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Bioengineering

Poli sensibile magnetico e termico ( doi: 10.3791/55648 Published: July 4, 2017

Summary

Questo manoscritto descrive la preparazione di microgeli magnetici e sensibili alla temperatura attraverso un'emulsione indotta dalla temperatura senza reazione chimica. Questi microgeli sensibili sono stati sintetizzati mescolando le nanoparticelle di poli ( N- isopropilacrilammide) (PNIPAAm), polietileniminina (PEI) e Fe 3 O 4 -NH 2 per il potenziale utilizzo in liberazione a rilascio di sostanze magnetiche e termiche.

Abstract

I microgeli poli ( N- isopropilacrilammide) (PNIPAAm) / Fe 3 O 4- NH 2 microelettrici magnetici e termici sensibili sono stati progettati e fabbricati per il rilascio magneticamente attivato. Microgeli magnetici a base PNIPAAm con struttura sferica sono stati prodotti mediante un'emulsione indotta dalla temperatura seguita da reticolazione fisica mescolando le nanoparticelle magnetiche PNIPAAm, polyethylenimine (PEI) e Fe 3 O 4 -NH 2 . A causa della loro dispersione, le nanoparticelle Fe 3 O 4 -NH 2 sono state incorporate all'interno della matrice polimerica. I gruppi amminici esposti sulla superficie di Fe 3 O 4 -NH 2 e PEI hanno sostenuto la struttura sferica fisicamente reticolata con i gruppi amidici del PNIPAAm. Il curcum idrofobico anti-cancro del farmaco può essere disperso in acqua dopo l'incapsulamento nei microgeli. I microgeli sono stati caratterizzatiMediante microscopia elettronica di trasmissione (TEM), spettroscopia a infrarossi a trasformazione di Fourier (FT-IR) e analisi spettrale UV-Vis. Inoltre, la liberazione magnetica è stata studiata sotto un campo magnetico esterno ad alta frequenza (HFMF). Una significativa "rilascio di scoppio" della curcumina è stata osservata dopo l'applicazione del HFMF ai microgeli a causa dell'effetto induttivo di riscaldamento magnetico (ipertermia). Questo manoscritto descrive il rilascio controllato magneticamente attivato da Curcumin incapsulato Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , potenzialmente applicabile alla terapia tumorale.

Introduction

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Gli idrogeli sono reti polimeriche tridimensionali (3D) che non possono dissolversi ma possono gonfiarsi in soluzioni acquose 1 . Le reti polimeriche hanno domini idrofili (che possono essere idratati per fornire la struttura idrogelica) e una conformazione incrociata (che può impedire il crollo della rete). Sono stati studiati diversi metodi per la preparazione di idrogeli, come la polimerizzazione in emulsione, la copolimerizzazione anionica, il reticolazione delle catene polimeriche vicine e la polimerizzazione a micro-emulsione inversa 2 . I reticolazione fisica e chimica vengono introdotti attraverso questi metodi per ottenere idrogel strutturalmente stabili 1 , 3 . Il reticolazione chimica richiede normalmente la partecipazione dell'agente di reticolazione, che collega la spina dorsale o la catena laterale dei polimeri. Rispetto al reticolazione chimico, la reticolazione fisica è una scelta migliore per fabr Idrogelici a causa dell'eliminazione di un agente reticolante, poiché questi agenti sono spesso tossici per applicazioni pratiche 4 . Sono stati studiati diversi approcci per la sintesi di idrogeli fisicamente reticolati, come il reticolazione con interazione ionica, la cristallizzazione, il legame tra blocchi anfifilici o l'innesto sulle catene polimeriche e l'idrogeno 4 , 5 , 6 , 7 .

Polimeri sensibili alla stimolazione, che possono subire variazioni di proprietà conformazionali, chimiche o fisiche in risposta a diverse condizioni ambientali (temperatura, pH, luce, resistenza ionica e campo magnetico), hanno recentemente attirato l'attenzione come piattaforma potenziale per sistemi di rilascio controllato , La consegna di farmaci e la terapia anti-cancro 8 , 9 ,Xref "> 10 , 11 , 12. I ricercatori stanno concentrando su polimeri termo-sensibili dove la temperatura intrinseca può essere controllata facilmente. PNIPAAm è un polimero termico sensibile, che contiene entrambi gruppi amidici idrofili e gruppi isopropilici idrofobici e ha una temperatura di soluzione più bassa critica (LCST) 13. L'idrogeno tra i gruppi amidici e le molecole d'acqua fornisce la dispersione di PNIPAAm in soluzione acquosa a basse temperature (al di sotto del LCST), mentre l'idrogeno-legame tra catene polimeriche avviene ad alte temperature (sopra il LCST) Per questa proprietà unica, sono state pubblicate numerose relazioni per la preparazione di idrogeli auto-assemblati a temperatura scatenata, regolando il rapporto idrofobico e idrofilo della lunghezza della catena polimerica, come la copolimerizzazione, l'innesto o il collettore laterale, Modifica catena per farmaciaLe piattaforme calcolatrici 14 , 15 , 16 , 17 .

Materiali magnetici come il ferro, il cobalto e il nichel hanno anche ricevuto un'attenzione maggiore negli ultimi decenni per le applicazioni biochimiche 18 . Tra questi candidati, l'ossido di ferro è il più diffuso a causa della sua stabilità e della bassa tossicità. Gli ossidi di ferro di dimensioni nano rispondono istantaneamente al campo magnetico e si comportano come atomi superparamagnetici. Tuttavia, tali piccole particelle possono facilmente aggregarsi; Questo riduce l'energia di superficie e quindi perde la loro dispersione. Al fine di migliorare la dispersione dell'acqua, l'innesto o il rivestimento per proteggere lo strato vengono comunemente applicati non solo per separare ogni singola particella per la stabilità ma anche per funzionalizzare ulteriormente il sito di reazione 19 .

Qui abbiamo costruito micro magnetico basato su PNIPAAmGel per servire come portatori di droga per sistemi di rilascio controllato. Il processo di sintesi è descritto e mostrato in Figura 1 . Invece di complicata copolimerizzazione e di reticolazione chimica, è stata impiegata la nuova emulsione indotta dalla temperatura di PNIPAAm seguita da reticolazione fisica per ottenere microgeli senza tensioattivi aggiuntivi o agenti reticolanti. Questo ha semplificato la sintesi e impedito la tossicità indesiderata. All'interno di un simile protocollo di preparazione semplice, i microgeli as sintetizzati hanno offerto dispersione idrica per entrambe le nanoparticelle di ossido di ferro magnetico e la droga idrofoba, anticancro, la curcumina. FT-IR, TEM e immagini hanno fornito prove di dispersione e incapsulamento. A causa del Fe 3 O 4 -NH 2 incorporato, i microgeli magnetici hanno mostrato potenzialità per essere utilizzati come micro-dispositivi per il rilascio controllato in HFMF.

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Protocol

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1. Sintesi di Nanoparticelle Magnetiche, modificate in superficie, disperse nell'acqua, Fe 3 O 4 e Fe 3 O 4 -NH 2

  1. Aggiungere 14,02 g di FeCl3, 8,6 g di FeCl2 · 4H2O e 250 ml di acqua a un bicchiere da 500 ml.
  2. Collegare il rotore e il regolatore per impostare agitazione meccanica. Mescolare la soluzione a 300 giri / min per 30 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Aggiungere 25 ml di idrossido di ammonio (33%) nella soluzione a RT e mantenerlo agitato (300 rpm) per 30 min. Tenere il bicchiere aperto.
    ATTENZIONE: L'idrossido di ammonio può causare irritazione del naso se inalato. Questo passaggio deve essere eseguito all'interno di una apposita cappa di fumo.
  4. Per raccogliere gli ossidi di ferro magnetici (Fe 3 O 4 ), rimuovere l'agitazione meccanica. Mettere un magnete sotto il bicchiere per raccogliere le particelle nere.
    1. Dopo che le nanoparticelle di Fe 3 O 4 sono interamente precipitate, rimuovete attentamente il surnatante. Non scuotere la bMentre si versa il surnatante per evitare la perdita di Fe 3 O 4 .
    2. Rimuovere il magnete e aggiungere 50 ml di acqua fresca al bicchiere.
    3. Agitare il bicchiere per ri-disperdere il Fe 3 O 4 . Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.4.2 tre volte per purificare la Fe 3 O 4 .
  5. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire tutti i Fe 3 O 4 (10 g) in una bottiglia di vetro da 100 ml. Aggiungere acqua fino a quando il volume della soluzione totale è di 100 mL. Agitare energicamente la bottiglia di vetro fino a quando non sono visibili grumi.
    NOTA: il protocollo può essere interrotto qui. Le nanoparticelle Fe 3 O 4 sono preparate.
  6. Modificare il Fe 3 O 4 con aminosilano (Fe 3 O 4 -NH 2 ).
    1. Prendi la soluzione da 100 ml dalla fase 1.5 e trasferisca in un becher da 1000 ml. Aggiungere 10 ml di soluzione di ammoniaca, 90 ml di acqua e 900 ml di etanolo nel bicchiere.
    2. Utilizzare una barra magnetica per mescolare la soluzione300 giri / min. Aggiungere 500 μl di (3-ammopropil) trietossisilano (APTES) a goccia a goccia a temperatura ambiente e mescolare per altri 12 h.
  7. Purificare e raccogliere il Fe 3 O 4 -NH 2 come descritto nella sezione 1.4.
  8. Ripartire 1 g di Fe 3 O 4 -NH 2 (dal punto 1.7) in una bottiglia di vetro da 20 ml con 20 ml di acqua.
    NOTA: il protocollo può essere interrotto qui. Le nanoparticelle Fe 3 O 4 -NH 2 sono preparate.

2. Sintesi dei microgelli ibridi organici inorganici mediante emulsione termoindicata

  1. Preparazione della soluzione 1-1 e 1-2 .
    1. Per la soluzione 1-1, aggiungere 0,25 g di PNIPAAm, 5 ml di soluzione Fe 3 O 4 (dal punto 1,5) e 0,2 g di PEI in una bottiglia di vetro da 50 ml. Aggiungere 20 ml di acqua e utilizzare una barra magnetica per mescolare a 300 giri / min per 30 min.
    2. Per la soluzione 1-2, ripetere la fase 2.1.1, ma sostituire Fe 3 O 4 come Fe3 O 4 -NH 2 (dal punto 1.8).
  2. Per preparare la soluzione 2 , aggiungere 0,8 g di PEI e 18,2 ml di acqua a una bottiglia di vetro da 50 ml. Usare un bagno d'acqua per riscaldare la soluzione a 70 ° C per 30 minuti. Preparare una seconda bottiglia di Soluzione 2 .
  3. Preparazione di PNIPAAm / Fe 3 O 4 .
    1. Utilizzare un disgregatore di cellule ad ultrasuoni per sonicare (50 w), una barra magnetica per mescolare (300 giri / min) e un bagno d'acqua per riscaldare la soluzione 2 (70 ° C).
    2. Aggiungere la soluzione 1-1 alla soluzione riscaldata 2 facendo uso di una siringa da 3 ml a una velocità di 1 mL / min.
    3. Continuare la sonicazione, l'agitazione e il riscaldamento a 70 ° C per 30 min.
    4. Raffreddare la soluzione a RT. Rimuovere la soluzione dal disgregatore cellulare e dal bagno d'acqua.
    5. Raccogli i microgeli mettendo il magnete vicino alla bottiglia di vetro.
    6. Rimuovere il surnatante afI microgeli sono precipitati al fondo della bottiglia di vetro.
    7. Aggiungere un altro 25 ml di acqua alla bottiglia di vetro e ri-disperdere i microgeli vorticando. Questa soluzione è PNIPAAm / Fe 3 O 4 .
      NOTA: il protocollo può essere interrotto qui.
  4. Preparazione di PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
    1. Utilizzare un disgregatore di cellule ad ultrasuoni per sonicare (50 w), una barra magnetica per mescolare (300 giri / min) e un bagno d'acqua per riscaldare la soluzione 2 (70 ° C).
    2. Aggiungere la soluzione 1-2 alla soluzione riscaldata 2 in goccia utilizzando una siringa da 3 ml a una velocità di 1 mL / min.
    3. Continuare la sonicazione, l'agitazione e il riscaldamento a 70 ° C per 30 min.
    4. Raffreddare la soluzione a RT. Rimuovere la soluzione dal disgregatore cellulare e dal bagno d'acqua.
    5. Raccogli i microgeli mettendo il magnete vicino alla bottiglia di vetro.
    6. Una volta che i microgeli precipitano, rimuovonoIl supernatante.
    7. Aggiungere un altro 25 ml di acqua alla bottiglia di vetro e ri-disperdere i microgeli vorticando. Questa soluzione è PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
      NOTA: il protocollo può essere interrotto qui.

3. Preparazione di microgeli caricati da curcum (Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 )

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti al buio.

  1. Aggiungere 100 mg di Cur e 20 mL di etanolo a una bottiglia di vetro da 20 mL.
  2. Prendere 2 ml della soluzione Cur e trasferire alla soluzione PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 (punto 2.4.7). Mescolare a 400 rpm e RT per una notte.
  3. Dopo agitazione a 400 rpm e RT per una notte, utilizzare il magnete per raccogliere PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 come descritto nei passaggi 2.4.5 e 2.4.6.
  4. Aggiungere un altro 25 ml di acqua alla bottiglia di vetro e ri-disperdere i microgeli vorticando. Questa soluzione è C Ur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .

4. Release rilasciata magneticamente

  1. Trasferire 10 ml della soluzione Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 e aggiungere 2 mL di acqua a un tubo di centrifugazione da 15 mL.
  2. Posizionare il tubo di centrifugazione al centro della bobina per applicare l'HFMF 20 . Applicare HFMF a 15 KHz per 20 minuti.
  3. Togliere 0,5 ml della soluzione HFMF e sostituire con 0,5 ml di acqua freschi ogni 2 minuti durante l'applicazione dell'HFMF.
  4. Trasferire la soluzione ritirata alla cuvetta da 1 ml.
  5. Misurare l'assorbimento della soluzione ritirata da UV / Vis a 482 nm 21 .
  6. Determinare la concentrazione dei farmaci liberati utilizzando il rapporto di assorbimento e concentrazione da una curva standard di calibrazione 22 .
    NOTA: La relazione di calibrazione standard è:
    S / ftp_upload / 55648 / 55648eq1.jpg "/>
    Dove il coefficiente di correlazione è 0.9993.

5. Caratterizzazione dei microgeli magnetici

  1. Analizzatore termogravimetrico (TGA) 23 .
    1. Misura la perdita di peso di PNIPAAm / Fe 3 O 4 e PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 contro la temperatura in atmosfera d'aria da TGA.
      1. Scaldare il campione da RT a 100 ° C e mantenere a questa temperatura per 10 minuti per eliminare l'umidità. Riscaldare il campione da 100 ° C a 800 ° C ad una velocità di 10 ° C / min. Pesare i campioni.
      2. Progettare la perdita di peso rispetto alla temperatura di PNIPAAm / Fe 3 O 4 e PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
        NOTA: Il peso residuo è Fe 3 O 4 o Fe 3 O 4 -NH 2 , mentre il peso perduto è PNIPAAm.
  2. FT-IR"> 24.
    1. Asciugare 10 mg di campione con 1 g di KBr a 100 ° C per una notte.
    2. Premere la miscela dalla fase 5.2.1 in pellet come descritto nei passaggi seguenti (5.2.2.1 - 5.2.2.5):
      1. Frantumare i materiali dal punto 5.2.1 in una polvere fine utilizzando un mortaio e un pestello.
      2. Posizionare l'apparecchio assemblato (mortaio e pestello) nella pressa di pellet. Allineare l'apparecchio nella metà esatta della pressa.
      3. Pompa la pressa fino a raggiungere una pressione di 20.000 psi. Lasciate che il pellet sieda a quella pressione per 5 minuti.
        ATTENZIONE: Allineare l'apparecchio nella metà esatta della stampa, altrimenti il ​​campione si disperderà dalla malta e causerà lesioni all'esposizione.
      4. Rimuovere la tazza contenente il pellet e il pistone dalla pressa.
      5. Girare a testa in giù e pompare il pistone per forzare il pellet fuori.
    3. Registrare gli spettri di assorbimento FT-IR di campioni da FT-IR a frequenze che vanno da 400 a 4.000 cm -1 -1 24 .
  3. Osservazioni della morfologia di TEM 25 .
    1. Far cadere la soluzione di campione su una griglia di rame rivestita con una collodione e poi asciugare a RT o in un forno a 70 ° C durante la notte.
    2. Prendere le immagini TEM.
      NOTA: forti travi elettroni possono danneggiare i campioni. Pertanto, le immagini TEM devono essere prese il più velocemente possibile.
  4. Capacità di dispersione acquosa di polimeri e microgeli.
    1. Per preparare la soluzione PNIPAAm aggiungere 7 mg di PNIPAAm e 7 ml di acqua a una bottiglia di vetro da 7 ml. Utilizzare un vortice per mescolare la soluzione fino a quando non ci sono aggregati.
    2. Per preparare la soluzione PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , trasferire 0,7 ml di soluzione PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 (punto 2.4.7) in una bottiglia di vetro da 7 ml e aggiungere 6.3 ml di acqua. Utilizzare un vortice per mescolare la soluzione fino a quando non ci sarà precipitazione.
    3. Preparare Cur-PNIPAAM / Fe 3 O 4 -NH 2 , trasferire 0,7 ml di soluzione Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 (fase 3.4) in una bottiglia di vetro da 7 ml e aggiungere 6.3 ml di acqua. Utilizzare un vortice per mescolare la soluzione fino a quando non ci sarà precipitazione.
    4. Scattare una foto delle soluzioni (passaggi 5.4.1 - 5.4.3) utilizzando una fotocamera digitale.
    5. Mettere le soluzioni in un forno e impostare la temperatura a 70 ° C. Attendere 2 h fino all'equilibrio.
    6. Prendi un'altra foto delle soluzioni. Per mantenere la temperatura, scattare la foto entro un minuto. Evitare di scuotere la bottiglia di vetro poiché questo può ri-disperdere le precipitazioni.
  5. Per la raccolta magnetica di microgeli, posizionare il magnete forte vicino alla soluzione Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 (punto 5.4.3). Attendere che i microgeli siano completamente raccolti, quindi scattare una foto.
    1. Rimuovere il magnete e vortex la soluzione di microgelo fino a completo dispersione. Prendi un'altra foto. </ Li>

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Representative Results

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Lo schema per la sintesi di microgeli di PNIPAAm / PEI / Fe 3 O 4 -NH 2 è mostrato in Figura 1 . TGA è stato applicato per stimare la relativa composizione del composto organico contro l'intero microgel. Poiché solo il composto organico PNIPAAm potrebbe essere bruciato, è stata determinata la relativa composizione di PNIPAAm e Fe 3 O 4 (o Fe 3 O 4 -NH 2 ) ed è mostrata nella Tabella 1 . Perchè i microgeli di PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 mostrano la dispersione migliore ma mantengono contenuti inferiori di ossidi di ferro? A causa dell'interazione più forte e della migliore dispersione in PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 rispetto a quella in PNIPAAm / Fe 3 O 4 , è più facile da legare PNPIAAm rispetto a Fe 3 O 4 , Fe 3 O 4 -NH 2 . Di conseguenza, le rese di PNIPAAm / Fe 3 O 2 microgeli sono molto più alti di quelli di PNIPAAm / Fe 3 O 4 . A causa dei processi di raccolta (punti 2.3.3 - 2.3.5 e 2.4.3 - 2.4.5), il PNIPAAm non reticolato è stato rimosso con il surnatante poiché solo l'ossido di ferro magnetico con microgeli può essere assorbito magneticamente. Di conseguenza, le percentuali in peso di PNIPAAm nei microgeli sono 32,37% (PNIPAAm / Fe 3 O 4 ) e 68,56% (PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 ). Le nanoparticelle Fe 3 O 4 -NH 2 possono fisicamente incollare molto più PNIPAAm rispetto alle nanoparticelle Fe 3 O 4 .

Le immagini TEM delle soluzioni PNIPAAm e microgel magnetiche sono state prese dalla fotocamera digitale a temperatura ambiente. Come mostrato nella figura 2a , non ci sono strutture specifiche in una soluzione pura PNIPAAm a temperatura ambiente. Tuttavia, parti regolari di ossido di ferro sferico( Figura 2b ) e PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 ( Figura 2d ), che hanno fornito prove di reticolazione fisica derivante dall'assorbimento di idrogeno tra PNIPAAm e PEI . La maggior parte delle nanoparticelle di Fe 3 O 4 possono essere adsorbite solo sulla superficie della matrice basata su PNIPAAm e prodotte aggregazioni di aggregazione ( Figura 2c ). Tuttavia, le nanoparticelle di ossido di ferro modificate APTES possono essere incorporate nelle particelle, a causa della maggiore dispersione dell'acqua e delle dimensioni minori delle nanoparticelle magnetiche ( Figura 3d ), rispetto alle nanoparticelle nere Fe 3 O 4 . Dopo aver caricato la curcumina, la morfologia di Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 ( FiGure 2e) era molto più isolata di quella dei microgeli magnetici a causa della caratteristica idrofobica di Cur. I risultati suggeriscono anche che Cur non è solo incapsulato all'interno ma anche assorbito sulla superficie dei microgeli.

La preparazione del microgel e l'incapsulamento delle molecole terapeutiche sono state identificate mediante analisi FT-IR, come mostrato nella Figura 3 . Rispetto a Fe 3 O 4 della letteratura 19 , 26 , i picchi di assorbimento di nuova comparsa a 2927, 1203, 987 e 472 cm-1 sono stati attribuiti alla vibrazione dello stretching CH, allo stretching Si-O-Si, a Si-O Stretching e Si-O, che hanno suggerito la modifica efficace di APTES per coprire la superficie delle nanoparticelle Fe 3 O 4 . I picchi di vibrazione Fe-O (584 cm -1 ) sono stati osservati sia in PNIPAAm / Fe 3 O 4 3 O 4 -NH 2 . Tuttavia, l'intensità relativa della vibrazione di Fe-O è stata maggiore in PNIPAAm / Fe 3 O 4 rispetto a quella in PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , che ha anche sostenuto la nostra descrizione della composizione, che una migliore dispersione dell'acqua ha portato ad una Migliore distribuzione strutturale. Dopo il processo di carico, i picchi di assorbimento caratteristici della curcumina a 1509 e 3511 cm-1 riferiti alla curvatura aromatica C = C e all'esaurimento di OH, appaiono rispettivamente negli spettri FT-IR di Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , che Ha indicato l'incapsulamento di successo della curcumina.

Le foto di vari microgeli a 25 ° C o 70 ° C sono mostrati in Figura 4 , in cui le soluzioni lattiginose e brune rappresentano rispettivamente l'aggregazione di PNIPAAm e ossidi di ferro. Rispetto alle figure 4a - c , non esistevano aggregazioni ovviamente visibili in PNIPAAm, PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 e Cur-PNIPAAm / Fe3O 4 -NH2 a temperatura ambiente (25 ° C). La soluzione PNIPAAm e microgel magnetici sono divenuti opachi quando le soluzioni sono state riscaldate al di sopra del LCST di PNIPAAm come mostrato nella Figura 4d - f . Entrambi i microgeli magnetici erano latenti ma dispersi senza alcuna precipitazione, e ciò indicava la grande dispersione e forte legame fisico tra PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 e curcumina. Come mostrato nella figura 5 , i microgeli magnetici possono essere facilmente raccolti con il magnete e ri-disperso nella soluzione acquosa senza alcuna aggregazione dopo aver rimosso il magnete. I risultati hanno indicato che questi microgeli magnetici potrebbero essere potenzialmente applicati ad un sistema di somministrazione acquosa come il corpo umano fO applicazioni cliniche.

I comportamenti di rilascio in vitro di microgeli magnetici sono stati monitorati tramite HFMF. L'apparato sperimentale impostato è mostrato in figura 6 , dove il tubo di centrifugazione dovrebbe essere al centro della bobina che porta il campo magnetico. Le precipitazioni brune che si trovano nel centro del tubo sono stati i microgeli magnetici, che sono stati separati dalle soluzioni nei trattamenti HFMF.

La percentuale di rilascio magnetico con e senza HFMF è stata monitorata e viene mostrata in Figura 7 . Rispetto alla percentuale di rilascio senza HFMF entro periodi identici (20 min), la percentuale di rilascio è aumentata 2,5 volte con trattamento HFMF e la temperatura della soluzione di massa può essere aumentata a oltre 50 ° C contemporaneamente. A causa del contenimento di polimeri termo-sensibili, PNIPAAm, i microgeli magnetici potrebberoEstrarre il farmaco incapsulato (Cur), risultante dalla matrice polimerica PNIPAAm diventando idrofobica e poi coniugata ad alta temperatura (50 ° C). Nel frattempo, la curcumina potrebbe essere rilasciata per realizzare la terapia anti-cancro applicando l'HFMF. Il riscaldamento locale dall'induzione magnetica su HFMF può distruggere il legame tra Cur e PNIPPAm, anche se il cur Curva idrofobica dovrebbe legarsi al PNIPPAm idrofobico ad alte temperature. Inoltre, il cambiamento di volume (da idrofilo a idrofobia e da una temperatura inferiore a quella più alta) dei microgeli magnetici potrebbe anche spingere il Cur.

L'aumento della temperatura della soluzione di massa è stato registrato e mostrato in Figura 7 come curva rossa con il simbolo del diamante. Come mostrato, la temperatura è aumentata innanzitutto con il tempo di riscaldamento e pianificata dopo 14 minuti. L'altopiano dovrebbe essere la saturazione del riscaldamento induttivo magnetico (ipertermia)Nell'acqua bulk. Tuttavia, la temperatura localizzata dovrebbe essere abbastanza elevata da spremere il Cur.

Figura 1
Figura 1. Schema di sintesi per microgeli PNIPAAm / PEI / Fe3O4-NH2.
Mescolare insieme PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 e PEI e riscaldare la miscela a 70 ° C per introdurre l'incollaggio ad H per la preparazione del microgel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Immagini TEM delle soluzioni PNIPAAm e Microgelle magnetiche. A) PNIPAAm, b) Fe 3 O 4 , c) PNIPAAm / Fe 3 O 4 , d) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 e e) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 . Le immagini TEM sono state prese per monitorare la dispersione e la morfologia dei campioni. I campioni TEM sono stati preparati a RT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Spectra FT-IR di PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 , PNIPAAm / Fe 3 O 4 , PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 e Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 . Le microgelle as sintetizzate sono state mescolate con KBr e premute in pellet. FRIR è stato quindi applicato per chiarire le interazioni oF PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 , PEI e curcumina monitorando i cambiamenti di assorbimento dei gruppi di funzioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Capacità di dispersione acquosa di Microgels sotto e sopra la LCST: a) PNIPAAm, b) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 e c) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 a 25 ° C. D) PNIPAAm, e) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , e f) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 a 70 ° C. Le soluzioni campione sono state preparate a RT e riscaldate fino a 70 ° C. La fotoI grafici sono stati presi in RT e 70 ° C per osservare la dispersione dell'acqua delle microgelle sintetizzate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Raccolta di microgeli magnetici a curcum con un magnete. Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 sono stati dispersi in soluzione acquosa (a sinistra) e raccolti da un magnete (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Apparecchio sperimentale per trigonometrismo Estratto con HFMF. L'anello bianco è la bobina di rame. Viene mostrato il tubo di centrifugazione contenente microgel magnetici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Rilascio controllato di Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 microgeli a pH 7.4 con (Square Symbol) e senza (Circle Symbol) HFMF. Viene mostrata la percentuale di rilascio di curcum di microgeli magnetici con (nero, quadrato) e senza (nero) cerchi applicando l'HFMF. L'aumento della temperatura di Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 microgeli con HFMF viene visualizzato in rosso (diamante). Le barre di errore rappresentano SD.= "_ Blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campioni PNIPAAm (%) Fe 3 O 4 (%)
PNIPAAm / Fe 3 O 4 32.37 68,63 (Fe 3 O 4 )
PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 68.56 31,44 (Fe 3 O 4 -NH 2 )

Tabella 1. Composizione relativa (peso percentuale) delle nanoparticelle magnetiche e PNIPAAm nei microgeli. La composizione relativa dei microgeli magnetici è stata calcolata utilizzando l'analisi TGA.

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Discussion

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Le fasi più importanti della preparazione sono nella sezione del protocollo 2, per la sintesi dei microgeli magnetici mediante emulsione termoindurata. Come mostrato in Figura 2 (immagini TEM), la struttura sferica dei microgeli potrebbe essere mantenuta a RT (inferiore al LCST) a causa del fisico reticolazione derivante dalla forte legame H tra PNIPAAm (gruppi amidici), PEI (gruppi amminici) E Fe 3 O 4 -NH 2 (gruppi amminici). Sulla base del confronto in figura 4 , i microgeli magnetici sono ben dispersi a bassa temperatura (25 ° C) o alta (70 ° C). I microgeli possono anche essere raccolti da un magnete e ri-dispersi in soluzione omogenea come mostrato in Figura 5 .

La preparazione tradizionale di idrogeli sintetizzati con entrambi monomeri idrofobici e idrofili richiede normalmente l'introduzione di agenti reticolanti per ottenere 3DReti 4 , 5 , 6 , 7 . Tuttavia, gli agenti reticolanti sono difficili da rimuovere e spesso causano effetti collaterali nella loro applicazione.

PNIPAAm può aggregare o auto-assemblarsi in particelle a temperatura elevata e anche ri-disperdere in soluzione omogenea quando la temperatura è inferiore al suo LCST. La reticolazione e la modifica chimica sono spesso utilizzati per la preparazione di idrogel per evitare il crollo delle reti 3D. La reticolazione termoindicata mediante l'adesione di idrogeno viene applicata qui per sostituire le reazioni chimiche, semplificando così il processo di sintesi e preparazione.

Critical per il successo della fabbricazione di idrogel sono il processo senza polimerizzazione e reticolazione e l'incapsulamento di farmaci idrofobici. Senza la polimerizzazione, l'idrogel potrebbe rimuovere gli iniziatori e monomeri non reagiti che spesso portanoA forte tossicità. Qui abbiamo realizzato con successo la dispersione e l'incapsulamento di composti inorganici (ossido di ferro) e molecole idrofobiche (curcumina) attraverso la modifica della superficie e l'introduzione del solvente.

Attraverso i test di rilascio in vitro ( Figura 7 ), abbiamo riscontrato che i microgeli magnetici avevano un efficace incremento della temperatura e della percentuale di rilascio nel campo magnetico esterno (HFMF) mediante l'effetto induttivo di riscaldamento magnetico (ipertermia). Con le proprietà di cui sopra, questi microgeli magnetici basati su PNIPAAm sono potenziali candidati per la terapia tumorale magneticamente e termicamente attivata e mirata.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 104-2221-E-131-010, MOST 105-2622-E-131-001-CC2) e parzialmente sostenuto dall'Istituto di Scienze Atomiche e Molecolari, Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) Polyscience, Inc 21458-10 Mw ~40,000
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 > 99 %
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 44939 99%
Iron(III) chloride Sigma-Aldrich 157740 97%
Curcumin Sigma-Aldrich 00280590
Ammonia hydroxide Fisher Chemical A/3240/PB15 35%
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich 806552 pH 7.4, liquid, sterile-filtered
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 50 % (w/v) in water
High-frequency magnetic field (HFMF) Lantech Industrial Co., Ltd.,Taiwan LT-15-80 15 kV, 50–100 kHz
Ultraviolet-Visible Spectrophotometry Thermo Scientific Co. Genesys
Transmission electron microscopy (TEM) JEM-2100 JEOL
Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) PerkinElmer Spectrum 100
Thermogravimetric analyzer PerkinElmer Pyris 1
Ultrasonic cell disruptor Hielscher Ultrasonics UP50H

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References

  1. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliv Rev. 64, 223-236 (2012).
  2. Ma, L., Liu, M., Liu, H., Chen, J., Cui, D. In vitro cytotoxicity and drug release properties of pH- and temperature-sensitive core-shell hydrogel microspheres. Int J Pharm. 385, (1-2), 86-91 (2010).
  3. Dong, Y., et al. Incorporation of Gold Nanoparticles Within Thermoresponsive Microgel Particles: Effect of Crosslinking Density. J Nanosci Nanotechnol. 8, (12), 6283-6289 (2008).
  4. Sun, G., Zhang, X. Z., Chu, C. C. Effect of the molecular weight of polyethylene glycol (PEG) on the properties of chitosan-PEG-poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J Mater Sci Mater Med. 19, (8), 2865-2872 (2008).
  5. Sun, Y. -M., Yu, C. -W., Liang, H. -C., Chen, J. -P. Temperature-Sensitive Latex Particles for Immobilization of α-Amylase. Journal of Dispersion Science and Technology. 20, (3), 907-920 (1999).
  6. Chiang, P. R., et al. Thermosensitive hydrogel from oligopeptide-containing amphiphilic block copolymer: effect of peptide functional group on self-assembly and gelation behavior. Langmuir. 29, (51), 15981-15991 (2013).
  7. Okuzaki, H., Kobayashi, K., Yan, H. Thermo-Responsive Nanofiber Mats. Macromolecules. 42, (16), 5916-5918 (2009).
  8. Singh, N. K., Lee, D. S. In situ gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J Control Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Strehin, I., Nahas, Z., Arora, K., Nguyen, T., Elisseeff, J. A versatile pH sensitive chondroitin sulfate-PEG tissue adhesive and hydrogel. Biomaterials. 31, (10), 2788-2797 (2010).
  10. Gil, E., Hudson, S. Stimuli-reponsive polymers and their bioconjugates. Prog Polym Sci. 29, (12), 1173-1222 (2004).
  11. Hubbell, J. A. Hydrogel systems for barriers and local drug delivery in the control of wound healing. J Control Release. 39, (2-3), 305-313 (1996).
  12. Rapoport, N. Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer drug delivery. Prog Polym Sci. 32, (8-9), 962-990 (2007).
  13. Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J Polym Sci A Polym Chem. 2, (8-9), 1441-1455 (1968).
  14. Chuang, C. -Y., Don, T. -M., Chiu, W. -Y. Synthesis and properties of chitosan-based thermo- and pH-responsive nanoparticles and application in drug release. J Polym Sci A Polym Chem. 47, (11), 2798-2810 (2009).
  15. Lee, C. -F., Lin, C. -C., Chiu, W. -Y. Thermosensitive and control release behavior of poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) latex particles. J Polym Sci A Polym Chem. 46, (17), 5734-5741 (2008).
  16. Lee, C. -F., Wen, C. -J., Lin, C. -L., Chiu, W. -Y. Morphology and temperature responsiveness-swelling relationship of poly(N-isopropylamide-chitosan) copolymers and their application to drug release. J Polym Sci A Polym Chem. 42, (12), 3029-3037 (2004).
  17. Lin, C. L., Chiu, W. Y., Lee, C. F. Preparation of thermoresponsive core-shell copolymer latex with potential use in drug targeting. J Colloid Interface Sci. 290, (2), 397-405 (2005).
  18. Ma, T., et al. A novel method to in situ synthesis of magnetic poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) nanogels. Colloid Polym Sci. 294, (8), 1251-1257 (2016).
  19. Du, G. H., Liu, Z. L., Xia, X., Chu, Q., Zhang, S. M. Characterization and application of Fe3O4/SiO2 nanocomposites. Journal of Sol-Gel Science and Technology. 39, (3), 285-291 (2006).
  20. Moroz, P., Jones, S. K., Gray, B. N. Magnetically mediated hyperthermia: current status and future directions. International Journal of Hyperthermia. 18, (4), 267-284 (2002).
  21. Silva-Buzanello, R. A., et al. Validation of an Ultraviolet-visible (UV-Vis) technique for the quantitative determination of curcumin in poly(l-lactic acid) nanoparticles. Food Chemistry. 172, 99-104 (2015).
  22. Kim, H. J., Jang, Y. P. Direct analysis of curcumin in turmeric by DART-MS. Phytochemical Analysis. 20, (5), 372-377 (2009).
  23. Horowitz, H. H., Metzger, G. A new analysis of thermogravimetric traces. Analytical Chemistry. 35, (10), 1464-1468 (1963).
  24. Smith, B. C. Fourier transform infrared spectroscopy. CRC. Boca Raton, FL. (1996).
  25. Williams, D. B., Carter, C. B. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. Springer. 3-17 (1996).
  26. Xie, Y., Sougrat, R., Nunes, S. P. Synthesis and characterization of polystyrene coated iron oxide nanoparticles and asymmetric assemblies by phase inversion. Journal of Applied Polymer Science. 132, (5), (2015).
Poli sensibile magnetico e termico (<em&gt; N</em&gt; -isopropilacrilammide) per il rilascio controllato magneticamente attivato
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Kuo, C. Y., Liu, T. Y., Wang, K. S., Hardiansyah, A., Lin, Y. T., Chen, H. Y., Chiu, W. Y. Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release. J. Vis. Exp. (125), e55648, doi:10.3791/55648 (2017).More

Kuo, C. Y., Liu, T. Y., Wang, K. S., Hardiansyah, A., Lin, Y. T., Chen, H. Y., Chiu, W. Y. Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release. J. Vis. Exp. (125), e55648, doi:10.3791/55648 (2017).

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