Summary
이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.
Abstract
혈관은 몸 전체에 산소와 영양분을 공급하며 혈관 네트워크의 형성은 엄격한 발달 조절하에 있습니다. 혈관의 효율적인 생체 내 시각화 및 그 복잡성의 신뢰할 수있는 정량화는 혈관 네트워크의 생물학 및 질병을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료 인 인간 혈장 아세틸 화 저밀도 지단백 DiI 복합체 (DiI-AcLDL)를 사용하여 혈관을 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하는 자세한 방법을 제공합니다. 혈관은 DiI-AcLDL을 배아의 심장 박동에 간단히 주입하여 표시 할 수 있으며 전체 배아의 혈관을 생체 또는 고정 배아에서 영상화 할 수 있습니다. 핵산의 표적 미세 주입 및 / 또는 약리학 적 시약의 배양 적용에 의한 유전자 교란과 결합하여, 혈관 발생에 대한 유전자 또는 신호 전달 경로의 역할을 수행 할 수있다정교한 유전자 조작 동물에 의지하지 않고 1 주일 이내에 징계 조치를 취했다. 잘 정의 된 Xenopus의 정맥 시스템과 그 고정 관념의 혈관 신생, 기존 혈관의 싹 트기 때문에 혈관의 복잡성은 섭동 실험 후에 효율적으로 정량화 될 수 있습니다. 이 비교적 단순한 프로토콜은 심혈관 연구 분야의 다양한 분야에서 쉽게 접근 할 수있는 도구가되어야합니다.
Introduction
Vasculogenesis, 새로 태어난 endothelial 세포에서 새로운 혈관의 형성, angiogenesis, 선재 혈관에서 새로운 혈관의 형성은 배아 vasculature 1 모양의 두 개의 독특한 프로세스입니다. 이러한 과정에서의 조절 장애는 다양한 심장병 및 혈관의 구조적 비정상을 초래합니다. 또한, 종양 성장은 통제되지 않은 혈관 성장과 관련이있다. 이와 같이, 혈관 신생 및 혈관 신생의 기초가되는 분자 기작은 강렬한 연구 2 의 대상이다.
Xenopus 와 zebrafish는 몇 가지 이유로 vasculogenesis 및 angiogenesis 연구에 대한 매력적인 척추 모델입니다. 첫째, 그들의 배아는 작습니다. 따라서 전체 vasculature를 이미지화하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 둘째로, 배아 발달은 빠릅니다. 전체 vasculature가 발달하는 데에는 며칠이 걸리고, 그 동안에 개발 vascul ature를 이미지화 할 수 있습니다. 셋째, antisense morpholino nucleotides (MOs)를 발달중인 배아 또는 약물의 목욕 적용을 통한 미세 주입 (microinjection)과 같이 혈관 형성 전과 도중에 유전 적 및 약리학 적 개입이 쉽게 수행 할 수 있습니다 3 , 4 , 5 .
제노 퍼스가 제브라 피쉬에 비해 갖는 독특한 이점은 Xenopus 가 진핵 적 완전 절편을 따르고 배아의 운명지도가 잘 정의되어 있기 때문에 발생 학적 조작이 수행 될 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 2 세포 단계에서 하나의 세포에 안티센스 MO를 주사하여 하나의 옆면 만 유전자 조작 된 배아를 생성 할 수 있습니다. 하나의 배아에서 다른 배아로 심장 원시를 이식하여 유전자가 세포 내재적 또는 흉부 외적 기작에 의해 그 기능을 발휘하는지 여부를 결정하는 것도 가능하다ass = "xref"> 7. 이 기술은 allotetraploid 인 Xenopus laevis 에서 주로 개발되었지만 유전 연구에 이상적이지는 않지만 밀접한 관련이있는 배수체 인 Xenopus tropicalis에 직접 적용될 수 있습니다.
살아있는 Xenopus 배아에서 혈관을 시각화하는 한 가지 방법은 형광 염료를 주입하여 혈관에 라벨을 붙이는 것입니다. DiI와 같은 형광 분자로 표지 된 아세틸 화 된 저밀도 지단백질 (AcLDL)은 매우 유용한 탐침이다. 비 아세틸 화 LDL과 달리, AcLDL은 LDL 수용체 9에 결합하지 않고 대 식세포 및 내피 세포에 의해 엔도시 처리된다. 살아있는 동물의 심장에 DiI - AcLDL의 주입은 내피 세포의 특정 형광 라벨 결과, 그리고 전체 vasculature은 라이브 또는 고정 배아 4 형광 현미경으로 몇 군데하실 수 있습니다.
여기, 우리는Xenopus tropicalis 에서 DiI-AcLDL을 사용하여 혈관을 시각화하고 정량화하기위한 상세한 프로토콜 ( 그림 1 ). 우리는 성공적이고 실패한 실험의 예와 함께 핵심 실용적인 포인트를 제공합니다. 또한 우리는 혈관 네트워크의 형성에 유전 적 및 환경 적 요인의 영향을 평가하는 데 유용한 혈관 복잡성의 정량 분석을위한 직접적인 방법을 제공합니다.
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Protocol
모든 실험은 연세대 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜을 따랐다.
1. Xenopus tropicalis 태아의 준비
참고 : Xenopus tropicalis 배아는 약간의 수정과 함께 이전에 설명한대로 생산되었다. Xenopus tropicalis 배아는 Nieuwkoop과 Faber 11 의 표에 따라 상연되었다.
- 배란 유도
- 프리 프라이밍 (pre-prime)을 위해서는 짝짓기 당일 전날 한 쌍의 개구리 (남성 1 명과 여성 1 명)의 등쪽 림프구에 인간 chorionic gonadotropin (hCG)을 주입하십시오. 암컷 개구리 당 20 개체, 수컷 당 10 개체를 주입합니다. 남자와 여자를 같은 수조에 밤새 머물게하십시오 (18 시간 이상 동안).
- 프라임을하려면 다음 날 200 개의 hCG를 미리 준비된 여성에게 주입하고 100 개의 hCG를 미리 준비된 여성에게 주입하십시오남성; 준비가 끝난 암컷은 약 3 시간 이내에 알을 낳기 시작할 것이고 하루 종일 그렇게 할 것입니다. 수컷과 암컷 쌍을 자연 교배를 위해 또는 체외 수정을 위해 별도의 탱크에 보관하십시오 (1.2 단계).
- 수분
참고 : 계란은 자연적 교미 또는 체외 수정에 의해 수정 될 수 있습니다. 자연 교미에서는 알을 낳을 때 수정되기 때문에 수정시기를 조절할 수 없습니다. 대안 적으로, 암묵화 된 암컷 개구리는 별도의 수조에 수용 될 수 있으며, 수정되지 않은 난자 를 체외 수정을 위해 수집 할 수있어 동시에 수정 된 수백 개의 배아를 생성한다. 후자의 접근법은 혈관 표식 전에 표적 세포가 표적화 된 미세 주입이 수행 될 때 유용합니다. 그러나이 방법에서는 남성이 희생됩니다.- 자연 교미
- 암ed지 않은 암컷과 수컷은 같은 탱크에 두십시오. 수컷은 f를 쥐고있을 것이다.양치류의 즉각적인 수정을 유도한다. 유리 또는 플라스틱 피펫으로 계란을 수집하고 페트리 접시에 전송. 계란이 피펫에 달라 붙지 않도록 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 피펫의 내부 표면을 코팅하십시오.
- 체외 수정 (IVF)
- 프라이밍 한 후 암컷과 수컷을 분리하십시오. 암컷은 약 3 시간 이내에 자발적으로 알을 낳기 시작합니다. 페트리 접시에 BSA로 코팅 피펫을 사용하여 몇 누워 계란을 전송하고 현미경으로 그들의 품질을 확인하십시오. 건강한 달걀 (맑은 색소, 탄력있는 공 모양)이 놓여지면 준비가 된 수컷에게서 정소를 해부 할 준비를하십시오.
- 안락사를 위해 0.4 % Tricaine methanesulfonate (MS222)를 만들고 뇌하수록을 가진 남성의 등쪽 림프절에 300 μL를 주입합니다. 약 10 분이 지나면 수컷은 균형 감각을 상실하고 떠 있어야합니다. 남성이 뒷다리를 꼬집어서 안락사 시켰다는 것을 확인하십시오.험프 포셉 한 쌍의 무응답 관찰.
- 2 개의 고환을 절개하고, 보풀이없는 종이에 신속하게 두드려 청소하고, 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 60 % Leibovitz L-15 Medium (60 %) 1 mL가 들어있는 마이크로 튜브로 옮깁니다. 자세한 절차는 다른 곳에서 설명합니다 10 .
- 부드럽게 정자를 추출하기 위해 유봉으로 고환을 말하다. 이 농도에서 ( 즉, 60 % L-15에서 10 % FBS 1 mL에 2 개의 고환), 약 1 mL의 고환 용액 (0.1 mL)이 약 300 개의 알을 비옥하게 할 수 있습니다. 남아있는 정자는 4 ℃에서 밀폐 된 튜브에 보관할 수 있으며 그 다음날 IVF에 사용할 수 있습니다.
- 암컷의 알을 작은 페트리 접시에 짜 넣으십시오. 손바닥에 여성의 윗부분을 거꾸로 잡고 집게 손가락을 뒷다리 사이에 넣으십시오. 검지와 뒷다리를 펼쳐서 배설물을 노출시킵니다. 페트리 접시에 담긴 망막을 터치하십시오. 외투그는 0.5 % BSA와 페트리 접시 IVF 동안 단층으로 계란을 균등하게 배포 할 수 있습니다.
- 계란에 정자 함유 L-15 배지 몇 방울 (0.1 mL)을 넣는다. 동기식 수정을 위해, 접시를 통해 정자 용액을 부드럽게 저어줍니다. 실온에서 4 분 후, 0.01x 수정 바스 식염수 (MBS)와 페트리 접시를 채우고 10 분 동안 품어, 0.1x MBS와 솔루션을 교체하십시오. 수정 된 난은 실온에서 약 1 시간 후 첫 번째 절단을 거친다. 1x MBS는 88mM NaCl, 1mM KCl, 2.5mM NaHCO3, 5mM HEPES, 1mM MgSO4 및 0.7mM CaCl2, pH 7.5이다.
- 자연 교미
- (선택 사항) 안티센스 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 (antisense morpholino oligonucleotides, MO) 및 / 또는 mRNA의 주입
- 혈관 형성에 대한 관심 유전자의 효과를 조사하기 위해 antisense MO 및 / 또는 mRNA의 미세 주입을 수행하십시오.
- 그러한 실험을 위해 1x MBS (pH 7.5-7.8)에서 2 % L- 시스테인으로 달걀 젤리를 제거하십시오.1 배 MBS에 2 % L - 시스테인과 수정 된 배아가 들어있는 접시에 0.1x MBS를 대체하십시오. 부드럽게 접시를 소용돌이가 솔루션을 섞어.
참고 : 그것은 일반적으로 배아가 de-jellied 수 있습니다 약 5 분 정도 걸립니다. 이 단계에서 계란을 자주 모니터링하여 용액에 과다 노출되지 않도록하십시오. 알이 과다 노출되면 신축성을 잃어 평평 해져 발달과 치사율이 비정상적으로 증가합니다. - 0.1x MBS로 de-jellied 달걀을 5 번 씻으십시오. 0.1x MBS에 용해 된 4 % Ficoll에서 마이크로 인젝션을 수행하십시오. 일반적으로 2 세포 단계에서 분열 기 당 4 ng의 MO와 600 pg의 mRNA를 주입합니다. 배아의 한쪽에서만 유전자 발현을 조작하기 위해 하나의 세포에 주입하십시오. 동일한 배아의 주사하지 않은 쪽을 대조군으로 사용하십시오.
- 유전자 조작의 특이성에 대한 또 다른 컨트롤로서 같은 양의 대조군 MO (CoMO) 또는 대조군 mRNA ( 예 : 베타 - 갈 락토시다 제 mRNA)를 주입하십시오. CoMO는 동일한 m유전자 특이 적 MO로서 비 체중을 나타내며 Xenopus 게놈에서 어떤 유전자도 표적해서는 안된다. 주입 된 쪽을 쉽게 시각화하려면, fluorescein-tag MO를 사용하거나 추적자 ( 예 : EGFP mRNA)를 함께 주입하십시오.
- 2 시간 동안 4 % Ficoll에 주입 된 배아를두고 다음 0.1x MBS로 가득 새로운 60mm 페트리 접시로 전송.
- 인상
- 23 ° C에서 배아를 올리십시오. 23 ° C 이하의 온도 (범위 : 16-26 ° C)를 사용하면 발달 속도를 늦추거나 가속시킬 수 있지만 23 ° C에서 올리는 것이 좋습니다.
- (선택 사항) 약리학 적 시약으로 치료
- 약리학 적 조작을 위해, 목욕 적용에 의해 개발중인 배아에 약물을 투여하십시오.
2. Di-AcLDL 주사제의 제조
- 표준 micr을 사용하여 테이퍼링 유리 피펫을 만드십시오.opipette 풀러. 마이크로 피펫 풀러에 붕 규산염 유리 튜브를 놓고 다음 설정을 사용하십시오 : 압력 200; 열, 30; 잡아 당기기, 30; 속도, 120; 시간, 200
- 4 ℃에서 DiI-AcLDL 저장 용액을 보관하십시오. 주입을 위해 용액의 상단 부분을 가져가지만 튜브의 바닥에 침전 된 입자는 가져 가지 마십시오. 유리 피펫에 잔해가 있으면 용액이 올바르게 분출되지 않습니다.
- microloader를 사용 DiI-AcLDL 솔루션 (~ 5 μL)의 적절한 금액으로 준비 유리 피펫을 채우십시오.
- 미세한 포셉 (55 번)을 사용하여 유리 피펫의 팁을 조금씩 벗겨냅니다. 한 번에 약 5 nL의 용액이 나오도록 압력 제어 주입 시스템을 설정하십시오. 50 ~ 60 nL의 DiI-AcLDL 용액으로 한 배아의 혈관을 염색 할 수 있습니다.
- 건조를 피하기 위해 DiI-AcLDL이 장착 된 피펫을 장시간 공기 중에 방치하지 마십시오. 피펫의 끝을 0.04 % MS에 잠긴 상태로 유지하십시오. MS222 in 0.1X MBS 용액. 배아에 주입하기 직전 (4.2.1 단계) 동일한 양의 염료가 나왔는지 확인하십시오.
3. 주입 설정
- 실 가드 곰팡이
- 작은 Sylgard 몰드를 준비하려면 Sylgard base와 경화제를 무게비 10 : 1로 혼합하십시오.이 혼합 용액으로 작은 페트리 접시 (35mm 또는 60mm 접시)의 약 절반을 채우고 대략 실온에서 48 시간.
- 마취
- 마취는 1x MBS (pH 7.5-8.0)에서 0.04 % MS222를 사용하십시오. 오랜 마취가 필요할 때 ( 예 : 생체 영상 도중) 삼투압 불균형을 줄이기 위해 0.1x MBS에서 0.04 % MS222를 사용하십시오. pH를 조절하려면 NaOH (~ 20 μL) 몇 방울을 넣고 pH 페이퍼를 사용하여 pH를 확인하십시오.
- 전송 배아가 움직일 때까지 기다립니다. 배아의 지느러미 지느러미를 터치하고 그들이 완료되었는지 확인하기 위해 반응하는지 검사하십시오.nesthesia.
- 주입 용 포지셔닝 배아
- 얇고 날카로운 칼날로 경화 된 Sylgard 몰드의 표면을 들여다보십시오. 배아를 넣을 V 형 오목한 움푹 들어간 곳을 만드십시오 ( 그림 2D 참조). 복부 쪽을 약간 위축 (약 30 °)시킨 마취 된 배아를 놓습니다 ( 그림 2D ).
- MS222 솔루션으로 금형을 채우고 금형에 배아를 놓습니다.
4. Di-AcLDL 주입
- 심장을 덮고있는 피부 절개
- 심장 위에있는 피부를 자르기 위해 두 개의 핀 (Minutiens, 0.10 mm)을 준비하십시오. 각 핀을 핀 홀더에 단단히 고정하십시오. 심장은 그것이 맥박 할 때 쉽게 식별 할 수 있어야합니다 ( 그림 2A-2C , 핑크색).
- 한 핀으로 배아의 피부에 구멍을 뚫습니다. 심장과 피부 사이의 공간에 구멍을 통해 핀을 삽입하십시오 ( 그림 2C
- 피부 외부에있는 다른 핀을 삽입 된 핀에 가볍게 문질러서 선형 절개를하십시오. 이 절개를 두 개의 핀으로 부드럽게 넓히고 심장을 드러내십시오 ( 그림 2B ' 및 2D' , 화살표). DiI-AcLDL이 장착 된 피펫은 이제 심장에 직접 접근 할 수 있습니다 ( 그림 2D ' ).
- 주입
- 심장에로드 유리 피펫의 팁을 삽입하고 약 10 분사 펄스에 DiI - AcLDL 솔루션 50-60 NL을 주입. 과도한 양의 용액을 주입하지 마십시오. 심장이 파열 될 수 있습니다. 주입 후 심장이 계속 뛰는 지 확인하십시오. 매 주사 후 DiI-AcLDL이 같은 양으로 배출되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 피펫의 끝이 막힐 수 있습니다 (2.5 단계 참조).
- 회복을 위해 0.1x MBS로 채워진 새로운 페트리 접시에 주입 배아를 전송합니다. 5-10 분 후, 올챙이는 의식을 되찾고 움직이기 시작해야합니다. 이 때, 표지 된 혈관을 영상화 할 수있다. 그것은 형광 현미경 ( 그림 3A 및 3B )에서 성공적으로 분류 된 배아를 육안으로 검사하는 것이 좋습니다. 불충분 한 양의 DiI-AcLDL이 배아에 주입되면 다시 주입 할 수 있습니다 ( 그림 3C ).
- 다른 장기가 표시된 올챙이를 버리십시오 ( 그림 3D ). 필요한 수의 성공적으로 분류 된 배아가 얻어 질 때까지 계속하십시오.
- 혈관을보다 완벽하게 관찰하려면 공 초점 현미경 검사법을 사용하십시오. 그것은 공 촛점 현미경에 대한 레이블 배아를 수정하기가 더 쉬울 수도 있습니다. 먼저 1x MB에서 0.04 % MS222로 표시 한 태아를 마취합니다.S (pH 7.5-8.0)로 세척 한 후 실온에서 1 시간 동안 1X phosphate buffered saline (PBS)로 4 % 파라 포름 알데히드로 고정시킨다. 고정 배아는 4 ° C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다; DiI의 광 변색을 피하기 위해 주입 된 시료를 빛으로부터 보호하십시오.
5. DiI-AcLDL의 이미징
- 입체 영상
- 혈관 구조의 전체 형태를 평가하기 위해 형광 입체 현미경 ( 그림 3 )으로 사진을 찍습니다.
- 고정 배아를위한 1x PBS 또는 라이브 영상을위한 1x MBS에서 1 % 아가 로스를 녹인다. 녹인 아가로 오스를 페트리 접시에 부어 굳힐 때까지 기다리십시오. 아가로 오스 젤의 표면에 얕은 압흔을 만들어 그 옆면에 누워있을 때 이미지화 될 배아에 맞을 것입니다. 버퍼 (고정 태아에 대한 anesthetized 배아 또는 1X PBS에 대한 MS222 솔루션)와 요리를 채우십시오.
- 형광 현미경 (Rhodamine filter se티)
- DiI는 녹색 흥분 및 적색 방출 염료이므로 rhodamine 또는 spectrally related fluorophores (554 nm에서 최대 여기, 571 nm에서 방출)에 대한 표준 필터 세트를 사용하여 이미지를 찍습니다. 아가로 오스 곰팡이에있는 들여 쓰기에 주입 배아를 놓고 사진을 찍어 ( 그림 3 ).
- 공 촛점 현미경
참고 : 혈관 구조를 더 자세히 분석하려면 공 촛점 현미경을 사용하십시오.- 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, 유리 바닥 접시에 배아를 놓습니다. 1x PBS 몇 방울을 넣고 상단에 커버 슬립을 넣어 부동액을 고정시킵니다. 여분의 PBS를 제거하십시오. 살아있는 배아가 이미징되어야하는 경우, 마취 된 태아를 사용하고 PBS 대신 0.1x MBS에서 0.015 % MS222를 사용하십시오.
- 저배율 이미징의 경우 4X ~ 10X 대물 렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾습니다. 후 정맥 정맥 (PCV)의 사구 부분은 발달 성 혈관 신생을 연구하는데 유용한 영역이다 (그림 4, 점선상자).
- 적색 방출 형광 물질 (예 : Rhodamine)에 대한 획득 설정을 사용하십시오.
- 배아의 측면 절반을 이미징하여 z- 스택 이미지를 만듭니다. 먼저, 목표 근처의 측면에있는 PCV에 초점을 맞춘 다음 목표에 가장 가까운 혈관에 초점이 맞춰진 위치에서 초점의 하한을 설정합니다. 이미징되는 PCV의 중앙 부분에 초점을 맞출 수있는 위치의 상한선을 설정하십시오. 배아의 전체 측면 절반을 이미지화합니다. 혈관 길이를 계산하는 데 필요한 x, y 및 z 축척과 같은 획득 설정에 메타 데이터를 저장하는 소프트웨어를 사용하십시오.
- 필요한 경우 타일 스캔 모드를 사용하여 배아의 전체 혈관을 이미지화하십시오. 경험적으로 수평 및 수직 타일의 수를 결정하십시오.
- 고배율 이미징의 경우 위의 절차에 따라 PCV와 4 개의 사구체 간 혈관 (ISV)의 사구 부분을 영상화하십시오 ( 그림 4 ,점선 상자). 스택 (z 스택) 및 타일 (타일 스캔)의 수를 적절하게 조정하십시오.
6. DiI 라벨링 용기의 정량화
참고 : DiI 라벨 혈관은 수동으로 또는 소프트웨어를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 우리는 혈관과 신경 돌과 같은 관 모양의 구조의 반자동 추적을 가능하게하는 무료 ImageJ (NIH) 플러그인 인 "Simple neurite tracer"를 사용합니다 12 . 이 자유 소프트웨어를 사용하여 다음 매개 변수를 계산할 수 있습니다. 이 소프트웨어 사용에 대한 자세한 절차는 다른 곳에서 설명합니다 (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer). 아래에서 우리는 Tie2 신호 전달이 억제되거나 강화 된 배아의 혈관 구조의 예를 사용합니다 ( 그림 4A-4C ). Antisense Tie2MO 주사 배아는 혈관 신생을 감소시키고 ISV를 단축시킨다 ( 그림 4B ). 반면에 구성 적으로 활성 인 Tie2돌연변이 mRNA (caTie2 mRNA)는이 표현형을 과도하게 구제하고, 무성한 ISV 가지를 생성한다 ( 그림 4C ).
- ISV 길이
- Simple neurite tracer를 사용하여 각 추적 혈관의 길이를 계산합니다. 가장 큰 4 개의 ISV의 길이를 계산하십시오.
- ISV 지점
참고 : 야생형 배아에서는 42 번 단계에서 가장 짧은 ISV의 몇 가지 짧은 가지 만 출현합니다.- Simple neurite tracer에서 ISV를 만든 후 작은 혈관을 추적하여 주 가지를 만듭니다. ISV에서 시작된 이러한 분기의 다음 매개 변수를 계산합니다.
- 총 지점 번호
- 모든 ISV와 관련 분기가 추적되면 총 분기 수를 계산합니다 ( 그림 5B-5D ).
- 지점 주문
- Simple neurite tracer가 각 가지 ( 그림 5A )의 순서를 기록하기 때문에, calculate 각 주문에 대한 분기 수. 야생형 배아의 혈관 대부분은 1 차 분지 ( 즉, ISV)이어야합니다.
- 정맥 복잡성 지수 (VCI)
- VCI는 혈관 복잡성에 유용한 매개 변수이므로 고차원 분지에 더 많은 가중치를 부여하므로 그림 5A 의 공식을 사용하여 각 배아의 VCI를 계산하십시오. 예를 들어, Tie2MO - 주입 배아는 대조 ( 그림 5B 와 5C )에 비해 VCI가 낮고, caTie2 mRNA 주입 배아는 VCI가 더 높습니다 ( 그림 5D ).
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Representative Results
실험 일정 (그림 1 및 2)
수정 직후, 유전자 발현을 조절하기 위해 표적화 된 미세 주입이 수행 될 수있다. 예를 들어, 내인성 Tie2 mRNA의 개시 코돈에 특이 적으로 결합하는 안티센스 MO가 입체 장애에 의해 Tie2 표적 mRNA의 번역을 억제하여 주입 될 수있다. MO는 성공적으로 주사 된 배아의 쉬운 육안 검사를 위해 플루오 레세 인에 접합 될 수있다. 또는 추적자 mRNA ( 예 : EGFP를 코딩하는 mRNA)를 MO와 함께 주입 할 수 있습니다. 또한, 부화 후 목욕 용품으로 약물을 치료할 수 있습니다 (초기 테일 버드 단계, NF 단계 26 주변). 0.1x MBS에 약물을 녹여 배아에 첨가하십시오. 초기 치료를 위해 배아는 한 쌍의 집게로 막으로부터 해방 될 수 있습니다. DiI-AcLDL은 혈관 형태의 역학을 조사하기 위해 33/34 스테이지 주변의 심장에 주입 할 수 있습니다.그러나 일반적으로 37/38 또는 그 이후 단계 ( 그림 2 , 색칠 된 지역)에 주입합니다.
성공 및 실패한 주사 (단계 4.3)의 전형적인 예 (그림 3)
스테레오 스코픽 이미징은 시각적 인 스크리닝에 적합합니다. 충분한 양의 DiI-AcLDL이 심장에 주입되면, PCV는 형광 입체경 ( 그림 3A 및 3B )에서 즉시 볼 수 있어야합니다. 불충분하게 또는 잘못 주입 된 배아는 쉽게 식별 할 수 있습니다 ( 그림 3C 및 3D ). DiI-AcLDL ( 그림 3C )의 양이 부족한 태아는 혈관이 명확하게 보일 때까지 동일한 염료를 다시 주사 할 수 있습니다. 이미지 공 촛점 현미경, 성공적 또는 고정 후 성공적으로 배아를 주입.
Posteri 개발또는 정맥류 (PCV)와 혈관 사이 정맥 (ISV)
PCV는 로스트 - 꼬리 방향으로 연장되며이 확장은 37/38 단계에서 끝납니다. ISV는 전방에서 후방으로 전파되는 PCV에서 등쪽으로 나옵니다. 이 ISV 형성 물결은 36 단계에서 시작하여 40/41 단계에서 끝납니다. ISV는 계속 성장하여 43 단계 ( 그림 3A 및 3B )까지 가볍게 분기됩니다.
Tie2 시그널링은 발달 ISV 브랜칭을 제어합니다 (그림 4)
PCV와 ISV는 진부한 패턴으로 성장하고 개발은 엄격한 통제하에 있습니다 ( 그림 4A ). PCV로부터의 ISVs의 형성은 혈관 신생 (angiogenesis)으로 기술 될 수 있으며, 따라서 혈관 신생의 기초가되는 분자 메커니즘을 조사하는 데 유용한 모델이다. 우리는 최근의 연구 결과를 소개합니다발달 신호는 ISV에서 Tie2 신호 전달을 억제하여 분기를 제한합니다. 안티센스 MO에 의한 Tie2 시그널링의 넉다운은 ISV의 길이와 복잡성을 감소시키고 (그림 4B), Tie2 (caTie2)의 구성 적 활성 형태를 표현하면 ISV가 과도하게 분지된다 ( 그림 4C ).
ISV 복잡성의 정량화 (그림 5)
ISV의 길이와 분기 번호 외에도 "정맥 복잡성 지수"(VCI)를 계산하여 복잡성을 평가할 수 있습니다 ( 그림 5A ). 우리는 신경 축색 돌기 또는 수지상종의 복잡성을 정량화하기 위해 고안된 Cohen-Cory와 동료가 개발 한 "복잡성 지수"를 채택했습니다. 이 지수에서 고위 가지가 더 많은 배아는 동일한 총 투수 수를 갖는 배보다 높은 점수를받습니다체스하지만 더 많은 하위 분기와. 따라서 높은 VCI는이 배아가 더 복잡한 정맥 네트워크를 가지고 있음을 나타냅니다. "Simple neurite tracer"는 개별 가지의 순서와 길이를 추적하는 유용한 소프트웨어입니다. 또한 "렌더링 된 경로"를 생성하는 것이 가능합니다.이 방법은 혈관 구조의 전체 구조를 시각화하는 데 유용한 방법입니다 ( 그림 5B-5D , 오른쪽 패널).
그림 1 : 실험의 타임 라인. 수정일에 NF 1 기 (st1) 또는 2 기 (st2)에서 수정란에 morpholinos (MOs), DNA, RNA 또는 단백질을 주입 할 수 있습니다. st2에서 하나의 분열구에만 주입하면 주입 된 시약은 한쪽 측면에만 영향을 미칩니다. 분사되지 않은 쪽은 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 주입 된 부분을 확인하기 위해 추적자 ( 예 : EGFP mRNA)를 함께 주사합니다. 둘째 날에는rly tailbud-stage (~ st24) 배아는 약제 학적 시약으로 목욕 적용에 의해 치료 될 수있다. 심장은 3 일째에 분명하게 보입니다. DiI-AcLDL은 심장에 주입 될 수 있으며 혈관은 주사 직후에 영상화 될 수 있습니다. st33 - 37 배아를 사용하여 혈관 성장의 동력 또는 완전히 발달 된 혈관을 이미지화하기위한 st42 배아를 이미지화하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : st42에서 Di-AcLDL 주입 위치 무대 42 태아의 측면 ( AB ' ) 및 복부 ( CD ) 뷰. Xenbase (www.xenbase.org)에서 가져온 이미지에서 AC 는 분홍색으로 표시됩니다. 대표적인 입체 영상은 A ' ,
그림 3 : 예상 결과 (입체 영상). 37/38 ( A ) 및 42 ( B ) 태아기의 대표적인 형광 이미지. 배아의 왼쪽면이 표시됩니다. 후 추경 정맥 (PCV)은 꼬리로 연장되며,이 사마동 정맥 (ISV)은 사타구니에서 꼬리 날개이자형. 주동기 ISV 만 37/38 ( A ) 단계에서 볼 수 있으며 대부분의 ISV는 42 ( B ) 단계에서 형성됩니다. DiI-AcLDL이 불충분하게 주입되면 30 분 ( C ) 후에도 PCV가 명확하게 보이지 않습니다. 이 경우 DiI-AcLDL을 더 주입 할 수 있습니다. DiI-AcLDL이 우연히 다른 기관 ( D )에 주입되면 배아를 버립니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Tie2 신호가 ISV 개발에 미치는 영향. Tie2 유전자 발현은 번역 차단 안티센스 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 (Tie2MO)의 분열 유리 주입에 의해 녹다. 대조 모르 폴리 노 (CoMO)는 동일한 분자량을 가지나 nXenopus tropicalis의 모든 유전자를 타겟팅 합니다. mRNA를 구성 적으로 활성 인 Tie2 돌연변이 체 (caTie2)를 Tie2 knockdown 표현형을 구제하기 위해 공동 주입 하였다. 대조군 ( A )과 달리, Tie2MO 주사는 ISV의 길이와 수를 현저히 감소시켰다 ( B ). 이 표현형은 caTie2에 의해 과도한 구조를 보였으며 부유 한 부 분 지종 ( C )이있는 ISV를 보였다. 파란색 점선 상자로 표시된 영역에서 ISV의 복잡성은 그림 5에서 정량화됩니다. Scale bar = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 정맥 복잡성의 정량화. ( A ) ISV의 복잡성은 정맥 복잡성 지수 (VCI)로 나타낼 수 있습니다.( BD ) VCI는 그림 4에 표시된 배아에서 계산되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 Xenopus laevis 4 에서 혈관 형성 중 발달 과정을 조사하기 위해 Ali H. Brivanlou와 동료에 의해 처음 개발되었지만이 원고에 표시된대로 다른 작은 동물에도 적용 할 수 있습니다. 심장에 염료 주입은 수행하기 쉽고, 전체 혈관 네트워크는 공 촛점 현미경뿐만 아니라 형광 해부 현미경으로 이미징 할 수 있습니다. 염색이 배 발달 동안 심장으로 주입되면, 혈관 성장과 분지의 동력이 실시간으로 영상화 될 수 있습니다 4 . 잘 정의 된 정맥 네트워크, 특히 PCV와 주동맥 대부분의 ISV를 사용하여 혈관 신생에 대한 유전 적 또는 환경 적 섭동의 영향을 정량적으로 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 DiI-AcLDL의 주입입니다 (4 단계). 성공적인 주사와 실패한 주사의 예를 제공합니다 ( Fi그림 3). 성공적으로 배아를 주입 단계 4.3에서 설명한 형광 현미경으로 선별해야합니다. 주입 30 분 후에 PCV가 보이지 않으면 충분한 DiI-AcLDL이 주입되지 않습니다 ( 그림 3C ). 성공적으로 주입 된 배아는 마취되어 다시 주입 될 수 있습니다. 경우에 따라 DiI-AcLDL을 잘못된 위치에 주사 할 수 있으며,이 경우 다른 장기가 라벨링됩니다 ( 그림 3D ). 잘못 주입 된 배아를 버립니다.
성공적으로 주입 된 배아의 혈관은 주입 직후에 볼 수 있으며 형광은 몇 시간 동안 지속됩니다. 따라서 주사가 ISV의 형성 이전에 수행된다면, 그들의 발달은 살아있는 배아에서 영상화 될 수 있으며, 실시간 및 생체 내 에서 심혈관 계통의 발달을 조사 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다 4 . Xenopus 가 성공적으로 혈관 d를 선별하는 모델로 사용됨에 따라포유류 14 에서 에이전트를 부식시키는 경우, 여기에 설명 된 실험적 접근법은 약리학 적 섭동 실험과 결합되어 혈관 신생을 강화하거나 억제하는 약물을 찾기위한 스크리닝 플랫폼으로 사용됩니다.
혈관은 유전 도구, 여기에 설명 된 염료 기반 표지 방법으로 시각화 할 수 있습니다. 예를 들어 세포 형 특이 적 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현하는 트랜스 제닉 Xenopus 15 또는 zebrafish 16 은 혈액 및 림프관의 생체 영상을 가능하게하고 혈관과 혈관을 구별 할 수 있습니다. 유전 접근법이 우수하고보다 일관된 라벨링 효율을 발생 시키더라도 염료 기반 방법은 유전자 조작 동물 없이도 대부분의 실험실에서 쉽게 접근 할 수 있습니다. Xenopus 에서 DiI-AcLDL의 심근 관류는대부분의 내피 세포의 표지 및 동맥 및 정맥은 형광 이미지에서 구별 할 수 없다. 흥미롭게도 토마토 lectin-fluorescein은 생쥐의 동맥을 선택적으로 표지하고 DiI-AcLDL과 함께 주입하면 동맥과 정맥을 구분할 수 있습니다 17 . 응용 프로그램이 다른 조직이나 동물에서 테스트 아니었지만, 이것은 Xenopus 의 동맥과 정맥의 역동적 인 발전을 조사하는 유망한 방향을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Levine et al. ,이 실험 방법을 설명하고 Xenopus laevis 에서 혈관 개발에 대한 포괄적 인 설명을 제공했습니다 . 우리는 실험실 구성원의 의견을 감사드립니다. 이 연구는 2015 년 미래의 연구 이니셔티브 (2015-22- 0095)와 과학, ICT 및 미래 기획이 자금을 지원하는 국립 연구 재단 (NRF)의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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