Kardial muskelcellebasert aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

Summary

I denne studien blir en biologisk aktuator og en selvstabiliserende, svømmende biorobot med funksjonaliserte elastomere cantileverarmer podet med kardiomyocytter, dyrket og karakterisert for deres biokjemiske og biomekaniske egenskaper over tid.

Abstract

I de senere årene er hybridutstyr som består av en levende celle eller vevskomponent integrert med en syntetisk mekanisk ryggrad blitt utviklet. Disse enhetene, som kalles bioroboter, drives kun av kraften som genereres av den kontraktile aktiviteten til den levende komponenten, og kan på grunn av deres mange iboende fordeler være et alternativ til konvensjonelle, helt kunstige roboter. Her beskriver vi metodene for frø og karakteriserer en biologisk aktuator og en biorobot som ble designet, fabrikkert og funksjonalisert i første del av denne todelt artikkelen. Fabrikerte biologiske aktuatorer og biorobot-enheter sammensatt av en polydimetylsiloksan (PDMS) base og en tynnfilm cantilever ble funksjonalisert for cellefeste med fibronektin. Etter funksjonalisering ble neonatale rottekardiomyocytter podet på PDMS-cantileverarmen med høy tetthet, noe som resulterte i en sammenflytende cellelag. Enhetene ble avbildet hver dag og bevegelsen av cantiArmene ble analysert. På den andre dagen etter sådd, observert vi bøyningen av de cantilever armer på grunn av de krefter som utøves av cellene under spontane sammentrekninger. Ved kvantitativ analyse av cantilever-bøyningen ble det observert en gradvis økning i overflatespenningen som ble utøvet av cellene etter hvert som de ble modnet over tid. På samme måte observerte vi bevegelse av biorobot på grunn av aktivering av PDMS cantilever arm, som fungerte som en fin. Ved kvantifisering av svømmeprofilene til innretningene ble det observert forskjellige fremdriftsmodi, som var påvirket av finens hvilevinkel. Bevegelsesretningen og bevegelsesfrekvensen ble også bestemt av vinklens hvilevinkel, og en maksimal svømmehastighet på 142 μm / s ble observert. I dette manuskriptet beskriver vi prosedyren for å fylle de produserte enhetene med kardiomyocytter, samt for vurdering av den biologiske aktuatoren og biorobotaktiviteten.

Introduction

Bioroboter er enheter basert på levende celler som er innlemmet i en mekanisk ryggrad som vanligvis består av myke, elastiske materialer, som PDMS eller hydrogeler ¹ . Cellene gjennomgår rytmiske sammentrekninger, enten spontant eller som respons på stimuli, og fungerer dermed som aktuator. Kraften som genereres fra cellekontraksjon driver ulike bioroboter. Mammalske hjerteceller (kardiomyocytter) og skjelettmuskelceller brukes ofte til biorobotaktivering på grunn av deres kontraktile egenskaper. Bortsett fra kardiomyocytt- og skjelettmuskelceller, har andre celletyper, så som insektsmuskulaturvev ² og eksplanterte muskelvev ³ blitt brukt. Insektmuskulatur gjør det mulig å drive biologiske aktuatorer ved romtemperatur.

Funksjonen og ytelsen til en biorobot bestemmes hovedsakelig av styrken og konsistensen til den biologiske aktuatoren ( dvs.. Muskelceller), mens den mekaniske ryggradstrukturen primært bestemmer mekanismer for fremdrift, stabilitet og kraft. Siden disse enhetene er utelukkende drevet av krefter generert av celler, er det ingen kjemiske forurensninger eller driftslyder. Derfor danner de et energieffektivt alternativ til andre konvensjonelle roboter. Ulike litteraturkilder har diskutert de forskjellige metodene for å integrere levende celler og vev i biorobots ^{1 , 4 , 5} . Fremskritt i mikrofabrikasjon og vevsteknikk har gjort det mulig å utvikle bioroboter som kan gå, grep, svømme eller pumpe ^{5 , 6} . Generelt dyrkes celler direkte på den mekaniske (polymere) ryggrad som et sammenflytende cellelag, eller de støpes til tredimensjonale aktiveringsstrukturer i stillaser som ringer og striper. Oftest er bioroboterFremstilt ved bruk av kardiomyocytarkene ^{6 , 7} , da disse cellene har en medfødt evne til å utvise spontan sammentrekning uten ytre stimuli. På den annen side er rapporter om skjelettmuskulærcelleblad begrenset på grunn av deres behov for stimuli til å initiere sammentrekninger in vitro for å initiere membran depolarisering ⁸ .

Denne protokollen beskriver først hvordan frø kardiomyocytter på en funksjonalisert biologisk aktuator laget av en tynn PDMS cantilever. Det beskriver deretter detaljert sådd og analyse av svømmeprofilene. Cantileveren er funksjonalisert med et celleklæbende protein som fibronektin og blir frøbundet sammen med kardiomyocytter. Etter hvert som cellene som er sådd på enhetskontrakten, får de cantileveren å bøye og dermed fungere som en aktuator. Over tid, ettersom cellene er modne, sporer vi endringene i overflatespenningen på enheten ved å analysere videoer avCantilever bøying. Den biologiske aktuatoren som er utviklet her, kan brukes til å bestemme kontraktile egenskaper av en hvilken som helst celletype, så som fibroblaster eller inducerte pluripotente stamceller, da de gjennomgår differensiering.

Mye av den tidligere biorobotsundersøkelsen har vært fokusert på å utvikle biologiske aktuatorer, mens optimering av biorobotarkitekturen og funksjonelle evner i stor utstrekning var neglisjert. Nylig har noen studier demonstrert implementeringen av svømmemodi i bioroboter som er inspirert av naturen. For eksempel har svømmende bioroboter med flagellabasert bevegelse ⁶ , maneter fremdrift ⁹ og bio-hybrid stråler ⁴ blitt konstruert. I motsetning til andre litteraturarbeid, fokuserer vi her på å variere egenskapene til den mekaniske ryggraden for å skape en selvstabiliserende struktur. Den biorobot utviklet i denne studien er i stand til å opprettholde en konstant tonehøyde, rulle og imMersion dybde når den svømmer. Disse parametrene kan modifiseres ved å variere tykkelsen av hver basekompositt. Fremstillingstrinnene som er involvert i å utvikle PDMS-aktuatoren, den nedsenkbare bioroboten og funksjonaliseringen av enheten er beskrevet i detalj i del 1 i denne todelte artikkelen, så vel som i vårt siste arbeid ^7. Teknikken som er utviklet her, kan bane Vei for utvikling av nye, høyeffektive bioroboter for ulike applikasjoner, som fraktlevering.

Isolasjonsprosessen som følges i denne studien ligner prosessen beskrevet i et tidligere arbeid ¹⁰ , samt i nylig publisert arbeid ⁷ . Mikrofabrikasjonsmetodene som brukes til fremstilling av PDMS-aktuatorer og biorobot-enheter er beskrevet i detalj i del 1 i dette todelt manuskriptet. Protokolldelen av dette manuskriptet beskriver trinnene som er involvert i seeding av kardiomyocytter på den produserte PDMS aCtuator og biorobot etter deres funksjonalisering med celleklæbende proteiner.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet her har blitt utført ved hjelp av en godkjent protokoll og i samsvar med forskriftene fra Institutt for dyrepleie og bruk av Universitetet i Notre Dame.

1. Cellsåling og kultur

1. Før du begynner, klargjør de nødvendige elementene: en liten trakt, pipetter og varm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% Penicillin antibiotikum (DMEM komplett).
2. Ta T-25 flasker sammen med den funksjonaliserte enheten (biologisk aktuator eller bioroboten) i den. Se avsnitt 4 i del 1 i dette todelt manuskriptet for detaljer om utstyrsberedning, funksjonalisering og lagring før cellesedning.
3. Forbered en trakt, som kan gjøres ved å rulle et lite, firkantet plastark. Plasser den over den biologiske aktuatoren eller bioroboten inne i T-25-kolben. Juster diameteren på den bredere enden for å passe hele enhetenOg høyden slik at den passer godt når toppen av kolben er strammet.
   1. For biorobotene, bruk en magnet for å holde enheten på plass nederst i kolben i løpet av såddprosessen.
      Merk: Her ble en enkelt neodymium-diskmagnet (1,26 "i diameter) brukt, men en magnet av samme størrelse og styrke kan også brukes til å holde bioroboten nede med den magnetiske nikkel-PDMS-komposittbasen.
   2. UV-steriliser plastplaten i minst 30 minutter før bruk.
4. Sørg for at det ikke er et stort gap mellom basen av trakten og kolben.
5. Resuspendere kardiomyocyttene i DMEM komplett ved en tetthet på 1,6 x 107 celler / ml og sakte dråp 400 μL suspensjon på enheten gjennom trakten. Bruk et hemocytometer eller en annen celleteller for å bestemme antall celler som er oppnådd.
6. Flytt systemet sakte inn i inkubatoren uten å forstyrre enheten og traktenhin. Kultur i 24 timer ved 37 ° C.
7. Etter inkuberingsperioden, sakte tragten, vask forsiktig prøven med PBS, og fyll på flasken med 10 ml frisk DMEM komplett.
   Merk: For biorobots må du fjerne magneten slik at enheten er i avlopp.

2. Biokjemisk karakterisering

1. Kalsiumfluxanalyse
   Merk: Kalsiumfluksanalysen utføres for å vurdere cellens sammenkoblingsevne. Fremgangsmåten for å laste cellene med det fluorescerende, kalsiumion-spesifikke fargestoffet følger fremgangsmåten beskrevet i en tidligere etablert protokoll ¹¹ .
   1. Først skal du forberede de nødvendige materialer, kalsiumfluoro-4-acetometyl (AM) ester, ikke-ionisk overflateaktivt polyol (se Materialetabell ) og Tyrode's saltoppløsning .
   2. Ved bruk av lange pinsetter, overfør enheten forsiktig fra kultursammen til en 35 mm petriskål med 2 ml Tyrode's saltolu sjon.
   3. I en separat sentrifugerør, ta 1 ml varm Tyrode-løsning (oppvarmet til 37 ° C) og tilsett 3-5 μL lager kalsiumfluoro-4 AM-fargestoff (arbeidskonsentrasjon: 3-5 μM) og en lik del av ikke-ionisk overflateaktivt middel Polyol (arbeidskonsentrasjon: 0,2%). Erstatt prøveoppløsningen med varm Tyrode-løsning tilsatt kalsiumindikatorfargen, fluo-4 og 0,2% ikke-ionisk overflateaktivt middel. Inkuber i 25 - 30 minutter ved 37 ° C.
   4. Fjern fargestoffet og vask forsiktig prøven med fersk Tyrode-løsning. Reinkuber prøven i 2 ml frisk DMEM i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C før avbildning.
      Merk: Resultatene av denne analysen og tilhørende video er gitt i det tidligere publiserte arbeidet ⁷ .
2. immunfluorescens
   Merk: Den dobbelte immunostaining av alle prøvene ble utført etter tidligere etablert protokoll> 12.
   1. Først må du forberede 10% geit serum (GS) i fosfatbuffert saltoppløsning (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) i diH20, 0,1% celle lysende vaskemiddel (se tabell over materialer ) i PBS, primære antistoffer -mouse monoklonalt antistoff-hjerte-troponin-I og anti-kanin-monoklonalt antistoff-konnexiner-43), sekundære antistoffer (Alexa 594-konjugat og geit-anti-mus IgG (H + L) Alexa 488-konjugat) og DAPI.
      Forsiktig : Paraformaldehyd er kreftfremkallende.
   2. Fjern prøven av interesse fra kolben og vask den forsiktig to ganger med PBS. Se avsnitt 4 i del 1 i dette todelt manuskriptet for detaljer om prøveforberedelse og funksjonalisering.
   3. Legg en dråpe PBS på en liten deksel (diameter: 12 mm eller 15 mm). Hold forsiktig på bunnen av enheten med pinsett og kutt de tynne PDMS-armene (cantilever, Figur 1 ) ved hjelp av en saks fra enden der den kobles til toppen av basene. Overfør de cantilever armene på dråpen med den celle-klæbte siden vendt oppover. PBS-dråpet vil forhindre at cellene tørker.
   4. Fiks prøvene med 4% PFA og utfør dobbelt immunostaining av prøvene, som beskrevet tidligere ¹² .
   5. Etter immunfarging, monter prøvene på en ren glassglass ved hjelp av anti-fade montering reagens og sett til side, uforstyrret, i mørket i 24 timer.
   6. Gjenta prosedyren for alle prøvene.
      Merk: Resultatene av denne analysen og tilhørende bilder diskuteres grundig i det tidligere publiserte arbeidet ⁷ .

3. Imaging

1. Plasser T-25-kolven oppreist i en CO _2- inkubator og lag bildesystemet inne i inkubatoren. Ta opp enheten ved hjelp av et kamera (se Materialebordet ) med et zoomobjektiv (se Materialebordet ). For en lyskilde,Bruk en stripe med LED-lamper.
   Merk: En stripe med hvite lysdioder ble brukt her, men noen vanlige lysdioder vil også fungere.
2. Koble kameraet til et operativsystem og åpne den kameraspesifikke programvaren (se Materialebordet ). Klikk på kamerabildet under "Fil" -fanen, i topppanelet, for å åpne alle kameraalternativer, og velg riktig kamera.
3. Velg "live" fra listen over faner på topppanelet i programvaren.
4. Manuell bringe bildet i fokus ved å justere objektivvelgeren. Velg "Beskjær til region av interesse (ROI)" fra topppanelet. Deretter tegner du et rektangel manuelt i videorammen, som omgir den biologiske aktuatorenheten og de trekkbare armene, for å markere avkastningen.
   Merk: Ved å velge en passende avkastning minimeres størrelsen på bildefiler.
   1. I tilfelle av bioroboter, ta opp hele skjermen for å ta opp svømmearbeidet til enheten.
      MERK: Det er ikke nødvendig å tegne avkastning på biorobotene
5. Før du starter opptaket, velg "Kamerainnstillinger" fra en av kategoriene i topppanelet på skjermen. Angi bildefrekvensen ved å justere eksponerings- og pikselforholdet til livebildet ved å skyve linjen for hver, eller ved å skrive inn verdiene manuelt. Still inn rammene til ca. 30 ± 2 fps.
   Merk: Endring av eksponerings- og pikselforholdet endrer lysstyrken og kontrasten til livebildet.
6. Klikk på "Record" -knappen fra topppanelet i programvaren for å begynne å ta opp videoene på aktuatorene med 1000 x 1000 pixeloppløsning for nøyaktig 30 s. Gjenta prosessen for alle prøver.

4. Bildeanalyse av de biologiske aktuatorene på en stasjonær base

1. Analyser bildene ved hjelp av en programmeringsprogramvare ( f.eks. Matlab) som kjører det tilpassede skriptet. Se Materialebordet tilleggsfilen for ytterligere detaljer.
   Merk: Skriptet viser hver ramme av de innspillte videoene, mottar brukerens musinngang for å registrere koordinasjonen av punktene på cantileveren på bildene, beregner diameteren og senteret av sirkelen som passerer de innførte punktene via minst kvadratisk montering, og Eksporterer alle innførte og beregnede data for videre bruk.
   1. Åpne programmeringsprogramvaren ved å klikke på ikonet. Klikk "File" -> "Open" fra menylinjen øverst og velg .m skriptfilen for bildeanalyse. Kontroller at innspilte TIFF-bilder er i samme mappe som .m-filen. Klikk "Kjør" for å kjøre skriptet.
      Merk: Et interaktivt display vil dukke opp for å endre.
   2. Trykk på "play" for å starte selve programmet. Klikk på "åpne" -knappen og finn TIFF-filen som skal analyseres.
   3. Klikk på "base & #34; Knappen, og klikk deretter på punktet hvor cantilever festes til basen øverst; Trykk enter. Dette vil plassere en firkantet markør på bildet for hver ramme for å betegne plasseringen til den cantilever basen.
   4. Klikk på "Skala" -knappen, og klikk deretter manuelt på en kant av glassperlen. Ta musepekeren til motsatt side av glassperlen og trykk "Enter".
      Merk: Dette bør tegne en linje som måler glasspermens diameter. Siden glassperlen er 3 mm i diameter, vil dette forholde seg 3 mm til de viste piksler.
   5. Klikk på "Analyser" -knappen. Klikk langs cantilever på kort avstand fra den første firkantede markøren som representerer cantilever-basen.
   6. Klikk på "Analyser" -knappen. Deretter klikker du langs cantileveren i kort avstand fra den første firkantede markøren som representerer cantilever-basen. Fortsett å klikke langs cantilever, inkludert tipset, og trykk enter nårgjort. Dette vil plassere en "x" på hvert punkt klikket på cantilever.
      Merk: Basert på koordinasjonen av kvadratmarkøren og på x-markørene, beregnes sirkelens senter og diameter ved å bruke en minst kvadratisk fiksjonsfunksjon (se vedlagte tilleggsfil for skriptet som brukes). Sirkelen, som passerer x-markørene og kvadratmakeren, vil bli lagt over på bildet automatisk.
   7. Kontroller om den overliggende sirkelen korrekt sporer kantprofilen.
      Merk: Når cantilever er veldig flatt, er det vanskelig å bedømme om cantileverprofilen er sporet riktig. Se figur 3 .
   8. Klikk på "neste ramme" -knappen. Dette vil bytte til neste ramme i TIFF-filen. Basen og skalaen er allerede satt fra forrige trinn.
   9. Gjenta trinn 4.1.5 til 4.1.7 til alle rammene i TIFF-filen er fullført. Når alle rammer har gått framSsed, klikk på "Export" knappen.
      Merk: Dette vil lage en regnearkfil med TIFF-filnavnet for cantilever som bare ble analysert. Rediger filnavnet for å inkludere hvilken side (venstre eller høyre) av cantileveren ble analysert.
2. Beregning av stress i regnearket.
   1. Beregn overflatespenningen, "σ," på cantilever ved å bruke følgende ligning:
      
      Hvor E, R, v og h er Youngs modul, krumningsradius, Poisson-forhold og henholdsvis cantilevertykkelsen.
      Merk: Tykkelsen på cantilever kan endres for å endre følsomheten. I denne studien var verdiene som følger: E = 750 kPa, v = 0,49 og h = 25 μm ^{13 , 14} .
   2. Beregn overflatespenningen ved å bruke ligningen i trinn 4.2.1. Åpne .Xls regnearkfil. Merk at utgangen har flere kolonner som først viser x- og y-koordinatene til basis og sirkel og deretter krumningsradius. Beregn x- og y-koordinatene til hvert punkt som klikkes basert på disse.
      Merk: Plotting av spenningene over tidsrammen bildrammer viser endringer i kraften som utøves på cantilever over tid. Troughs viser stresset på cantileveren under avslapping av kardiomyocyttene eller den statiske stressen som utøves på cantileveren på grunn av cellefrekvensstyrker. Toppene viser det dynamiske stresset på cantileveren, som ble utøvd ved kardiomyocytter. Denne verdien tilsvarer den maksimale kraftstyrke som oppstår ved sammentrekning av kardiomyocyttene.

5. Analyse av svømme bioroboter

1. Ta opp biorobots posisjon ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
   Merk: Se listen Materialer for programvaren som brukes i denEr seksjonen.
   1. Åpne bildeanalyseprogrammet ( f.eks. ImageJ). Trykk "File" og "Open" og velg svømming biorobot videofilen. Klikk "OK" og la programmet laste filen. Åpne regnearkprogramvaren.
   2. I den lastede biorobotvideoen finner du en referanse med kjente dimensjoner ( f.eks. Glassperlen 3 mm i diameter som var innebygd i den biologiske aktuatoren).
      Merk: Ethvert objekt med kjent dimensjon vil fungere. Dette bestemmer piksel-til-lengdeforholdene i hver video.
   3. Bruk "Rett" verktøyet til å tegne en linje over glassperlen. Klikk på "Analyser" og velg "Angi skala". Sett feltet "Kjent avstand" til "3000 μm" og klikk "OK".
      Merk: Dette vil stille x- og y-koordinatene til mikrometre.
   4. Velg et punkt på enheten som ikke skifter mellom rammer for å fungere som en markør.
      Merk:Det anbefales å velge et hjørne av basen.
   5. Pek på det valgte punktet i 5.1.4 på den første rammen. Ta opp x- og y-koordinatene på regnearket.
   6. Bytt tilbake til vinduet for bildeanalyseprogramvare og trykk på høyre piltast for å bytte til neste ramme. Pek på markøren på nytt (fra trinn 5.1.4) og skriv inn x- og y-koordinatene på regnearket.
   7. Gjenta trinn 5.1.6 for alle rammer.
2. Beregn biorobotens svømmeparametere ved å bruke regnearket til koordinatene ⁷ .
   1. Beregn perioden mellom rammene fra den kjente rammevakten for hver video.
   2. Beregn endringen i x- og y-koordinatene mellom rammer for å finne avstanden flyttet, inkludert totalavstanden.
   3. Beregn amplitude av sammentrekning fra maksimal endring langs y-aksen. Bestem slåfrekvensen for hver biorobot fra den inverse perioden mellom to sammentrekninger.
   4. CAlkuler svømmehastigheten til hver enhet fra den totale tiden og avstanden som er flyttet i x-retningen.
   5. Gjenta trinn 5.2 for hver biorobotvideo som ble analysert.
   6. Normaliser hver målt parameter.
      Merk: Normaliser alle verdiene for å bedre visualisere forskjellene. Denne protokollen demonstrerer normalisering med hensyn til en horisontal modus biorobot med lavfrekvent sammentrekning (horisontal LF) ( Figur 4 ) ⁷ .

6. Analyse av proteinuttrykk

Merk: De monterte prøvene fremstilt i trinn 2.2.4 og 2.2.5 ble avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Bilder ble ervervet ved 20X, 40X og 60X forstørrelse sekvensielt i tre kanaler samtidig: 460 nm, 488 nm og 594 nm. Et sett på 5 bilder ble fanget ved 40X forstørrelse, fra forskjellige stillinger for hver prøve, og hver kanal ble lagret som et individ. TIFFfil. Eksponeringsinnstillingen ble bestemt av forstørrelsen av objektet som ble brukt og ble satt konstant for alle fangene ved den forstørrelsen.

1. Åpne bildeanalyseprogrammet og velg "File" -> "Open" for å laste bildene.
2. Tegn en rektangulær polygon på bilderammen for å markere avkastningen. Velg "Analyser" -> "Mål" for å måle gjennomsnittlig fluorescerende intensitet.
3. Gjenta trinn 6.2 for å samle intensitetsmålinger fra alle prøvene og beregne den respektive gjennomsnittlige intensiteten for hver tilstand.
   Merk: Her refererer en annen tilstand til forskjellige tidspunkter, som i, dag 1, dag 2 og opp til dag 6.
4. Eksporter resultatene på et regneark for videre statistisk analyse og for produksjon av dataposter.

Representative Results

Den biologiske aktuatoren som er laget av en tynn PDMS cantilever (25 μm i tykkelse) og kardiomyocytter utgjør kjerne av svømmebioroboten, som vist i skjematisk og skjermbilde av innretningene i figur 1 . Cellene begynner å oppvise sammentrekninger etter 24 timer i kultur, og bøyning av bøyelarmene ble observert ved dag 2. Sideprofilen til enheten ble registrert hver dag, og overflatebelastningen ble kvantifisert fra bøyning av bøyelarmene ved bruk av en Tilpasset bildeanalyseskript ⁷ . De statiske og dynamiske stressene ble ekstrahert fra overflatespenningen på hver dag ( figur 2a ). Vær oppmerksom på at statisk stress (cellefrekvensstyrke) er kontraktilspenningen cellene utviser på overflaten i hvilemodus og dynamisk stress (cellekontraksjonskraft) er stresset som genereres av cellene ved maksimal sammentrekning.

figur 2a ). Det var en stor standardavvik i måling av krefter på grunn av forskjeller i cellemodning mellom forskjellige prøver. Cellene viste en maksimal celletrekkkraft på 50 mN / m og en maksimal sammentrekningskraft på ca. 165 mN / m på dag 6. Analysen av alle individuelle data for flere prøver viste en sterk positiv korrelasjon mellom de statiske og dynamiske stressene, da begge Viste en økning over tid.

For å kvantifisere modningen av kardiomyocyttene over tid, vil ekspresjonsnivåene av noen av de strukturelle og funksjonelle kardiomyocytproteiner, så som hjerte-troponin I, gap-junction protein connexin-43 og actin filamenTs, ble beregnet. Som vist i figur 2b ble det observert en jevn økning i intensitetsmålinger over tid, tilsvarende uttrykket av de respektive proteiner. Denne økningen i proteinuttrykk bekrefter modning av cellene (cardiac troponin I) ¹⁵ , cellevekst og spredning ( dvs. økning i aktinuttrykk) og en økning i celleforbindelsen ( dvs. økning i antall gapskryssinger).

De statiske og dynamiske spenningene plottet i figur 2a ble kvantifisert ved å bruke et tilpasset dataskript, som beskrevet i det tidligere avsnitt. Når de innspilte bildene av den biologiske aktuatoren ble lastet inn i systemet, ble skriptet tillatt for sporing av bevegelsen av cantilever armen ved hjelp av manuelt tildelte markører, som vist i figur 3 . En gradvis økning i bøyningsvinkelen på kantelenVer armer ble observert over tid i kultur, som korresponderte med økningen i dynamisk sammentrekning og statisk celle-trekkraft utvist av cellene ⁷ . Resultatene av kalsiumfluxanalysen og tilhørende video er gitt i det tidligere publiserte arbeidet ⁷ .

Biorobotene viste spontane sammentrekninger på dag 2 etter cellesedning og kunne aktivt svømme horisontalt i opptil 10 d. På grunn av kraftbalansen mellom biorobotens vekt og oppdrift, opprettholdet enheten en stabil posisjon ved luft / mediumgrensesnittet. Fordeling eller bevegelse av biorobotene ble drevet av de synkroniserte sammentringene av kardiomyocytene, noe som førte til bøyning av de tynne cantileverarmene og fungerte som en aktuator. Det ble observert at biorobots hastighet og avstanden som ble flyttet med hvert slag, ble redusert etter 6 d i kulturen. Siden muskelcellene brukerD i denne studien var primære kardiomyocytter isolert fra neonatale rotter, inneholdt den seedede cellepopulasjonen også andre celletyper, slik som hjertefibroblaster, som er svært proliferative ¹⁶ . Da hjertefibroblaster prolifererer og sprer seg over tid i kultur, kan de undertrykke kontraktiliteten til kardiomyocytter. Resultatet er i tråd med andre studier som har vist at aktiviteten til primære celler avtar naturlig etter den første uken i kultur ¹⁶ . I fremtidig forskning kan cellekulturen bli behandlet med anti-mitogenmidler for å blokkere ikke-myocyttproliferasjon for å øke levetiden til biorobotene.

Vi observerte at hvilevinkelen til bøylen etter fabrikasjonen bestemte biorobots svømmeprofil, og ga enten horisontal eller vertikal modus til biorobots svømmeprofil. Her, "horisontal" og "vertikalt"Al "henvises til hvilevinkelen til cantileveren i forhold til en horisontal akse og refererer ikke til svingbevegelsens ⁷ retning. De vertikale biorobots hadde en hvilevinkel på ca. 110 ° og kontraheres i en vinkel på 90 °, mens Horisontale modus bioroboter hadde en hvilevinkel på ca. 45 ° og kontraherte om den horisontale akse (0 °). Vi observerte også et bredt spekter av slåfrekvenser over alle prøvene og klassifiserte dem i stor grad som enten en høyfrekvente (HF ) Eller lavfrekvent (LF) -modus. Figur 4 sammenligner hastigheten, slagfrekvensen og avstanden som er tilbakestilt for et enkelt slag for tre hovedtyper av bioroboter: horisontal HF, horisontal LF og vertikal modus. De horisontale HF-biorobotene viste et gjennomsnitt Slagfrekvens på 1,6 ± 0,417 Hz, mens de horisontale LF-biorobotene opprettholdt en stabil 1,09 ± 0,134 Hz. Selv om de vertikale biorobotene bare utstilte 0,86 ± 0,07 Hz, de exhiBidro til en høyere svømmehastighet på 142 μm / s og viste den største avstanden som var reist ved 160 ± 642 μm. På den annen side reiste den horisontale LF ca 48 ± 21,2 μm med hvert slag ved en hastighet på 67,3 μm / s, mens den horisontale HF biorobot hadde en hastighet på 84,4 μm / s og dekket en avstand på 61,5 ± 17,7 μm pr. Slag .

Figur 1: Biologisk aktuator og biorobot. ( A ) Skjematisk av den biologiske aktuatoren frøet med en sammenflytende cellelag i avslappet og kontraktet tilstand (topppanel) og et skjermbilde av enheten i kultur (bunnpanel). Som vist i figuren, består den biologiske aktuatoren av en tynn, funksjonalisert PDMS-cantilever (25 μm tykk) sådd med et ark med kardiomyocytter. Denne aktuatoren danner kjernen til svømmebioroboten, også som vist. ( B </ Strong>) Skjematisk av en-arm biorobot sådd med en sammenflytende celleplate (topppanel) og et skjermbilde av enheten i kultur (bunnpanel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Biomekanisk analyse av kardiomyocytter. ( A ) Den dynamiske kontraksjonskraften og statisk celle-trekkraft økte etter hvert som kardiomyocyttene var modnet. Prøvestørrelse = 6 for hver parameter. Den dynamiske og statiske stress uttrykt av cellene økte over tid da cellene modnet og utviklet seg i kultur. En maksimal statisk kraft på 50 mN / m og en dynamisk sammentrekningskraft på 165 mN / m ble observert på dag 6. ( B ) Kvantifisering av fluorescensintensiteten for proteinmarkørens hjerte-troponin-I, connexins-43 og actin; Prøve størrelse = 4 for hver parameter. Fluorescenssignalet for alle tre markørene økte gjennom hele kulturen, noe som tyder på en økning i ekspresjonen av disse funksjonelle proteiner over tid i kultur. Feilbarene i (A) og (B) representerer standardavviket for hver parameter som er kvantifisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Kvantifisering av ROC: Kalkulasjonsradius (ROC) beregninger ved hjelp av et tilpasset bildeanalyseskript. ROC funnet under en sammentrekning er illustrert på figuren. Flere punkter blir manuelt plukket langs cantilever, vist som en liten grønn "X." Når du er angitt for beregning, tegnes en best egnet sirkel for poengene som er oppgitt, som viserN ved den grønne sirkelen går gjennom cantilever. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Sammenligning av gjennomsnittlig svømmingshastighet, slagfrekvens og fjernet flytting / strekk for 3 bioroboter med forskjellige svømmeprofiler: Horisontal lavfrekvens (Horisontal LF), Horisontal høyfrekvens (Horisontal HF) og Vertikal. Målingene normaliseres til verdien av horisontal LF. Feilbarene representerer den relative standardavviket for hver parameter som er kvantifisert. Den horisontale LF og HF hadde hver en kantelarm med en hvilevinkel langs den horisontale aksen og viste slagfrekvenser på 1,09 ± 0,134 Hz ​​og 1,59 ± 0,417 Hz og svømmehastigheter på 67,3 μm / s og 84,4 μm / s resp.svis. Den vertikale bioroboten viste en bevegelsesfrekvens på 0.862 ± 0.075 Hz og en gjennomsnittlig svømmehastighet på 142 μm / s. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Prosedyren som er beskrevet her beskriver en vellykket såddsmetode for PDMS-baserte aktuatorer og bioroboter, noe som letter tilkoblingen av kardiomyocytter. Videre ble prosessen med bildeoppkjøp og den etterfølgende analyse som karakteriserer oppførselen til cellene og ytelsen til enhetene beskrevet.

Vi observerte spontan sammentrekning av cellene på de cantilever armer etter 24 timer; Intensiteten av sammentrekninger fortsatte å øke jevnt over tid og nådde et maksimum på dag 6, hvoretter intensiteten gikk sakte ned. Selv om den biologiske aktuatorens cantilever armer bare var 4 mm lange, ble det observert store avbøyninger opp til 2,5 mm, spesielt etter 6 dager i kultur. Den lave Young-modulen (750 kPa) og ultra-lav tykkelse av cantilever (25 μm) tillatt for så store avbøyninger, noe som resulterte i sterk fremdrift av biorobotene. For å vurdere den mekaniske egenskapenS av disse cellene, kvantifiserte vi cellekontraksjonene og trekkraftene generert på hver dag. Tynne filmkanter har blitt brukt til å måle kontraktilitet og mekanisk stress indusert av kardiomyocytter eller andre muskelceller ^{13 , 17} .

Den målte maksimale dynamiske kontraksjonsstyrken på 165 mN / m i denne studien er sammenlignbar med litteraturen ¹³ , hvor celler sådd på en hydrogel-cantilever utstod en systolisk spenning på ca. 82,8 ± 22,4 mN / m. De målte kreftene og økningen i stress over tid var relatert til modning av cellene som var sådd på anordningen, sett fra den tilsvarende økning i kontraktil og cytoskeletalproteinuttrykk. Den elektromekaniske koplingen økte også over tid, sett fra en økning i ekspresjonen av gapforbindelsesproteinet connexins-43.

Biorobot enheten utviklet her faller i kategorienAv ostraciiform svømmere ¹⁸ , hvor fremdriften er tilveiebragt ved vikning av en hale og avbøyning er begrenset til kaudalfinen. Den maksimale svømmehastigheten på 142 μm / s, som vises ved vertikal modus biorobot, ligger mellom de målte verdiene for andre populære svømmebioroboter i litteraturen, som er flagellabaserte bioroboter med hastigheter på rundt 9,7 μm / s ⁶ og jetfremdrift Modus enheter med hastigheter på 6 - 10 mm / s ⁹ .

I de senere år har mange biologiske maskiner eller bioroboter blitt utviklet ved hjelp av myke, elastiske materialer, for eksempel PDMS og hydrogeler, og frøes med kontraktile muskelceller. Vandre og svømme bioroboter har fått økt fokus som et alternativ til tradisjonelle roboter på grunn av deres potensial til å fungere som energieffektive, smidige roboter med selvreparasjonspotensial ^{1 , 5} . I motsetning til andre bioroboter iLitteraturen, bioroboten utviklet i denne studien, kan opprettholde sin egen tonehøyde, rulle og dybdedybde ⁷ . Lang levetiden til hjertecellene som brukes her er imidlertid en av de største begrensningene, da levetiden er begrenset til 10 d. For å overvinne denne begrensningen kan kontraktile celletyper fra andre arter brukes til å drive enheten, i stedet for pattedyr-avledede celler. For eksempel er forskjellige arbeider av Akiyama et al. Har utforsket bruken av kontraktile insektvingeceller for aktivering, da de har lengre levetid og kan overleve ved atmosfærisk temperatur ² .

For tiden dyrkes cellene isotropisk på den kantløse overflaten, noe som begrenser den genererte netto kontraktile kraften. I fremtidige studier kan en av de mulige modifikasjonene som kan inkluderes være å innlemme mikropatterner på cantilevers for å oppnå anisotropisk justering av de podede cellene ⁹ . Også, elektrOdes kunne settes inn for elektrisk stimulering for å øke kraften som genereres av cellene ⁴ . Med fortsatt utvikling i teknologi og produksjonsteknikker kan disse enhetene bane vei for utvikling av nye biologiske maskiner med ulike anvendelser, for eksempel fraktlevering. For eksempel kan basen av bioroboten utviklet her lett tilpasses for å bære små pakker ( dvs. last) ⁷ . Derfor har vi i dette arbeidet gitt en alternativ tilnærming til å utvikle en biorobot, med fokus på å variere egenskapene til den mekaniske ryggraden for å skape en selvstabiliserende struktur. Videre kan den biologiske aktuatoren utviklet her, brukes til å bestemme kontraktilspenningen av andre celletyper, slik som fibroblaster og induserte pluripotente stamceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software