Summary
Dit manuscript beschrijft de bereiding van magnetische en thermische gevoelige microgels via een temperatuur geïnduceerde emulsie zonder chemische reactie. Deze gevoelige microgels werden gesynthetiseerd door poly ( N- isopropylacrylamide) (PNIPAAm), polyethyleenimine (PEI) en Fe304 -NH2 nanodeeltjes te mengen voor het potentiële gebruik in magnetisch en thermisch geactiveerde geneesmiddelafgifte.
Abstract
Magnetisch en thermisch gevoelig poly ( N- isopropylacrylamide) (PNIPAAm) / Fe3O4 -NH2 microgels met het ingekapselde anti-kanker drug curcumin (Cur) werden ontworpen en vervaardigd voor magnetisch geactiveerde afgifte. PNIPAAm-gebaseerde magnetische microgels met een bolvormige structuur werden geproduceerd via een door temperatuur geïnduceerde emulsie gevolgd met fysische verknoping door PNIPAAm, polyethylenimine (PEI) en Fe3O4 -NH2 magnetische nanodeeltjes te mengen. Door hun dispersie werden de Fe3O4NH2 nanodeeltjes ingebed in de polymeermatrix. De aminogroepen die op het Fe3O4 -NH2- en PEI-oppervlak werden blootgesteld, ondersteunen de bolvormige structuur door fysiek verknoping met de amidegroepen van het PNIPAAm. Het hydrofobe anti-kanker drug curcumin kan worden gedispergeerd in water na inkapseling in de microgels. De microgels werden gekenmerktDoor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), Fourier transform-infrarood spectroscopie (FT-IR) en UV-Vis spectrale analyse. Voorts werd magnetisch geactiveerde vrijgave onder een extern hoogfrequent magnetisch veld (HFMF) onderzocht. Een significante "burst release" van curcumin werd waargenomen na het toepassen van de HFMF op de microgels door het magnetische inductieve verhitting (hyperthermie) effect. Dit manuscript beschrijft het magnetisch geactiveerde gecontroleerde afgifte van Cur-PNIPAAm / Fe3O4 -NH2 ingekapseld curcumin, dat mogelijk kan worden toegepast voor tumortherapie.
Introduction
Hydrogels zijn driedimensionaal (3D) polymere netwerken die niet kunnen oplossen, maar kunnen zwellen in waterige oplossingen 1 . De polymere netwerken hebben hydrofiele domeinen (die kunnen worden gehydrateerd om de hydrogelstructuur te verschaffen), en een crosslinked conformatie (die de ineenstorting van het netwerk kan voorkomen). Verschillende methoden zijn onderzocht voor de bereiding van hydrogelen, zoals emulsiepolymerisatie, anionische copolymerisatie, verknoping van naburige polymeerketens en inverse microemulsiepolymerisatie 2 . Fysische en chemische verknoping worden via deze methoden ingevoerd om structurele stabiele hydrogelen 1 , 3 te verkrijgen . Chemische verknoping vereist normaal gesproken de deelname van het verknopingsmiddel, dat de ruggengraat of de zijketen van de polymeren verbindt. In vergelijking met chemische verknoping is fysieke verknoping een betere keuze voor fabr Ijzige hydrogelen door het vermijden van een verknopingsmiddel, aangezien deze middelen vaak giftig zijn voor praktische toepassingen 4 . Verschillende benaderingen zijn onderzocht voor het synthetiseren van fysiek versteekte hydrogelen, zoals kruisverbindingen met ionische interactie, kristallisatie, binding tussen amfifiele blokken of inplanting op de polymeerketens en waterstofbinding 4 , 5 , 6 , 7 .
Stimuli-gevoelige polymeren, die conformiteit, chemische of fysieke eigenschappen kunnen veranderen in reactie op verschillende omgevingsomstandigheden ( dwz temperatuur, pH, licht, ionsterkte en magnetisch veld), hebben onlangs aandacht gekregen als een potentieel platform voor systemen met gecontroleerde afgifte , Geneesmiddelafgifte en anti-kankertherapie 8 , 9 ,Xref "> 10 , 11 , 12. Onderzoekers richten zich op thermo-gevoelige polymeren waar de intrinsieke temperatuur gemakkelijk kan worden geregeld. PNIPAAm is een thermisch gevoelig polymeer, dat zowel hydrofiele amidegroepen als hydrofobe isopropylgroepen bevat en een lagere kritische oplossingstemperatuur heeft (LCST) 13. Waterstofbinding tussen amidegroepen en watermoleculen verschaft de dispersie van PNIPAAm in waterige oplossing bij lage temperaturen (onder de LCST), terwijl de waterstofbinding tussen polymeerketens bij hoge temperaturen (boven de LCST) optreedt en water uitsluit Moleculen, zodat het polymeer netwerk instort. In verband met deze unieke eigenschap zijn veel rapporten gepubliceerd voor het bereiden van temperatuurgerichte zelfgemonteerde hydrogelen door de hydrofobe en hydrofiele verhouding van de polymeerketenlengte aan te passen, zoals copolymerisatie, transplantatie of zij- Kettingmodificatie voor farmacieCal platformen 14 , 15 , 16 , 17 .
Magnetische materialen zoals ijzer, kobalt en nikkel hebben ook de afgelopen decennia meer aandacht gekregen voor biochemische toepassingen 18 . Van deze kandidaten is ijzeroxide het meest gebruikt vanwege de stabiliteit en de lage toxiciteit. Nano-grootte ijzeroxiden reageren direct op het magnetische veld en gedragen zich als superparamagnetische atomen. Echter, dergelijke kleine deeltjes makkelijk aggregeren; Dit vermindert de oppervlaktetergie, waardoor ze hun dispersie verliezen. Om de waterdispersiteit te verbeteren, worden de transplantaties of bekledingen ter bescherming van de laag algemeen toegepast, niet alleen om elk afzonderlijk deeltje voor stabiliteit te scheiden, maar ook om de reactieplaats 19 verder te functionaliseren.
Hier vervaardigen we magnetische PNIPAAm-gebaseerde microGels om te dienen als geneesmiddel dragers voor systemen met gecontroleerde afgifte. Het synthese proces wordt beschreven en getoond in Figuur 1 . In plaats van gecompliceerde copolymerisatie en chemische verknoping werd de nieuwe temperatuur geïnduceerde emulsie van PNIPAAm gevolgd door fysieke verknoping gebruikt voor het verkrijgen van de microgels zonder aanvullende oppervlakteactieve stof of verknopingsmiddelen. Dit vereenvoudigde de synthese en voorkomde ongewenste toxiciteit. Binnen een dergelijk eenvoudig voorbereidingsprotocol bood de as-gesynthetiseerde microgels waterdispersiteit voor zowel de magnetische ijzeroxide-nanodeeltjes als het hydrofobe, anti-kankergeneesmiddel, curcumine. FT-IR, TEM, en beeldvorming leverde bewijs van dispersie en inkapseling voor. Door de embedded Fe 3 O 4 -NH 2 bleek dat de magnetische microgels potentieel zijn om te dienen als micro-apparaten voor geregelde afgifte onder HFMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van oppervlakte gemodificeerde, waterdispergeerbare, magnetische nanodeeltjes, Fe3O4 en Fe3O4-NH2
- Voeg 14,02 g FeCl3, 8,6 g FeCl2 · 4H20 en 250 ml water toe aan een 500 ml beker.
- Verbind de rotor en de regelaar om het mechanische roeren op te zetten. Meng de oplossing bij 300 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg 25 ml ammoniumhydroxide (33%) in de oplossing bij kamertemperatuur en blijf 30 minuten roeren (300 rpm). Houd de beker open.
VOORZICHTIG: Ammoniumhydroxide kan neusirritatie veroorzaken bij inademing. Deze stap moet uitgevoerd worden in een geschikte afzuigkap. - Om de magnetische ijzeroxiden (Fe 3 O 4 ) te verzamelen, verwijder de mechanische roer. Zet een magneet onder de beker om de zwarte deeltjes te verzamelen.
- Nadat de Fe 3 O 4 nanodeeltjes volledig neergeslagen zijn, verwijder de supernatant zorgvuldig. Schud de b nietEaker tijdens het gieten van de supernatant om verlies van Fe 3 O 4 te vermijden.
- Verwijder de magneet en voeg 50 ml zoet water toe aan de beker.
- Schud de beker om de Fe 3 O 4 opnieuw te verspreiden. Herhaal stappen 1.4 tot 1.4.2 drie keer om de Fe 3 O 4 te zuiveren.
- Na de laatste was overbrengt u alle Fe 3 O 4 (10 g) in een 100 ml glazen fles. Voeg water toe tot het totale volume van de oplossing 100 ml bedraagt. Schud de glazen fles krachtig totdat er geen klontjes zichtbaar zijn.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken. De Fe 3 O 4 nanodeeltjes worden bereid. - Wijzig de Fe3O4 met aminosilaan (Fe3O4 -NH2).
- Neem de 100 ml oplossing van stap 1.5 en overbrengen in een 1.000 ml beker. Voeg 10 ml ammoniakoplossing, 90 ml water en 900 ml ethanol toe aan de beker.
- Gebruik een magnetische roerbalk om de oplossing op te mengen300 rpm. Voeg 500 μl (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) druppelsgewijs bij de beker bij RT en roer nog 12 uur.
- Reinig en verzamel de Fe 3 O 4 -NH 2 zoals beschreven in sectie 1.4.
- Re-disperse 1 g Fe3O4 -NH2 (uit stap 1.7) in een 20 ml glazen fles met 20 ml water.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken. De Fe304 -NH2 nanodeeltjes worden bereid.
2. Synthese van organisch-anorganische hybride microgels door thermo-geïnduceerde emulsie
- Bereiding van Oplossing 1-1 en 1-2 .
- Voor oplossing 1-1, voeg 0,25 g PNIPAAm, 5 ml Fe3O4-oplossing (uit stap 1.5) en 0,2 g PEI toe aan een 50 ml glazen fles. Voeg 20 ml water toe en gebruik een magnetische roerbar om 30 minuten bij 300 rpm te roeren.
- Voor oplossing 1-2, herhaal stap 2.1.1, maar vervang Fe3O4 als Fe3O-NH2-oplossing (uit stap 1.8).
- Om Oplossing 2 op te maken , voeg 0,8 g PEI en 18,2 ml water toe aan een 50 ml glazen fles. Gebruik een waterbad om de oplossing gedurende 30 minuten op te warmen tot 70 ° C. Bereid een tweede fles Oplossing 2 op .
- Bereiding van PNIPAAm / Fe304 .
- Gebruik een ultrasone celonderbreking aan sonicate (50 w), een magnetische roerbalk om te roeren (300 rpm) en een waterbad om Oplossing 2 (70 ° C) te verhitten.
- Voeg Oplossing 1-1 toe aan de verwarmde oplossing 2 druppelsgewijs met een 3 ml spuit met een snelheid van 1 ml / min.
- Vervolg sonicatie, roer en verwarm bij 70 ° C gedurende 30 minuten.
- Koel de oplossing op RT. Verwijder de oplossing uit de celverstorende stof en het waterbad.
- Verzamel de microgels door de magneet dicht bij de glazen fles te plaatsen.
- Verwijder de supernatant afDe microgels zijn neergeslagen naar de bodem van de glazen fles.
- Voeg nog eens 25 ml water toe aan de glazen fles en verspreid de microgels door vortexing. Deze oplossing is PNIPAAm / Fe3O4.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken.
- Bereiding van PNIPAAm / Fe304 -NH2 .
- Gebruik een ultrasone celonderbreking aan sonicate (50 w), een magnetische roerbalk om te roeren (300 rpm) en een waterbad om Oplossing 2 (70 ° C) te verhitten.
- Oplossing 1-2 toevoegen aan de verwarmde oplossing 2 druppelsgewijs met een 3 ml spuit met een snelheid van 1 ml / min.
- Vervolg sonicatie, roer en verwarm bij 70 ° C gedurende 30 minuten.
- Koel de oplossing op RT. Verwijder de oplossing uit de celverstorende stof en het waterbad.
- Verzamel de microgels door de magneet dicht bij de glazen fles te plaatsen.
- Zodra de microgels neerslaan, verwijderDe supernatant
- Voeg nog eens 25 ml water toe aan de glazen fles en verspreid de microgels door vortexing. Deze oplossing is PNIPAAm / Fe304 -NH2.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Bereiding van Curcumine-geladen Microgels (Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2)
OPMERKING: Deze stappen moeten in het donker uitgevoerd worden.
- Voeg 100 mg Cur en 20 ml ethanol toe aan een 20 ml glazen fles.
- Neem 2 ml van de Cur oplossing en overbrengen naar de PNIPAAm / Fe3O4 -NH2 oplossing (stap 2.4.7). Roer bij 400 rpm en RT overnacht.
- Na roeren bij 400 rpm en RT overnachting, gebruik de magneet om PNIPAAm / Fe304 -NH2 te verzamelen zoals beschreven in stappen 2.4.5 en 2.4.6.
- Voeg nog eens 25 ml water toe aan de glazen fles en verspreid de microgels door vortexing. Deze oplossing is C Ur-PNIPAAm / Fe304 -NH2.
4. Magnetisch getroffen Drug Release
- Breng 10 ml van de Cur-PNIPAAm / Fe3O4-NH2-oplossing over en voeg 2 ml water toe aan een 15 ml centrifugeringsbuis.
- Plaats de centrifugatiebuis in het midden van de spoel om de HFMF 20 aan te brengen . Breng HFMF gedurende 20 minuten op 15 kHz aan.
- Verwijder 0,5 ml van de HFMF oplossing en vervang met verse 0,5 ml water per 2 minuten interval tijdens het aanbrengen van de HFMF.
- Breng de getrokken oplossing over op de 1 ml-cuvette.
- Meet de absorptie van de teruggetrokken oplossing door UV / Vis bij 482 nm 21 .
- Bepaal de concentratie van de vrijgegeven drugs door gebruik te maken van de relatie van absorptie en concentratie van een standaard kalibratiekromme 22 .
OPMERKING: De standaard kalibratie relatie is:
S / ftp_upload / 55648 / 55648eq1.jpg "/>
Waar de correlatiecoëfficiënt 0,9993 is.
5. Karakterisering van de magnetische microgels
- Thermogravimetrische analysator (TGA) 23 .
- Meet het gewichtsverlies van PNIPAAm / Fe 3 O 4 en PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 versus temperatuur onder luchtatmosfeer door TGA.
- Verhit het monster van RT tot 100 ° C en hou gedurende 10 minuten bij deze temperatuur om de vochtigheid te elimineren. Verhit het monster van 100 ° C tot 800 ° C met een snelheid van 10 ° C / min. Weeg de monsters.
- Bepaal het gewichtsverlies tegen de temperatuur van zowel PNIPAAm / Fe3O4 als PNIPAAm / Fe3O4 -NH2.
OPMERKING: Het restgewicht is ofwel Fe3O4 of Fe3O4 -NH2, terwijl het verloren gewicht PNIPAAm is.
- Meet het gewichtsverlies van PNIPAAm / Fe 3 O 4 en PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 versus temperatuur onder luchtatmosfeer door TGA.
- FT-IR"> 24.
- Droog 10 mg monster met 1 g KBr bij 100 ° C overnacht.
- Druk het mengsel van stap 5.2.1 in pellets zoals beschreven in de volgende stappen (5.2.2.1 - 5.2.2.5):
- Maal de materialen van stap 5.2.1 in een fijn poeder met een mortel en stamper.
- Plaats het gemonteerde apparaat (mortier en stamper) in de pelletpers. Zet het apparaat in het midden van de pers uit.
- Pomp de pers tot een druk van 20.000 psi is bereikt. Laat de pellet gedurende 5 minuten zitten.
LET OP: Richt het apparaat in het midden van de pers, anders komt het monster uit de mortel en veroorzaken schade door blootstelling. - Verwijder de matrijs die de pellet en de zuiger uit de pers bevat.
- Zet het ondersteboven en pomp de zuiger om de pellet uit te drijven.
- Noteer de FT-IR absorptiespectra van monsters door FT-IR bij frequenties variërend van 400 tot 4000 cm -1 -1 24 .
- Morfologie waarnemingen door TEM 25 .
- Druppel de monsteroplossing op een koperrooster dat is bedekt met een collodion en droog vervolgens gedurende een nacht bij RT of in een oven van 70 ° C.
- Neem TEM afbeeldingen.
OPMERKING: Sterke elektronenbundels kunnen de monsters beschadigen. Daarom dienen TEM beelden zo snel mogelijk te worden genomen.
- Waterige dispersie mogelijkheden van polymeren en microgels.
- Om PNIPAAm oplossing op te maken, voeg 7 mg PNIPAAm en 7 ml water toe aan een 7 ml glazen fles. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen tot er geen aggregaten zijn.
- Voor het bereiden van PNIPAAm / Fe304 -NH2 oplossing, overbrengen 0,7 ml PNIPAAm / Fe3O4 -NH2 oplossing (stap 2.4.7) naar een 7 ml glazen fles en voeg 6,3 ml water toe. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen tot er geen neerslag is.
- Cur-PNIPAA voorbereidenM / Fe3O4 -NH2 oplossing, overbrengen 0,7 ml Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2 oplossing (stap 3.4) naar een 7 ml glazen fles en voeg 6,3 ml water toe. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen tot er geen neerslag is.
- Neem een foto van de oplossingen (stappen 5.4.1 - 5.4.3) met behulp van een digitale camera.
- Leg de oplossingen in een oven en stel de temperatuur op op 70 ° C. Wacht 2 uur tot evenwicht.
- Neem een andere foto van de oplossingen. Om de temperatuur te behouden, neem de foto binnen 1 minuut. Vermijd schudden van de glazen fles omdat dit de neerslagen opnieuw kan verspreiden.
- Voor magnetische verzameling microgels plaatst u de sterke magneet dicht bij de Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 oplossing (stap 5.4.3). Wacht tot de microgels volledig zijn verzameld, neem dan een foto.
- Verwijder de magneet en vortex de microgel oplossing tot volledig verspreid. Neem een andere foto. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De schematische voor de synthese van PNIPAAm / PEI / Fe304 -NH2 microgels wordt getoond in Figuur 1 . TGA werd toegepast om de relatieve samenstelling van de organische verbinding tegen de gehele microgel te schatten. Aangezien alleen de organische verbinding PNIPAAm kon worden verbrand, werd de relatieve samenstelling van PNIPAAm en Fe3O4 (of Fe304 -NH2) bepaald en wordt in Tabel 1 getoond. Waarom tonen PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 microgels de betere dispersiteit maar houden de lagere inhoud van ijzeroxiden vast? Door de sterkere interactie en betere dispersie in PNIPAAm / Fe304 -NH2 dan die in PNIPAAm / Fe304, is Fe3O4 -NH2 makkelijker om PNIPAAm te verbinden dan Fe3O4. Als gevolg hiervan werden de opbrengsten van PNIPAAm / Fe3O De TEM-afbeeldingen van PNIPAAm-oplossingen en magnetische microgels werden bij kamertemperatuur door de digitale camera genomen. Zoals blijkt uit figuur 2a zijn er geen specifieke structuren in een zuivere PNIPAAm oplossing bij kamertemperatuur. Echter, regelmatige sferische ijzeroxide partiCles ( figuur 2b ) werden waargenomen in zowel PNIPAAm / Fe304 ( Figuur 2c ) en PNIPAAm / Fe304 -NH2 ( Figuur 2d ) microgels, die bewijs gaf van fysieke verknoping die resulteerde uit de waterstofbinding tussen PNIPAAm en PEI . De meeste Fe 3 O 4 nanodeeltjes kunnen alleen geadsorbeerd worden op het oppervlak van de PNIPAAm-gebaseerde matrix en produceren aggregatieclusters ( Figuur 2c ). APTES-gemodificeerde ijzeroxide nanodeeltjes, Fe3O4 -NH2 kunnen echter in de deeltjes ingebed worden door de grotere waterdispersiteit en kleinere grootte van de magnetische nanodeeltjes ( Figuur 3d ), vergeleken met blote Fe3O4 nanodeeltjes. Na het laden met curcumin, de morfologie van Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2 ( FiGure 2e) was veel meer geïsoleerd dan die van magnetische microgels door de hydrofobe eigenschap van Cur. De resultaten suggereren ook dat Cur niet alleen ingekapseld was binnen maar ook geabsorbeerd op het oppervlak van de microgels. Microgelpreparatie en therapeutische moleculen inkapseling werden geïdentificeerd door FT-IR analyse zoals getoond in Figuur 3 . In vergelijking met Fe3O4 uit de literatuur 19 , 26 werden de nieuw verschijnende absorptiepieken bij 2927, 1203, 987 en 472 cm -1 toegeschreven aan de trilling van CH-stretching, Si-O-Si-stretching, Si-O Strekken, en Si-O buigen, die de succesvolle modificatie van APTES voorstelde om het oppervlak van de Fe 3 O 4 nanodeeltjes te bedekken. Fe-O trillingen pieken (584 cm -1 ) werden ook waargenomen in zowel PNIPAAm / Fe304
De foto's van verschillende microgels bij 25 ° C of 70 ° C zijn weergegeven in figuur 4 , waarbij de melkachtige en bruine oplossingen respectievelijk de aggregatie van respectievelijk PNIPAAm en ijzeroxiden vertegenwoordigen. Vergeleken met figuren 4a - Figuur 4d - f . Beide magnetische microgels waren melkachtig maar gedispergeerd zonder enige neerslag, en dit gaf de grote dispersie en sterke fysieke binding aan tussen PNIPAAm, Fe304 -NH2 en curcumine. Zoals getoond in figuur 5 kunnen de magnetische microgels gemakkelijk worden verzameld met de magneet en opnieuw gedispergeerd worden in de waterige oplossing zonder enige aggregatie na het verwijderen van de magneet. De resultaten wijzen erop dat deze magnetische microgels mogelijk zouden kunnen worden toegepast op een waterafgifte systeem zoals het menselijk lichaam fOf klinische toepassingen.
In vitro- vrijgegeven gedragingen van magnetische microgels werden gecontroleerd via HFMF. De opstelling van het experimentele apparaat wordt getoond in figuur 6 , waarbij de centrifugatiebuis in het midden van de spoel met het magnetische veld moet zijn. De bruine neerslag in het buiscentrum was de magnetische microgels, die gescheiden waren van de oplossingen onder HFMF-behandelingen.
Het magnetische vrijgavepercentage met en zonder HFMF werd gecontroleerd en is getoond in Figuur 7 . Vergeleken met het percentage van de vrijgave zonder HFMF binnen dezelfde perioden (20 min), verhoogde het vrijgavepercentage 2,5 keer onder HFMF-behandeling, en de temperatuur van bulkoplossing kon tegelijkertijd verhoogd worden tot meer dan 50 ° C. Door de bevalling van thermo-gevoelige polymeren kon PNIPAAm magnetische microgelsHet ingekapselde geneesmiddel (Cur) uitdrukken, resulterend uit de PNIPAAm-polymere matrix die hydrofoob wordt en vervolgens onder hoge temperatuur (50 ° C) geconjugeerd wordt. Intussen kan curcumin vrijgegeven worden om de anti-kanker therapie te bereiken door het HFMF toe te passen. Lokale verwarming van magnetische inductie op HFMF kan de binding tussen Cur en PNIPPAm vernietigen, hoewel de hydrofobe Cur wordt verwacht te binden aan de hydrofobe PNIPPAm bij hoge temperaturen. Bovendien zou de volumeverandering (van hydrofiel tot hydrofoob en lager naar hogere temperatuur) van de magnetische microgels ook de Cur uitdrukken.
De temperatuurverhoging van de bulkoplossing werd geregistreerd en getoond in figuur 7 als de rode kromme met het diamant symbool. Zoals getoond, verhoogde de temperatuur eerst na verwarmingstijd en plateau na 14 minuten. Het plateau moet de verzadiging zijn van de magnetische inductieve verwarming (hyperthermie)In het grote water. De gelokaliseerde temperatuur moet echter hoog genoeg zijn om de Cur uit te drukken.
Figuur 1. Schematisch Synthese Proces voor PNIPAAm / PEI / Fe3O4-NH2 Microgels.
Meng het PNIPAAm, Fe3O4 -NH2 en PEI samen en verwarm het mengsel tot 70 ° C om H-binding voor de microgelpreparatie te introduceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. TEM afbeeldingen van PNIPAAm Oplossingen en Magnetische Microgels. A) PNIPAAm, b ) Fe3O4, c) PNIPAAm / Fe304, d) PNIPAAm / Fe304 -NH2 en e) Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2. De TEM beelden werden genomen om de dispersie en morfologie van de monsters te monitoren. De TEM monsters werden bereid bij RT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. FT-IR Spectra van PNIPAAm, Fe304 -NH2, PNIPAAm / Fe304, PNIPAAm / Fe304 -NH2 en Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2. De gesynthetiseerde microgels werden met KBr gemengd en in pellets ingedrukt. FRIR werd vervolgens toegepast om de interacties te verduidelijken oF PNIPAAm, Fe3O4 -NH2, PEI en curcumin door de absorptieveranderingen van functiegroepen te volgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Waterdispersie Vermoëns van Microgels onder en boven de LCST: a) PNIPAAm, b) PNIPAAm / Fe304 -NH2 en c) Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2 bij 25 ° C. D) PNIPAAm, e) PNIPAAm / Fe304 -NH2 en f) Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2 bij 70 ° C. De monsteroplossingen werden bereid bij RT en verhit tot 70 ° C. De fotoGrafieken werden onder RT en 70 ° C genomen om de waterdispersiteit van gesynthetiseerde microgels te waarnemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Inzameling van Curcumin-geladen Magnetische Microgels door een Magneet. Cur-PNIPAAm / Fe304 -NH2 werden gedispergeerd in waterige oplossing (links) en verzameld door een magneet (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Experimentele Apparatuur voor Magnetische-trig Gered Release met HFMF. De witte ring is de koperspiraal. De centrifugatiebuis die de magnetische microgels bevat, wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Gecontroleerde afgifte van Cur-PNIPAAm / Fe3O4 -NH2 Microgels bij pH 7,4 met (Vierkant Symbool) en zonder (Circle Symbol) HFMF. Het curcumin-vrijgegeven percentage magnetische microgels met (zwarte, vierkanten) en zonder (zwarte; cirkels) die de HFMF toepassen wordt getoond. De toename van de temperatuur van Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 microgels met HFMF wordt in rood (diamant) weergegeven. Foutstaven vertegenwoordigen SD.= "_ Blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| samples | PNIPAAm (%) | Fe 3 O 4 (%) |
| PNIPAAm / Fe304 | 32.37 | 68,63 (Fe304) |
| PNIPAAm / Fe304 -NH2 | 68,56 | 31,44 (Fe304 -NH2) |
Tabel 1. Relatieve samenstelling (% gewicht) van de magnetische nanodeeltjes en PNIPAAm in de Microgels. De relatieve samenstelling van de magnetische microgels werd berekend aan de hand van TGA analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen van de bereiding zijn in protocolsectie 2, voor de synthese van de magnetische microgels door thermo-geïnduceerde emulsie. Zoals getoond in Figuur 2 (TEM-beelden) kan de bolvormige structuur van microgels op RT (lager dan de LCST) worden gehandhaafd door de fysieke verknoping die voortvloeit uit de sterke H-binding tussen PNIPAAm (amidegroepen), PEI (aminogroepen) En Fe304 -NH2 (aminogroepen). Op basis van de vergelijking in Figuur 4 zijn de magnetische microgels goed gedispergeerd bij lage (25 ° C) of hoge (70 ° C) temperatuur. De microgels kunnen ook worden verzameld door een magneet en opnieuw gedispergeerd worden in een homogene oplossing zoals getoond in Figuur 5 .
Traditionele bereiding van hydrogels die gesynthetiseerd zijn met zowel hydrofobe als hydrofiele monomeren vereist normaal gesproken de introductie van verknopingsmiddelen om 3D te verkrijgenNetwerken 4 , 5 , 6 , 7 . Crosslinkende middelen zijn echter moeilijk te verwijderen en veroorzaken vaak bijwerkingen bij hun toepassing.
PNIPAAm kan aggregaten of zelfmonteren in deeltjes onder hoge temperatuur en ook opnieuw verspreiden in een homogene oplossing als de temperatuur lager is dan de LCST. Crosslinking en chemische modificatie worden vaak gebruikt voor hydrogelbereiding om de ineenstorting van 3D-netwerken te voorkomen. Thermo-geïnduceerde verknoping via waterstofbinding wordt hier toegepast om chemische reacties te vervangen, waardoor het synthese- en bereidingsproces wordt vereenvoudigd.
Kritisch voor het succes van hydrogelfabrieken zijn het polymerisatie- en verknopingsvrije proces en de inkapseling van hydrofobe geneesmiddelen. Zonder polymerisatie kan de hydrogel de ongereageerde initiatoren en monomeren verwijderen die vaak leidenTot sterke toxiciteit. Hier hebben we succesvol de dispersie en inkapseling van anorganische verbindingen (ijzeroxide) en hydrofobe moleculen (curcumin) bereikt via oppervlakte-modificatie en oplosmiddelinleiding.
Door middel van in vitro vrijlatingstesten ( Figuur 7 ) vonden we dat de magnetische microgels door het magnetische inductieve verwarmen (hyperthermie) effectief verhogen van zowel temperatuur- als vrijgegeven percentage in het externe magnetische veld (HFMF). Met de bovengenoemde eigenschappen zijn deze PNIPAAm-gebaseerde magnetische microgels potentiële kandidaten voor magnetisch en thermisch geactiveerd, gerichte levering van tumortherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (MOST 104-2221-E-131-010, MOST 105-2622-E-131-001-CC2), en gedeeltelijk ondersteund door het Instituut voor Atomaire en Moleculaire Wetenschappen, Academia Sinica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) | Polyscience, Inc | 21458-10 | Mw ~40,000 |
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | > 99 % |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 44939 | 99% |
| Iron(III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | 97% |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 00280590 | |
| Ammonia hydroxide | Fisher Chemical | A/3240/PB15 | 35% |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | 806552 | pH 7.4, liquid, sterile-filtered |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 50 % (w/v) in water |
| High-frequency magnetic field (HFMF) | Lantech Industrial Co., Ltd.,Taiwan | LT-15-80 | 15 kV, 50–100 kHz |
| Ultraviolet-Visible Spectrophotometry | Thermo Scientific Co. | Genesys | |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEM-2100 | JEOL | |
| Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) | PerkinElmer | Spectrum 100 | |
| Thermogravimetric analyzer | PerkinElmer | Pyris 1 | |
| Ultrasonic cell disruptor | Hielscher Ultrasonics | UP50H |
References
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliv Rev. 64, 223-236 (2012).
- Ma, L., Liu, M., Liu, H., Chen, J., Cui, D. In vitro cytotoxicity and drug release properties of pH- and temperature-sensitive core-shell hydrogel microspheres. Int J Pharm. 385 (1-2), 86-91 (2010).
- Dong, Y., et al. Incorporation of Gold Nanoparticles Within Thermoresponsive Microgel Particles: Effect of Crosslinking Density. J Nanosci Nanotechnol. 8 (12), 6283-6289 (2008).
- Sun, G., Zhang, X. Z., Chu, C. C. Effect of the molecular weight of polyethylene glycol (PEG) on the properties of chitosan-PEG-poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J Mater Sci Mater Med. 19 (8), 2865-2872 (2008).
- Sun, Y. -M., Yu, C. -W., Liang, H. -C., Chen, J. -P. Temperature-Sensitive Latex Particles for Immobilization of α-Amylase. Journal of Dispersion Science and Technology. 20 (3), 907-920 (1999).
- Chiang, P. R., et al. Thermosensitive hydrogel from oligopeptide-containing amphiphilic block copolymer: effect of peptide functional group on self-assembly and gelation behavior. Langmuir. 29 (51), 15981-15991 (2013).
- Okuzaki, H., Kobayashi, K., Yan, H. Thermo-Responsive Nanofiber Mats. Macromolecules. 42 (16), 5916-5918 (2009).
- Singh, N. K., Lee, D. S. In situ gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J Control Release. 193, 214-227 (2014).
- Strehin, I., Nahas, Z., Arora, K., Nguyen, T., Elisseeff, J. A versatile pH sensitive chondroitin sulfate-PEG tissue adhesive and hydrogel. Biomaterials. 31 (10), 2788-2797 (2010).
- Gil, E., Hudson, S. Stimuli-reponsive polymers and their bioconjugates. Prog Polym Sci. 29 (12), 1173-1222 (2004).
- Hubbell, J. A. Hydrogel systems for barriers and local drug delivery in the control of wound healing. J Control Release. 39 (2-3), 305-313 (1996).
- Rapoport, N. Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer drug delivery. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 962-990 (2007).
- Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J Polym Sci A Polym Chem. 2 (8-9), 1441-1455 (1968).
- Chuang, C. -Y., Don, T. -M., Chiu, W. -Y. Synthesis and properties of chitosan-based thermo- and pH-responsive nanoparticles and application in drug release. J Polym Sci A Polym Chem. 47 (11), 2798-2810 (2009).
- Lee, C. -F., Lin, C. -C., Chiu, W. -Y. Thermosensitive and control release behavior of poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) latex particles. J Polym Sci A Polym Chem. 46 (17), 5734-5741 (2008).
- Lee, C. -F., Wen, C. -J., Lin, C. -L., Chiu, W. -Y. Morphology and temperature responsiveness-swelling relationship of poly(N-isopropylamide-chitosan) copolymers and their application to drug release. J Polym Sci A Polym Chem. 42 (12), 3029-3037 (2004).
- Lin, C. L., Chiu, W. Y., Lee, C. F. Preparation of thermoresponsive core-shell copolymer latex with potential use in drug targeting. J Colloid Interface Sci. 290 (2), 397-405 (2005).
- Ma, T., et al. A novel method to in situ synthesis of magnetic poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) nanogels. Colloid Polym Sci. 294 (8), 1251-1257 (2016).
- Du, G. H., Liu, Z. L., Xia, X., Chu, Q., Zhang, S. M. Characterization and application of Fe3O4/SiO2 nanocomposites. Journal of Sol-Gel Science and Technology. 39 (3), 285-291 (2006).
- Moroz, P., Jones, S. K., Gray, B. N. Magnetically mediated hyperthermia: current status and future directions. International Journal of Hyperthermia. 18 (4), 267-284 (2002).
- Silva-Buzanello, R. A., et al. Validation of an Ultraviolet-visible (UV-Vis) technique for the quantitative determination of curcumin in poly(l-lactic acid) nanoparticles. Food Chemistry. 172, 99-104 (2015).
- Kim, H. J., Jang, Y. P. Direct analysis of curcumin in turmeric by DART-MS. Phytochemical Analysis. 20 (5), 372-377 (2009).
- Horowitz, H. H., Metzger, G. A new analysis of thermogravimetric traces. Analytical Chemistry. 35 (10), 1464-1468 (1963).
- Smith, B. C. Fourier transform infrared spectroscopy. , CRC. Boca Raton, FL. (1996).
- Williams, D. B., Carter, C. B. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , Springer. 3-17 (1996).
- Xie, Y., Sougrat, R., Nunes, S. P. Synthesis and characterization of polystyrene coated iron oxide nanoparticles and asymmetric assemblies by phase inversion. Journal of Applied Polymer Science. 132 (5), (2015).
