Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

Summary

Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo.

Abstract

Nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos híbridos que consistem numa célula viva ou componente de tecido integrado com uma espinha dorsal mecânica sintética. Estes dispositivos, chamados biorobots, são alimentados apenas pela força gerada a partir da atividade contrátil do componente vivo e, devido às suas muitas vantagens inerentes, poderia ser uma alternativa aos robôs convencionais totalmente artificiais. Aqui, descrevemos os métodos para semear e caracterizar um atuador biológico e um biorobot que foi projetado, fabricado e funcionalizado na primeira parte deste artigo em duas partes. O actuador biológico fabricado e os dispositivos biorobot compostos por uma base de polidimetilsiloxano (PDMS) e um cantilever de película fina foram funcionalizados para ligação de células com fibronectina. Após a funcionalização, os cardiomiócitos de ratos neonatais foram semeados no braço cantilever PDMS a uma densidade elevada, resultando numa folha de células confluentes. Os dispositivos foram visualizados todos os dias eo movimento do cantiBraços de alavanca foi analisada. No segundo dia após a semeadura, observamos a flexão dos braços em consola devido às forças exercidas pelas células durante as contrações espontâneas. Após análise quantitativa da dobra em cantilever, observou-se um aumento gradual no stress superficial exercido pelas células à medida que amadureciam ao longo do tempo. Da mesma forma, observamos o movimento do biorobot devido à atuação do braço cantilever PDMS, que atuou como uma aleta. Após a quantificação dos perfis de natação dos dispositivos, foram observados vários modos de propulsão, que foram influenciados pelo ângulo de repouso da barbatana. A direção do movimento e a freqüência de batimento também foram determinadas pelo ângulo de repouso da barbatana, e observou-se uma velocidade máxima de natação de 142 μm / s. Neste artigo, descrevemos o procedimento para preencher os dispositivos fabricados com cardiomiócitos, bem como para a avaliação do atuador biológico e atividade biorobot.

Introduction

Biorobots são dispositivos baseados em células vivas que são incorporados dentro de um backbone mecânico que é geralmente composto de materiais macios, elásticos, como PDMS ou hidrogéis ¹ . As células sofrem contrações rítmicas, espontaneamente ou em resposta a estímulos, e assim funcionam como um atuador. A energia gerada a partir da célula de contração drives vários biorobots. As células do coração de mamíferos (cardiomiócitos) e as células do músculo esquelético são frequentemente utilizadas para a actuação biorobot devido às suas propriedades contrácteis. Além de cardiomiócitos e células musculares esqueléticas, foram utilizados outros tipos de células, tais como tecidos musculares de insectos ² e tecidos musculares explantados ³ . Os tecidos musculares de insetos permitem a operação de atuadores biológicos à temperatura ambiente.

A função eo desempenho de um biorobot são determinados principalmente pela força e consistência do atuador biológico ( ie. Células musculares), enquanto que a estrutura principal mecânica determina os mecanismos de locomoção, estabilidade e potência. Uma vez que estes dispositivos são exclusivamente movidos por forças geradas por células, não existem poluentes químicos ou ruídos operacionais. Portanto, eles formam uma alternativa de energia eficiente para outros robôs convencionais. Várias fontes da literatura discutiram os diferentes métodos para integrar células vivas e tecidos em biorobots ^{1 , 4 , 5} . Os avanços na microfabricação e técnicas de engenharia de tecidos permitiram o desenvolvimento de biorobôs que podem andar, segurar, nadar ou bombear ^{5 , 6} . Em geral, as células são cultivadas directamente sobre o esqueleto mecânico (polimérico) como uma folha de células confluentes ou são moldadas em estruturas de actuação tridimensionais dentro de andaimes tais como anéis e tiras. Na maioria das vezes, biorobots sãoFabricadas utilizando folhas de cardiomiócitos ^{6 , 7} , uma vez que estas células têm uma capacidade inata para exibir uma contracção espontânea sem estímulos externos. Por outro lado, os relatos sobre as folhas de células do músculo esquelético são limitados devido à sua necessidade de estímulos para iniciar as contrações in vitro , a fim de iniciar a despolarização da membrana ⁸ .

Este protocolo descreve, em primeiro lugar, como semear cardiomiócitos num actuador biológico funcionalizado feito de um cantilever PDMS fino. Em seguida, descreve em detalhes a semeadura e análise dos perfis de natação. O cantilever é funcionalizado com uma proteína adesiva celular tal como a fibronectina e é semeado confluentemente com cardiomiócitos. À medida que as células semeadas no dispositivo se contraem, elas fazem com que o cantilever se dobre e assim actue como um actuador. Ao longo do tempo, à medida que as células se amadurecem, rastreamos as mudanças no estresse superficial no dispositivo, analisando vídeosDobra em cantilever. O actuador biológico desenvolvido aqui pode ser utilizado para determinar as propriedades contrácteis de qualquer tipo de célula, tal como os fibroblastos ou células de caules pluripotentes induzidas, à medida que sofrem diferenciação.

Grande parte da pesquisa anterior sobre biorobôs foi focada no desenvolvimento de atuadores biológicos, enquanto a otimização da arquitetura biorobot e capacidades funcionais foram largamente negligenciadas. Recentemente, alguns estudos têm demonstrado a implementação de modos de natação em biorobôs que são inspirados pela natureza. Por exemplo, os biorobots de natação com movimento baseado em flagelos ⁶ , propulsão de água-viva ⁹ e raios bio-híbridos ⁴ foram projetados. Ao contrário de outros trabalhos na literatura, aqui nos concentramos em variar as propriedades da espinha dorsal mecânica para criar uma estrutura de auto-estabilização. O biorobot desenvolvido neste estudo é capaz de manter um passo constante, roll, e imMersion como ele nada. Estes parâmetros podem ser modificados variando a espessura de cada composto de base. Os passos de fabricação envolvidos no desenvolvimento do atuador PDMS, o biorobot submergível e a funcionalização do dispositivo são descritos detalhadamente na Parte 1 deste artigo em duas partes, bem como em nosso recente trabalho ^7. A técnica desenvolvida aqui pode pavimentar o Para o desenvolvimento de novos, altamente eficientes biorobots para várias aplicações, tais como entrega de carga.

O processo de isolamento seguido neste estudo é semelhante ao processo descrito em um trabalho anterior ¹⁰ , bem como em trabalhos recentemente publicados ⁷ . Os métodos de microfabricação utilizados para fabricar os actuadores PDMS e os dispositivos biorobot são descritos em pormenor na Parte 1 deste manuscrito de duas partes. A seção de protocolo deste manuscrito descreve os passos envolvidos na semeadura de cardiomiócitos no PDMS fabricado aE o biorobot após a sua funcionalização com proteínas adesivas celulares.

Protocol

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados utilizando um protocolo aprovado e de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame.

1. Semente e Cultura de Células

1. Antes de iniciar, prepare os itens necessários: um pequeno funil, pipetas e meio de Eagle modificado Dulbecco morno (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina (DMEM completo).
2. Tome frascos T-25 juntamente com o dispositivo funcionalizado (atuador biológico ou biorobot) dentro dele. Consulte a seção 4 da Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação do dispositivo, a funcionalização e o armazenamento antes da semeadura celular.
3. Prepare um funil, que pode ser feito rolando uma pequena folha quadrada de plástico. Coloque-o sobre o atuador biológico ou biorobot dentro do frasco T-25. Ajuste o diâmetro da extremidade mais larga para ajustar o dispositivo inteiroE a altura de modo a que encaixe confortavelmente quando o topo do balão é apertado.
   1. Para os biorobôs, use um íman para manter o dispositivo no lugar no fundo do frasco durante todo o processo de semeadura.
      Nota: Aqui, um único ímã de disco de neodímio (1,26 "de diâmetro) foi usado, mas qualquer ímã de tamanho e força semelhantes também pode ser usado para manter o biorobot com a base compósita magnética de níquel-PDMS.
   2. UV esterilizar a folha de plástico por pelo menos 30 min antes da utilização.
4. Certifique-se de que não haja um grande espaço entre a base do funil eo balão.
5. Ressuspender os cardiomiócitos em DMEM completo a uma densidade de 1,6 x 10 ⁷ células / mL e deixar cair lentamente 400 μL de suspensão para o dispositivo através do funil. Use um hemocitômetro ou qualquer outro contador de células para determinar o número de células obtidas.
6. Lentamente mover o sistema de volta para a incubadora sem perturbar o dispositivo eo funil witHin. Cultura durante 24 h a 37 ° C.
7. Após o período de incubação, retire lentamente o funil, lave cuidadosamente a amostra com PBS, e reabasteça o balão com 10 mL de DMEM fresco completo.
   Nota: Para os biorobôs, remova o íman para que o dispositivo flutue.

2. Caracterização bioquímica

1. Ensaio de fluxo de cálcio
   Nota: O ensaio de fluxo de cálcio é realizado para avaliar a interconectividade das células. O procedimento para carregar as células com o corante fluorescente, específico do ião cálcio, segue o processo descrito num protocolo previamente estabelecido ¹¹ .
   1. Primeiro, prepare os materiais requeridos, éster de fluo-4-acetometil (AM) de cálcio, poliol surfactante não iónico (ver Tabela de Materiais ) e solução de sal de Tyrode.
   2. Usando pinças longas, transferir suavemente o dispositivo do frasco de cultura para uma placa de Petri de 35 mm com 2 mL de solução salina de Tyrode Ção.
   3. Em um tubo de centrífuga separado, tomar 1 mL de solução de Tyrode quente (aquecida a 37 ° C) e adicionar 3-5 μL de corante de cálcio fluo-4 AM (concentração de trabalho: 3-5 μM) e uma parte igual de surfactante não iónico Poliol (concentração de trabalho: 0,2%). Substituir a solução da amostra por uma solução quente de Tyrode suplementada com o corante indicador de cálcio, fluo-4 e 0,2% de surfactante não iónico. Incubar durante 25 - 30 min a 37 ° C.
   4. Remover a solução de corante e lavar cuidadosamente a amostra com a solução fresca de Tyrode. Re-incubar a amostra em 2 mL de DMEM fresco completo durante mais 30 min a 37 ° C antes da imagem.
      Nota: Os resultados deste ensaio e vídeo relacionados são fornecidos no trabalho publicado anteriormente ⁷ .
2. Imunofluorescência
   Nota: A imunocoloração dupla de todas as amostras foi realizada seguindo o protocolo previamente estabelecido> 12.
   1. Primeiro, preparar 10% de soro de cabra (GS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), paraformaldeído a 4% (PFA) em diH2O, 0,1% de detergente de lise celular (ver Tabela de Materiais ) em PBS, anticorpos primários Anticorpos monoclonais de murganho monoclonal cardíaco troponina I e anticorpos monoclonais anti-coelho conexinas 43), anticorpos secundários (conjugado Alexa 594 e conjugado de cabra anti-IgG de rato anti-IgG de rato (Alexa 488) e DAPI.
      Cuidado: Paraformaldeído é cancerígeno.
   2. Remover a amostra de interesse do balão e lavá-la suavemente duas vezes com PBS. Consulte a seção 4 na Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação da amostra e a sua funcionalização.
   3. Adicione uma gotícula de PBS em uma pequena lamela (diâmetro: 12 mm ou 15 mm). Segure delicadamente a base do dispositivo com uma pinça e corte os braços PDMS finos (cantilever, Figura 1 ) usando tesouras da extremidade onde se conecta ao topo da baseE. Transfira os braços cantilever para a gotícula com o lado aderente à célula voltado para cima. A gota de PBS impedirá que as células seque.
   4. Fixar as amostras com PFA a 4% e realizar a imunomarcação dupla das amostras, como descrito anteriormente ¹² .
   5. Após a imunocoloração, montar as amostras em uma lâmina de vidro limpo usando anti-fade montagem reagente e reservado, sem ser perturbado, no escuro por 24 h.
   6. Repita o procedimento para todas as amostras.
      Nota: Os resultados deste ensaio e as imagens relacionadas são discutidos em profundidade no trabalho previamente publicado ⁷ .

3. Imagens

1. Colocar o frasco T-25 ereto numa incubadora de CO ₂ e preparar o sistema de imagem dentro da incubadora. Grave o dispositivo usando uma câmera (consulte a Tabela de Materiais ) com uma lente de zoom (consulte a Tabela de Materiais ). Para uma fonte de luz,Use uma faixa de luzes LED.
   Nota: Uma tira de LEDs de luz branca foi usada aqui, mas qualquer LED normal também funcionará.
2. Conecte a câmera a um sistema operacional e abra o software específico da câmera (consulte a Tabela de Materiais ). Clique na imagem da câmera embaixo da guia "Arquivo", no painel superior, para abrir todas as opções da câmera e escolha a câmera correta.
3. Escolha "live" na lista de guias no painel superior dentro do software.
4. Coloque manualmente a imagem em foco, ajustando o mostrador da lente. Selecione "Cortar para a região de interesse (ROI)" no painel superior. Em seguida, desenhe manualmente um retângulo na moldura de vídeo, encerrando o dispositivo de atuador biológico e os braços em consola, para marcar o ROI.
   Nota: Escolher um ROI adequado minimiza o tamanho dos ficheiros de imagem.
   1. No caso de biorobots, capturar toda a tela, a fim de gravar o movimento de natação do dispositivo.
      NOTA: Não há necessidade de desenhar um ROI para os biorobôs
5. Antes de iniciar a gravação, selecione "Configurações da câmera" em uma das guias no painel superior da tela. Defina a taxa de quadros ajustando a relação de exposição e pixel da imagem ao vivo, deslizando a barra para cada um ou inserindo manualmente os valores. Defina as taxas de quadros para cerca de 30 ± 2 fps.
   Nota: Alterar a relação de exposição e pixel altera o brilho eo contraste da imagem ao vivo.
6. Clique no botão "Gravar" do painel superior do software para começar a gravar os vídeos dos atuadores com resolução de 1.000 x 1.000 pixels para precisamente 30 s. Repita o processo para todas as amostras.

4. Análise de imagem dos atuadores biológicos em uma base estacionária

1. Analise as imagens usando um software de programação ( por exemplo, Matlab) executando o script personalizado. Veja a Tabela de Materiais Arquivo Suplementar para mais detalhes.
   Nota: O script exibe cada quadro dos vídeos gravados, recebe a entrada do mouse do usuário para registrar a coordenação dos pontos do cantilever nas imagens, calcula o diâmetro e o centro do círculo que passa os pontos introduzidos por meio do encaixe pelo menos quadrado e Exporta todos os dados introduzidos e calculados para utilização posterior.
   1. Abra o software de programação clicando no ícone. Clique em "Arquivo" -> "Abrir" na barra de menu na parte superior e selecione o arquivo de script .m para análise de imagem. Verifique se as imagens TIFF gravadas estão na mesma pasta que o arquivo .m. Clique em "Executar" para executar o script.
      Nota: Uma tela interativa aparecerá para alterar.
   2. Pressione "play" para iniciar o programa real. Clique no botão "abrir" e localize o arquivo TIFF que vai ser analisado.
   3. Clique no botão "base & #34; Botão e, em seguida, clique no ponto onde o cantilever atribui à base no topo; Pressione Enter. Isto irá colocar um marcador quadrado na imagem para cada quadro para denotar a localização da base cantilever.
   4. Clique no botão "Escala" e, em seguida, clique manualmente em uma borda do grânulo de vidro. Traga o ponteiro do mouse para o lado oposto da conta de vidro e pressione "Enter".
      Nota: Isto deve traçar uma linha que mede o diâmetro do cordão de vidro. Uma vez que o rebordo de vidro tem 3 mm de diâmetro, isto irá relacionar 3 mm com os pixels apresentados.
   5. Clique no botão "Analisar". Clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever.
   6. Clique no botão "Analisar". Em seguida, clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever. Continue a clicar ao longo do cantilever, incluindo a ponta, e pressione enter quandofeito. Isto colocará um "x" em cada ponto clicado no cantilever.
      Nota: Com base na coordenação do marcador quadrado e nos marcadores x, o centro e o diâmetro de um círculo serão calculados usando uma função de encaixe pelo menos quadrada (consulte o arquivo suplementar anexado para o script utilizado). O círculo, que passa os marcadores x eo criador de quadrados, será sobreposto automaticamente à imagem.
   7. Verifique se o círculo sobreposto traça corretamente o perfil do cantilever.
      Nota: Quando o cantilever é muito plano, é difícil julgar se o perfil do cantilever é traçado corretamente. Consulte a Figura 3 .
   8. Clique no botão "próximo quadro". Isto irá mudar para o próximo quadro no ficheiro TIFF. A base ea escala já estão definidas a partir da etapa anterior.
   9. Repita as etapas 4.1.5 até 4.1.7 até que todos os quadros no arquivo TIFF tenham sido concluídos. Uma vez que todos os quadros foram proceSsed, clique no botão "Exportar".
      Nota: Isso fará um arquivo de planilha com o nome do arquivo TIFF para o cantilever que acabou de ser analisado. Edite o nome do arquivo para incluir qual lado (esquerdo ou direito) do cantilever foi analisado.
2. Calculando o estresse na planilha.
   1. Calcule a tensão superficial "σ" no cantilever usando a seguinte equação:
      
      Onde E, R, v e h são o módulo de Young, o raio de curvatura, a razão de Poisson ea espessura em consola, respectivamente.
      Nota: A espessura do cantilever pode ser alterada para alterar a sensibilidade. Neste estudo, os valores foram os seguintes: E = 750 kPa, v = 0,49 e h = 25 μm ^{13 , 14} .
   2. Calcular a tensão superficial utilizando a equação do passo 4.2.1. Abra o .Xls arquivo de planilha. Observe que a saída tem várias colunas mostrando primeiro as coordenadas x e y de base e círculo e, em seguida, o raio de curvatura. Calcule as coordenadas xey de cada ponto clicado com base nestes.
      Nota: A representação gráfica das tensões sobre os quadros de imagem de intervalo de tempo mostra mudanças na força exercida sobre o cantilever ao longo do tempo. As depressões mostram o estresse sobre o cantilever durante o relaxamento dos cardiomiócitos ou a tensão estática exercida sobre o cantilever devido às forças de tração celular. Os picos mostram o estresse dinâmico no cantilever, que foi exercido pelo batimento dos cardiomiócitos. Este valor corresponde à quantidade máxima de força gerada pela contracção dos cardiomiócitos.

5. Análise de Natação Biorobots

1. Registre a posição do biorobot usando o software de análise de imagens.
   Nota: Consulte a lista de Materiais para o softwareÉ seção.
   1. Abra o software de análise de imagem ( por exemplo, ImageJ). Pressione "Arquivo" e "Abrir" e selecione o arquivo de vídeo biorobot natação. Clique em "OK" e deixe o programa carregar o arquivo. Abra o software da folha de cálculo.
   2. No vídeo biorobot carregado, encontre uma referência de dimensões conhecidas ( por exemplo, o rebordo de vidro de 3 mm de diâmetro que foi incorporado no atuador biológico).
      Nota: Qualquer objeto com dimensão conhecida funcionará. Isso determinará as proporções de pixel para comprimento em cada vídeo.
   3. Use a ferramenta "Straight" para desenhar uma linha em toda a pérola de vidro. Clique em "Analisar" e selecione "Definir escala". Defina o campo "Distância conhecida" para "3.000 μm" e clique em "Ok".
      Nota: Isto irá definir as coordenadas x e y para micrômetros.
   4. Escolha um ponto no dispositivo que não oscila entre quadros para agir como um marcador.
      Nota:Recomenda-se escolher um canto da base.
   5. Aponte para o ponto selecionado em 5.1.4 no primeiro quadro. Registre as coordenadas x e y na planilha.
   6. Volte para a janela do software de análise de imagem e pressione a tecla de seta para a direita para mudar para a próxima moldura. Aponte novamente para o marcador (a partir do passo 5.1.4) e registre as coordenadas x e y na planilha.
   7. Repita o passo 5.1.6 para todos os quadros.
2. Calcule os parâmetros de natação do biorobot usando a planilha de coordenadas ⁷ .
   1. Calcule o período entre quadros a partir da taxa de quadros conhecida de cada vídeo.
   2. Calcule a mudança nas coordenadas x e y entre quadros para encontrar a distância movida, incluindo a distância total.
   3. Calcule a amplitude de contração da mudança máxima ao longo do eixo y. Determine a frequência de batimento para cada biorobot do inverso do período entre duas contrações.
   4. CCalcular a velocidade de natação de cada dispositivo a partir do tempo total e da distância movida na direção x.
   5. Repita o passo 5.2 para cada vídeo biorobot que foi analisado.
   6. Normalize cada parâmetro medido.
      Nota: Normalize todos os valores para melhor visualizar as diferenças. Este protocolo demonstra normalização com relação a um biorobot de modo horizontal com contrações de baixa frequência (LF horizontal) ( Figura 4 ) ⁷ .

6. Análise da Expressão de Proteína

Nota: As amostras montadas preparadas nos passos 2.2.4 e 2.2.5 foram visualizadas utilizando um microscópio confocal. As imagens foram adquiridas em amplificação 20X, 40X e 60X sequencialmente em três canais simultaneamente: 460 nm, 488 nm e 594 nm. Um conjunto de 5 imagens foram capturadas a uma ampliação de 40X, a partir de posições diferentes para cada amostra, e cada canal foi guardado como um indivíduo.Arquivo. O ajuste de exposição foi determinado pela ampliação do objectivo utilizado e foi fixado constante para todas as capturas nessa ampliação.

1. Abra o software de análise de imagem e selecione "Arquivo" -> "Abrir" para carregar as imagens.
2. Desenhe um polígono retangular na moldura da imagem para marcar o ROI. Selecione "Analisar" -> "Medir" para medir a intensidade fluorescente média.
3. Repita o passo 6.2 para coletar medições de intensidade de todas as amostras e calcular a respectiva intensidade média para cada condição.
   Nota: Aqui, uma condição diferente refere-se a diferentes pontos de tempo, como em, dia 1, dia 2 e até dia 6.
4. Exporte os resultados em uma planilha para análise estatística adicional e para a produção de gráficos de dados.

Representative Results

O atuador biológico feito de um cantilever PDMS fino (25 μm de espessura) e cardiomiócitos constitui o núcleo do biorobot de natação, conforme mostrado na esquemática e captura de tela dos dispositivos na Figura 1 . As células começam a apresentar contracções após 24 h em cultura e a flexão dos braços em consola foi observada até ao dia 2. O perfil lateral do dispositivo foi registado todos os dias e o stress superficial foi quantificado a partir da dobra dos braços em consola utilizando um Script de análise de imagem personalizado ⁷ . As tensões estática e dinâmica foram extraídas do estresse superficial em cada dia ( Figura 2a ). Observe que o estresse estático (força de tração da célula) é o estresse contrátil que as células exibem na superfície em seu estado de repouso e o estresse dinâmico (força de contração celular) é o estresse gerado pelas células na contração máxima.

Figura 2a ). Houve um grande desvio padrão na medida de forças devido a diferenças na maturação celular entre diferentes amostras. As células exibiram uma força de tração celular máxima de 50 mN / m e uma força de contração máxima de cerca de 165 mN / m no dia 6. A análise de todos os dados individuais para amostras múltiplas mostrou uma forte correlação positiva entre as tensões estática e dinâmica, Mostrou um aumento ao longo do tempo.

Para quantificar a maturação dos cardiomiócitos ao longo do tempo, os níveis de expressão de algumas das proteínas estruturais e funcionais dos cardiomiócitos, tais como a troponina I cardíaca, a conexin-43 da proteína da junção gap e a filina de actinaSt, foram calculados. Conforme observado na Figura 2b , observou-se um aumento constante das medições de intensidade ao longo do tempo, correspondendo à expressão das respectivas proteínas. Este aumento na expressão da proteína confirma a maturação das células (troponina I cardíaca) ¹⁵ , crescimento e disseminação celular ( ou seja, aumento da expressão de actina) e aumento da interconectividade celular ( ou seja, aumento do número de junções entre lacunas).

As tensões estática e dinâmica traçadas na Figura 2a foram quantificadas usando um script de computador personalizado, conforme descrito na seção anterior. Uma vez que as imagens gravadas do atuador biológico foram carregadas no sistema, o script permitiu o rastreamento do movimento do braço em consola com a ajuda de marcadores manualmente atribuídos, como mostrado na Figura 3 . Um aumento gradual do ângulo de flexão do cantileVer braços foi observado ao longo do tempo em cultura, o que correspondeu ao aumento da contração dinâmica e estática força de tração celular exibido pelas células ⁷ . Os resultados do ensaio de fluxo de cálcio e do vídeo relacionado são fornecidos no trabalho previamente publicado ⁷ .

Os biorobôs exibiram contracções espontâneas no dia 2 após a semeadura celular e foram capazes de nadar ativamente horizontalmente por até 10 dias. Devido ao equilíbrio de força entre o peso do biorobot e a flutuabilidade, o dispositivo manteve uma posição estável na interface ar / meio. O deslocamento ou movimento dos biorobots foi impulsionado pelas contrações síncronas dos cardiomiócitos, o que causou a flexão dos braços finos em consola e funcionou como um atuador. Observou-se que a velocidade dos biorobots e a distância percorrida com cada curso diminuíram após 6 d em cultura. Uma vez que as células musculares usamD neste estudo foram cardiomiócitos primários isolados de ratos neonatais, a população de células semeadas também continha outros tipos celulares, como os fibroblastos cardíacos, que são altamente proliferativos ¹⁶ . À medida que os fibroblastos cardíacos proliferam e se espalham ao longo do tempo em cultura, podem suprimir a contratilidade dos cardiomiócitos. O resultado é consistente com outros estudos que mostraram que a atividade das células primárias declina inerentemente após a primeira semana em cultura ¹⁶ . Em pesquisas futuras, a cultura celular poderia ser tratada com agentes anti-mitogênicos para bloquear a proliferação de não miócitos para aumentar a vida útil dos biorobôs.

Observamos que o ângulo de repouso do braço em consola após a fabricação determinou o perfil de natação dos biorobôs, proporcionando um modo horizontal ou vertical aos perfis de natação dos biorobôs. Aqui, "horizontal" e "vertical"Al "referem-se ao ângulo de repouso do cantilever em relação a um eixo horizontal e não se referem à direcção do movimento de natação ^7. Os biorobots verticais tinham um ângulo de repouso de cerca de 110 ° e contraíram-se num ângulo de 90 °, Os biorobôs de modo horizontal apresentaram um ângulo de repouso de cerca de 45 ° e contraíram-se em torno do eixo horizontal (0 °) e observaram-se uma ampla gama de frequências de batimento em todas as amostras e classificaram-nas, em geral, como de alta frequência ) Ou o modo de baixa frequência (LF) A Figura 4 compara a velocidade, a frequência de batimento ea distância percorrida para um único golpe para três tipos principais de biorobots: HF horizontal, horizontal LF e modo vertical Os biorobôs HF horizontais exibiram uma média Freqüência de batimento de 1,6 ± 0,417 Hz, enquanto os biorobots LF horizontais mantiveram uma constante 1,09 ± 0,134 Hz. Embora os biorobôs verticais exibiram apenas 0,86 ± 0,07 Hz, eles exhiBited uma velocidade de natação maior de 142 μm / s e exibiu a maior distância percorrida a 160 ± 642 μm. Por outro lado, o LF horizontal percorreu cerca de 48 ± 21,2 μm com cada curso a uma velocidade de 67,3 μm / se o biorobot HF horizontal teve uma velocidade de 84,4 μm / se cobriu uma distância de 61,5 ± 17,7 μm por curso .

Figura 1: Atuador Biológico e Biorobot. ( A ) Esquema do actuador biológico semeado com uma folha de células confluentes em estado relaxado e contraído (painel de topo) e uma captura de ecrã do dispositivo em cultura (painel de fundo). Conforme ilustrado na figura, o atuador biológico é composto por um cantilever PDMS fino e funcionalizado (25 μm de espessura) semeado com uma folha de cardiomiócitos. Este atuador forma o núcleo do biorobot de natação, também como mostrado. ( B </ Strong>) Esquema de um biorobot de braço único semeado com uma folha de células confluentes (painel superior) e uma captura de tela do dispositivo em cultura (painel de fundo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise Biomecânica dos Cardiomiócitos. ( A ) A força de contração dinâmica ea força de tração da célula estática aumentaram à medida que os cardiomiócitos amadureceram; Tamanho da amostra = 6 para cada parâmetro. O estresse dinâmico e estático expresso pelas células aumentou ao longo do tempo à medida que as células amadureceram e desenvolveram-se em cultura. Uma força estática máxima de 50 mN / me uma força de contração dinâmica de 165 mN / m foram observadas no dia 6. ( B ) Quantificação da intensidade de fluorescência para os marcadores de proteína troponina cardíaca-I, conexinas-43, e actina; Tamanho da amostra = 4 para cada parâmetro. O sinal de fluorescência para os três marcadores aumentou ao longo da cultura, sugerindo um aumento na expressão destas proteínas funcionais ao longo do tempo em cultura. As barras de erro em (A) e (B) representam o desvio padrão para cada parâmetro quantificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação dos cálculos ROC: Radius of Curvature (ROC) usando um Script de análise de imagem personalizado. A ROC encontrada durante uma contração é ilustrada na figura. Múltiplos pontos são colhidos manualmente ao longo do cantilever, mostrado como um pequeno "X" verde. Uma vez entrado para o cálculo, um círculo do melhor-ajuste é desenhado para os pontos fornecidos, como mostraN pelo círculo verde que atravessa o cantilever. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação da Velocidade Média da Nadada, da Freqüência de Batendo e da Distância para 3 Biorobots com Perfis de Natação Diferentes: Horizontal Baixa Frequência (Horizontal LF), Horizontal Alta Freqüência (HF Horizontal) e Vertical. As medições são normalizadas para o valor de LF horizontal. As barras de erro representam o desvio padrão relativo para cada parâmetro quantificado. Os LF e HF horizontais tinham cada um braço cantilever com um ângulo de repouso ao longo do eixo horizontal e exibiram frequências de batimento de 1,09 ± 0,134 Hz ​​e 1,59 ± 0,417 Hz e velocidades de natação de 67,3 μm / s e 84,4 μm / s respectivamenteMente. O biorobot vertical exibiu uma frequência de batimento de 0,862 ± 0,075 Hz e uma velocidade média de natação de 142 μm / s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O procedimento descrito aqui descreve um método de sementeira bem sucedido para actuadores e biorobots baseados em PDMS, o que facilita a ligação de cardiomiócitos. Além disso, foi descrito o processo de aquisição de imagem e a subsequente análise que caracteriza o comportamento das células eo desempenho dos dispositivos.

Observamos a contração espontânea de células nos braços cantilever após 24 h; A intensidade das contrações continuou a aumentar de forma constante ao longo do tempo e atingiu um máximo no dia 6, após o que a intensidade diminuiu lentamente. Embora os braços cantilever do atuador biológico tenham apenas 4 mm de comprimento, observaram-se grandes deflexões até 2,5 mm, especialmente após 6 dias em cultura. O baixo módulo de Young (750 kPa) ea ultra-baixa espessura do cantilever (25 μm) permitiram grandes deflexões, o que resultou na forte propulsão dos biorobôs. Para avaliar a característica mecânicaS dessas células, quantificamos as forças de contração e tração da célula geradas em cada dia. Os cantilevers de película fina têm sido utilizados para medir a contratilidade eo estresse mecânico induzido por cardiomiócitos ou outras células musculares ^{13 , 17} .

A força de contração dinâmica máxima medida de 165 mN / m neste estudo é comparável à literatura ¹³ , onde as células semeadas em cantilever de hidrogel exibiram uma tensão sistólica de cerca de 82,8 ± 22,4 mN / m. As forças medidas e o aumento do estresse ao longo do tempo foram relati- vos à maturação das células semeadas no dispositivo, como visto a partir do correspondente aumento na expressão da proteína contrátil e citoesquelética. O acoplamento eletromecânico também aumentou ao longo do tempo, como pode ser observado a partir de um aumento na expressão da proteína de junção gap conexinas-43.

O dispositivo biorobot desenvolvido aqui enquadra-se na categoriaDe nadadores ostraciiformes ¹⁸ , onde a propulsão é proporcionada pelo abanar de uma cauda e a deflexão é limitada à barbatana caudal. A velocidade máxima da nadada de 142 μm / s, exibida pelo biorobot de modo vertical, está entre os valores medidos de outros biorobots de natação popular na literatura, que são biorobots com base em flagelos com velocidades de cerca de 9,7 μm / s ⁶ e propulsão a jato Modo com velocidades de 6 - 10 mm / s ⁹ .

Nos últimos anos, muitas máquinas biológicas ou biorobots foram desenvolvidas usando materiais macios, elásticos, como PDMS e hidrogéis, e são semeadas com células musculares contrácteis. Andar e nadar biorobots ganharam maior foco como uma alternativa aos robôs tradicionais devido ao seu potencial para funcionar como eficiente em energia, ágil robôs com auto-reparação potenciais ^{1 , 5} . Ao contrário de outros biorobots emA literatura, o biorobot desenvolvido neste estudo pode manter seu próprio passo, rolo e profundidade de imersão ⁷ . No entanto, a longevidade das células cardíacas utilizadas aqui é uma das maiores limitações, como a vida é limitada a 10 d. Para ultrapassar esta limitação, os tipos de células contrácteis de outras espécies podem ser utilizados para conduzir o dispositivo, em vez de células derivadas de mamíferos. Por exemplo, várias obras de Akiyama et al. Têm explorado o uso de células de asa de insetos contráteis para atuação, uma vez que têm uma vida útil mais longa e podem sobreviver à temperatura atmosférica ² .

Atualmente, as células são cultivadas isotropicamente na superfície em consola, o que limita a força contrátil líquida gerada. Em estudos futuros, uma das possíveis modificações que podem ser incluídas será incorporar micropatterns nos cantilevers para alcançar o alinhamento anisotrópico das células semeadas ⁹ . Além disso, electrOdes poderiam ser inseridos para estimulação elétrica para aumentar a força gerada pelas células ⁴ . Com o avanço contínuo na tecnologia e nas técnicas de fabricação, estes dispositivos podem pavimentar a maneira para o desenvolvimento de máquinas biológicas novas com aplicações diversas, tais como a entrega da carga. Por exemplo, a base do biorobot desenvolvida aqui pode ser facilmente modificada para transportar pequenas embalagens ( ou seja, carga) ⁷ . Portanto, neste trabalho, nós fornecemos uma abordagem alternativa para desenvolver um biorobot, focando em variando as propriedades do backbone mecânico para criar uma estrutura de auto-estabilização. Além disso, o actuador biológico desenvolvido aqui pode ser utilizado para determinar a tensão contráctil de outros tipos de células, tais como fibroblastos e células estaminais pluripotentes induzidas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software