biorobot som kan behålla sin tonhöjd, djup och rulle utan yttre ingrepp. Konstruktionen och tillverkningen av PDMS-ställningen för det biologiska ställdonet och biorobot följt av funktionaliseringen med fibronektin beskrivs i denna första del. I den andra delen av denna tvådelade artikel detaljerar vi införlivandet av kardiomyocyter och karakteriserar det biologiska trycketAtor och biorobot funktion. Båda innehåller en bas och svans (cantilever) som producerar finbaserad framdrivning. Svansen är konstruerad med mjuka litografitekniker som använder PDMS och lasergravering. Efter inkorporering av svansen med anordningens bas, funktionaliseras den med ett cellhäftande protein och sådd sammanflödigt med kardiomyocyter. Basen av det biologiska ställdonet består av ett fast PDMS-block med en central glaspärla (fungerar som en vikt). Basen av biorobot består av två komposit-PDMS-material, Ni-PDMS och mikroballong-PDMS (MB-PDMS). Nickelpulvret (i Ni-PDMS) möjliggör magnetisk styrning av biorobot under cellerna sådd och stabilitet under rörelse. Mikroballonger (i MB-PDMS) minskar densiteten hos MB-PDMS, och gör det möjligt för biorobot att flyta och simma stadigt. Användningen av dessa två material med olika massdensiteter möjliggjorde exakt kontroll över viktfördelningen för att säkerställa en positiv återställningskraft vid vilken vinkel som helst av bioroboten. Denna teknikProducerar en magnetiskt styrd självstabiliserande biorobot.

Introduction

Biologiska ställdon och biorobot studeras aktivt för att ge ett alternativ till konventionell robotik för många tillämpningar. Biorobots som går ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ , simma ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ , pump ⁹ ^, ¹⁰ eller grepp ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ Har redan utvecklats. På liknande sätt kan muskelceller inkorporeras i en 3D-rullad PDMS-struktur ¹⁴ . Ofta tillverkas biorobot backbones med hjälp av mjuk litografi tekniker med material som hydrogeler och PDMS (polydimetylsiloxan). Dessa är attraktiva val på grund av deras flexibilitet, biocompatibIlity, och lätt avstämbar styvhet. Levande muskelceller införlivas vanligtvis med dessa material för att ge kraftgenerering genom sammandragning. Mammaliska hjärtmuskelceller (kardiomyocyter) och skelettmuskelceller har dominerande använts för aktivering. Förutom dessa två har insektsmusklerna använts för att driva biorobot vid rumstemperatur ³ . I denna tvådelade studie valdes kardiomyocyter på grund av deras spontana sammandragning ⁶ .

Mycket av tidigare forskning om biorobots var inriktad på att utveckla de biologiska manöverorganen medan optimering av biorobotarkitekturen och utvecklingen av väsentliga funktioner för biorobotten i stor utsträckning försummade. Nyligen visade några rapporter genomförandet av olika simningslägen som inspirerades av framdrivningsmetoder som finns i naturen. Dessa metoder innefattar PDMS-filmer och muskelceller för att efterlikna olika naturliga framdrivningsmetoder. Till exempel har flagella-baserad framdrivning ¹ , biomimetisk maneter framdrivning ² , biohybrid strålning ⁴ och tunnfilm PDMS-svimningsanordningar ¹³ rapporterats.

I det här dokumentet presenterar vi tillverkningsprocessen av självstabiliserande badbiorobot som kan bibehålla nedsänkningshöjden såväl som pitch och roll. Bioroboten har en fast bas eller kropp, som drivs av en enda cantilever med kardiomyocyter fästa vid dess yta. Kardiomyocyterna orsakar att cantileverna böjer i längdriktningen när de sammandrags. Denna form av simning klassificeras som ostraciiform simning. Möjligheten att lägga till ytterligare funktioner på basen är en unik fördel med ostraciiform simning. Basen kan till exempel användas för att tillhandahålla överskott av flytkraft för att bära ytterligare laster eller kontrollkretsar för kardiomyocytkontraktion.

StabilitetAv bioroboten blev ofta förbisedd i tidigare studier av biorobot. I denna studie genomförde vi självstabilisering genom att utforma basen med olika komposit-PDMS-material med varierande massdensiteter. Bioroboten uppvisar sålunda motstånd mot yttre störningar och upprätthåller dess nedsänkningsdjup, tonhöjd och rulle, utan hjälp. Det första skiktet är microballoon PDMS (MB-PDMS), det vill säga PDMS blandat med mikroballonger, vilket sänker biorobotens densitet, vilket gör det möjligt att flyta i media. Det andra skiktet är PDMS cantilever, och dess tjocklek är skräddarsydd så att kraft genererad av kardiomyocyterna kan dramatiskt böja cantilevern från 45 ° till 90 °. Bottenskiktet är nickel-PDMS (Ni-PDMS), dvs PDMS blandat med nickelpulver. Detta lager utför flera funktioner. Det är magnetiskt och tillåter därför att biorobot förankras i botten av mediet under cellsåkning med en magnet. Nickelblandningen har högre densitet än MB-PDMS ochMedium och säkerställa en upprätt position av biorobot medan flytande. Vikten av detta skikt genererar ett återställningsmoment på biorobot vid vilken tonning som helst. Även volymen mellan Ni-PDMS och MB-PDMS upprätthåller dämpningsdjupet. De presenterade protokollen skulle vara mycket användbara för forskare som är intresserade av att karakterisera slagkraften hos muskelceller och -vävnader, liksom de som vill bygga badbiorobot.

Utsläppen av det funktionaliserade biologiska aktuatorn och biorobotanordningarna, den mekaniska och biokemiska karakteriseringen av cellerna och den kvantitativa analysen av enhetsfunktionen beskrivs i detalj i del 2 i denna tvådelade artikel såväl som i det senaste arbetet ¹⁵ .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beräkna massan av PDMS och tillsatser

Använd följande ekvation för att hitta massan av PDMS som behövs för specifika höjder i följande procedurer,
M = ρ * V = ρ * Höjd * Område (1),
Där 'Höjd' är skiktets höjd, 'Area' är området för en behållare som PDMS kommer att botas i, 'ρ' är blandningens densitet och 'V' är volymen.
OBS: Densiteter för höjdberäkningar är PDMS = 0,965 g / ml, Ni-PDMS = 1,639 g / ml, MB-PDMS = 0,678 g / ml.
Använd ekvation (1) för att uppskatta massan av PDMS som behövs för en given behållare för att erhålla en specifik höjd (5 mm) för basen av det biologiska ställdonet. Den resulterande densiteten av PDMS är 0,965 g / ml.
OBS: Förhållandet är 10: 1 bas till härdningsmedel i vikt.
M _basen = p * V = p * V * ( )(2)
M _{härdningsmedel} = p * V = p * V * ( )
Använd ekvation (1) för att hitta massan av Ni-PDMS som behövs för en given behållare för att få en specifik höjd (1,5 mm) av bottenbasen av bioroboten.
OBS: Förhållandena är 1: 1,88 (nickelpulver till PDMS enligt vikt) och 1: 1,71: 0,171 (nickelpulver till PDMS-bas till PDMS-härdningsmedel). Den resulterande densiteten av Ni-PDMS kommer att vara 1.639 g / ml.
M _Nickel = ρ * V = ρ * V * ( ) (3)
M _basen = p * V = p * V * ( )
M _{härdningsmedel} = p * V = p * V * ( )
På samma sätt använd ekvation (1) till f Ind massan av MB-PDMS som behövs för en given behållare för att erhålla en specifik höjd (3,5 mm) av biorobotets övre bas.
OBS: Förhållandena är 1: 5 (mikroballonger till PDMS i vikt) och 1: 4,54: 0,444 (mikroballonger till PDMS-bas till PDMS-härdningsmedel i vikt). Den resulterande densiteten hos MB-PDMS kommer att vara 0.648 g / ml.
M _Microballoon = ρ * V = ρ * V * ( ) (4)
M _basen = p * V = p * V * ( )
M _{härdningsmedel} = p * V = p * V * ( )
Kontrollera biorobots dynamiska stabilitet med önskad dimension och geometri med hjälp av analysskript; Se kompletterande information, "Biorobot_dynamic_stability.m" och "CG_CB_calculation.m".

_title "> 2. Tillverkning av biologiska aktuatorer på en stationär bas

OBS: Se Figur 1a.

Spin-coat en tunn film av PDMS (se Figur 1a-1 och a2). Tjockleken hos den erhållna PDMS-filmen kommer att vara 25 pm.
1. Placera en kiselplatta på en fotoresistspinnare och vrid pumpomkopplaren för att producera sug.
  OBS : Kiselplattan har en diameter på 4 tum och en tjocklek på 500 μm.
2. Häll positiv fotoresist ( t.ex. S1808) på kiselplattan tills skivan är helt täckt. Programma spinnaren för att rotera vid 2000 rpm i 20 s. Koppla sedan in spinnaren genom att trycka på fotpedalen. Stäng av suget efter spinning.
3. Värm en värmeplatta upp till 120 ° C. Använd wafer pincett för att plocka upp kiselplattan från spinnaren och placera kiselplattan direkt på kokplattan. Täck skivan med en grundig petriskål och baka i 10 minuter.
  OBS : En ugn kan användas till baKoka skivan med samma temperatur och varaktighet. Figur 1a-1 visar denna process.
4. Placera en plastbehållare på en vågskala och noll ut den. Häll 6 g PDMS-bas i behållaren och tillsätt 0,6 g PDMS-härdningsmedel. Blanda PDMS grundligt under 5 minuter.
  ANMÄRKNING: Efter blandning ska blandningen vara sammankopplad med bubblor.
5. Placera behållaren av blandat PDMS i en vakuumkammare. Minska trycket i vakuumkammaren till 100 mbar och lämna behållaren i kammaren i 30 minuter. Bryt vakuum och ta bort behållaren. Håll behållaren täckt tills den används.
6. Placera kiselskivan med det bakade fotoresistskiktet på spinnaren. Häll långsamt hela avgasad PDMS-blandning på skivan.
  OBS: Häll långsamt så att inga nya bubblor införs i blandningen.
7. Ställ spinnaren till 1200 rpm i 5 min. Slå på spinnsugningen och sätt i spinnaren. Stäng av suget efter spinning.
  OBS: TDessa inställningar resulterar i ett 25 μm tjockt lager av PDMS.
8. Värm ugnen till 40 ° C. Använd waferpincett för att plocka upp kiselplattan från spinnaren och placera den i ugnen. Baka skivan över natten och kyld sedan skivan vid rumstemperatur.
  OBS! Figur 1a-2 visar denna process.
Lasergravering av PDMS-skiktet med tunnfilm.
1. Slå på strömbrytaren till lasergraveraren och dess avgaser. Slå på datorn ansluten till lasergraveraren. Öppna lasergraverprogrammet.
2. Under "File" -alternativet, öppna den biologiska aktuator designfilen som visas i Figur 2e.
  1. Tryck på knappen "Inställningar". Klicka på "Blå" och ändra effektinställningen till 3% och hastighet till 4%. Klicka på "Set". Klicka på "Svart" och ändra "Mode" för att hoppa över. Klicka sedan på "Set". Gör detsamma för "Röd". Tryck på "Apply" knappen för att slutföraInställningarna. "
  2. Tryck på knappen "Aktivera graveren" längst upp till höger.
3. Tryck på "Flytta" -knappen för att flytta designen till mitten av programmets skärm.
4. Tryck på "Focus View" -knappen i programmet och klicka på kanten på biorobot på skärmen. Detta flyttar lasergraveringen av lasergraveraren till motsvarande punkt.
5. Flytta skivan manuellt med pincett, så att punkten på skivan som motsvarar den punkt som klickas i 2.2.4 ligger direkt under den ledande laserpunkten.
6. Tryck på "Starta gravering av tidigare jobb" -knappen för att starta graveringsprocessen. Ta bort skivan efter graveringen är klar. Stäng av all utrustning.
  OBS! "Start gravering av tidigare jobb" -knappen är den stora gröna triangeln. Titta inte direkt vid graveringsprocessen eftersom lasern kan skada ögonen. Figur 1a-3 visar denna process.
7. Förberedelse och tillverkning av den biologiska manövreringsbasen.
  1. Häll glaspärlor (3 mm diameter) i ett 15 ml rör. Sänk perlerna med 70% etanol i DI vatten under 24 timmar. Ta bort etanolen och fyll röret med DI-vatten i 24 timmar. Häll ut DI-vattnet och lägg röret på en kokplatta vid 50 ° C för att underlätta torkningen av glaspärlorna.
  2. Tillsätt 3 g till mängden PDMS som finns i ekvation (1) för att redogöra för PDMS som kommer att hålla fast vid behållarsidorna under hällning. Använd ekvation (2) för att hitta PDMS-bas och härdningsmedel.
  3. Placera en plastbehållare på en vågskala och noll ut den. Häll upp mängden PDMS-bas som finns i steg 2.3.2 i behållaren och noll ut. Häll sedan mängden PDMS-härdningsmedel som hittades i steg 2.3.2 i behållaren.
  4. Blanda PDMS grundligt under 5 minuter.
    OBS: PDMS används i ett förhållande av 10: 1 bas till härdningsmedel. Blandningen borde ha många bubblor.
  5. PlatsEn behållare som ska användas för bakning på en skala och noll ut. Häll försiktigt ut den rätta mängden PDMS som hittades i steg 2.3.2 (och blandas i steg 2.3.4) i behållaren. Lossa rengjorda glaspärlor i hela PDMS-blandningen med jämna mellanrum. Lämna minst 5 mm utrymme kring varje pärla för det biologiska ställdonet.
  6. Placera behållaren i en vakuumkammare. Minska vakuumtrycket till 100 mbar och stäng av vakuumpumpen. Efter 30 min, bryt vakuum och ta bort behållaren. Fortsätt täckt tills användning.
    OBS: Trycket i kammaren kan stiga långsamt över tiden då blandningen avgasar och vakuumkammaren läcker ut. Om trycket ökar väsentligt över 100 mbar, sätt på vakuumpumpen för att återställa trycket till 100 mbar.
  7. Värm en kokplatta till 40 ° C. Placera behållaren PDMS och glaspärlorna försiktigt på värmeplattan. Täck behållaren och baka över natten.
8. Biologisk ställdon. OBS! Följande procedur kan göras med blotta ögat.
  1. Klipp kuber (5 mm x 5 mm x 5 mm) ur bulk PDMS tillverkad i del 2.3 med ett rakblad.
    OBS: En pärla borde vara i mitten av varje kub.
  2. Rengör alla sidor av varje biologiskt ställdon, för att avlägsna eventuella föroreningar på bottenytorna, genom att trycka in basen i bandet och ta bort. Upprepa för varje sida.
  3. Upprepa steg 2.3.2 till 2.3.6 för att göra en liten mängd flytande PDMS. Doppa spetsen av en nål i det flytande PDMS. Placera en droppe av det flytande PDMS på det graverade basområdet på skivan mönstrat i steg 2.2. Smörj PDMS-dråpen så att den helt täcker 5 mm x 5 mm basområdet.
    OBS: Basområdet är mittfältet i figur 2a .
  4. Använd pincett för att placera den rengjorda kuben från steg 2.4.2 på basområdet som är täckt med flytande PDMS.
  5. Upprepa steg 2.4.3 från "Placera en droppe flytande PDMS" till eNd och steg 2.4.4 för varje enhet som kommer att göras.
  6. Värm en kokplatta till 40 ° C. Placera kiselplattan försiktigt med aggregaten på värmeplattan. Täck skivan och baka över natten.
    OBS : Håll monteringarna fästa tills de används. Figur 1a-4 visar den slutliga anordningen.
3. Tillverkning av bioroboter (figur 1b)
1. Spinbeläggning och lasergravering en tunn PDMS-film
  1. Upprepa alla steg i 2.1 och 2.2 med en ny kiselplatta. Detta kommer att resultera i en silikonplatta med en tunn film av PDMS och en tunn film av fotoresist som är inristad med en biorobotdesign.
    OBS! När du upprepar steg 2.2 använder du biorobotdesignen för lasergravering istället för det tidigare använda biologiska aktuatorns design. Figurerna 1b-1 och b-3 visar dessa processer.
2. Förberedelse och tillverkning av PDMS compowebbplatser.
  OBS! Följande procedur kan göras med blotta ögat.
  1. Häll fenoliska mikroballonger i ett 50 ml rör tills det är fullt. Fyll röret med 70% etanol i DI-vatten och låt det sitta i 24 timmar. Häll ut etanolen, tillsätt DI-vatten och låt det sitta i 24 timmar. Häll ut DI-vattnet och lägg sedan röret på en kokplatta vid 50 ° C för att underlätta torkningen av mikroballongerna före användning.
  2. Använd ekvation (1) med MB-PDMS-densiteten och 3,5 mm höjd för att hitta den mängd PDMS som krävs. Tillsätt 3 g till det totala beloppet, för att redogöra för det material som förblir i behållaren efter hällning. Använd ekvation (3) för att hitta PDMS-basen och härdningsmedlet. Mät ut lämplig mängd PDMS bas, härdare och mikroballonger med hjälp av skalan.
  3. Använd ekvation (1) med Ni-PDMS-densitet och 1,5 mm höjd för att hitta den mängd PDMS som behövs. Tillsätt 3 g till den totala mängden som i steg 3.2.2. Använd ekvation (2) för att hitta PDMS-basen och härdning aGent mängder. Mät ut lämplig mängd PDMS-bas, härdningsmedel och nickelpulver med hjälp av skalan.
  4. Blanda varje blandning av MB-PDMS och Ni-PDMS i 5 min. Häll försiktigt den rätta mängden MB-PDMS och Ni-PDMS beräknat i 3.2.2 och 3.2.3 i separata behållare med en skala.
    OBS : Blandningarna ska blandas noggrant med en metall- eller glasstång utan att skrapa bottenytan på blandningsbehållaren. Blandningen kommer att sammanfalla med bubblor.
  5. Placera båda behållarna i en vakuumkammare. Minska trycket till 100 mbar i 30 minuter. Bryt vakuum och ta bort behållarna. Fortsätt täckt tills användning.
  6. Värm en kokplatta till 40 ° C. Placera behållare med MB-PDMS och Ni-PDMS på värmeplattan. Täck varje behållare och baka över natten.
    OBS : Förvara med lock tills använd.
3. Biorobotmontering.
  1. Klipp biorobotbaser med dimensioner respektive till varje biorobotstorlek från Ni-PDMS och MB-PDMS med ett rakblad. Se figur 2b-2d för basdesign.
    OBS: Tjockleken på Ni-PDMS är 1,5 mm och den för MB-PDMS är 3,5 mm.
  2. Rengör alla sidor av biorobotbaserna för att ta bort eventuella föroreningar på ytorna, genom att trycka på basen i bandet och ta bort dem. Upprepa för varje sida.
  3. Slå på en coronaförstärkare. Ta med spetsen av coronaförstärkaren 1 cm över Ni-PDMS-basen, vilken placeras på en metallplatta med en renrumsvävnad däremellan. Flytta spetsen runt basen och fortsätt i 15 s för att behandla ytan.
    OBS: En urladdning bör ske mellan coronaförstärkaren och skivan. Om det inte gör, ta spetsen närmare tills en urladdning uppstår.
  4. Upprepa steg 3.3.3 för att behandla ytan på basen av en biorobot graverad i steg 3.1 under samma tid. Använd pincett för att placera den behandlade Ni-PDMS-sidan på filmens behandlade sida. Låt enheten sitta i 5 minuter.
    OBS : Detta kommer att stronGlybinda de två delarna. Se figur 1b4 .
  5. Använd skarpa pincett för att skala biorobotskivan från skivan och placera den på botten av Ni-PDMS-basen. Använd pincett för att ta bort hela enheten från skivan.
    OBS : Cantilever kommer att fästas på Ni-PDMS basen. Figur 1b-5 och b-6 visar detta.
  6. Placera en liten droppe ohärdad PDMS (10: 1 bas till härdare) på toppen av MB-PDMS-basen. Använd pincett för att placera sidan av Ni-PDMS med den tunna filmen PDMS på MB-PDMS med det ohärdade PDMS. Placera enheten i en petriskål av plast, och placera det på en kokplatta vid 40 ° C för att bota över natten.
    OBS! Figur 1b-7 visar den slutliga enheten.
4. Funktionalisering av enheterna
OBS! Nedan beskriver vi processen att förbereda enheterna för cellsåning.
1. PrepÄr de nödvändiga materialen: Fibronectin lösning (50 μg / ml), fosfatbuffertsalinlösning (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin antibiotikum (DMEM komplett).
2. Placera 100 μl fibronektinlösning i mitten av en T-25 odlingskolv (bottenyta när kolven sitter upprätt). Behåll separata kolvar för varje enhet.
3. Placera bioroboten eller det biologiska ställdonet vänd nedåt över droppen av fibronektinlösningen. Se till att cantileveret är utfällt och nedsänkt i droppen. Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter.
4. Efter inkubationen avlägsnas fibronektinlösningen och tvättas med PBS två gånger.
5. Ta bort PBS och fyll kolven med 10 ml DMEM. Inkubera vid 37 ° C i 1 h för att underlätta avgasning av PDMS. För att nedsänka biorobotsna i 10 mL media, använd en magnet för att hålla enheten i botten av kolven. Placera kolven med samPles i ett ultraljudsbad under 5 min för att avlägsna bubblorna.
  OBS : Under inkubationsperioden bildas luftbubblor på PDMS-ytan, som kallas avgasning här. Ni-PDMS som används i biorobot-enheten är magnetisk. Det biologiska ställdonet behöver inte en magnet eftersom den kommer att ligga kvar i bottnen på grund av glaspärlets vikt. Bioroboten eller det biologiska ställdonet är nu klart för sådd, vilket förklaras i detalj i del 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det biologiska ställdonet och biorobot har mycket liknande tillverkningsprocesser, eftersom biorobot är en naturlig förlängning av det biologiska ställdonet ( Figur 1 ). Det biologiska ställdonet utvecklades först för att fastställa tekniker som krävdes för biorobot, för att analysera kraften som genererades av cellerna och för att karakterisera cellmognad mekaniskt och biokemiskt, vilka båda beskrivs i detalj i del 2 i denna tvådelade artikel som Liksom i vårt nyligen publicerade arbete ¹⁵ .

Fjäderkonstanten hos manövreringsorganet utvärderades och avstämdes för en stor förändring av krökningsradien hos kanten under full sammandragning av kardiomyocytarket. Därefter konstruerade vi biorobot med särskild hänsyn till stabiliteten, kontrollen vid cellsåtning och lätthet av rörelse. Initialt valdes några mönster, som visatI Figur 2b-2d , med olika egenskaper för att bedöma vilka attribut som bidrar mest till designkraven. Biorobots konstruerades och testades med korta, långa och breda cantilevers, liksom med flera cantilevers för att testa effekten av förändringar i ställdonet på biorobotfunktionen. Vi betraktade också olika storlekar av den flytande basen. Basens geometri bibehölls som en triangel, eftersom den skapar den asymmetri som skulle resultera i en riktningsrörelse.

Stabiliteten hos biorobot var en kritisk komponent i designprocessen. Det översta MB-PDMS-skiktet användes för att ge uppdrift till anordningen, medan det undre Ni-PDMS-skiktet användes för stabilitet och magnetisk kontroll. På grund av en högre densitet ger basskiktet av nickel biorobot förmågan att hålla sig upprätt och återgå till sin ursprungliga position efter exponering för yttre störningar. Som visas i figur 3

Följande ekvation kan beskriva biorobots höjd ovanför mediet:

Där H _Ni , H _Mb , P _medium , ρ _Mb och ρ Figur 3b ). Biorobots höjd är en kritisk faktor som påverkar den maximala belastningen som den kan bära och dess stabilitet. Ytterligare vikt belastad på basen sänker biorobotten i mediet och en större volym av basen kommer att nedsänkas. Den ytterligare volymen som ska nedsänkas har en densitet som är lägre än mediet och ger extra flytkraft för att lyfta den uppmätta vikten. För att öka den maximala lasten måste vi öka h så mycket som möjligt. Ändå kommer stabiliteten hos biorobot att minska när h ökar. För maximal stabilitet bör basens mittpunkt vara så låg som möjligt. Emellertid skulle ökande h placera biorobotets centrum nära eller över mediet, destabiliserande bioroboten. Därför krävs detaljerad analysFör att optimera stabiliteten och den maximala bärbelastningen samtidigt före modifiering av biorobotens basstruktur.

För att bestämma den rätta tjockleken hos varje kompositskikt testades olika blandningsförhållanden med Ni-PDMS och MB-PDMS. De maximala och minimitätheter som lätt kunde blandas var 0.648 g / cm3 för MB-PDMS och 1,64 g / cm3 för Ni-PDMS, såsom visas i Figur 3a . Alla biorobothöjder konstruerades så att återställningsmomentet hos en biorobot vid någon lutningsvinkel skulle vara tillräckligt stark för att bringa den tillbaka till det horisontella läget. En triangulär form användes för att minska hydrodynamisk dragning. De slutliga dimensionerna visas i figur 3d . Med hjälp av ett datorskript analyserades stabiliteten numeriskt och visade sig ha ett starkt återställande moment genom att använda tvåskiktsmetoden, som visas i figur 3e . Se tabell över material och kompletterande informationN för det datorprogram som används.

Figur 1
Figur 1: Processflöde för tillverkning av den biologiska aktuatorn och biorobot. Varje ritning representerar stegen i materialen och metoderna i protokollsektionerna 2 och 3 för biologisk påverkan och biorobottillverkning. PDMS cantilevers tillverkas av spin-beläggning och lasergravering. Sedan är cantilevarna fästa på en stationär bas med en glaspärla för det biologiska ställdonet ( a ) eller till en självstabiliserande flytande bas för bioroboten ( b ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Dimensioner avDen biologiska aktuator och biorobots som tillverkas i den här studien och CAD-filerna för gravyr, både biologiska aktuatorer och olika typer av bioroboter. ( A ) Biologiskt ställdon. B ) Dubbelarm cantilever biorobot. ( C ) Brantarm cantilever biorobot. ( D ) Enarm biorobot. ( E ) CAD-ritning av biologiskt ställdon för lasergravering. ( F ) CAD ritning av biorobots för lasergravering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Blandningstäthet för Ni-PDMS och MB-PDMS och stabiliteten hos biorobotten. (A) Blandningsförhållanden och resulterande densiteter. ( B ) Tätheterna och höjdenBasen i baserna i förhållande till media. ( C ) Rotationen och restaureringen av biorobot när den lutas. Felinriktningen mellan tyngdpunkten (CG) och centrum för flytkraft (CB) genererar ett roterande moment. Detta ögonblick kommer antingen att återställa biorobot eller få det att luta ytterligare. ( D ) Dimensionerna av enarmsbiorobot i millimeterskala. ( E ) Återställningskraft simulerades för den envila biorobot som visas i del (c) under lutningsförhållandena i (b) med användning av två skikt (Ni-PDMS och MB-PDMS) kontra ett skikt (MB-PDMS). Diagrammet visar att ett biorobot med ett lager inte återställer sig om det lutas över 45 °, medan den dubbelskiktade bioroboten alltid har positiv återställningskraft och håller bioroboten upprätt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Olika rörelsesmekanismer finns bland vattenlevande simmare ¹⁶ . Biorobots rörelsesmekanism i denna studie använder finbaserad rörelse, speciellt ostraciiform lokomotion. Ostraciiformsvimmare driver sig genom att sväva en svans (cantilever) och ha en styv kropp (skiktad bas) ¹⁶ . Fisk som boxfish och cowfish använder denna typ av rörelse. Ostraciiformsvimmare är vanligtvis långsamma och har ineffektiva kroppsdimensioner. Även om ostraciiform simning saknar hastighet tillåter denna form av simning ingenjörer att genomföra olika funktioner (såsom dynamisk stabilitet) på basen eller kroppen. Den biorobotdesign som utvecklats i denna studie baseras på en solid bas för flyt och stabilitet, med en självaktiverande cantilever som drivmekanism. En av de viktigaste stegen i tillverkningen av biorobot i denna studie är den tunnfilm PDMS och lasergraveringsprocessen för att bilda cantispak. Utan en ren cantilever, den rätta blandningen av PDMS (för elasticitet), korrekt tjocklek (för fjäderkonstant) och dimensioner (som har tillräckligt med utrymme för sammanflytande vidhäftning av kardiomyocyter för att producera rörelse), kommer bioroboten inte att fungera. Dessutom är det också nödvändigt att avlägsna alla bubblor från den kantiga ytan genom ultraljud för att skapa en livskraftig yta för kardiomyocytbindning.

De utvecklade PDMS-kompositmaterialen, MB-PDMS och Ni-PDMS kan användas för att exakt styra underdjupsdjupet och framgångsrikt producera biorobots dynamiska stabilitet. Massdensiteten hos dessa material kan finjusteras, såsom visas i figur 3a . Vidare visar dessa material inga negativa effekter på mognad och sammandragning av kardiomyocyterna som vi har visat i vårt senaste arbete ¹⁵ . Därför kan de utvecklade materialen användas i stor utsträckning för att implementera en självstabiliserande och flytande strukturE för biorobots och andra applikationer.

Även om det nuvarande protokollet kunde bygga en självstabiliserande biorobot, har den några begränsningar. Först, eftersom cantileveren manuellt avskalas från skivan, kan cantileveren deformeras under processen och repeterbarheten av biorobotytan påverkas. Detta kan lösas genom att använda ett vattenlösande offerlager istället för fotoresistskiktet, så att cantileveren lätt kan avlägsnas från skivan; Större cantilevers kan också användas för högre effekt. För det andra beror förfarandet huvudsakligen på manuell drift. Tillverkningsförfarandet kan strömlinjeformas för högre effektivitet. Till exempel kan sammansättningsförfarandet innefattande kardiomyocyt sådd modifieras så att den leder på en skivnivå istället för individuell anordningsnivå. Slutligen kan formen på den triangulära basen av biorobot optimeras för att öka riktningen och stabiliteten i simning.

<P class = "jove_content"> Biorobots som utnyttjar kraften som genereras av levande muskelceller är av stort intresse som ett alternativ till traditionella helt artificiella robotar. Detta protokoll använder mjuklitografi och bio-MEMS-tekniker för att producera en självstabiliserande, bimobobot. Den speciella konstruktionen kan vidareutvecklas. Effektiviteten hos manöverdonet kan ökas genom patrering av inriktningsljus för kardiomyocyterna på den kantiga ytan. Detta kommer att främja cellorientering och kan öka kraftgenereringen av cariomyoctyesna ¹⁷ . Dimensionerna kan också varieras eller flera cantileverarmar kan fästas för att ytterligare öka nätkraften från synkroniserade sammandragningar. Såsom beskrivits tidigare tillåter multilagbasen att skräddarsy biorobots höjd ovanför medieytan. Detta bestämmer maximal last och stabilitet. Dessutom kan vi ersätta eller addera ledande material till cantilever för att fAcilitera elektrisk stimulering. Elektrisk stimulering kan användas för att kontrollera cellens sammandragningshastighet och biorobots hastighet. Vi tror att de presenterade metoderna kan användas för att utveckla högeffektiv biorobot för applikationer som små paketleveranser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja

Acknowledgments

MT Holley stöds av Graduate Fellows programmet från Louisiana Board of Regents och C. Danielson stöds av Howard Hughes Medical Institute Professors Program. Denna studie stöds av NSF Grant No: 1530884. Författarna vill tacka stöd för renrummet vid Center for Advanced Microstructures and Devices (CAMD).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	184 sil elast kit 0.5kg	Sylgard 184
Nickel Powder	Sigma-Aldrich	266981-100G
Phenolic microballoons	US Composites	BJO-0930
Silicon wafers			4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner			Spin- coater
Positive photoresist (S1808)	Dow Corning	DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven			Convection oven
Laser engraver	Universal Laser System	VLS2.30	Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO₂ Laser
Universal Laser Systems Application	Universal Laser System		Application for running the VLS 2.30
Matlab	MathWorks		Numerical analysis program
Scotch Tape	Scotch Brand
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich	Z265926-1EA	Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale	Mettler Toledo	EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater	Electrotechnic Products	12051A	Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L	Fisher Scientific	15-337-402	40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum	Hyclone Industries, GE	16777-240	Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).

Bioengineering

Cardiac Muscle Cell Based Actuator och självstabiliserande Biorobot - DEL 1

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.