Summary
यह प्रोटोकॉल vasculature कल्पना और क्सीनोपस उष्णकटिबंधीय में इसकी जटिलता का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति को दर्शाता है । रक्त वाहिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन के बाद भ्रूण के हृदय के आनुवंशिक और / या औषधीय जोड़तोड़ के बाद हृदय में हृदय संबंधी विकास के अध्ययन के बाद मिनटों को इमेज किया जा सकता है ।
Abstract
रक्त वाहिकाओं पूरे शरीर में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति करते हैं, और संवहनी नेटवर्क का गठन तंग विकास नियंत्रण के अंतर्गत होता है। रक्त वाहिकाओं के विवो दृश्यता में और उनकी जटिलता के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव, नाड़ी नेटवर्क के जीव विज्ञान और बीमारी को समझने में महत्वपूर्ण है। यहां, हम एक विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं जो रक्त वाहिकाओं को वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट डाई, मानव प्लाज्मा एसिटाइटेड कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन डीआई कॉम्प्लेक्स (डीआईआई-एसीडीएल) के साथ कल्पना करते हैं, और क्सीनोपस ट्रॉपिकल में उनकी जटिलता का पता लगाने के लिए प्रदान करते हैं । रक्त वाहिकाओं को डीआईआई- एसीडीएल के एक सरल इंजेक्शन द्वारा भ्रूण के पिटाई दिल में लेबल किया जा सकता है, और पूरे भ्रूण में रक्त वाहिकाओं को जीवित या निश्चित भ्रूण में चित्रित किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड के लक्षित microinjection और / या औषधीय अभिकर्मकों के स्नान आवेदन द्वारा जीन गड़बड़ी के साथ संयुक्त, एक जीन की भूमिका या नाड़ी के विकास पर एक सिग्नलिंग मार्ग हो सकता हैपरिष्कृत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों का सहारा लेने के बिना एक सप्ताह के भीतर शर्मिंदा Xenopus और इसकी स्टीरियोटाइपिक एंजियोजेनेसिस की अच्छी तरह से परिभाषित श्वासनलिका प्रणाली के कारण, पूर्व-मौजूदा जहाजों के अंकुरण, पोत जटिलता को गड़बड़ी प्रयोगों के बाद कुशलतापूर्वक मापा जा सकता है। यह अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल कार्डियोवास्कुलर अनुसंधान के विविध क्षेत्रों में एक आसानी से सुलभ उपकरण के रूप में सेवा करना चाहिए।
Introduction
Vasculogenesis, नवजात जन्मजात कोशिकाओं से नए रक्त वाहिकाओं का निर्माण, और एंजियोजेनेसिस, पूर्व-मौजूदा जहाजों से नए जहाजों का गठन, दो अलग-अलग प्रक्रियाएं हैं जो कि भ्रूण वास्क्यूचर 1 को आकार देते हैं। इन प्रक्रियाओं में किसी भी प्रकार के अभाव में विभिन्न हृदय रोगों और जहाजों की संरचनात्मक असामान्यताएं होती हैं। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास अनियंत्रित पोत विकास के साथ जुड़ा हुआ है जैसे, वास्कुलोजेनेसिस और एंजियोजेनेसिस के अंतर्गत आणविक तंत्र, तीव्र जांच का विषय है 2 ।
ज़िनोपस और ज़ेबराफिश, कई कारणों से vasculogenesis और angiogenesis अध्ययनों के लिए आकर्षक वर्टेब्रेट मॉडल हैं। सबसे पहले, उनके भ्रूण छोटे होते हैं; इसलिए, यह छवि के लिए अपेक्षाकृत आसान है, पूरे वास्कुलचर। दूसरा, भ्रूण विकास तेजी से होता है; यह केवल पूरे vasculature के विकास के लिए कुछ दिनों का समय लेता है, जिसके दौरान विकासशील कोशिकाएं अचरण इमेजेट किया जा सकता है तीसरा, पोषक संरचना के पहले और दौरान, आनुवंशिक और औषधीय हस्तक्षेप करना आसान है, जैसे कि एंटीसेन्स मोर्फोलिनो न्यूक्लियोटाइड (एमओ) के विकासशील भ्रूण में या 3 , 4 , 5 दवाओं के स्नान आवेदन के माध्यम से।
ज़ेब्राफिश पर ज़ीनोपस का अनूठा लाभ यह है कि भ्रूण-संबंधी जोड़-तोड़ें इसलिए की जा सकती हैं क्योंकि ज़िनोपस टकसाली होलोब्लास्टिक क्लीवेज का अनुसरण करता है और भ्रूण भाग्य का नक्शा अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है। उदाहरण के लिए, एक भ्रूण पैदा करना संभव है जिसमें दो कोशिकाओं के एक कोशिका में दो कोशिकाओं के एक एंटीज़ेंस एमओ द्वारा इंजेक्शन लगाने से आनुवंशिक रूप से केवल एक पार्श्व की ओर बढ़ जाती है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या जीन एक सेल-आंतरिक या -परिर्सेज तंत्र द्वारा अपने कार्य को सक्रिय करता है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए हृदय प्रापर्टीज को एक भ्रूण से दूसरे स्थान पर ट्रांसप्लांट करना भी संभव हैAss = "xref"> 7 यद्यपि इन तकनीकों को ज्यादातर ज़िनोपस लाईविस में विकसित किया गया है, जो कि ऑलोटेट्राप्लाइड है और इसलिए आनुवंशिक अध्ययनों के लिए आदर्श नहीं है, उन्हें सीधे Xenopus tropicalis , एक बारीकी से संबंधित द्विगुणित प्रजातियों 8 पर लागू किया जा सकता है।
जीवित Xenopus भ्रूण में vasculature की कल्पना करने का एक तरीका रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्ट करना है। डीआईआई जैसे फ्लोरोसेंट अणु के साथ लेबल एसिटिलेटेड कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एसीएलडीएल) एक बहुत ही उपयोगी जांच है। अप्रभावी एलडीएल के विपरीत, एसीएलडीएल एलडीएल रिसेप्टर 9 से जुड़ा नहीं है, लेकिन मैक्रोफेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एन्डोकिटेट किया गया है। डीआईआई-एसीडीएल का इंजेक्शन एक जीवित प्राणियों के परिणाम में एंडोथेलियल कोशिकाओं के विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग में होता है, और पूरे vasculature को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव या निश्चित भ्रूण 4 में इमेज किया जा सकता है।
यहाँ, हम presXenopus tropicalis ( चित्रा 1 ) में DiI-AcLDL का उपयोग कर रक्त वाहिकाओं के दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल। हम महत्वपूर्ण व्यावहारिक बिंदुएं प्रदान करते हैं, सफल और असफल प्रयोगों के उदाहरणों के साथ। इसके अलावा, हम संवहनी जटिलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करते हैं, जो संवहनी नेटवर्क के आकार पर आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभावों का आकलन करने में उपयोगी हो सकते हैं।
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Protocol
सभी प्रयोगों ने यूनेसी यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुपालन किया।
1. Xenopus tropicalis भ्रूण की तैयारी
नोट: Xenopus tropicalis भ्रूण के रूप में पहले से वर्णित 10 के रूप में उत्पादन किया गया , मामूली संशोधन के साथ। Xenopus tropicalis भ्रूण Nieuwkoop और Faber 11 की मेज के अनुसार आयोजित किया गया।
- ओवल्यूशन का प्रेरण
- पूर्व-प्राइम के लिए, संभोग के दिन के पहले दिन में मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) को एक बेड़ी के मेंढक (एक पुरुष और एक महिला) के पृष्ठीय लिम्फ थैली में इंजेक्षन करना। प्रति महिला मेंढक में 20 इकाइयां और पुरुष प्रति 10 इकाइयां इंजेक्ट करें। रात में एक ही टैंक में पुरुष और एक महिला (18 घंटे से अधिक के लिए) घर।
- प्रधानमंत्री के लिए, अगले दिन, पूर्व प्राइमरी महिला को एचसीजी की 200 इकाइयां और प्री-प्राइमड में 100 यूनिट एचसीजी को इंजेक्ट करनानर; प्राइमरी महिला लगभग 3 घंटे में अंडे देना शुरू कर देगी और पूरे दिन ऐसा करते रहेंगे। इन विट्रो निषेचन (चरण 1.2) में प्राकृतिक संभोग के लिए या अलग टैंक में नर और मादा जोड़ी एक साथ रखें।
- निषेचन
नोट: अंडे को प्राकृतिक संभोग या इन विट्रो निषेचन में निषेचित किया जा सकता है। प्राकृतिक संभोग में अंडे को निषेचित किया जाता है क्योंकि वे रखे जाते हैं, और इसलिए, निषेचन का समय नियंत्रित नहीं किया जा सकता। वैकल्पिक रूप से, एक प्राइमरी मादा मेंढक एक अलग टैंक में रखे जा सकते हैं और इनफ्रूटो फर्टिलाइज़ेशन के लिए बिना खारिज अंडे एकत्र किए जा सकते हैं, जो एक ही समय में सैकड़ों भ्रूण को निषेचित करता है। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण उपयोगी होता है जब ब्लास्टोमरे-लक्षित माइक्रोइन्जेक्शन को पोत लेबलिंग से पहले किया जाएगा। इस दृष्टिकोण में, हालांकि, एक पुरुष का बलिदान किया जाता है।- प्राकृतिक संभोग
- एक ही टैंक में प्रस्तोता महिला और पुरुष जोड़ी छोड़ दें पुरुष एफ को पकड़ लेगाइमले, जिससे निर्धारित अंडे के तत्काल निषेचन होते हैं। एक गिलास या प्लास्टिक विंदुक के साथ अंडे ले लीजिए और उन्हें पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। अंडे को विंदुक से चिपकाने के लिए, 0.5% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) के साथ पिपेट की आंतरिक सतह कोट।
- इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) में
- प्राइमिंग के बाद पुरुष से प्राइमरी मादा को अलग करना। महिला लगभग 3 घंटे में अनायास ही अंडे देना शुरू कर देगी। पेट्री डिश में बीएसए लेपित पिपेट का उपयोग करके कुछ डिब्बाबंद अंडों को स्थानांतरित करें और माइक्रोस्कोप के तहत उनकी गुणवत्ता जांचें। यदि स्वस्थ अंडे (स्पष्ट वर्णक, लोचदार गेंद-आकार) रखे गए थे, तो प्राइमेट नर से टेस्ट्स काटना करने के लिए तैयार।
- इच्छामृत्यू के लिए 0.4% ट्राइकेन मेथेनसल्फोनेट (एमएस 222) बनाएं और प्राइमड नर के पृष्ठीय लिम्फ थैली में 300 μL को इंजेक्षन करें। लगभग 10 मिनट में, पुरुष अपनी शेष राशि की भावना खो देगा और बचाएगा; पुष्टिकरण करें कि पुरुष को एक हिंद पैर के साथ एक को छेड़ने के द्वारा euthanized हैकुंद संदंश की जोड़ी और कोई जवाब नहीं देख रहा है।
- दो वृषणों को छीलकर, उन्हें जल्दी से लिंट-फ्री पेपर पर टैप करके उन्हें साफ करें, और उन्हें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक 60% लीबॉविट्ज़ के एल -15 मध्यम (60%) युक्त 1 एमएल युक्त माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें; एक विस्तृत प्रक्रिया कहीं और 10 में वर्णित है
- धीरे से शुक्राणु निकालने के लिए पेस्टल के साथ टेस्ट्स को छील कर दें। इस एकाग्रता पर ( अर्थात, 60% एल -15 में 10% एफबीएस के 1 एमएल में 2 टेस्ट्स), टेस्टिस सॉल्यूशन (0.1 एमएल) के कुछ बूंदों में लगभग तीन सौ अंडे का उपयोग कर सकते हैं। शेष शुक्राणु 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सख्ती मुहरबंद ट्यूब में संग्रहीत किया जा सकता है और अगले दिन आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- अंडे को एक छोटे पेट्री डिश में महिला से दबाएं। महिला के ऊपरी भाग को हथेली पर उल्टा रखें और अपने पिछले पैरों के बीच तर्जनी डाल दीजिए। क्लॉका का पर्दाफाश करने के लिए तर्जनी और दूसरे हाथ के साथ अपने पिछले पैरों को फैलाएं। पेटी डिश में क्लॉका को स्पर्श करें कोट टीवह पेट्री डिश 0.5% बीएसए के साथ आईवीएफ के दौरान एक मोनोलेयर के रूप में अंडे को समान रूप से वितरित करता है।
- कुछ बूंदों (0.1 एमएल) शुक्राणु युक्त एल -15 मध्यम अंडे को जोड़ें। तुल्यकालिक निषेचन के लिए, धीरे से पकवान भर में शुक्राणु समाधान हलचल। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के बाद, 0.01x संशोधित बार्थ के खारा (एमबीएस) के साथ पेट्री डिश भरें, 10 मिनट के लिए सेते, और समाधान को 0.1x एमबीएस के साथ बदलें। निषेचित अंडे कमरे के तापमान पर लगभग 1 घंटे में पहली दरार से गुजरेंगे। 1x एमबीएस 88 एमएम NaCl, 1 एमएम केएलएल, 2.5 मिमी एनएचओओ 3 , 5 एमएम HEPES, 1 एमएम एमजीएसओ 4 और 0.7 एमएम CaCl 2 , पीएच 7.5 है।
- प्राकृतिक संभोग
- (वैकल्पिक) एंटीसेन्स मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एमओएस) और / या एमआरएनए का इंजेक्शन
- पोत के गठन पर ब्याज की एक जीन के प्रभाव की जांच के लिए, एंटीसेन्स एमओ और / या एमआरएनए के माइक्रोिनगेनाइजेशन करें।
- ऐसे प्रयोगों के लिए डी-जेली 1x एमबीएस (पीएच 7.5-7.8) में 2% एल-सिस्टीन के साथ अंडे।1x एमबीएस में 2% एल-सिस्टीन युक्त निषेचित भ्रूण वाले डिश में 0.1x एमबीएस बदलें। हलचल को हल करने के लिए धीरे से पकवान को भंवर।
नोट: भ्रूण को डी-जेलीड होने के लिए आमतौर पर लगभग 5 मिनट लगते हैं। इस चरण के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए अक्सर अंडे की निगरानी करें कि वे समाधान से अधिक नहीं हैं अगर अंडे अधिक से अधिक उजागर होते हैं, तो वे लोच खो देंगे और चपटा हो जाएंगे, जिससे बेईमान विकास और घातकता का कारण होगा। - डी-जेलीड अंडे को 0.1 गुना एमबीएस के साथ पांच बार धो लें। 0.1% एमबीएस में भंग 4% Ficoll में microinjection करें। आमतौर पर, दो सेल चरण में 4 एनजी एमओ और 600 पीजी एमआरएन प्रति ब्लॉस्टोमेरे इंजेक्ट करें। भ्रूण के केवल एक तरफ जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए एक सेल में इंजेक्शन करें। नियंत्रण के रूप में एक ही भ्रूण के बिना पक्ष का उपयोग करें।
- जीन के हेरफेर की विशिष्टता के लिए एक और नियंत्रण के रूप में, एक नियंत्रण एमओ (कोमो) या नियंत्रण एमआरएनए ( जैसे, बीटा-गैलेक्टोसिडेस एमआरएनए) की एक ही राशि इंजेक्षन करें। कोमो के पास एक ही मील होना चाहिएजीन-विशिष्ट एमओ के रूप में ओलेक्यूलर वजन और ज़िनोपस जीनोम में किसी भी जीन को लक्ष्य नहीं करना चाहिए। इंजेक्टेड पक्ष के आसान दृश्य के लिए, फ्लोरोसिसिन टैग किए गए एमओ का उपयोग करें या एक अनुरेखक को सह-इंजेक्ट करें ( जैसे, ईजीएफपी एमआरएनए)।
- इंजेक्शन किए गए भ्रूण को 4% Ficoll में 2 घंटे के लिए छोड़ दें और फिर उन्हें 0.1x एमबीएस से भरे हुए एक नए 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरण करें।
- रेजिंग
- भ्रूण 23 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं यद्यपि विकास की गति धीमा हो सकती है या क्रमश: 23 डिग्री सेल्सियस से नीचे या तापमान का उपयोग करके तेज हो सकती है (सीमा: 16-26 डिग्री सेल्सियस), उन्हें 23 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाने की सिफारिश की जाती है।
- (वैकल्पिक) औषधीय अभिकर्मकों के साथ उपचार
- औषधीय जोड़ों के लिए, स्नान अनुप्रयोग द्वारा विकासशील भ्रूणों के लिए दवाओं को प्रशासित करें।
2. DiI-AcLDL इंजेक्शन की तैयारी
- मानक माइक का उपयोग करके एक टेपरिंग ग्लास विंदुक बनाएंओपीिपेट खींचने वाला माइक्रोप्रिपेट खींचने में एक बोरोजिलेट ग्लास ट्यूब रखें और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: दबाव, 200; गर्मी, 30; पुल, 30; वेग, 120; समय, 200
- स्टोर डीआई- एसीडीएल स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन के लिए समाधान के ऊपरी हिस्से को निकालें, लेकिन नलिका के नीचे उपजी कण नहीं। कांच विंदुक में कोई मलबे समाधान की उचित इजाजत को भंग कर देगा।
- डिली-एसीडीएल समाधान (~ 5 μL) की उपयुक्त मात्रा के साथ तैयार किए गए ग्लास विंदुक को एक माइक्रोलोडर का उपयोग करके भरें।
- कांच विंदुक की नोक थोड़ी-थोड़ी से संदंश (संख्या 55) की एक अच्छी जोड़ी का उपयोग करके क्लिप से छूटे। दबाव-नियंत्रित इंजेक्शन सिस्टम सेट अप करें ताकि लगभग 5 एनएल समाधान हल हो जाए; डीआई-एसीडीएल समाधान के 50-60 एनएएल एक भ्रूण के जहाजों को दाग करने के लिए पर्याप्त है
- सुखाने से बचने के लिए समय की विस्तारित अवधि के लिए डाय-एसीडीएल-लोडेड पिपेट को हवा में न छोड़ें। 0.04% एमएस में डुबकी पिपेट की नोक रखें222 में 0.1 एक्स एमबीएस समाधान। भ्रूण में कदम लगाने से पहले (चरण 4.2.1), यह देखने के लिए जांचें कि क्या समान मात्रा में डाई निकलती है।
3. इंजेक्शन सेटअप
- Sylgard मोल्ड
- एक छोटा सा सिलगर्ड मोल्ड तैयार करने के लिए, सिल्गर्ड बेस और इलाज के एजेंट को 10 से 1 के वजन अनुपात के साथ मिलाएं। इस मिश्रित समाधान के साथ एक छोटा पेट्री डिश (लगभग 35 मिमी या 60 मिमी डिश) का आधा भाग लें और फिर इसे लगभग कमरे के तापमान पर 48 घंटे
- बेहोशी
- संज्ञाहरण के लिए 1x एमबीएस (पीएच 7.5-8.0) में 0.04% एमएस 222 का उपयोग करें। जब लम्बी संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है ( उदाहरण के लिए, लाइव इमेजिंग के दौरान), 0.04% एमएस 222 का 0.1x एमबीएस में ऑसमॉटिक असंतुलन को कम करने के लिए उपयोग करें। पीएच समायोजित करने के लिए, NaOH (~ 20 μL) की कुछ बूंदें जोड़ें और पीएच पेपर का उपयोग करके पीएच की जांच करें।
- ट्रांसफर किए गए भ्रूण को आगे बढ़ने तक रुको। भ्रूण के पृष्ठीय पंख को स्पर्श करें और निरीक्षण करें कि क्या वे पूरी तरह से पुष्टि करने के लिए जवाब देते हैंnesthesia।
- इंजेक्शन के लिए भ्रूण स्थान निर्धारण
- एक पतली और तेज ब्लेड के साथ कठोर Sylgard मोल्ड की सतह इंडेंट। भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक वी-आकार का अंतराल बनाओ ( चित्रा 2 डी देखें)। थोड़ा तिरछा फैशन (लगभग 30 डिग्री) ( चित्रा 2 डी ) में एक संवेदनाहृत भ्रूण, उदर-पक्ष ऊपर रखें।
- एमएस 222 समाधान के साथ मोल्ड भरें और ढालना में भ्रूण को रखें।
4. डीआईआई-एसीएलडीएल इंजेक्शन
- हृदय पर निर्भर त्वचा का निराकरण
- दिल को खत्म करने वाली त्वचा को काटने के लिए दो पिन तैयार करें (मिनिटियन, 0.10 मिमी) प्रत्येक पिन को पिन-धारक के लिए कसकर ठीक करें; हृदय को आसानी से पहचाना जाना चाहिए क्योंकि यह स्पंदन करता है ( चित्रा 2 ए -2 सी , गुलाबी)।
- एक पिन के साथ भ्रूण की त्वचा को पंचर करें। दिल और त्वचा के बीच के अंतरिक्ष में छेद के माध्यम से पिन डालें ( चित्रा 2 सी
- धीरे-धीरे डाले हुए पिन के खिलाफ त्वचा के बाहर रखी अन्य पिन को रगड़कर एक रैखिक चीरा बनाएं। धीरे धीरे इस चीरा को दो पिनों के साथ चौड़ा करें, दिल को उजागर करें ( चित्रा 2 बी ' और 2 डी' , तीर)। डीआईआई-एसीडीएलएल के साथ भरा विंदुक अब सीधे हृदय ( चित्रा 2 डी ' ) पर पहुंच सकता है
- इंजेक्शन
- लोड किए गए ग्लास विंदुक की टिप को हृदय में डालें और लगभग 10 इग्जेशन दालों में 50-60 एनएल का डाय-एसीडीएल समाधान डालें। समाधान की एक अत्यधिक राशि इंजेक्षन न करें, क्योंकि इससे हृदय को टूटना पड़ता है जांचें कि क्या इंजेक्शन के बाद दिल को हराया जा रहा है या नहीं। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, जांचें कि क्या डाय-एसीएलडीएल की समान मात्रा निकली है; अन्यथा, विंदुक की नोक अवरुद्ध (चरण 2.5 देखें) हो सकता है।
- इंजेक्शन भ्रूण को वसूली के लिए 0.1x एमबीएस से भरा एक नया पेट्री डिश में स्थानांतरण करें। 5-10 मिनट के बाद, टेडपोल को चेतना हासिल होनी चाहिए और आगे बढ़ना आरंभ करना चाहिए। इस समय, लेबल वाले जहाजों को इमेजेट किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) के तहत सफलतापूर्वक लेबल किए गए भ्रूण को नेत्रहीन रूप से स्क्रीन करने की सिफारिश की जाती है। यदि डीआईआई-एसीडीएल का अपर्याप्त मात्रा भ्रूण में अंतःक्षिप्त है, तो इसे फिर से इंजेक्शन किया जा सकता है ( चित्रा 3C )।
- उन टेडपोल को छोड़ दें जिनके अन्य अंग लेबल किए गए हैं ( चित्रा 3 डी )। सफलतापूर्वक लेबल किए गए भ्रूण की आवश्यक संख्या प्राप्त होने तक जारी रखें।
- रक्त वाहिकाओं के अधिक इमेजिंग के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें; यह confocal माइक्रोस्कोपी के लिए लेबल भ्रूण ठीक करने के लिए आसान हो सकता है। 1x एमबी में 0.04% एमएस 222 में लेबल वाले भ्रूण को पहले संज्ञाहरण करनाएस (पीएच 7.5-8.0) और फिर उन्हें कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मालाइहाइड में ठीक करें। निश्चित भ्रूण कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; डीआईआई की फोटोबलीचिंग से बचने के लिए इंजेक्शन वाले नमूनों को प्रकाश से बचाएं
5. आईआईआई-एसीडीएल का इमेजिंग
- त्रिविम इमेजिंग
- Vasculature के समग्र आकारिकी का आकलन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति त्रिविम माइक्रोस्कोप ( चित्रा 3 ) के तहत तस्वीरें ले लो।
- 1% पीरबीज़ में 1% पीबीएस के लिए निश्चित भ्रूण या 1x एमबीएस में लाइव इमेजिंग पिगलो। एक पेट्री डिश में पिघला हुआ agarose डालो और इंतजार जब तक यह solidifies। Agarose जेल की सतह पर एक उथले खरोज बनाओ जो भ्रूण को अपने पार्श्व की ओर झूठ बोलने पर इमेजेट किया जा सके। पकवान को बफर के साथ भरें (निश्चित गर्भ के लिए एमएस 222 समाधान या निश्चित भ्रूण के लिए 1x पीबीएस)।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Rhodamine फ़िल्टर सेटी)
- चूंकि डीआईआई एक हरा-उत्तेजित और लाल-उत्सर्जित डाई है, रोडामाइन या स्पेक्ट्रेटिक रूप से जुड़े फ्लोरोफोर्स (554 एनएम पर अधिकतम उत्तेजना और 571 एनएम पर उत्सर्जन) के लिए मानक फ़िल्टर सेट का उपयोग करते हुए छवि। Agarose ढालना पर indentations में इंजेक्शन भ्रूण रखें और तस्वीरें ले ( चित्रा 3 )।
- संनाभि माइक्रोस्कोपी
नोट: संवहनी वास्तुकला के करीब विश्लेषण के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।- उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, एक गिलास नीचे डिश पर भ्रूण की स्थिति। 1x पीबीएस के कुछ बूंदों को जोड़ें और शीर्ष पर एक कवर पर्ची रखकर उन्हें स्थिर करें। अतिरिक्त पीबीएस निकालें यदि जीवित भ्रूण को इमेजेट किया जाना है, तो अन्तःचलित भ्रूण का उपयोग करें और 0.015% MS222 का उपयोग पीबीएस के बजाय 0.1x एमबीएस में करें।
- कम-बढ़ाई इमेजिंग के लिए, रुचि के क्षेत्र को खोजने के लिए एक 4x से 10 एक्स उद्देश्य का उपयोग करें; पिछड़े कार्डिनल नस (पीसीवी) का जन्मदिन का हिस्सा विकासात्मक एंजियोजेनेसिस की जांच करने के लिए एक उपयोगी क्षेत्र है (चित्रा 4, धराशायीबक्से)।
- लाल उत्सर्जन फ्लोरोफोरे (जैसे कि रोडामाइन) के लिए एक अधिग्रहण सेटिंग का उपयोग करें।
- भ्रूण के पार्श्व आधे को इमेजिंग करके ज़-स्टैक्ड छवियां बनाएं। सबसे पहले, उद्देश्य के निकट पार्श्व की तरफ पीसीवी पर ध्यान दें और फिर उस स्थान पर फोकस की निचली सीमा निर्धारित करें जहां उद्देश्य के पास स्थित जहाजों को ध्यान में रखा गया है। उस स्थिति में ऊपरी सीमा निर्धारित करें जहां आईसीएड की औसत दर्जे का हिस्सा ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। भ्रूण के इस पूरे पार्श्व आधे को चित्रित करें। ऐसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें जो अधिग्रहण की सेटिंग, जैसे कि एक्स, वाई, और जेड तराजू पर मेटाडेटा संग्रहीत करता है, क्योंकि उन्हें पोत की लंबाई की गणना करने की आवश्यकता होती है।
- यदि आवश्यक हो, तो भ्रूण के संपूर्ण vasculature को छवि के लिए टाइल स्कैन मोड का उपयोग करें। अनुभवशील रूप से क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर टाइल की संख्या निर्धारित करते हैं।
- उच्च-बढ़ाई इमेजिंग के लिए, पीवीसी और 4 रोस्टरल-सबसे अंतर्सोमेटिक नसों (आईएसवी) ( चित्रा 4 ,धराशायी बॉक्स) स्टैक (z- स्टैक) और टाइल (टाइल स्कैन) की संख्या को उचित रूप से समायोजित करें
6. डाय-लेबल वाले जहाजों की मात्रा
नोट: डाय-लेबल वाले जहाजों को मैन्युअल रूप से या सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने का पता लगाया जा सकता है। हम "सरल न्यूरैट ट्रैसर" का उपयोग करते हैं, एक नि: शुल्क इमेजजे (एनआईएच) प्लगइन, जो कि ट्यूब-आंक्ड स्ट्रक्चर्स जैसे कि रक्त वाहिकाओं और न्यूरिट्स 12 के अर्ध-स्वचालित ट्रेसिंग की अनुमति देता है। इस मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, निम्न पैरामीटर की गणना की जा सकती है इस सॉफ़्टवेयर के उपयोग की एक विस्तृत प्रक्रिया कहीं और वर्णित है (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 नीचे, हम भ्रूणों के vasculature के उदाहरणों का उपयोग करते हैं जिसमें Tie2 सिग्नलिंग को हिचकते या बढ़ाया जाता है ( चित्रा 4 ए -4 सी ) 5 । एंटिसेंस टाई 2 एमओ-इंजेक्शन भ्रूण एंजियोजेनेसिस कम कर देता है और आईएसवी (शॉर्ट -4 बी ) को छोटा करता है, जबकि गठित सक्रिय टाई 2 के सह-इंजेक्शनउत्परिवर्ती एमआरएनए (सीटीई 2 एमआरएनए) इस फेनोटाइप को बचाता है, जिसके परिणामस्वरूप विपुल आईएसवी शाखाएं ( चित्रा 4 सी ) होती हैं।
- ISV लंबाई
- सरल न्यूरेट ट्रेसर का उपयोग करना, प्रत्येक पता लगाए गए पोत की लंबाई की गणना करना। 4 रोस्टल-सबसे आईएसवी की लंबाई की गणना करें
- आईएसवी शाखाएं
नोट: wildtype भ्रूण में, चरण 42 में सबसे कम आईएसवी की सबसे छोटी शाखाएं हैं।- साधारण न्यूरैट ट्रेसर में, इन छोटे जहाजों को आईएसवी बनाने के बाद ट्रेस करें, जहां से वे प्राथमिक शाखा शुरु करते हैं। आईएसवी से उत्पन्न होने वाली इन शाखाओं के निम्नलिखित पैरामीटर की गणना करें
- कुल शाखा संख्या
- एक बार जब सभी आईएसवी और संबंधित शाखाएं पता चली जाती हैं, तो शाखाओं की कुल संख्या ( चित्रा 5 बी -5 डी ) की गणना करें।
- शाखा आदेश
- सरल न्यूरैट ट्रेसर प्रत्येक शाखा ( चित्रा 5 ए ) का क्रम रिकॉर्ड करता है, गणना करता हैप्रत्येक आदेश के लिए शाखाओं की संख्या Wildtype भ्रूण में अधिकांश जहाजों प्राथमिक शाखाएं होनी चाहिए ( यानी, आईएसवी)
- नस की जटिलता सूचकांक (वीसीआई)
- जैसा कि वीसीआई पोत की जटिलता के लिए एक उपयोगी पैरामीटर है, जो उच्च-आदेश वाली शाखाओं को अधिक वजन देता है, चित्रा 5 ए में सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक भ्रूण के लिए वीसीआई की गणना करता है। उदाहरण के लिए, टाई 2 एमओ-इंजेक्ट किए गए भ्रूण को नियंत्रण ( चित्रा 5 बी और 5 सी ) की तुलना में कम वीसीआई है, और सीटीई 2 एमआरएनए-इंजेक्ट किए गए भ्रूण में एक उच्च वीसीआई ( चित्रा 5 डी ) है।
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Representative Results
प्रयोगों की समय सीमा (आंकड़े 1 और 2)
निषेचन के तुरंत बाद, लक्षित माइक्रोएन्जेक्शन को जीन अभिव्यक्ति को व्यवस्थित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक एंटीसेन्स एमओ जो विशेषकर अंतर्जात Tie2 mRNA के दीक्षा कोडन में बांधता है इंजेक्ट किया जा सकता है, जो टाई 2 लक्ष्य एमआरएनए के स्टीरिक बाधा से अनुवाद को रोकता है। सफलतापूर्वक इंजेक्ट भ्रूण के आसान दृश्य स्क्रीनिंग के लिए एक एमओ को फ्लुरेससेन पर संयुग्मित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक अनुरेखक एमआरएनए ( जैसे, एमआरएनए एन्कोडिंग ईजीएफपी) को एमओ के साथ सह-इंजेक्शन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अंडे सेने के बाद नशीली दवाओं का उपयोग स्नान के बाद किया जा सकता है (एनएफ स्टेज 26 के आसपास शुरुआती टेलबड स्टेज)। 0.1x एमबीएस में दवा को भंग करें और भ्रूण में जोड़ें। पहले के उपचार के लिए, भ्रूण संदंश की एक जोड़ी के साथ झिल्ली से मुक्त हो सकते हैं। डीआईआई-एसीएलडीएल को पोत के स्वरूप की गतिशीलता की जांच के लिए चरण 33/34 के आसपास के हृदय में इंजेक्ट किया जा सकता हैव्यावहारिक, लेकिन आम तौर पर हम मंच 37/38 या बाद में ( चित्रा 2 , रंगीन क्षेत्रों) इंजेक्षन करते हैं।
सफल और असफल इंजेक्शन (चरण 4.3) के विशिष्ट उदाहरण (चित्रा 3)
त्रिविम इमेजिंग विज़ुअल स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है I यदि डायआई-एसीएलडीएल की पर्याप्त मात्रा में हृदय में अंतःक्षिप्त है, तो पीसीवी तुरंत प्रतिदीप्ति स्टिरिओस्कोप ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) के तहत दिखाई जानी चाहिए। अपर्याप्त या ग़लत ढंग से इंजेक्शन किए गए भ्रूण की पहचान करना आसान है ( चित्रा 3 सी और 3 डी )। डीआईआई-एसीडीएल ( चित्रा -3 सी ) की अपर्याप्त राशि के साथ भ्रूण को फिर से डाई के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है जब तक जहाजों को स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे रहा हो। इमेज सफलतापूर्वक एक भ्रूण माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण इंजेक्शन, रहने या निर्धारण के बाद।
पोस्टर का विकासया कार्डिनल नस (पीसीवी) और अंतर्सोमैटिक नसों (आईएसवी)
पीसीवी रोस्टल-टू-क्वोडिक दिशा में फैली हुई है, और यह एक्सटेंशन स्टेज 37/38 के आसपास समाप्त होता है। आईएसवी पीसीवी से एक पूर्वकाल से पीछे की ओर लहर में उभरे आईएसवी गठन की यह लहर चरण 36 में शुरू होती है और चरण 40/41 के आसपास समाप्त हो जाती है; आईएसवी का विकास 43 और चरण 43 ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) तक हल्का ढंग से बढ़ता जा रहा है।
टाई 2 सिग्नलिंग डिवेलपमेंट आईएसवी ब्रांचिंग (चित्रा 4)
पीसीवी और आईएसवी एक रूढ़िवादी पैटर्न में विकसित होते हैं, और उनका विकास तंग नियंत्रण में होता है ( चित्रा 4 ए )। पीसीवी से आईएसवी के गठन को एंजियोजेनेसिस के रूप में वर्णित किया जा सकता है, और इसलिए यह एंजियोजेनेसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है। हम अपने हाल के अध्ययन showi के परिणाम को प्रस्तुत करते हैंएनजी कि विकासात्मक सिग्नल आईएसवी में टाई 2 सिग्नल को अपनी शाखाओं को सीमित करने के लिए बाधित करते हैं एंटिसेंस एमओ द्वारा टाई 2 सिग्नल का पछाड़ना आईएसवी (लंबाई 4 बी) की लंबाई और जटिलता को कम करता है, और टाई 2 (सीटीई 2) के गठित सक्रिय रूप को व्यक्त करता है जिससे अत्यधिक आईएसवी शाखाएं आती है ( चित्रा 4 सी )।
आईएसवी जटिलता का मात्रा (चित्रा 5)
ISVs की लंबाई और शाखा संख्याओं के अतिरिक्त, "शिरा जटिलता सूचकांक" (वीसीआई) को उनकी जटिलता ( चित्रा 5 ए ) का आकलन करने के लिए गणना की जा सकती है। हमने कोहेन-कॉरी और सहकर्मियों द्वारा विकसित "जटिलता सूचकांक" को अपनाया, जिसे न्यूरोनल एक्सीनल या वृक्ष के समान आर्कबर्स 13 की जटिलता को मापने के लिए बनाया गया था। इस सूचकांक में, अधिक उच्च-आदेश शाखाओं वाले भ्रूण को कुल चोकर की संख्या के साथ भ्रूण की तुलना में अधिक अंक प्राप्त होता हैचीज, लेकिन कम-आदेश शाखाओं के साथ। इसलिए, एक उच्च वीसीआई इंगित करता है कि इस भ्रूण में अधिक जटिल शिरापरक नेटवर्क है। "सरल न्यूरैट ट्रेसर" उपयोगी शार्टफॉर्म है ताकि व्यक्तिगत शाखाओं के क्रम और लंबाई का पता लगाया जा सके। "गाया पथ" उत्पन्न करने के लिए भी संभव है, जो कि vasculature ( आंकड़े 5 बी -5 डी , दायें पैनल) की समग्र संरचना को कल्पना करने का एक उपयोगी तरीका है।
चित्रा 1: प्रयोगों की समयरेखा। निषेचन के दिन, morpholinos (एमओ), डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन एनएफ चरण 1 (एसटी 1) या 2 (सीटी 2) में निषेचित अंडे में इंजेक्ट किया जा सकता है। यदि केवल एक blastomere में st2 में इंजेक्शन, इंजेक्शन अभिकर्मक केवल एक पार्श्व पक्ष को प्रभावित करेगा। निर्बाध पक्ष को एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इंजेक्टेड पक्ष की पहचान करने के लिए एक अनुरेखक को सह-इंजेक्शन ( जैसे, ईजीएफपी एमआरएनए)। दूसरे दिन, ईएRly tailbud-stage (~ st24) भ्रूण को स्नान अनुप्रयोग द्वारा औषधीय अभिकर्मकों के साथ इलाज किया जा सकता है। दिल तीसरे दिन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। डाय-एसीडीएल को दिल में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है और इंजेक्शन के तुरंत बाद रक्त वाहिकाओं को इमेज किया जा सकता है। छवियों को पूरी तरह से विकसित जहाजों में पोत के विकास या st42 भ्रूण की गतिशीलता को चित्रित करने के लिए st33-37 भ्रूण का उपयोग करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 चित्रा 2: st42 में डीआईआई-एसीएलडीएल इंजेक्शन की स्थिति। मंच 42 भ्रूण के पार्श्व ( एबी ) और उदर ( सीडी ) के विचार Xenbase (www.xenbase.org) से ली गई छवियों में, दिल एसी में गुलाबी रंग का है। प्रतिनिधि त्रिविम छवियों को ए में दिखाया गया है,
चित्रा 3: अपेक्षित परिणाम (त्रिविक्राव्य छवियाँ) स्टेज 37/38 ( ए ) और चरण 42 ( बी ) भ्रूण से प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियाँ भ्रूण के बाईं ओर दिखाया गया है पश्चवर्ती कार्डिनल नस (पीसीवी) कंडोली रूप से फैली हुई है, जिसमें से एक अंतर्निर्मित नसों (आईएसवी) शाखा को एक द्विस्तरीय-से-पूच्छीय वावई। केवल पलटवार आईएसवी चरण 37/38 ( ए ) में दिखाई दे रहे हैं और चरण 42 ( बी ) द्वारा अधिकांश आईएसवी का गठन किया है। यदि डीआईआई-एसीएलडीएल की एक अपर्याप्त मात्रा इंजेक्शन है, तो पीसीवी 30 मिनट ( सी ) के बाद भी स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देगी। इस मामले में, अधिक DiI-AcLDL इंजेक्ट किया जा सकता है। अगर DiI-AcLDL गलती से अन्य अंगों ( डी ) में इंजेक्ट किया जाता है, तो भ्रूण को त्यागें। स्केल बार = 500 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: आईएसवी विकास पर टाई 2 सिग्नल के प्रभाव। टाई 2 जीन अभिव्यक्ति को अनुवाद-अवरुद्ध एंटिसेंस मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (टी 2 एमओ) के ब्लास्टोरे इंजेक्शन द्वारा गिरा दिया गया था। नियंत्रण morpholino (कोमो) का एक ही आणविक वजन है लेकिन nओयटी Xenopus tropicalis में किसी भी जीन का लक्ष्य एमआरएनए-एन्कोडिंग स्थिर रूप से सक्रिय टाई 2 उत्परिवर्ती (सीटीई 2) को टाई 2 पछाड़ना फ़िनोटाइप को बचाने के लिए सह-इंजेक्शन दिया गया था। नियंत्रण ( ए ) के विपरीत, टाई 2 एमओ इंजेक्शन की लंबाई और आईएसवी ( बी ) की संख्या में एक नाटकीय कमी आई है। इस फेनोटाइप को कैटी 2 द्वारा बचाया गया था, जिसने आईएसवी को अप्रत्यक्ष संपार्श्विक शाखाओं ( सी ) के साथ दिखाया था। नीले धराशायी बक्से द्वारा इंगित क्षेत्रों में आईएसवी की जटिलता चित्रा 5 में मापा गया है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: नस की जटिलता का मात्रा ( ए ) आईएसवी की जटिलता शिरा जटिलता सूचकांक (वीसीआई) द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है( बीडी ) वीसीआई की गणना चित्रा 4 में दिखाए गए भ्रूणों से की गई थी। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सबसे पहले अली एच। बिर्वनलोउ और उनके सहयोगियों द्वारा एक्सनोपस लाईविस 4 में संवहनी गठन के दौरान विकास संबंधी घटनाओं की जांच के लिए विकसित किया गया था, लेकिन जैसा कि इस पांडुलिपि में दिखाया गया है, इसे अन्य छोटे जानवरों पर लागू किया जा सकता है। दिल में डाई इंजेक्शन प्रदर्शन करना सरल है, और पूरे संवहनी नेटवर्क को एक प्रतिदीप्ति विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, और साथ ही एक confocal microscope के रूप में चित्रित किया जा सकता है। अगर पोत के विकास के दौरान डाई को हृदय में अंतःक्षिप्त किया जाता है, तो वास्तविक समय 4 में पोत विकास और शाखाओं की गतिशीलता को चित्रित किया जा सकता है। अच्छी तरह से परिभाषित शिरापरक नेटवर्क का उपयोग करना, विशेष रूप से पीसीवी और रोस्टल-सबसे आईएसवी, एंजियोजेनेसिस पर आनुवांशिक या पर्यावरण संबंधी गड़बड़ी का प्रभाव मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम DiI-AcLDL (चरण 4) का इंजेक्शन है। हम सफल और असफल इंजेक्शन के उदाहरण प्रदान करते हैं ( फाईध्यान 3)। सफलतापूर्वक इंजेक्शन किए गए भ्रूण को एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत स्क्रीनिंग किया जाना चाहिए, जैसा कि चरण 4.3 में वर्णित है। यदि पीसीवी इंजेक्शन के बाद 30 मिनट तक दिखाई नहीं दे रहा है, तो पर्याप्त डायआई-एसीएलडीएल इंजेक्ट नहीं किया गया है ( चित्रा 3C )। असंबद्ध इंजेक्ट किए गए भ्रूण संवेदनाहट हो सकते हैं और फिर इंजेक्शन हो सकते हैं। कुछ मामलों में, DiI-AcLDL को गलत स्थान में इंजेक्ट किया जा सकता है, इस मामले में अन्य अंगों को लेबल किया जाएगा ( चित्रा 3 डी )। गलत इंजेक्ट किए गए भ्रूण को त्यागें।
इंजेक्शन के तुरंत बाद इंजेक्शन वाले भ्रूण के रक्त वाहिकाओं को दिखाई देगा, और प्रतिदीप्ति कई घंटे तक रहता है। इसलिए, यदि इंजेक्शन आईएसवी के गठन से पहले किया जाता है, तो उनके विकास को एक लाइव भ्रूण में इमेज किया जा सकता है, वास्तविक समय में और विवो 4 में कार्डियोवास्कुलर सिस्टम के विकास की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान किया जा सकता है। Xenopus के रूप में एक मॉडल के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है ताकि नाड़ी घस्तनधारियों के 14 में एजेंटों को बर्दाश्त करते हुए, यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण औषधीय उलझन प्रयोगों के साथ जोड़ा जा सकता है और एंजियोजेनेसिस को बढ़ाने या बाधित दवाओं को खोजने के लिए स्क्रीनिंग प्लेटफार्म के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
रक्त वाहिकाओं आनुवंशिक उपकरणों के साथ-साथ यहां वर्णित डाई-आधारित लेबलिंग विधियों द्वारा भी देखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक Xenopus 15 या zebrafish 16 जो कि सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में प्रतिदीप्ति प्रोटीन को व्यक्त करता है, रक्त और लसीका वाहिकाओं के लाइव इमेजिंग को सक्षम करता है, और नदियों 16 से धमनियों को भेद करना भी संभव है। हालांकि आनुवांशिक दृष्टिकोण बेहतर हैं और अधिक सुसंगत लेबलिंग दक्षता उत्पन्न करते हैं, डाई-आधारित तरीकों ऐसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों तक पहुंच के बिना अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से सुलभ हैं। Xenopus में , DiI-AcLDL के ट्रांसकार्डियल इरिफेक्शन का परिणामअधिकांश एंडोथिलियल कोशिकाओं का लेबलिंग 4 , और धमनियों और नसों प्रतिदीप्ति छवियों में भिन्न नहीं हैं दिलचस्प है, टमाटर लेक्टिन-फ्लुरेससेन चूहों में चुनिंदा धमनियों को लेबल करता है, और जब डाय-एसीडीएल के साथ सह-इंजेक्शन, धमनियों और नसों को भेदभाव किया जा सकता है 17 । हालांकि आवेदन अन्य ऊतकों या जानवरों में परीक्षण नहीं किया गया था, यह Xenopus में धमनियों और नसों के गतिशील विकास की जांच के लिए एक आशाजनक दिशा प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को लेविन एट अल के काम से प्रेरित किया गया था । , जो इस प्रयोगात्मक विधि का वर्णन करता है और ज़िनोपस लाईविस में संवहनी विकास का एक व्यापक वर्णन प्रदान करता है । हम अपने इनपुट के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को 2015 के 2015 (2015-22-00 9) के योनेसी विश्वविद्यालय के भविष्य के अग्रणी अनुसंधान पहल और विज्ञान, आईसीटी और भविष्य नियोजन मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के जैव एवं चिकित्सा प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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