Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Cardiac Muscle Cell-baserad Actuator och självstabiliserande Biorobot - Del 2

Published: May 9, 2017 doi: 10.3791/55643
* These authors contributed equally

Summary

I denna studie utsöndras ett biologiskt manöverdon och en självstabiliserande, badbiorobot med funktionaliserade elastomerkaroler, kardiomyocyter, odlade och karakteriseras för deras biokemiska och biomekaniska egenskaper över tiden.

Abstract

Under de senaste åren har hybridanordningar som består av en levande cell eller vävnadskomponent integrerad med en syntetisk mekanisk ryggrad utvecklats. Dessa enheter, som kallas biorobots, drivs enbart av kraften som genereras av den levande komponentens kontraktile aktivitet och kan på grund av deras många inneboende fördelar vara ett alternativ till konventionella helt artificiella robotar. Här beskriver vi metoderna för utsäde och karakteriserar ett biologiskt manöverdon och en biorobot som konstruerades, tillverkades och funktionaliserades i den första delen av denna tvådelade artikel. Tillverkat biologiskt manöverdon och biorobotanordningar sammansatta av en polydimetylsiloxan (PDMS) bas och en tunnfilmslösning funktionaliserades för cellfästning med fibronektin. Efter funktionalisering såddes neonatala råttkardiomyocyter på PDMS-cantileverarmen vid en hög densitet vilket resulterade i ett sammanflödande cellark. Enheterna avbildades varje dag och cantiens rörelseHävarmarna analyserades. På den andra dagen efter sådd observerade vi böjningen av cantileverarmarna på grund av de krafter som cellerna utövade under spontana sammandragningar. Vid kvantitativ analys av cantilever-böjningen observerades en gradvis ökning av ytspänningen som utövades av cellerna när de mognades med tiden. På samma sätt observerade vi rörligheten för biorobot på grund av aktiveringen av PDMS cantilever armen, vilken fungerade som en fin. Vid kvantifiering av apparatens simningsprofiler observerades olika framdrivningsmetoder, vilka påverkades av finens vilodinkel. Rörelsesriktningen och slagfrekvensen bestämdes också av vilans vinklingsvinkel och en maximal svänghastighet av 142 | im / s observerades. I det här manuskriptet beskriver vi förfarandet för att fylla de tillverkade enheterna med kardiomyocyter, liksom för bedömningen av det biologiska aktuatorn och biorobotaktiviteten.

Introduction

Biorobots är enheter baserade på levande celler som ingår i en mekanisk ryggrad som vanligtvis består av mjuka, elastiska material, såsom PDMS eller hydrogeler 1 . Cellerna genomgår rytmiska sammandragningar, antingen spontant eller som reaktion på stimuli, och fungerar således som ett ställdon. Effekten som genereras av cellkontraktion driver olika biorobot. Mammaliska hjärtceller (kardiomyocyter) och skelettmuskelceller används ofta för biorobotaktivering på grund av deras kontraktila egenskaper. Bortsett från kardiomyocyt- och skelettmuskelceller har andra celltyper, såsom insektsmuskulaturvävnader 2 och explanterade muskelvävnader 3 , använts. Insektsmuskulaturen möjliggör drift av biologiska ställdon vid rumstemperatur.

Funktionen och prestanda hos en biorobot bestäms huvudsakligen av det biologiska ställdonets styrka och konsistens ( dvs.. Muskelceller), medan den mekaniska ryggradstrukturen primärt bestämmer mekanismerna för rörelse, stabilitet och kraft. Eftersom dessa enheter drivs enbart av krafter som alstras av celler finns det inga kemiska föroreningar eller driftsljud. Därför bildar de ett energieffektivt alternativ till andra konventionella robotar. Olika litteraturkällor har diskuterat de olika metoderna för att integrera levande celler och vävnader i biorobot 1 , 4 , 5 . Framsteg inom mikrofabrikation och vävstekniksteknik har möjliggjort utvecklingen av biorobot som kan gå, greppa, simma eller pumpa 5 , 6 . I allmänhet odlas cellerna direkt på den mekaniska (polymera) ryggraden som ett sammanflödande cellark eller de formas till tredimensionella påverkande strukturer i byggnadsställningar såsom ringar och remsor. Oftast är biorobotsTillverkad med användning av kardiomyocytskikt 6 , 7 , eftersom dessa celler har en medfödd förmåga att uppvisa spontan sammandragning utan yttre stimuli. Å andra sidan är rapporter om skelettmuskelcellskikt begränsade grund av deras behov av stimuli att initiera sammandragningar in vitro för att initiera membranav depolarisation 8 .

Detta protokoll beskriver först hur man fröser kardiomyocyter på ett funktionaliserat biologiskt manöverdon som är tillverkat av en tunn PDMS cantilever. Det beskriver sedan i detalj sådd och analys av simningsprofilerna. Cantileverfunktionen är funktionaliserad med ett cellhäftande protein, såsom fibronektin, och ympas konfluktivt med kardiomyocyter. När cellerna utsöndras på anordningskontraktet orsakar de cantilever att böja och således fungera som ett ställdon. Med tiden som cellerna mognar spårar vi förändringarna i ytspänningen på enheten genom att analysera videor avCantilever böjning. Det biologiska aktuatorn som utvecklats här kan användas för att bestämma kontraktilegenskaperna hos vilken celltyp som helst, såsom fibroblasterna eller inducerade pluripotenta stamceller, då de genomgår differentiering.

Mycket av den tidigare forskningen om biorobots har varit inriktad på att utveckla biologiska ställdon, medan optimering av biorobotarkitekturen och funktionella kapaciteter i stor utsträckning ignorerades. Nyligen har några studier visat genomförandet av simningslägen i biorobotter som är inspirerade av naturen. Till exempel har simning biorobot med flagellabaserad rörelse 6 , maneter framdrivning 9 och biohybrid strålar 4 konstruerats. Till skillnad från andra verk i litteraturen fokuserar vi här på att variera egenskaperna hos den mekaniska ryggraden för att skapa en självstabiliserande struktur. Den biorobot som utvecklats i denna studie kan upprätthålla en konstant tonhöjd, rulle och imMersion djup när det svimmar. Dessa parametrar kan modifieras genom att variera tjockleken hos varje baskomposit. Tillverkningsstegen involverad i att utveckla PDMS-manöverdonet, den nedsänkbara bioroboten och funktionaliseringen av anordningen beskrivs i detalj i del 1 i denna tvådelade artikel, liksom i vårt senaste arbete 7. Tekniken som utvecklas här kan bana Sätt för utveckling av nya, högeffektiva biorobots för olika tillämpningar, såsom lastleverans.

Den isoleringsprocess som följdes i denna studie liknar processen som beskrivits i ett tidigare arbete 10 , liksom i nyligen publicerade arbetet 7 . Mikrofabrikationsmetoderna som används för tillverkning av PDMS-manöverdon och biorobotanordningar beskrivs i detalj i del 1 i detta tvådelade manuskript. Protokolldelen i detta manuskript beskriver stegen involverade i såddkardiomyocyter på det tillverkade PDMS aCtuator och biorobot efter deras funktionalisering med cellhäftande proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs här har utförts med hjälp av ett godkänt protokoll och i enlighet med bestämmelserna i Institutionen för djurvård och användningskommitté vid University of Notre Dame.

1. Cellsåkning och kultur

  1. Innan du börjar, förbered de nödvändiga föremålen: en liten tratt, pipetter och varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) och 1% Penicillin antibiotikum (DMEM komplett).
  2. Ta T-25 flaskor tillsammans med den funktionaliserade enheten (biologiskt ställdon eller biorobot) inuti det. Se avsnitt 4 i del 1 i detta tvådelade manuskript för detaljer angående apparatberedning, funktionalisering och lagring före cellsåkning.
  3. Förbered en tratt, som kan göras genom att rulla ett litet plastplåt. Placera den över det biologiska ställdonet eller biorobot inuti T-25-kolven. Justera diametern på den bredare änden för att passa hela enhetenOch höjden så att den passar tätt när flaskans övre del är åtdragen.
    1. För biorobotsna, använd en magnet för att hålla enheten på plats under botten av kolven under såddprocessen.
      Anm: Här användes en enda neodymisk skivmagnet (1,26 tum), men en magnet av samma storlek och styrka kan också användas för att hålla bioroboten fast med den kompositbaserade magnetiska nickel-PDMS-basen.
    2. UV-sterilisera plastplattan i minst 30 min före användning.
  4. Se till att det inte finns ett stort gap mellan trattens botten och kolven.
  5. Resuspendera kardiomyocyterna i DMEM komplett med en densitet av 1,6 x 107 celler / ml och sakta sakta ned 400 μl suspension på anordningen genom tratten. Använd en hemocytometer eller någon annan cellräknare för att bestämma antalet celler som erhållits.
  6. Långsamt flytta systemet tillbaka in i inkubatorn utan att störa enheten och tratten vitthin. Kultur under 24 timmar vid 37 ° C.
  7. Efter inkubationstiden tar du långsamt traven, tvättar försiktigt provet med PBS och fyller kolven på nytt med 10 ml frisk DMEM.
    Obs! För biorobotsna, ta bort magneten så att enheten är flytande.

2. Biokemisk karaktärisering

  1. Kalciumflödesanalys
    Anm .: Kalciumflödesanalysen utförs för att bedöma cellanslutningsförmågan. Förfarandet för att ladda cellerna med det fluorescerande, kalciumjonspecifika färgämnet följer förfarandet beskrivet i ett tidigare etablerat protokoll 11 .
    1. Först bereder du de nödvändiga materialen, kalciumfluoro-4-acetometyl- (AM) -estern, nonjonisk ytaktivt polyol (se Materialetabell ) och Tyrodes saltlösning .
    2. Använd långa pincett, försiktigt överföra enheten från odlingskolven till en 35 mm petriskål med 2 ml Tyrode saltlösning tion.
    3. I ett separat centrifugrör ta 1 ml varm Tyrode-lösning (värmd till 37 ° C) och tillsätt 3-5 μl lager kalciumfluoro-4 AM färgämne (arbetskoncentration: 3-5 μM) och en lika stor del av nonjonisk tensid Polyol (arbetskoncentration: 0,2%). Ersätt provlösningen med varm Tyrode lösning kompletterad med kalciumindikatorfärgen, fluo-4 och 0,2% nonjoniskt ytaktivt medel. Inkubera i 25 - 30 min vid 37 ° C.
    4. Ta bort färglösningen och tvätta försiktigt provet med färsk Tyrode lösning. Reinkubera provet i 2 ml färsk DMEM färdigt under ytterligare 30 minuter vid 37 ° C före bildning.
      Obs: Resultaten av denna analys och relaterad video finns i det tidigare publicerade arbetet 7 .
  2. immunofluorescens
    Obs: Dubbel immunförstärkning av alla prover utfördes enligt tidigare fastställt protokoll> 12.
    1. Först bereder du 10% getsserum (GS) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) i diH20, 0,1% celllysmedel (se tabell över material ) i PBS, primära antikroppar Monoklonala antikroppskardon troponin-I och anti-kaninmonoklonal antikropp konnexiner-43), sekundära antikroppar (Alexa 594 konjugat och get-anti-mus IgG (H + L) Alexa 488 konjugat) och DAPI.
      Varning: Paraformaldehyd är cancerframkallande.
    2. Ta bort provet av intresse från kolven och tvätta det försiktigt två gånger med PBS. Se avsnitt 4 i del 1 i detta tvådelade manuskript för detaljer om provberedning och funktionalisering.
    3. Lägg en droppe av PBS på en liten täckglas (diameter: 12 mm eller 15 mm). Håll försiktigt basen på enheten med pincett och skär de tunna PDMS armarna (cantilever, Figur 1 ) med hjälp av sax från slutet där den ansluter till toppen av basene. Överför de lutande armarna på droppen med den cellhäftande sidan uppåt. PBS-droppen kommer att förhindra att cellerna torkar.
    4. Fixa proven med 4% PFA och utföra dubbel immunförstärkning av proven, som beskrivits tidigare 12 .
    5. Efter immunförstärkning montera proven på en ren glasskiva med hjälp av anti-fade monteringsreagens och lägg åt sidan, ostörd, i mörkret i 24 timmar.
    6. Upprepa proceduren för alla prover.
      Obs: Resultaten av denna analys och de relaterade bilderna diskuteras djupt i det tidigare publicerade arbetet 7 .

3. Bildbehandling

  1. Placera T-25-kolven upprätt i en CO 2- inkubator och förbered bildesystemet inuti inkubatorn. Spela in enheten med en kamera (se materialet ) med ett zoomobjektiv (se materialet ). För en ljuskälla,Använd en remsa av LED-lampor.
    Obs! En remsa med vitljusdioder användes här, men alla normala lysdioder kommer också att fungera.
  2. Anslut kameran till ett operativsystem och öppna den kameraspecifika programvaran (se materialet ). Klicka på kamerabilden under fliken "Arkiv" i överpanelen för att öppna alla kamerans alternativ och välj rätt kamera.
  3. Välj "live" från listan över flikar på den övre panelen i programvaran.
  4. Lägg in bilden manuellt genom att justera linsskivan. Välj "Beskär till region av intresse (ROI)" från överpanelen. Dra sedan en rektangel manuellt i videobilden, som omslutar det biologiska ställdonet och de vridbara armarna, för att markera avkastningen.
    Obs! Om du väljer en lämplig avkastning minimeras storleken på bildfilerna.
    1. I händelse av biorobots, fånga hela skärmen för att spela in simning av enheten.
      OBS! Det finns ingen anledning att dra en avkastning på biorobotten
  5. Innan du börjar spela in, välj "Kamerainställningar" från en av flikarna i den övre panelen på skärmen. Ställ in bildfrekvensen genom att justera exponerings- och pixelförhållandet för den levande bilden genom att glida fältet för varje eller genom att manuellt mata in värdena. Ställ in bildhastigheterna till cirka 30 ± 2 fps.
    Obs! Om du ändrar exponerings- och pixelförhållandet ändras ljusstyrkan och kontrasten för den levande bilden.
  6. Klicka på "Spela in" -knappen från överpanelen i programvaran för att börja spela in videoklipp av manöverdon med en 1000 x 1000 pixel upplösning för exakt 30 s. Upprepa processen för alla prover.

4. Bildanalys av de biologiska aktuatorerna på en stationär bas

  1. Analysera bilderna med hjälp av en programmeringsprogramvara ( t.ex. Matlab) som kör det anpassade skriptet. Se materialets tabell kompletterande filen för ytterligare detaljer.
    Obs! Skriptet visar varje bild av de inspelade videoklippen, mottar användarens musingång för att spela in koordinering av punkterna på cantileveren på bilderna, beräknar diametern och centrumet av cirkeln som passerar de inmatade punkterna via minst kvadratisk montering och Exporterar alla inmatade och beräknade data för vidare användning.
    1. Öppna programmeringsprogrammet genom att klicka på ikonen. Klicka på "File" -> "Open" från menyraden längst upp och välj .m-skriptfilen för bildanalys. Kontrollera att inspelade TIFF-bilder finns i samma mapp som .m-filen. Klicka på "Kör" för att köra skriptet.
      Obs! En interaktiv visning kommer dyka upp för att ändra.
    2. Tryck på "play" för att starta det aktuella programmet. Klicka på "öppna" -knappen och leta reda på TIFF-filen som ska analyseras.
    3. Klicka på "basen & #34; Knappen och klicka sedan på den punkt där cantilever fästs på basen längst upp; Slå in. Detta kommer att placera en fyrkantig markör på bilden för varje ram för att ange platsen för den kantiga basen.
    4. Klicka på "Skala" -knappen och klicka sedan manuellt på ena sidan av glaspärlan. Håll muspekaren på motsatt sida av glaspärlan och tryck på "Enter".
      Obs! Detta bör rita en linje som mäter glaspärlens diameter. Eftersom glaspärlan är 3 mm i diameter, kommer detta att relatera 3 mm till pixlarna som visas.
    5. Klicka på knappen "Analysera". Klicka längs kanten på ett kort avstånd från den första kvadratmarkeringen som representerar kanten.
    6. Klicka på knappen "Analysera". Sedan klickar du längs kanten på ett kort avstånd från den första kvadratmarkeringen som representerar kanten. Fortsätt att klicka längs cantilever, inklusive tipset, och tryck på enter närGjort. Detta kommer att placera en "x" på varje punkt som klickas på cantilever.
      Obs! Baserat på koordinering av kvadratmarkören och på x-markörerna, beräknas en cirkels mitt och diameter beräknas med en minsta kvadratpassningsfunktion (se bifogad kompletterande fil för skriptet som används). Cirkeln, som passerar x-markörerna och fyrkantsmaskinen, läggs över på bilden automatiskt.
    7. Kontrollera om den överlagda cirkeln korrekt spårar kantprofilen.
      Obs! När cantilever är mycket platt, är det svårt att bedöma om cantileverprofilen är spårad korrekt. Se Figur 3 .
    8. Klicka på knappen "Nästa bild". Detta växlar till nästa ram i TIFF-filen. Basen och skalan är redan inställda från föregående steg.
    9. Upprepa steg 4.1.5 till 4.1.7 tills alla ramar i TIFF-filen har slutförts. När alla ramar har gått igenomSsed, klicka på "Exportera" knappen.
      Obs! Det här kommer att skapa en kalkylarkfil med TIFF-filnamnet för den cantilever som just analyserades. Redigera filnamnet för att inkludera vilken sida (vänster eller höger) av cantilever analyserades.
  2. Beräkning av stress i kalkylbladet.
    1. Beräkna ytspänningen, "σ," på cantilever med följande ekvation:
      Ekvation 1
      Där E, R, v och h är Youngs modul, krökningsradien, Poisson-förhållandet och respektive cantilever-tjockleken.
      Obs! Cantileverens tjocklek kan ändras för att ändra känsligheten. I denna studie var värdena följande: E = 750 kPa, v = 0,49 och h = 25 μm 13 , 14 .
    2. Beräkna ytspänningen med ekvationen i steg 4.2.1. Öppna .Xls kalkylarkfil. Observera att utgången har flera kolumner som först visar x- och y-koordinaterna för bas och cirkel och sedan krökningsradie. Beräkna x- och y-koordinaterna för varje punkt som klickas utifrån dessa.
      Obs! Plottar spänningarna över tidsramar bildramar visar förändringar i kraften som utövas på cantilever över tiden. Trogarna visar spänningen på cantileveren under kardiomyocyternas avspänning eller den statiska påfrestningen som utövas på cantileveren på grund av celldragningskrafter. Topparna visar den dynamiska spänningen på cantilever som utövades genom kardiomyocyternas slag. Detta värde motsvarar den maximala kraftstyrkan som genereras av sammandragningen av kardiomyocyterna.

5. Analys av swimming biorobots

  1. Spela in biorobots position med hjälp av bildanalysprogram.
    Obs! Se materiallistan för den programvara som används i thÄr sektion.
    1. Öppna bildanalysprogrammet ( t.ex. ImageJ). Tryck på "File" och "Open" och välj biorobot-videofilen för simning. Klicka på "OK" och låt programmet ladda filen. Öppna kalkylbladsprogrammet.
    2. I den laddade biorobot-videon, hitta en referens med kända dimensioner ( t.ex. glaspärlan 3 mm i diameter som var inbäddad i det biologiska ställdonet).
      Obs! Varje objekt med känd dimension kommer att fungera. Detta bestämmer pixel-till-längdförhållandena i varje video.
    3. Använd "Rak" verktyget för att dra en linje över glaspärlan. Klicka på "Analysera" och välj "Ange skala". Ange fältet "Känt avstånd" till "3000 μm" och klicka på "Ok".
      Obs! Detta ställer x- och y-koordinaterna till mikrometrar.
    4. Välj en punkt på enheten som inte vrider mellan ramar för att fungera som en markör.
      Notera:Det rekommenderas att välja ett hörn av basen.
    5. Peka på den valda punkten i 5.1.4 på den första ramen. Spela in x- och y-koordinaterna i kalkylbladet.
    6. Byt tillbaka till fönstret för bildanalysprogram och tryck på högerpilknappen för att växla till nästa ram. Peka på markören igen (från steg 5.1.4) och spela in x- och y-koordinaterna på kalkylbladet.
    7. Upprepa steg 5.1.6 för alla ramar.
  2. Beräkna biorobots badparametrar med kalkylbladets kalkylblad 7 .
    1. Beräkna perioden mellan ramar från den kända bildhastigheten för varje video.
    2. Beräkna förändringen i x- och y-koordinaterna mellan ramar för att hitta det avstånd som rör sig, inklusive det totala avståndet.
    3. Beräkna amplituden av sammandragning från maximal förändring längs y-axeln. Bestäm bockfrekvensen för varje biorobot från invers av perioden mellan två sammandragningar.
    4. CBeräkna svetshastigheten för varje enhet från den totala tiden och avståndet som rör sig i x-riktningen.
    5. Upprepa steg 5.2 för varje biorobotvideo som analyserades.
    6. Normalisera varje uppmätt parameter.
      Obs! Normalisera alla värden för att bättre visualisera skillnaderna. Detta protokoll visar normalisering med avseende på ett horisontellt läge biorobot med lågfrekventa sammandragningar (horisontell LF) ( Figur 4 ) 7 .

6. Analys av proteinuttryck

Obs! De monterade proverna som framställdes i steg 2.2.4 och 2.2.5 avbildades med hjälp av ett konfokalt mikroskop. Bilder förvärvades vid 20X, 40X och 60X förstoring i följd i tre kanaler samtidigt: 460 nm, 488 nm och 594 nm. En uppsättning av 5 bilder fångades vid 40X förstoring, från olika positioner för varje prov, och varje kanal sparades som en individ. TIFFfil. Exponeringsinställningen bestämdes av förstoringen av det använda objektet och sattes konstant för alla fångster vid den förstoringen.

  1. Öppna bildanalysprogramvaran och välj "Arkiv" -> "Öppna" för att ladda bilderna.
  2. Rita en rektangulär polygon på bildramen för att markera avkastningen. Välj "Analysera" -> "Mät" för att mäta medelvärdet av fluorescerande intensitet.
  3. Upprepa steg 6.2 för att samla intensitetsmätningar från alla prover och beräkna respektive medelintensitet för varje tillstånd.
    Obs! Här hänvisar ett annat villkor till olika tidpunkter, som i dag 1, dag 2 och upp till dag 6.
  4. Exportera resultaten i ett kalkylblad för ytterligare statistisk analys och för produktion av dataposter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det biologiska manöverdonet som är tillverkat av en tunn PDMS-cantilever (25 μm i tjocklek) och kardiomyocyter utgör kärnan i badbioroboten, såsom visas i schematisk och skärmdump av anordningarna i Figur 1 . Cellerna börjar uppvisa sammandragningar efter 24 timmar i kulturen och böjning av cantilever armarna observerades vid dag 2. Sidans profil av anordningen registrerades varje dag och ytspänningen kvantifierades från böjningen av cantileverarmarna med användning av en Anpassat bildanalys skript 7 . De statiska och dynamiska spänningarna extraherades från ytspänningen på varje dag ( figur 2a ). Observera att statisk stress (celltraktionskraft) är den kontraktila stressen som cellerna uppvisar på ytan vid vilodillståndet och dynamisk stress (cellkontraktionskraft) är den stress som genereras av cellerna vid maximal sammandragning.

Figur 2a ). Det var en stor standardavvikelse vid mätning av krafter på grund av skillnader i cellmognad mellan olika prover. Cellerna uppvisade en maximal celltraktionskraft på 50 mN / m och en maximal sammandragningskraft på omkring 165 mN / m på dag 6. Analys av all individuell data för multipla prover visade en stark positiv korrelation mellan de statiska och dynamiska spänningarna, eftersom båda Visade en ökning över tiden.

För att kvantifiera mognad av kardiomyocyterna över tiden, var uttrycksnivåerna för några av de strukturella och funktionella kardiomyocytproteinerna, såsom hjärt-troponin I, gapförbindelseprotein-konnexin-43 och aktinfilamenTs, beräknades. Såsom ses i figur 2b observerades en stadig ökning av intensitetsmätningar över tid, vilket motsvarar uttrycket av respektive proteiner. Denna ökning av proteinuttryck bekräftar cellens mognad (hjärtatroponin I) 15 , celltillväxt och spridning ( dvs ökning av aktinuttryck) och en ökning av cellförbindelsen ( dvs. ökningen av antalet klyftanslutningar).

De statiska och dynamiska spänningarna som skisseras i figur 2a kvantifierades med användning av ett skräddarsytt datorskript, såsom beskrivits i det tidigare avsnittet. När de inspelade bilderna av det biologiska manöverdonet laddades in i systemet, tilläts manuskriptet för spårning av den rörliga armens rörelse med hjälp av manuellt tilldelade markörer, såsom visas i figur 3 . En gradvis ökning i böjningsvinkeln hos kantdelenVer armar observerades över tiden i odling, vilket motsvarade ökningen av dynamisk sammandragning och statisk celldragningskraft uppvisad av cellerna 7 . Resultaten av kalciumflödesanalysen och den relaterade videon finns i det tidigare publicerade arbetet 7 .

Biorobotten uppvisade spontana sammandragningar på dag 2 efter cellsåtning och kunde aktivt simma horisontellt i upp till 10 d. På grund av kraftbalansen mellan biorobots vikt och flytkraft behöll anordningen en stabil position vid luft / mediumgränssnittet. Förskjutning eller rörelse av biorobotten drevs av de synkrona sammandragningarna av kardiomyocyterna, vilket orsakade böjningen av de tunna cantileverarmarna och fungerade som ett ställdon. Det observerades att biorobots hastighet och avståndet som rördes med varje stroke minskade efter 6 d i odling. Eftersom muskelcellerna använderD i denna studie var primära kardiomyocyter isolerade från neonatala råttor, innehöll den frönade cellpopulationen även andra celltyper, såsom hjärtfibroblaster, vilka är mycket proliferativa 16 . Eftersom hjärtfibroblasterna prolifererar och sprids över tiden i odling, kan de undertrycka kontraktiliteten hos kardiomyocyter. Resultatet överensstämmer med andra studier som har visat att aktiviteten av primära celler i sig sjunker efter den första veckan i kultur 16 . I framtida forskning kan cellkulturen behandlas med anti-mitogena medel för att blockera icke-myocytproliferation för att öka livslängden hos biorobotten.

Vi observerade att björnbärarens vilosvinkel efter tillverkningen bestämde biorobots simningsprofil, vilket gav antingen ett horisontellt eller vertikalt läge till biorobots simningsprofiler. Här, "horisontellt" och "vertikalt"Al "hänvisar till svängningsvinkeln hos kantkroppen med avseende på en horisontell axel och hänvisar inte till svängningsrörelsens 7 riktning. De vertikala biorobotten hade en vilopervinkel av ca 110 ° och kontraherades i en vinkel på 90 °, medan Biorobots med horisontell mod hade en viloperansvinkel på ca 45 ° och sammandragdes om den horisontella axeln (0 °). Vi observerade också ett stort antal slagfrekvenser över alla proverna och klassificerade dem i stor utsträckning som antingen en högfrekvent ) Eller lågfrekvent (LF) -läge. Figur 4 jämför hastigheten, slagfrekvensen och avståndet som reste för ett enda slag för tre huvudtyper av biorobots: horisontellt HF, horisontellt LF och vertikalt läge. De horisontella HF-biorobotten uppvisade ett genomsnitt Slagfrekvens på 1,6 ± 0,417 Hz, medan de horisontella LF-biorobotten behöll en stadig 1,09 ± 0,134 Hz. Även om de vertikala biorobotten uppvisade endast 0,86 ± 0,07 Hz, exhiberar deBidrog till en högre svänghastighet av 142 μm / s och uppvisade det största avståndet som reste vid 160 ± 642 μm. Å andra sidan reste sig den horisontella LF ca 48 ± 21,2 μm med varje stroke med en hastighet av 67,3 μm / s medan den horisontella HF-bioroboten hade en hastighet av 84,4 μm / s och täckte ett avstånd på 61,5 ± 17,7 μm per slag .

Figur 1
Figur 1: Biologisk Aktuator och Biorobot. ( A ) Schematisk av det biologiska manöverdonet fröet med en sammanflödande cellplatta i avslappnat och sammandraget tillstånd (topppanel) och en skärmdump av anordningen i odling (bottenpanel). Såsom visas i figuren består det biologiska ställdonet av en tunn, funktionaliserad PDMS-cantilever (25 μm tjock) sådd med ett ark av kardiomyocyter. Denna ställdon bildar kärnan i badbiorobot, även som visat. ( B </ Strong>) Schematisk av en-arm biorobot sådd med en sammanflödande cellplåt (topppanel) och en skärmdump av enheten i kultur (bottenpanel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Biomekanisk analys av kardiomyocyterna. ( A ) Den dynamiska kontraktionskraften och statisk celldragningskraft ökade när kardiomyocyterna mogit; Provstorlek = 6 för varje parameter. Den dynamiska och statiska stressen som uttrycks av cellerna ökade över tiden då cellerna mognades och utvecklades i odling. En maximal statisk kraft på 50 mN / m och en dynamisk kontraktionskraft på 165 mN / m observerades på dag 6. ( B ) Kvantifiering av fluorescensintensiteten för proteinmarkörerna hjärtatroponin-I, konnexiner-43 och aktin; Provstorlek = 4 för varje parameter. Fluorescenssignalen för alla tre markörerna ökade genom hela kulturen, vilket antyder en ökning i uttrycket av dessa funktionella proteiner över tiden i odling. Felstängerna i (A) och (B) representerar standardavvikelsen för varje parameter som kvantifieras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Kvantifiering av ROC: radie av kurvatur (ROC) beräkningar med hjälp av ett anpassat bildanalysskript. ROC som hittades under en sammandragning illustreras i figuren. Flera punkter är manuellt plockade längs cantilever, som visas som en liten grön "X." När en gång har matats in för beräkning ritas en lämplig cirkel för de angivna poängen, som visasN genom den gröna cirkeln går genom cantilever. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Jämförelse av den genomsnittliga svänghastigheten, slagfrekvensen och avståndet flyttat / slag för 3 bioroboter med olika svängprofiler: horisontell lågfrekvens (horisontell LF), horisontell högfrekvens (horisontell HF) och vertikal. Mätningarna normaliseras till värdet av horisontell LF. Felstängerna representerar den relativa standardavvikelsen för varje parameter som kvantifieras. Den horisontella LF och HF var och en hade en lutningsvinkel med viloperation längs den horisontella axeln och visade slagfrekvenser på 1,09 ± 0,134 Hz ​​och 1,59 ± 0,417 Hz och svimmhastigheter av 67,3 μm / s och 84,4 μm / s resp.tivt. Den vertikala biorobot uppvisade en slagfrekvens på 0,862 ± 0,075 Hz och en genomsnittlig svetshastighet av 142 μm / s. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förfarandet som beskrivs här beskriver en framgångsrik såddmetod för PDMS-baserade ställdon och biorobot, vilket underlättar vidhäftningen av kardiomyocyter. Vidare beskrivs processen för bildförvärv och den efterföljande analysen som karakteriserar cellernas beteende och utförandet av anordningarna.

Vi observerade spontan sammandragning av celler på de lutande armarna efter 24 timmar; Intensiteten av sammandragningar fortsatte att öka stadigt över tid och nått maximalt på dag 6, varefter intensiteten minskade långsamt. Trots att det biologiska ställdonets cantilever armar var endast 4 mm långa observerades stora avböjningar upp till 2,5 mm, speciellt efter 6 dagar i odling. Den låga Unga modulen (750 kPa) och den ultralåga tjockleken av cantilever (25 μm) tillåts för sådana stora avböjningar, vilket resulterade i stark framdrivning av biorobotten. För att bedöma den mekaniska egenskapenS av dessa celler kvantifierade vi cellkontraktion och dragkraft som genererades varje dag. Tunna filmcantilevers har använts för mätning av kontraktilitet och mekanisk stress inducerad av kardiomyocyter eller andra muskelceller 13 , 17 .

Den uppmätta maximala dynamiska sammandragningskraften på 165 mN / m i denna studie är jämförbar med litteraturen 13 , där celler utsöndrade på en hydrogel-cantilever uppvisade en systolisk spänning av ca 82,8 ± 22,4 mN / m. De uppmätta krafterna och ökningen av stress över tiden var relaterade till mognad av cellerna sådda på anordningen, vilket framgår av motsvarande ökning av kontraktil och cytoskeletala proteinuttryck. Den elektromekaniska kopplingen ökade också över tiden, sett från en ökning i uttryck av gapförbindelseprotein-konnexinerna-43.

Den biorobotanordning som utvecklas här faller i kategorinAv ostraciiformsvimmare 18 , där framdrivningen åstadkommes genom svängning av en svans och avböjning är begränsad till den kaudala finen. Den maximala svänghastigheten på 142 μm / s, som uppvisas av vertikalt läge biorobot, ligger mellan de uppmätta värdena för andra populära biorobots i litteraturen, som är flagellabaserade bioroboter med hastigheter på ca 9,7 μm / s 6 och jetframdrivning Mode enheter med hastigheter 6 - 10 mm / s 9 .

Under de senaste åren har många biologiska maskiner eller biorobotter utvecklats med mjuka, elastiska material, såsom PDMS och hydrogeler, och utsädes med kontraktila muskelceller. Walking och swimming biorobots har fått ökat fokus som ett alternativ till traditionella robotar på grund av deras potential att fungera som energieffektiva, smidiga robotar med självreparationspotential 1 , 5 . Till skillnad från andra biorobots iLitteraturen, den biorobot som utvecklats i denna studie kan bibehålla sin egen tonhöjd, rulle och nedsänkningsdjup 7 . Men livslängden hos de hjärtceller som används här är en av de största begränsningarna, eftersom livslängden är begränsad till 10 d. För att övervinna denna begränsning kan kontraktila celltyper från andra arter användas för att driva anordningen, snarare än däggdjurs-härledda celler. Till exempel kan olika verk av Akiyama et al. Har undersökt användningen av kontraktila insektsvingarceller för aktivering, eftersom de har längre livslängd och kan överleva vid atmosfärstemperatur 2 .

För närvarande odlas cellerna isotropiskt på den kantiga ytan, vilket begränsar den genererade nettalkontraktskraften. I framtida studier kan en av de möjliga modifieringarna som kan inkluderas vara att införliva mikropatterner på cantileversna för uppnående av anisotropinriktning av de utsöndrade cellerna 9 . Även elektrOdes kunde införas för elektrisk stimulering för att öka kraften som alstras av cellerna 4 . Med fortsatta framsteg inom teknik och tillverkningsteknik kan dessa enheter bana väg för utvecklingen av nya biologiska maskiner med olika tillämpningar, såsom lastleverans. Till exempel kan basen av den biorobot som utvecklas här lätt ändras för att bära små paket ( dvs. last) 7 . Därför har vi i detta arbete tillhandahållit ett alternativt tillvägagångssätt för att utveckla en biorobot, med fokus på att variera egenskaperna hos den mekaniska ryggraden för att skapa en självstabiliserande struktur. Vidare kan det biologiska aktuatorn som utvecklas här användas för att bestämma kontraktilspänningen hos andra celltyper, såsom fibroblaster och inducerade pluripotenta stamceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

MT Holley stöds av Graduate Fellows programmet från Louisiana Board of Regents, och C. Danielson stöds av Howard Hughes Medical Institute Professors Program. Denna studie stöds av NSF Grant No: 1530884.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells) Charles River NA Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) Hyclone Laboratories 16750-074 with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum Hyclone industries, GE 16777-240 Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) Sigma-Aldrich D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141 Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) Molecular Probes L3224
Calcium Fluo-4, AM Molecular Probes F14217 calcium indicator dye
Tyrodes salt solution Sigma-Aldrich T2397 buffer solution
Pluronic F-127 Molecular Probes P3000MP nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde Electron microscopy 15710 Caution: Irritant and combustible
Triton x-100 Sigma-Aldrich X-100 100 mL cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent Molecular Probes P10144 Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes A12381 Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probes A-11012
pha Molecular Probes A-11001
Anti-connexin 43 antibody Abcam ab11370 Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody Abcam ab10231 Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution Electron microscopy 100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS) Elsevier Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera Thor Labs DCC1545M
LED light strip NA NA Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope Nikkon C2 NA Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens Infinity Model# 252120
Software
Matlab Mathworks NA Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J National Institute of Health NA Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis.
Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam Thor Labs NA Camera operating software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
  2. Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
  3. Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
  4. Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
  5. Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
  6. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
  7. Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
  8. Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
  9. Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
  11. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
  12. Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
  13. Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
  14. Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney's equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
  15. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
  16. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
  17. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  18. Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).

Tags

Bioengineering kardiomyocyter biologiskt manöverdon biorobots cellkontraktion ytbelastning cantilever.
Cardiac Muscle Cell-baserad Actuator och självstabiliserande Biorobot - Del 2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagarajan, N., Holley, M. T.,More

Nagarajan, N., Holley, M. T., Danielson, C., Park, K., Zorlutuna, P. Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2. J. Vis. Exp. (123), e55643, doi:10.3791/55643 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter