Summary
פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .
Abstract
כלי הדם מספקים חמצן וחומרים מזינים בכל הגוף, ויצירת רשת כלי הדם נמצאת תחת שליטה התפתחותית הדוקה. הדמיה יעילה של vivo של כלי הדם ואת כימות אמין של המורכבות שלהם הם המפתח להבנת ביולוגיה ומחלות של הרשת כלי הדם. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לדמיין כלי דם עם צבע פלורסנט זמין מסחרית, פלזמה אנושית acetylated צפיפות נמוכה lipoprotein DiI מורכבים (DiI-AcLDL), וכמות המורכבות שלהם tropis Xenopus . כלי דם יכול להיות מתויג על ידי הזרקת פשוטה של DiI-AcLDL לתוך הלב פועם של העובר, וכלי הדם העובר כולו יכול להיות צילמו עוברי לחיות או קבוע. בשילוב עם הפרעות גנטיות על ידי המיקרו-זרקור הממוקד של חומצות גרעין ו / או יישום אמבט של ריאגנטים פרמקולוגיים, תפקידים של גן או של מסלול איתות על התפתחות כלי הדם יכולים להיות inveStigated בתוך שבוע מבלי להזדקק חיות מתוחכמות מהונדסים גנטית. בגלל מערכת ורידים מוגדרת היטב של קסנופוס ואת אנגיוגנזה סטריאוטיפית שלה, הנבטה של כלי קיים מראש, מורכבות כלי ניתן לכמת ביעילות לאחר ניסויים ההפרעה. זה פרוטוקול פשוט יחסית צריך לשמש כלי נגיש בקלות בתחומים מגוונים של מחקר לב וכלי דם.
Introduction
Vasculogenesis, היווצרות של כלי דם חדשים תאים אנדותל שנולדו לאחרונה, אנגיוגנזה, היווצרות של כלים חדשים מן הכלים הקיימים מראש, הם שני תהליכים שונים המעצבים את כלי הדם עובריים 1 . כל dysregulation בתהליכים אלה גורמת למחלות לב שונות וחריגות מבניות של כלי שיט. יתר על כן, הגידול קשורה לצמיחה כלי בלתי מבוקרת. ככזה, מנגנונים מולקולריים שבבסיס וסקולוגנזה ואנגיוגנזה הם נושא לחקירה אינטנסיבית 2 .
Xenopus דג הזברה הם מודלים חוליות אטרקטיבי עבור vasculogenesis ומחקרים אנגיוגנזה, מכמה סיבות. ראשית, העוברים שלהם קטנים; לכן, קל יחסית לדמיין את כלי הדם כולו. שנית, התפתחות עובריים היא מהירה; זה לוקח רק כמה ימים על כל כלי הדם לפתח, שבמהלכן vascul המתפתח בבית ניתן לדמות. שלישית, התערבויות גנטיות פרמקולוגיות לפני ובמהלך היווצרות כלי הם קלים לביצוע, כגון באמצעות microinjection של antisense morpholino נוקליאוטידים (MO) לתוך העובר המתפתח או באמצעות יישום אמבטיה של תרופות 3 , 4 , 5 .
היתרון הייחודי של Xenopus על דג הזברה היא כי מניפולציות אמבריולוגיות ניתן לבצע כי Xenopus עוקב clevages holoblastic סטריאוטיפיים ואת מפת הגורל עובריים מוגדר היטב 6 . לדוגמה, ניתן ליצור עובר שבו צד אחד לרוחב רק מניפולציה גנטית על ידי הזרקת מו antisense לתא אחד בשלב שני תא. ניתן גם להשתיל את הלימבורד הלב מעובר אחד לאחר כדי לקבוע אם הגן מפעיל את תפקודו על ידי מנגנון פנימי או מהותי-תאהתחת = "xref"> 7. למרות טכניקות אלו פותחו בעיקר Xenopus laevis , שהוא allotetraploid ולכן אינו אידיאלי עבור מחקרים גנטיים, הם יכולים להיות מיושמים ישירות Xenopus tropicalis , מינים דיפלואידי קרובים 8 .
אחת הדרכים לדמיין את כלי הדם בעובר Xenopus לחיות היא להזריק צבע פלואורסצנטי לתווית את כלי הדם. Acetylated צפיפות נמוכה lipoprotein (AcLDL) שכותרתו עם מולקולת פלורסנט כגון DiI הוא בדיקה מאוד שימושי. שלא כמו lDL unacetylated, AcldL אינו קשור לקולטן LDL 9 אבל הוא endocytosed על ידי מקרופאגים ותאי אנדותל. הזרקת DiI-ACLDL אל הלב של חיה תוצאות חיה תיוג פלורסנט ספציפיים של תאים אנדותל, ואת כלי הדם כולו יכול להיות צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעוברים חיים או קבוע 4 .
הנה, אנחנו presEnt מפורט פרוטוקולים להדמיה וכימות של כלי הדם באמצעות DiI-AcLDL ב xenopus tropicalis ( איור 1 ). אנו מספקים נקודות מעשיות מרכזיות, עם דוגמאות של ניסויים מוצלחים ולא מוצלחים. בנוסף, אנו מספקים שיטה פשוטה לניתוח כמותי של המורכבות של כלי הדם, אשר עשוי להיות שימושי בהערכת ההשפעות של גורמים גנטיים וסביבתיים על עיצוב של רשת כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים עמדו בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת יונסי קולג 'לרפואה טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות.
1. הכנת Xenopus tropicalis עוברים
הערה: Xenopus עוברי tropicalis הופקו כפי שתואר לעיל 10 , עם שינוי קל. Xenopus עוברי tropicalis היו מבוים על פי השולחנות של Nieuwkoop ו פבר 11 .
- אינדוקציה של הביוץ
- כדי מראש הממשלה, להזריק גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) לתוך שק הלימפה הגב של זוג צפרדעים (זכר אחד ונקבה אחת) ביום לפני יום ההזדווגות. להזריק 20 יחידות לכל נקבה צפרדע ו 10 יחידות לכל זכר. בית זכר ונקבה באותו טנק לילה (במשך יותר מ 18 שעות).
- כדי פריים, ביום המחרת, להזריק 200 יחידות של hCG ל נקבה מראש דרוך 100 יחידות של hCG כדי מראש- primedזָכָר; את הנקבה תחול יתחיל להטיל ביצים בערך 3 שעות ימשיך לעשות זאת לאורך כל היום. שמור על זוג זכר ונקבה יחד עבור הזדווגות טבעית או טנקים נפרדים עבור ההפריה חוץ גופית (שלב 1.2).
- הַפרָיָה
הערה: ביצים יכול להיות מופרות על ידי הזדווגות טבעית או הפריה חוץ גופית . ב ההזדווגות הטבעית, ביצים מופרות כפי שהם מונחים, ולכן, העיתוי של ההפריה לא ניתן לשלוט. לחלופין, צפרדע ראשונית יכול להיות משובץ בתוך טנק נפרד ביצים unfertilized ניתן לאסוף עבור הפריה חוץ גופית , אשר מייצר מאות עוברים מופרות בו זמנית. הגישה השנייה היא שימושית כאשר microjectject blastomere ממוקד יבוצע לפני תיוג כלי. בגישה זו, עם זאת, זכר הוא הקריב.- הזדווגות טבעית
- השאירו זוג נקבי וזוג זכרי באותו טנק. הזכר יהיה לאחוז את FEmale, המוביל להפריה מיידית של ביצים הניח. לאסוף את הביצים עם כוס או פיפטה פלסטיק ולהעביר אותם בצלחת פטרי. כדי למנוע את הביצים מ דבק פיפטה, מעיל את המשטח הפנימי של פיפטה עם 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA).
- הפריה חוץ גופית (IVF)
- הפרד את הנקבה המחודדת מן הזכר לאחר התחול. הנקבה תתחיל להטיל ביצים באופן ספונטני בערך 3 שעות. העברת כמה ביצים הניח באמצעות BSA מצופה פיפטה לצלחת פטרי לבדוק את איכותם תחת מיקרוסקופ. אם ביצים בריאות (פיגמנט ברור, בצורת כדור אלסטי) הונחו, להתכונן לנתח את האשכים מן הזכר דרוך.
- הפוך 0.4% Tricaine methanesulfonate (MS222) עבור המתת חסד ולהזריק 300 μL לתוך שק הלימפה הגבי של זכר דרוך. בתוך 10 דקות בערך, הזכר יאבד את תחושת האיזון שלו ויישאר לצוף; לאשר כי הזכר הוא מורדמים על ידי צובט רגל אחורית עםזוג מלקחיים קהה ולא התבוננו בתגובה.
- לנתח את שני האשכים, לנקות אותם על ידי הקשה עליהם במהירות על נייר נטול מוך, ולהעביר אותם לתוך microtube המכיל 1 מ"ל של 60% Leibovitz של L-15 בינוני (60%) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS); הליך מפורט מתואר במקום אחר.
- בעדינות למחות את האשכים עם העלי לחלץ את הזרע. בריכוז זה ( כלומר, 2 מבחנים ב 1 מ"ל של 10% FBS ב 60% L-15), כמה טיפות של פתרון טסטיס (0.1 מ"ל) יכול להפרות כשלוש מאות ביצים. הזרע שנותר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בצינור אטום היטב המשמש IVF למחרת.
- לסחוט את הביצים מן הנקבה לתוך צלחת פטרי קטנה. החזק את החלק העליון של הנקבה במהופך על כף היד והניח את האצבע בין רגליה האחוריות. מורחים את רגליה האחוריות באצבע וביד השנייה כדי לחשוף את הקלוואקה. לגעת cloaca לצלחת פטרי. מעיל tהוא צלחת פטרי עם BSA 0.5% כדי להפיץ באופן שווה את הביצים כמו monolayer במהלך ההפריה החוץ גופית.
- הוסף כמה טיפות (0.1 מ"ל) של זרע המכיל L-15 בינוני הביצים. עבור הפריה סינכרוני, לערבב בעדינות את פתרון הזרע על פני המנה. לאחר 4 דקות בטמפרטורת החדר, למלא את צלחת פטרי עם 0.01x שינוי מאלית של מלוחים (MBS), דגירה של 10 דקות, ולהחליף את הפתרון עם 0.1x MBS. ביצים מופרות יעברו את המחשוף הראשון כ 1 שעה בטמפרטורת החדר. 1x MBS הוא 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ NaHCO 3 , 5 מ"מ HEPES, 1 מ"מ MgSO 4 , ו 0.7 מ"מ CaCl 2 , pH 7.5.
- הזדווגות טבעית
- (אופציונלי) הזרקה של oligonucleotides morpholino antisense (MO) ו / או mRNAs
- כדי לחקור את ההשפעה של גן עניין על היווצרות כלי, לבצע את microinjection של antisense MO ו / או mRNAs.
- עבור ניסויים כאלה, דה ג 'לי את הביצים עם 2% L- ציסטאין 1x MBS (pH 7.5-7.8).החלף 0.1x MBS בצלחת המכילה את עוברי מופרות עם L-Cysteine 2% 1 MBS. מערבולת בעדינות את המנה לערבב את הפתרון.
הערה: זה בדרך כלל לוקח בערך 5 דקות עבור העוברים להיות דה- jellied. במהלך שלב זה, לפקח על הביצים לעתים קרובות כדי להבטיח שהם לא חשופים יתר על המידה לפתרון. אם הביצים חשופות יתר על המידה, הן יאבדו את הגמישות ויישכבו, דבר שיגרום להתפתחות קטלנית וקטלניות. - לשטוף את הביצה דה ביצים חמש פעמים עם 0.1x MBS. בצע את microinjection ב 4% Ficoll מומס 0.1x MBS. בדרך כלל, להזריק 4 ng של MO ו 600 pG של mRNA לכל blastomere בשלב שני תא. להזריק לתוך תא אחד לתפעל ביטוי גנים בצד אחד בלבד של העובר. השתמש בצד uninjected של העובר אותו כמו שליטה.
- כמו שליטה נוספת על הספציפיות של מניפולציה גנטית, להזריק את אותה כמות של שליטה MO (CoMO) או mRNA שליטה ( למשל, meta beta-galactosidase). CoMO חייב להיות באותו מ 'משקל אולקולרי כמו MO ספציפי לגן ולא חייב להתמקד בכל גן בגנום Xenopus . להדמיה קלה של הצד מוזרק, להשתמש fluorescein- מתויג MO או שיתוף להזריק נותב ( למשל, mFPNA EGFP).
- השאירו את העוברים מוזרק 4% Ficoll עבור 2 שעות ולאחר מכן להעביר אותם צלחת פטרי 60 מ"מ חדש מלא 0.1x MBS.
- הַעֲלָאָה
- להעלות את העוברים ב 23 מעלות צלזיוס. למרות מהירות הפיתוח ניתן להאט או מואצת על ידי שימוש בטמפרטורות מתחת או מעל 23 מעלות צלזיוס, בהתאמה (טווח: 26-26 מעלות צלזיוס), מומלץ לגדל אותם על 23 מעלות צלזיוס.
- (אופציונלי) טיפול עם ריאגנטים פרמקולוגיים
- עבור מניפולציות פרמקולוגיות, לנהל תרופות לעוברים המתפתחים על ידי יישום אמבטיה.
2. הכנת הזרקת DiI-AcLDL
- הפוך פיפטה זכוכית מתחדד באמצעות micr רגילאופייפט חולץ. מניחים צינור זכוכית borosilicate ב משיכה micropipette ולהשתמש בהגדרות הבאות: לחץ, 200; חום, 30; משוך, 30; מהירות, 120; , 200
- חנות DiI-AcLDL פתרון המניה ב 4 ° C. קח את החלק העליון ברורה של הפתרון עבור הזרקת, אבל לא את החלקיקים זירז על החלק התחתון של הצינור. כל פסולת בפיפטה זכוכית יהיה להפריע את פליטה נאותה של הפתרון.
- ממלאים את פיפטה זכוכית מוכן עם כמות מתאימה של פתרון DiI-AcLDL (~ 5 μL) באמצעות microloader.
- קליפ את קצה פיפטה זכוכית מעט על ידי שימוש זוג מלקחיים בסדר (מספר 55). הגדר את מערכת הזרקת לחץ בלחץ כך כ 5 nL של פתרון הוא נפלט בכל פעם; 50-60 nL של פתרון DiI-AcLDL מספיק כדי הכתם כלי של עובר אחד.
- אל תעזוב את פיפטה טעון DI-ACLDL באוויר במשך תקופה ארוכה של זמן על מנת למנוע ייבוש. שמור על קצה פיפטה שקוע 0.04% MS222 ב 0.1x MBS פתרון. רק לפני הזרקת אותו לתוך העובר (שלב 4.2.1), לבדוק אם אותה כמות של פולט צבע.
3. הגדרת הזרקת
- עובש Sylgard
- כדי להכין עובש Sylgard קטן, לערבב Sylgard בסיס סוכן ריפוי עם יחס משקל של 10-1 מילוי כמחצית צלחת פטרי קטן (35 מ"מ או 60 מ"מ צלחת) עם פתרון זה מעורב ולאחר מכן להשאיר אותו כדי לחזק בערך 48 שעות בטמפרטורת החדר.
- הַרדָמָה
- השתמש 0.04% MS222 ב 1x MBS (pH 7.5-8.0) עבור הרדמה. כאשר נדרשת הרדמה ממושכת ( לדוגמה, במהלך הדמיה חיה), יש להשתמש ב- 0.04% MS222 ב- 0.1x MBS כדי להפחית את חוסר האיזון האוסמוטי. כדי להתאים את ה- pH, להוסיף כמה טיפות של NaOH (~ 20 μL) ולבדוק את ה- pH באמצעות נייר pH.
- המתן עד שהעוברים המועברים יפסיקו לנוע. לגעת סנפירים הגב של העוברים ולבדוק אם הם מגיבים לאשר להשליםהרדמה.
- מיקום העוברים להזרקה
- הכנס את פני השטח של עובש Sylgard מוקשה עם להב דק וחד. הפוך הזחה קעור בצורת V שבו למקם את העוברים (ראה איור 2 ד ). מניחים עובר הרדים, בצד הגחון למעלה, בצורה אלכסונית מעט (כ 30 °) ( איור 2 ד ).
- ממלאים את התבנית עם פתרון MS222 ומכניסים את העוברים בתבנית.
4. DiI-AcLDL הזרקת
- חתך של העור מעל הלב
- הכן שני סיכות (Minutiens, 0.10 מ"מ) לחתוך את העור מעל הלב. חזק לתקן כל סיכה על בעל סיכות; הלב צריך להיות מזוהה בקלות כפי שהוא פועם ( איור 2A-2C , ורוד).
- לנקב את העור של העובר עם סיכה אחת. הכנס את הסיכה דרך החור ברווח בין הלב לבין העור ( איור 2 ג
- בצע חתך ליניארי על ידי שפשוף בעדינות את הסיכה האחרת המוחזקת מחוץ לעור כנגד הסיכה שהוכנסה. בעדינות להרחיב את החתך עם שני סיכות, חשיפת הלב ( איור 2 ב ' ו 2 ד' , חץ). פיפטה טעון עם DiI-AcLDL יכול עכשיו לגשת ישירות את הלב ( איור 2 ' ).
- זריקה
- הכנס את קצה פיפטה טעון זכוכית לתוך הלב להזריק 50-60 nL של פתרון DiI-AcLDL כ 10 פולסים פליטה. אין להזריק כמות מופרזת של פתרון, כמו זה גורם ללב לקרע. בדוק אם הלב ממשיך להכות לאחר ההזרקה. לאחר כל זריקה, לבדוק אם אותה כמות של DiI-AcLDL הוא נפלט; אחרת, קצה פיפטה עשוי להיות חסום (ראה שלב 2.5).
- מעבירים את העוברים מוזרק לצלחת פטרי חדש מלא 0.1x MBS להתאוששות. לאחר 5-10 דקות, הראשנים צריכים להחזיר את ההכרה ולהתחיל לזוז. בשלב זה, את כלי שכותרתו ניתן הדמיה. מומלץ מסך ויזואלי בהצלחה עוברים שכותרתו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 3 א ו 3 ב ). אם כמות מספקת של DiI-AcLDL מוזרק לתוך העובר, זה יכול להיות מוזרק שוב ( איור 3 ג ).
- מחק את ראשנים כי יש איברים אחרים שכותרתו ( איור 3D ). המשך עד לקבלת המספר הנדרש של עוברים שכותרתו בהצלחה.
- לקבלת הדמיה מקיפה יותר של כלי הדם, השתמש מיקרוסקופיה confocal; זה יכול להיות קל יותר לתקן את העוברים שכותרתו עבור מיקרוסקופיה confocal. ראשית להרדים את העוברים שכותרתו ב 0.04% MS222 ב 1x MBS (pH 7.5-8.0) ולאחר מכן לתקן אותם paraformaldehyde 4% ב 1X פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. עוברי קבוע ניתן לאחסן במשך מספר ימים ב 4 ° C; להגן על דגימות מוזרק מן האור כדי למנוע photobleaching של DiI.
5. הדמיה של DiI-AcLDL
- הדמיה סטריאוסקופית
- לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית ( איור 3 ) כדי להעריך את המורפולוגיה הכוללת של כלי הדם.
- ממיסים 1% agarose ב 1x PBS עבור עוברי קבוע או ב 1x MBS עבור הדמיה חיה. יוצקים agarose מומס לתוך צלחת פטרי לחכות עד שהוא מתקשה. הפוך הזחה רדוד על פני השטח של ג'ל agarose כי יתאים העובר להיות צילמו כאשר שוכב על הצד הצדדי שלה. ממלאים את המאכל עם חיץ (פתרון MS222 עבור עוברי הרדים או 1x PBS עבור עוברי קבוע).
- מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מסנן Rhodamine SET)
- כמו DiI הוא ירוק נרגש ואדום פולטת צבע, התמונה באמצעות סט מסנן סטנדרטי עבור rhodamine או fluorophores הקשורים הקשורים מבחינה ספקטרום (עירור מקסימלי ב 554 ננומטר פליטה ב 571 ננומטר). מניחים את העוברים מוזרק ב indentations על עובש agarose ולצלם ( איור 3 ).
- מיקרוסקופיה
הערה: לקבלת ניתוח קרוב יותר של ארכיטקטורת כלי הדם, להשתמש במיקרוסקופ confocal.- אם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, למקם את העוברים על צלחת זכוכית התחתונה. הוסף כמה טיפות של 1x PBS ו immobilize אותם על ידי הנחת כיסוי להחליק על גבי. הסר עודף PBS. אם עוברי לחיות הם להיות צילמו, להשתמש בעוברים הרדים ולהשתמש 0.015% MS222 ב 0.1x MBS במקום PBS.
- עבור הדמיה בהגדלה נמוכה, השתמש המטרה 4X ל 10X למצוא את האזור של עניין; החלק מקורי של הווריד הקרדינלי האחורי (PCV) הוא אזור שימושי לחקור אנגיוגנזה התפתחותית (איור 4, מקווקותיבות).
- השתמש בהגדרת הרכישה עבור fluorophore פליטה אדומה (כגון Rhodamine).
- הפוך z-stacked תמונות על ידי הדמיה חצי לרוחב של עובר. ראשית, להתמקד PCV בצד לרוחב ליד המטרה ולאחר מכן להגדיר את הגבול התחתון של המיקוד במיקום שבו כלי הקרובה ביותר המטרה ממוקדים. הגדר את הגבול העליון במיקום שבו החלק המדיאלי של PCV להיות צילמו יכול להיות ממוקד. תמונה זו כל מחצית לרוחב של העובר. השתמש בתוכנה שמאחסנת מטא נתונים על הגדרות הרכישה, כגון x, y ו- z קשקשים, כפי שהם נדרשים כדי לחשב את אורך הספינה.
- במידת הצורך, השתמש במצב סריקה אריח לתמונה wasculature כולו של העובר. אמפירי לקבוע את מספר האריחים אופקי ואנכי.
- עבור הדמיה הגדלה גבוהה, בצע את ההליכים לעיל לתמונה החלק מקורי של PCV ו 4 ורידים מקורי- rostral ביותר (ISVs) ( איור 4 ,תיבת מקווקו). התאם את מספר ערימות (z- מחסנית) ואריחים (אריח סריקה) כראוי.
6. כימות של DiI שכותרתו כלי
הערה: ניתן לסמן ידנית או להשתמש בתוכנה. אנו משתמשים "פשוט נותב neurite," תוסף חינם ImageJ (NIH), המאפשר חצי אוטומטית מעקב של מבנים דמויי צינור כגון כלי דם ו neurites 12 . באמצעות תוכנה חופשית זו, ניתן לחשב את הפרמטרים הבאים. הליך מפורט לשימוש בתוכנה זו מתואר במקום אחר (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . להלן, אנו משתמשים בדוגמאות של כלי הדם של עוברי שבו Tie2 איתות הוא מעוכב או משופרת ( איור 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO מוזרק עוברי התערוכה מפחית אנגיוגנזה מקצר ISVs ( איור 4 ב ), ואילו שיתוף הזרקת של פעיל Tie2 פעילמוטציה mRNA (caTie2 mRNA) מעל rescues זה פנוטיפ, וכתוצאה מכך ענפי ISV נלהב ( איור 4 ג ).
- אורך ISV
- באמצעות נותב neurite פשוט, לחשב את אורך של כל כלי שייט. חישוב אורכים של 4 ISVs מקורי.
- סניפי ISV
הערה: בעוברים wildtype, רק כמה ענפים קצרים נובטים מן ISVs רוב מקורי בשלב 42.- ב נותב פשוט neurite, לעקוב אחר כלי קטן לאחר ביצוע ISV שממנו הם מקורם הסניף העיקרי. חישוב הפרמטרים הבאים של ענפים אלה שמקורם ISVs.
- מספר סניף סך הכל
- לאחר כל ה- ISVs ואת הענפים הקשורים נלכדים, לחשב את המספר הכולל של הענפים ( איור 5B-5D ).
- סדר סניף
- כמו נייורט פשוט נותב רשומות סדר של כל ענף ( איור 5 א ), חישובE מספר הסניפים עבור כל הזמנה. רוב כלי עוברים wildtype צריך להיות הענפים העיקריים ( כלומר, ISVs).
- מדד המורכבות של הוורידים (VCI)
- כמו VCI הוא פרמטר שימושי עבור המורכבות כלי, אשר נותן משקל רב יותר לענפים סדר גבוה יותר, לחשב את VCI עבור כל עובר באמצעות הנוסחה בתרשים 5A . לדוגמה, עוברי Tie2MO מוזרק יש VCI נמוך בהשוואה לבקרה ( איור 5 ב ו 5 ג ), ו- CATie2 mRNA מוזרק עוברים יש VCI גבוה יותר ( איור 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ציר הזמן של ניסויים (תרשימים 1 ו -2)
זמן קצר לאחר ההפריה, ממוקד microinjection יכול להתבצע כדי לווסת ביטוי גנים. לדוגמה, antisense MO אשר נקשר ספציפית קודון חניכה של mRNA Tie2 אנדוגני יכול להיות מוזרק, מעכב את התרגום של mRNA היעד Tie2 ידי מכשול סטרי. מו יכול להיות מצומדות כדי פלואורסצין עבור הקרנה חזותית קלה של עוברי מוזרק בהצלחה. לחלופין, mRNA נותב ( למשל, קידוד mRNA קידוד EGFP) ניתן שיתוף מוזרק עם MO. בנוסף, תרופות ניתן לטפל על ידי יישום אמבטיה לאחר הבקיעה (שלב tailbud מוקדם, סביב NF שלב 26). ממיסים את התרופה 0.1x MBS ולהוסיף אותו העוברים. לטיפול מוקדם יותר, עוברי יכול להיות משוחרר מן הקרומים עם זוג מלקחיים. DiI-AcLDL יכול להיות מוזרק ללב סביב שלב 33/34 לחקור את הדינמיקה של כלי כליAtion, אבל בדרך כלל אנחנו מזריקים בשלב 37/38 או מאוחר יותר ( איור 2 , אזורים צבעוניים).
דוגמאות אופייניות לזריקות מוצלחות ולא מוצלחות (שלב 4.3) (איור 3)
הדמיה סטריאוסקופית מתאימה להקרנה חזותית. אם כמות מספקת של DiI-AcLDL מוזרק לתוך הלב, ה- PCV צריך להיות גלוי מיד תחת stereoscope פלואורסצנטי ( איור 3 א ו 3 ב ). עוברים הזרקת מספיק או לא מזוהים קל לזהות ( איור 3 ג ו -3 D ). עוברים עם כמות מספקת של DiI-AcLDL ( איור 3 ג ) ניתן להזריק שוב עם צבע זהה עד כלי נראים בבירור. התמונה הזריקו בהצלחה עוברי תחת מיקרוסקופ confocal, חי או לאחר קיבוע.
פיתוח פוסטריםאו הווריד הקרדינלי (PCV) והורידים האינטרסומיים (ISV)
ה- PCV משתרע בכיוון הזווית אל הזנב, ותוסף זה מסתיים סביב שלב 37/38. ISVs יוצאים dorsally מן PCV בגל הקדמי אל האחורי. גל זה של הקמת ISV מתחיל בשלב 36 ומסתיים סביב שלב 40/41; ISVs ממשיכים לגדול ולהיות מסועפת קלות עד שלב 43 ( איור 3 א ו 3 ב ).
Tie2 איתות שולט התפתחותי ISV הסתעפות (איור 4)
PCV ו- ISVs לגדול דפוס סטריאוטיפי, ואת הפיתוח שלהם תחת שליטה הדוקה ( איור 4 א ). ניתן לתאר את התהוות של ה- ISV מה- PCV כאנגיוגנזה, ולכן הוא מודל שימושי לבדיקת מנגנונים מולקולריים שבבסיס אנגיוגנזה. אנו מציגים את התוצאה של המחקר הנוכחי שלנו showiNg כי אותות התפתחותיים לעכב Tie2 איתות ב ISVs להגביל את הסתעפות שלהם 5 . את מציאה של Tie2 איתות על ידי antisense MO מקטין את אורך ומורכבות של ISVs (איור 4 ב), וביטוי צורה אקטיבית מכוננת של Tie2 (caTie2) גורם מוגזם ISV הסתעפות ( איור 4 ג ).
כימות המורכבות של ISV (איור 5)
בנוסף לאורכים ולסניפים של ספקי שירותי האינטרנט, ניתן לחשב את "מדד המורכבות הוורידית" (VCI) כדי להעריך את המורכבות שלהם ( איור 5 א ). אימצנו את "מדד המורכבות" שפותח על ידי כהן-קורי ועמיתיו, אשר נועד לכמת את המורכבות של נוירונים אקסונליים או דנדריטים סוכות 13 . במדד זה, עובר עם סניפים גבוה יותר מקבל ציון גבוה יותר מאשר עובר עם אותו מספר של סובין סה"כChes אבל עם יותר נמוך סדר סניפים. לכן, VCI גבוה יותר עולה כי עובר זה יש רשת ורידית מורכבת יותר. "פשוט neurite נותב" היא תוכנה שימושית כדי לעקוב אחר סדר ואורך של סניפים בודדים. זה גם אפשרי ליצור "נתיבים שניתנו", אשר היא דרך שימושית כדי לדמיין את האדריכלות הכוללת של כלי הדם ( איורים 5B-5D , לוחות ימין).
איור 1: ציר הזמן של הניסויים. ביום ההפריה, morpholinos (MO), DNA, RNA, או חלבון יכול להיות מוזרק ביצים מופרות בשלב NF 1 (st1) או 2 (st2). אם מוזרק רק לתוך אחד blastomere ב st2, מגיב מוזרק ישפיע רק צד אחד צדדי. הצד uninjected יכול לשמש כבקרה. Co- להזריק נותב ( למשל, EGFP mRNA) כדי לזהות את הצד מוזרק. ביום השני, אהשלב tailbud rly (~ st24) עוברים ניתן לטפל עם ריאגנטים פרמקולוגיים על ידי יישום אמבטיה. הלב נראה בבירור ביום השלישי. DiI-AcLDL ניתן להזריק ללב וכלי הדם ניתן הדמיה זמן קצר לאחר ההזרקה. השתמש st33-37 עוברים לתדמית הדינמיקה של צמיחה כלי או עוברי st42 לתמונה כלי מפותח במלואו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מיקום של הזרקת DiI-ACLDL ב st42. לרוחב ( AB ) ו הגחון ( CD ) תצוגות של שלב 42 העובר. הלב הוא בצבע ורוד ב AC , בתמונות שצולמו Xenbase (www.xenbase.org). תמונות סטריאוסקופיות נציג מוצגים A ,
איור 3: התוצאות הצפויות (תמונות סטריאוסקופיות). תמונות הקרינה נציג מן שלב 37/38 ( א ) ו שלב 42 ( ב ) עוברים. בצד שמאל של העוברים מוצגים. הווריד הקרדינלי אחורי (PCV) משתרע על פני הזנב, שממנו נייחים הוורידים האינטרסומיסטים (ISVs) בסניף dorsally ב- wav מקורי ל- to-caudalה. רק רכבי ISV מקורי נראים בשלב 37/38 ( A ), ורוב ISVs נוצרו על ידי שלב 42 ( B ). אם כמות לא מספקת של DiI-AcLDL מוזרק, ה- PCV לא יהיה גלוי לעין, גם לאחר 30 דקות ( C ). במקרה זה, יותר DiI-AcLDL יכול להיות מוזרק. אם DiI-AcLDL מוזרק בטעות לאיברים אחרים ( D ), מחק את העוברים. סולם בר = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ההשפעות של איתות Tie2 על פיתוח ISV. ביטוי Tie2 הגן הופל על ידי הזרקת blastomere של חסימת תרגום antisense morpholino oligonucleotides (Tie2MO). שליטה morpholino (CoMO) יש משקל מולקולרי זהה, אבל האם nלכוון כל גן ב- Xenopus tropicalis . MRNA-cododively פעיל Tie2 מוטציה (caTie2) היה שיתוף מוזרק כדי להציל את הפנוטיפ Tie2 מציאה. בניגוד לשליטה ( A ), הזריקה TTie2MO הובילה לירידה דרמטית באורך ומספר ISVs ( B ). פנוטיפ זה חולץ על ידי CATie2, אשר הראה ISVs עם ענפים בטחונות שופע ( C ). המורכבות של ISVs באזורים המצוין על ידי תיבות מקווקו כחול הוא לכמת באיור 5. קנה מידה בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: כימות המורכבות של הווריד. ( א ) המורכבות של ISV יכול להיות מיוצג על ידי מדד המורכבות הווריד (VCI).( BD ) VCIs חושבו מן העוברים שמוצג באיור 4. קנה מידה בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שהוצג כאן פותח לראשונה על ידי עלי H. Brivanlou ועמיתיו לחקור אירועים התפתחותיים במהלך היווצרות כלי הדם ב Xenopus laevis 4 , אבל, כפי שמוצג בכתב יד זה, זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים קטנים אחרים. הזרקת דיו לתוך הלב הוא פשוט לבצע, ואת הרשת כלי הדם כולו יכול להיות צילמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי פלואורסצנטי, כמו גם מיקרוסקופ confocal. אם הצבע מוזרק ללב במהלך פיתוח כלי שיט, הדינמיקה של כלי השיט ואת הסתעפות יכול להיות צילמו בזמן אמת 4 . באמצעות הרשת הוורידית מוגדרת היטב, במיוחד ה- PCV ו רוב ISVs, מקרין את ההשפעות של הפרעות גנטיות או סביבתיים על אנגיוגנזה ניתן להעריך באופן כמותי.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הזרקת DiI-ACLDL (שלב 4). אנו מספקים דוגמאות לזריקות מוצלחות ולא מוצלחות ( Fi3). עוברים מוזרק בהצלחה צריך להיות מוקרן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמתואר בשלב 4.3. אם PCV אינו גלוי 30 דקות לאחר ההזרקה, לא מספיק DiI-AcLDL הוזרק ( איור 3 ג ). עוברים מוזרקים בהצלחה עשוי להיות הרדים מוזרק שוב. במקרים מסוימים, DiI-AcLDL עשוי להיות מוזרק לתוך מיקום שגוי, ובמקרה זה איברים אחרים יפורטו ( איור 3D ). מחק עוברי מוזרקים שגוי.
כלי הדם של העובר מוזרק בהצלחה יהיה גלוי זמן קצר לאחר ההזרקה, ואת הקרינה נמשכת כמה שעות. לכן, אם ההזרקה מבוצעת לפני היווצרות של ISVs, הפיתוח שלהם יכול להיות צילמו בעובר חי, מתן כלי רב עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של מערכת הלב וכלי הדם בזמן אמת ב vivo 4 . כמו קסנופוס שימש בהצלחה כמודל למסך כלי הדם ד14 , הגישה הניסויית המתוארת כאן עשויה להיות משולבת עם ניסויים הפרעה פרמקולוגית ומשמשת פלטפורמת הקרנה כדי למצוא תרופות המעצימות או מעכבות אנגיוגנזה.
כלי הדם יכולים להיות דמיינו על ידי כלים גנטיים, כמו גם על ידי צבע מבוססי שיטות תיוג המתואר כאן. לדוגמה, מהונדס Xenopus 15 או דג הזברה 16 המבטאים חלבונים הקרינה תחת שליטה מסוגים ספציפיים סוג תא לאפשר הדמיה חיה של דם כלי הלימפה, וזה אפשרי אפילו להפלות עורקים מורידי 16 . למרות גישות גנטיות עדיפות וליצור יעילות תיוג עקבית יותר, שיטות מבוססות צבע הם נגישים בקלות על רוב המעבדות ללא גישה אלה בעלי חיים מהונדסים גנטית. ב Xenopus , זלוף transcardial של תוצאות DII-ACLDL בתיוג של רוב התאים האנדותל 4 , העורקים והוורידים אינם ניתנים להבדיל בתמונות הקרינה. למרבה הפלא, עגבניות lectin-fluorescein סלקטיבית תוויות העורקים בעכברים, וכאשר שיתוף הזריקו עם DiI-AcLDL, העורקים והורידים ניתן להפלות 17 . למרות היישום לא נבדק ברקמות אחרות או בעלי חיים, זה מספק כיוון מבטיח לחקור את התפתחות דינמית של העורקים והורידים Xenopus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה קיבל השראה מעבודתו של לוין ואח '. , אשר תיאר שיטה זו ניסיוני וסיפק תיאור מקיף של פיתוח כלי הדם ב Xenopus laevis. אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הקלט שלהם. מחקר זה נתמך על ידי יוזמת המחקר המובילה של Yonsei University for Future of 2015 (2015-22- 0095) ותוכנית פיתוח הטכנולוגיה הביו-רפואית של הקרן הלאומית למחקר (NRF) הממומנת על ידי משרד המדע, ICT & תכנון עתידי ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
