Summary
Denne protokollen demonstrerer en fluorescensbasert metode for å visualisere vaskulaturen og å kvantifisere kompleksiteten i Xenopus tropicalis . Blodkar kan bli avbildet minutter etter injeksjon av et fluorescerende fargestoff inn i et embryos slårhjerte etter genetisk og / eller farmakologisk manipulasjon for å studere kardiovaskulær utvikling in vivo .
Abstract
Blodkar leverer oksygen og næringsstoffer gjennom hele kroppen, og dannelsen av det vaskulære nettverket er under tett utviklingskontroll. Effektiv in vivo visualisering av blodkar og pålitelig kvantifisering av deres kompleksitet er nøkkelen til å forstå biologien og sykdommen i det vaskulære nettverket. Her gir vi en detaljert metode for å visualisere blodkar med et kommersielt tilgjengelig fluorescerende fargestoff, humant plasma acetylert lavdensitets lipoprotein DiI-kompleks (DiI-AcLDL), og for å kvantifisere deres kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan merkes med en enkel injeksjon av DiI-AcLDL inn i et embryo som slår på hjertet, og blodkar i hele embryoet kan avbildes i levende eller faste embryoer. Kombinert med genforstyrrelser ved målrettet mikroinjeksjon av nukleinsyrer og / eller badapplikasjon av farmakologiske reagenser, kan roller av et gen eller en signalvei på vaskulær utvikling være invektetØkte innen en uke uten å gripe til sofistikerte genetisk utviklede dyr. På grunn av det veldefinerte venesystemet av Xenopus og dets stereotypiske angiogenese kan spiring av eksisterende fartøy, kompleksitet av fartøy, kvantifiseres effektivt etter perturbasjonseksperimenter. Denne relativt enkle protokollen skal fungere som et lett tilgjengelig verktøy i ulike felt av kardiovaskulær forskning.
Introduction
Vaskulogenese, dannelsen av nye blodkar fra nyfødte endotelceller og angiogenese, dannelsen av nye fartøy fra eksisterende fartøy, er to forskjellige prosesser som danner embryonisk vaskulatur 1 . Eventuell dysregulering i disse prosessene resulterer i forskjellige hjertesykdommer og strukturelle abnormiteter i kar. Videre er tumorvekst assosiert med ukontrollert kar-vekst. Som sådan er molekylære mekanismer som ligger bak vasculogenese og angiogenese gjenstand for intens undersøkelse 2 .
Xenopus og sebrafisk er attraktive hvirveldyrsmodeller for vaskulogenese og angiogenesestudier, av flere grunner. For det første er deres embryoer små; Derfor er det relativt enkelt å bilde hele karet. For det andre er embryonisk utvikling rask; Det tar bare et par dager for hele vaskulaturen å utvikle, i løpet av hvilken tid utvikler vascul Ature kan bli avbildet. Tredje genetisk og farmakologisk inngrep før og under fartøydannelse er lett å utføre, for eksempel gjennom mikroinjeksjon av antisense morfolino nukleotider (MOs) i det utviklende embryo eller gjennom badapplikasjonen av legemidler 3 , 4 , 5 .
Den unike fordelen med Xenopus over sebrafisk er at embryologiske manipulasjoner kan utføres fordi Xenopus følger stereotypiske holoblastiske spaltninger, og det embryonske skjebnen er godt definert 6 . For eksempel er det mulig å generere et embryo hvor bare en lateral side er genetisk manipulert ved å injisere en antisense MO til en celle i tocelletrinnet. Det er også mulig å transplantere hjertet primordium fra ett embryo til et annet for å avgjøre om genet utøver sin funksjon ved hjelp av en celle-inneboende eller -ekstrinsisk mekanismeAss = "xref"> 7. Selv om disse teknikkene for det meste har blitt utviklet i Xenopus laevis , som er allotetraploid og derfor ikke er ideell for genetiske studier, kan de brukes direkte til Xenopus tropicalis , en nært beslektet diploid art 8 .
En måte å visualisere vaskulaturen på i et levende Xenopus- embryo er å injisere et fluorescerende fargestoff for å merke blodårene. Acetylert lavdensitetslipoprotein (AcLDL) merket med et fluorescerende molekyl som DiI er en meget nyttig probe. I motsetning til ikke-acetylert LDL, binder AcLDL ikke til LDL-reseptoren 9, men endocytteres av makrofager og endotelceller. Injeksjonen av DiI-AcLDL inn i hjertet av et levende dyr resulterer i den spesifikke fluorescensmerking av endotelceller, og hele vaskulaturen kan avbildes ved fluorescensmikroskopi i levende eller faste embryoer 4 .
Her presiserer viEnt detaljerte protokoller for visualisering og kvantifisering av blodkar ved hjelp av DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi gir viktige praktiske poeng, med eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter. I tillegg gir vi en enkel metode for kvantitativ analyse av vaskulær kompleksitet, noe som kan være nyttig for å vurdere effektene av genetiske og miljømessige faktorer ved utformingen av det vaskulære nettverket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter fulgte protokoller godkjent av Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care og brukskomiteer.
1. Fremstilling av Xenopus tropicalis-embryoer
MERK: Xenopus tropicalis- embryoer ble produsert som tidligere beskrevet 10 , med liten modifikasjon. Xenopus tropicalis- embryoer ble arrangert ifølge tabellene til Nieuwkoop og Faber 11 .
- Induksjon av eggløsning
- For å pre-prime, injiser human chorionic gonadotropin (hCG) i dorsal lymfesekken av et par frosker (en mann og en kvinne) dagen før dagen for parring. Injiser 20 enheter per kvinnelig frosk og 10 enheter per mann. Hus en mann og en kvinne i samme tank over natten (i mer enn 18 timer).
- For å prime på neste dag, injiser 200 enheter hCG til den pre-primed kvinne og 100 enheter hCG til pre-primedmannlig; Den primede kvinnen vil begynne å legge egg på omtrent 3 timer og vil fortsette å gjøre det hele dagen. Hold mannlige og kvinnelige par sammen for naturlig parring eller i separate tanker for in vitro befruktning (trinn 1.2).
- befruktning
MERK: Egg kan befruktes ved naturlig parring eller in vitro befruktning. Ved naturlig parring befruktes eggene etter hvert som de legges, og derfor kan ikke tidspunktet for gjødsling styres. Alternativt kan en primet kvinnelig frosk være plassert i en separat tank, og unfertiliserte egg kan samles inn for in vitro befruktning, noe som genererer hundrevis av embryoer befruktet på samme tid. Den sistnevnte tilnærmingen er nyttig når blastomere-målrettet mikroinjeksjon skal utføres før merking av fartøy. I denne tilnærmingen blir imidlertid en mann ofret.- Naturlig parring
- Legg primed kvinnelige og mannlige par i samme tank. Hanen vil låse fEmale, som fører til umiddelbar befruktning av de lagt eggene. Samle eggene med et glass- eller plastpipett og overfør dem til en petriskål. For å hindre at eggene stikker til pipetten, belegge pipettens indre overflate med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
- In vitro befruktning (IVF)
- Separer den primede kvinnen fra hannen etter priming. Kvinnen vil begynne å legge egg spontant på ca 3 timer. Overfør noen få egg med en BSA-belagt pipette til en Petri-tallerken og kontroller kvaliteten under et mikroskop. Hvis sunne egg (klart pigment, elastisk kuleformet) ble lagt, forberede seg på å dissekere testene fra den primede hannen.
- Lag 0,4% Tricain-metansulfonat (MS222) for eutanasi og injiser 300 μL i dorsal lymfesekken til den primede hannen. På omtrent 10 minutter vil hanen miste sin balanse og holde seg flytende; Bekreft at hanen er euthanized ved å klemme et bakben med aPar stumpe tang og observere ingen respons.
- Dissekter de to testene, rengjør dem ved raskt å tappe dem på fargepapir, og overfør dem til en mikrotube som inneholder 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). En detaljert prosedyre er beskrevet andre steder 10 .
- Forsiktig hakk testesene med en pestle for å trekke ut sæden. Ved denne konsentrasjonen ( dvs. 2 testikler i 1 ml 10% FBS i 60% L-15), kan noen få dråper av testisoppløsningen (0,1 ml) befrukte ca. tre hundre egg. Resterende sæd kan lagres ved 4 ° C i et tett lukket rør og brukes til IVF neste dag.
- Klem eggene fra kvinnen inn i en liten petriskål. Hold den øvre delen av kvinnen opp og ned på håndflaten og legg pekefingeren mellom bakbenene. Spred sine bakben med pekefingeren og den andre hånden for å utsette cloacaen. Berør cloaca til Petri-parabolen. Frakk tHan Petri parabolen med 0,5% BSA for jevnt fordelt eggene som et monolayer under IVF.
- Tilsett et par dråper (0,1 ml) spermholdig L-15 medium til eggene. For synkron befruktning, rør forsiktig opp sædoppløsningen over parabolen. Etter 4 minutter ved romtemperatur fyller du petriskålen med 0,01x Modified Barth's Saline (MBS), inkuberes i 10 minutter, og erstatter løsningen med 0,1x MBS. De befruktede eggene vil gjennomgå den første spaltningen i ca. 1 time ved romtemperatur. 1 x MBS er 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 og 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
- Naturlig parring
- (Valgfritt) Injeksjon av antisense morfolino-oligonukleotider (MOs) og / eller mRNAer
- For å undersøke effekten av et gen av interesse ved fartøydannelse, utfør mikroinjeksjonen av antisense MO og / eller mRNA.
- For slike eksperimenter, dejell eggene med 2% L-cystein i 1x MBS (pH 7,5-7,8).Erstatt 0,1x MBS i fatet som inneholder befruktede embryoer med 2% L-cystein i 1x MBS. Vri forsiktig opp røret for å blande løsningen.
MERK: Det tar vanligvis ca 5 minutter for embryoene å bli avlokket. I løpet av dette trinnet må du kontrollere eggene ofte for å sikre at de ikke er overeksponert for løsningen. Hvis eggene er overeksponerte, vil de miste elastisitet og bli flatt, noe som vil føre til avvikende utvikling og dødelighet. - Vask de-jellied eggene fem ganger med 0.1x MBS. Utfør mikroinjeksjonen i 4% Ficoll oppløst i 0,1x MBS. Typisk injiser 4 ng MO og 600 pg mRNA per blastomere i tocelletrinnet. Injiser i en celle for å manipulere genuttrykk på bare den ene siden av embryoet. Bruk den uinjiserte siden av det samme embryoet som en kontroll.
- Som en annen kontroll for spesifikkiteten til genmanipulering, injiserer samme mengde av en kontroll MO (CoMO) eller kontrollmRNA ( f.eks. Beta-galaktosidase-mRNA). CoMO må ha samme mOlekularvekt som det genspesifikke MO og må ikke målrette mot noe gen i Xenopus- genomet. For enkel visualisering av den injiserte siden, bruk fluorescein-merket MO eller co-injiser en sporingsenhet ( f.eks. EGFP mRNA).
- La de injiserte embryoer i 4% Ficoll i 2 timer og overfør dem til en ny 60 mm petriskål fylt med 0,1x MBS.
- Raising
- Øk embryoene ved 23 ° C. Selv om utviklingshastigheten kan reduseres eller akselereres ved bruk av temperaturer under eller over 23 ° C, henholdsvis (område: 16-26 ° C), anbefales det å heve dem ved 23 ° C.
- (Valgfritt) Behandling med farmakologiske reagenser
- For farmakologisk manipulasjon, administrer medisiner til de utviklende embryoer ved badapplikasjon.
2. Fremstilling av DiI-AcLDL Injeksjon
- Lag en avsmalende glasspipett med en standard mikrOpipette puller. Plasser et borosilikatglassrør i mikropipettuttakeren og bruk følgende innstillinger: trykk, 200; Varme, 30; Trekk, 30; Hastighet, 120; Tid, 200.
- Oppbevar DiI-AcLDL stamløsning ved 4 ° C. Ta den øvre, klare delen av injeksjonsvæsken, men ikke de utfelte partiklene på bunnen av røret. Eventuelle rusk i glasspipetten vil forstyrre riktig utkasting av løsningen.
- Fyll den tilberedte glasspipetten med en passende mengde DiI-AcLDL-oppløsning (~ 5 μl) ved hjelp av en mikrolaster.
- Klem av glasspipettens spiss litt etter litt ved hjelp av et fint par tapper (nummer 55). Sett opp det trykkregulerte injeksjonssystemet slik at ca. 5 ml løsningen utløses ad gangen; 50-60 nL DiI-AcLDL-løsning er nok til å flekke karene i ett embryo.
- Ikke la DiI-AcLDL-ladet pipetten komme i luft over lengre tid for å unngå tørking. Hold tuppen av pipetten nedsenket i 0,04% MS222 i 0,1 x MBS løsning. Like før du injiserer det i embryoet (trinn 4.2.1), kontroller for å se om samme mengde fargestoff utløser.
3. Injeksjonsoppsett
- Sylgard mugg
- For å forberede en liten Sylgard-mold, bland Sylgard base og herdemiddel med et vektforhold på 10 til 1. Fyll omtrent halvparten av en liten petriskål (35 mm eller 60 mm fat) med denne blandede løsningen og la den størkne i ca. 48 timer ved romtemperatur.
- anestesi
- Bruk 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) for anestesi. Når lang anestesi er nødvendig ( f.eks. Under levende bildebehandling), bruk 0,04% MS222 i 0,1x MBS for å redusere den osmotiske ubalansen. For å justere pH, tilsett et par dråper NaOH (~ 20 μL) og kontroller pH ved hjelp av pH-papir.
- Vent til de overførte embryoer slutter å bevege seg. Berør embryos dorsale finner og kontroller om de svarer for å bekrefte fullfør anesthesia.
- Plassering av embryoer til injeksjon
- Legg overflaten av den herdede Sylgard-molden med et tynt og skarpt blad. Lag en V-formet konkav innrykk for å plassere embryoene (se figur 2D ). Plasser et bedøvet embryo, ventral-side opp, litt skråt (ca. 30 °) ( Figur 2D ).
- Fyll mold med MS222 løsning og legg embryoene i formen.
4. DiI-AcLDL Injeksjon
- Innsnitt av huden som ligger over hjertet
- Klargjør to pins (Minutiens, 0.10 mm) for å kutte huden over hjertet. Stram hver stift fast til en stiftholder; Hjertet bør være lett identifiserbart ettersom det pulserer ( figur 2A-2C , rosa).
- Punkter huden på et embryo med en pin. Sett stiften gjennom hullet i rommet mellom hjertet og huden ( figur 2C
- Gjør et lineært snitt ved å forsiktig gni den andre pinnen som holdes utenfor huden mot den innsatte pinnen. Forstørre dette snittet forsiktig med to pinner, utsette hjertet ( figur 2B ' og 2D' , pil). Pipetten lastet med DiI-AcLDL kan nå nå direkte til hjertet ( Figur 2D ' ).
- injeksjon
- Sett spissen av den innfylte glasspipetten inn i hjertet og injiser 50-60 nL DiI-AcLDL-oppløsning i ca. 10 utkastpulser. Ikke injiser en overdreven mengde løsning, da det forårsaker at hjertet brister. Sjekk om hjertet fortsetter å slå etter injeksjonen. Etter hver injeksjon, kontroller om samme mengde DiI-AcLDL utløses. Ellers kan pipettens spiss være blokkert (se trinn 2.5).
- Overfør de injiserte embryoer til en ny petriskål fylt med 0,1x MBS for gjenoppretting. Etter 5-10 minutter bør tadpoles gjenvinne bevisstheten og begynne å bevege seg. På dette tidspunktet kan de merkede fartøyene avbildes. Det anbefales å visuelt vise vellykket merkede embryoer under et fluorescensmikroskop ( figur 3A og 3B ). Hvis en utilstrekkelig mengde DiI-AcLDL injiseres i et embryo, kan det injiseres igjen ( figur 3C ).
- Kast bort tadpoles som har merket andre organer ( Figur 3D ). Fortsett til det nødvendige antallet vellykket merkede embryoer er oppnådd.
- For mer grundig bildebehandling av blodkar, bruk konfokal mikroskopi; Det kan være lettere å fikse de merkede embryoer for konfokal mikroskopi. Først anestetiser de merkede embryoer i 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) og deretter fikse dem i 4% paraformaldehyd i 1X fosfatbuffert saltvann (PBS) i 1 time ved romtemperatur. Faste embryoer kan lagres i flere dager ved 4 ° C; Beskytt de injiserte prøvene fra lys for å unngå fotoblekking av DiI.
5. Imaging av DiI-AcLDL
- Stereoskopisk avbildning
- Ta bilder under et fluorescens stereoskopisk mikroskop ( Figur 3 ) for å vurdere den generelle morfologien til vaskulaturen.
- Smelte 1% agarose i 1x PBS for faste embryoer eller i 1x MBS for levende bildebehandling. Hell smeltet agarose i en petriskål og vent til den stivner. Lag et grunt innrykk på overflaten av agarosegelen som passer til embryoen som skal avbildes når den ligger på sin side. Fyll fatet med buffer (MS222-løsning for bedøvede embryoer eller 1x PBS for faste embryoer).
- Fluorescensmikroskopi (Rhodamine filter set)
- Som DiI er et grønt-spennende og rødemitterende fargestoff, blir bildet brukt ved hjelp av et standardfiltersett for rhodamin eller spektralrelaterte fluoroforer (maksimal eksitasjon ved 554 nm og utslipp ved 571 nm). Plasser de injiserte embryoene i innsnittene på agaroseskjermen og ta bilder ( figur 3 ).
- Konfokal mikroskopi
MERK: For en nærmere analyse av vaskulær arkitektur, bruk konfokal mikroskopi.- Hvis du bruker et invertert mikroskop, plasserer du embryoene på en glassbunnsrett. Legg til noen dråper 1x PBS og immobiliser dem ved å sette et deksel på toppen. Fjern overskytende PBS. Hvis levende embryoer skal avbildes, bruk bedøvede embryoer og bruk 0,015% MS222 i 0,1x MBS i stedet for PBS.
- For lav forstørrelse bildebehandling, bruk en 4X til 10X objektiv for å finne området av interesse; Den rostrale delen av den bakre kardinalvenen (PCV) er en nyttig region for å undersøke utviklingsangiogenese (figur 4, stipledeesker).
- Bruk en oppkjøpsinnstilling for en rød utslipp fluorofor (som rhodamin).
- Lag z-stablede bilder ved å avbilde den laterale halvdelen av et embryo. Først fokuserer du på PCV på sidekanten i nærheten av målet, og sett deretter den nedre grensen for fokuset i posisjonen der fartøyene nærmest målet er i fokus. Sett øvre grense på posisjonen der medialdelen av PCV-bildet som er avbildet, kan fokuseres. Bild hele denne helbredden av embryoen. Bruk programvare som lagrer metadata på oppkjøpsinnstillingene, for eksempel x, y og z skalaer, ettersom de må beregne fartøyets lengder.
- Hvis det er nødvendig, bruk flisskannefunksjonen til å bilde hele karet av et embryo. Bestem empirisk antall horisontale og vertikale fliser.
- For høy forstørrelse avbildning, følg prosedyrene ovenfor for å vise den rostrale delen av PCV og 4 rostral-mest intersomittiske vener (ISVer) ( Figur 4 ,Dashed boks). Juster antall stabler (z-stack) og fliser (flisskanning) på riktig måte.
6. Kvantifisering av DiI-merkede fartøy
MERK: DiI-merkede fartøy kan spores manuelt eller ved hjelp av programvare. Vi bruker "Simple neurite tracer", et gratis ImageJ (NIH) plugin, som muliggjør halvautomatisk sporing av rørlignende strukturer som blodkar og neuritter 12 . Ved hjelp av denne gratisprogramvaren kan følgende parametere beregnes. En detaljert fremgangsmåte for bruk av denne programvaren er beskrevet andre steder (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Nedenfor bruker vi eksempler på vasculatur av embryoer der Tie2-signalering hemmer eller forsterkes ( figur 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-injisert embryoutstilling reduserer angiogenese og forkorter ISV ( figur 4B ), mens saminjeksjon av konstitutivt aktiv Tie2Mutant mRNA (caTie2 mRNA) redigerer denne fenotypen, noe som resulterer i utrolige ISV-grener ( figur 4C ).
- ISV lengder
- Ved hjelp av Simple neurite tracer, beregne lengden på hvert sporet fartøy. Beregn lengdene på de 4 mest rostrelle ISVene.
- ISV grener
MERK: I wildtype-embryoer, sprer bare noen få korte grener fra de mest rostral-ISVene på stadium 42.- I Simple Neural Tracer, spore disse små fartøyene etter å ha gjort ISV fra hvilken de stammer fra den primære grenen. Beregn følgende parametere av disse grener som kommer fra ISVene.
- Totalt grenenummer
- Når alle ISVene og tilhørende grener er sporet, beregner du det totale antall grener ( Figur 5B-5D ).
- Grenbestilling
- Som Enkel nevittesporer registrerer rekkefølgen til hver gren ( Figur 5A ), beregnerE antall grener for hver ordre. Flertallet av fartøyene i wildtype-embryoer bør være primære grener ( dvs. ISVer).
- Vein kompleksitetsindeks (VCI)
- Fordi VCI er en nyttig parameter for fartøyets kompleksitet, noe som gir mer vekt til høyereordningsgrener, beregnes VCI for hvert embryo ved hjelp av formelen i Figur 5A . For eksempel har Tie2MO-injiserte embryoer en lavere VCI sammenlignet med kontroll ( Figur 5B og 5C ), og caTie2 mRNA-injiserte embryoer har en høyere VCI ( Figur 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidslinje for eksperimenter (figur 1 og 2)
Kort etter befruktning kan målrettet mikroinjeksjon utføres for å modulere genuttrykk. For eksempel kan en antisense MO som spesifikt binder til initieringskodonet til det endogene Tie2-mRNA injiseres, hemme oversettelsen av Tie2-målmRNA ved sterisk hindring. En MO kan bli konjugert til fluorescein for enkel visuell screening av vellykket injiserte embryoer. Alternativt kan et sporings-mRNA ( f.eks. MRNA som koder for EGFP) injiseres med MO. I tillegg kan narkotika behandles ved badapplikasjon etter klekking (tidlig halebudstad, rundt NF-stadium 26). Oppløs stoffet i 0,1x MBS og legg det til embryoene. For tidligere behandling kan embryoer frigjøres fra membranene med et par tapper. DiI-AcLDL kan injiseres i hjertet rundt scene 33/34 for å undersøke dynamikken i fartøyformenAtion, men vanligvis injiserer vi på scenen 37/38 eller senere ( figur 2 , farvede områder).
Typiske eksempler på vellykkede og mislykkede injeksjoner (trinn 4.3) (figur 3)
Stereoskopisk avbildning er egnet for visuell screening. Hvis en tilstrekkelig mengde DiI-AcLDL injiseres i hjertet, bør PCV umiddelbart synlig under et fluorescens-stereoskop ( figur 3A og 3B ). Utilstilt eller ukorrekt injiserte embryoer er lette å identifisere ( Figur 3C og 3D ). Embryoer med utilstrekkelig mengde DiI-AcLDL ( figur 3C ) kan injiseres igjen med samme fargestoff til karene er tydelig synlige. Bilde injiseres vellykket embryoer under et konfokalt mikroskop, levende eller etter fiksering.
Utvikling av posteriEller kardinalvein (PCV) og intersomittiske vener (ISVer)
PCV strekker seg i rostal-til-caudal retning, og denne forlengelsen slutter rundt scenen 37/38. ISVer dukker opp dorsalt fra PCV i en anterior-to-posterior bølge. Denne bølgen av ISV-dannelse begynner på scenen 36 og slutter rundt stadium 40/41; ISVer fortsetter å vokse og blir lett forgrenet til trinn 43 ( figur 3A og 3B ).
Tie2-signalstyring styrer utviklingsmessig ISV-forgrening (figur 4)
PCV og ISVene vokser i et stereotypisk mønster, og deres utvikling er under tett kontroll ( figur 4A ). Dannelsen av ISVene fra PCV kan beskrives som angiogenese, og derfor er det en nyttig modell for å undersøke molekylære mekanismer som ligger til grund for angiogenese. Vi presenterer resultatet av vår siste studie showiNg at utviklingssignaler hemmer Tie2 signalering i ISVer for å begrense deres forgrening 5 . Knockdown av Tie2-signalering av antisense MO reduserer lengden og kompleksiteten av ISV'er (figur 4B), og uttrykk for den konstitutive aktive formen for Tie2 (caTie2) forårsaker overdreven ISV-forgrening ( figur 4C ).
Kvantifisering av ISV-kompleksitet (figur 5)
I tillegg til lengdene og grennummerene til ISVene kan "vein kompleksitetsindeksen" (VCI) beregnes for å vurdere deres kompleksitet ( Figur 5A ). Vi vedtok "kompleksitetsindeksen" utviklet av Cohen-Cory og kollegaer, som var utformet for å kvantifisere kompleksiteten til neuronale aksonale eller dendritiske arbors 13 . I denne indeksen får et embryo med flere høyordens grener en høyere poengsum enn et embryo med samme antall totalt kliChes men med flere lavordre grener. Derfor indikerer et høyere VCI at dette embryoet har et mer komplekst venøst nettverk. "Simple neurite tracer" er nyttig programvare for å holde oversikt over rekkefølgen og lengden på individuelle grener. Det er også mulig å generere "gjengitte baner", som er en nyttig måte å visualisere den samlede arkitekturen til vaskulaturen ( Figur 5B-5D , høyre panel).
Figur 1: Tidslinje for forsøkene. På dagen for befruktning kan morfolinos (MOs), DNA, RNA eller protein injiseres i befruktede egg ved NF stadium 1 (st1) eller 2 (st2). Hvis det injiseres bare i den ene blastomeren ved st2, vil det injiserte reagenset bare påvirke en side side. Den uinjiserte siden kan brukes som en kontroll. Co-injiser en sporer ( f.eks. EGFP mRNA) for å identifisere injisert side. På den andre dagen, eaRyggehalsstadier (~ st24) embryoer kan behandles med farmakologiske reagenser ved badapplikasjon. Hjertet er tydelig synlig på den tredje dagen. DiI-AcLDL kan injiseres i hjertet og blodårene kan avbildes kort tid etter injeksjonen. Bruk st33-37 embryoer til å vise dynamikken til fartøyets vekst eller st42-embryoer til bilde fullt utviklede fartøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plassering av DiI-AcLDL-injeksjonen på st42. Lateral ( AB ' ) og ventral ( CD ) syn på scenen 42 embryo. Hjertet er farget i rosa i AC , i bilder tatt fra Xenbase (www.xenbase.org). Representative stereoskopiske bilder vises i A ' ,
Figur 3: Forventede resultater (stereoskopiske bilder). Representative fluorescensbilder fra fase 37/38 ( A ) og stadium 42 ( B ) embryoer. De venstre sidene av embryoer er vist. Den bakre kardinalvenen (PCV) strekker seg caudalt, hvorfra intersomittiske vener (ISVs) forgrenes dorsalt i en rostral-til-caudal wave. Bare rostral ISVer er synlige på scenen 37/38 ( A ), og de fleste ISVer er dannet av fase 42 ( B ). Dersom en utilstrekkelig mengde DiI-AcLDL injiseres, vil PCV ikke være tydelig synlig, selv etter 30 minutter ( C ). I dette tilfellet kan mer DiI-AcLDL injiseres. Hvis DiI-AcLDL ved et uhell injiseres i andre organer ( D ), kast embryoene. Skalbjelke = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekter av Tie2-signalering på ISV-utvikling. Tie2-genuttrykk ble slått ned ved blastomereinjeksjonen av translationsblokkerende antisensmorfolino-oligonukleotider (Tie2MO). Kontrollmorfolino (CoMO) har samme molekylvekt, men gjør nMå ikke være noe gen i Xenopus tropicalis . MRNA-kodende konstitutivt aktiv Tie2-mutant (caTie2) ble injisert for å redde Tie2-knockdown-fenotypen. I motsetning til kontrollen ( A ) førte theTie2MO injeksjonen til en dramatisk reduksjon i lengden og antall ISVer ( B ). Denne fenotypen ble overreddet av caTie2, som viste ISV med utrolige sikkerhetsgrener ( C ). Kompleksiteten til ISV-er i regioner som er indikert av blåstippede bokser, er kvantifisert i figur 5. Skalbjelke = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av venekompleksitet. ( A ) Kompleksiteten til ISV kan representeres av veinkompleksitetsindeksen (VCI).( BD ) VCIs ble beregnet fra embryoene vist i figur 4. Skalbjelke = 200 um. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presentert her ble først utviklet av Ali H. Brivanlou og kollegaer for å undersøke utviklingshendelser under vaskulær formasjon i Xenopus laevis 4 , men som vist i dette manuskriptet, kan den brukes på andre små dyr. Fargestoffinjeksjon i hjertet er enkelt å utføre, og hele det vaskulære nettverket kan avbildes under et fluorescensdisseksjonsmikroskop, samt et konfokalt mikroskop. Hvis fargestoffet injiseres i hjertet under fartøyets utvikling, kan dynamikken i fartøyets vekst og forgrening bli avbildet i sanntid 4 . Ved bruk av det veldefinerte venøse nettverket, spesielt PCV og Rostral-mest ISV, kan effektene av genetisk eller miljømessig forstyrrelse på angiogenese bli kvantitativt vurdert.
Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er injeksjonen av DiI-AcLDL (trinn 4). Vi gir eksempler på vellykkede og mislykkede injeksjoner ( FiGure 3). Suksessfullt injiserte embryoer bør screenes under et fluorescensmikroskop, som beskrevet i trinn 4.3. Hvis PCV ikke er synlig 30 minutter etter injeksjon, ble ikke nok DiI-AcLDL injisert ( figur 3C ). Unsuccessfully injiserte embryoer kan bedøves og injiseres igjen. I noen tilfeller kan DiI-AcLDL injiseres på feil sted, i så fall vil andre organer bli merket ( Figur 3D ). Kast kaste embryoer med feil injeksjon.
Blodkarrene til et vellykket injisert embryo vil være synlige kort tid etter injeksjon, og fluorescens varer i flere timer. Derfor, hvis injeksjonen utføres før dannelsen av ISV, kan deres utvikling avbildes i et levende embryo, noe som gir et kraftig verktøy for å undersøke utviklingen av kardiovaskulærsystemet i sanntid og in vivo 4 . Som Xenopus har blitt vellykket brukt som en modell for å skjerme vaskulær dForstyrrende midler i pattedyr 14 , kan den eksperimentelle tilnærming som er beskrevet her, kombineres med farmakologiske forstyrrelseseksperimenter og brukes som en screeningsplattform for å finne stoffer som forsterker eller hemmer angiogenese.
Blodkar kan visualiseres ved hjelp av genetiske verktøy, samt med de fargebaserte merkingsmetodene som er beskrevet her. For eksempel muliggjør transgen Xenopus 15 eller sebrafisk 16 som uttrykker fluorescensproteiner under kontroll av celletypespesifiserte promotorer levende bildebehandling av blod og lymfatiske kar, og det er også mulig å diskriminere arterier fra vener 16 . Selv om genetiske tilnærminger er overlegne og genererer mer konsistent merkingseffektivitet, er fargebaserte metoder lett tilgjengelige for de fleste laboratorier uten tilgang til slike genetisk manipulerte dyr. I Xenopus resulterer transkardial perfusjon av DiI-AcLDL iMerking av de fleste endotelceller 4 , og arterier og vener er ikke skiller i fluorescensbilder. Tiltrengende markerer tomatlesin-fluorescein selektivt arterier i mus, og når det injiseres med DiI-AcLDL, kan arterier og årer diskrimineres 17 . Selv om applikasjonen ikke ble testet i andre vev eller dyr, gir dette en lovende retning for å undersøke den dynamiske utviklingen av arterier og årer i Xenopus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble inspirert av Levine et al. , Som beskrev denne eksperimentelle metoden og ga en omfattende beskrivelse av vaskulær utvikling i Xenopus laevis. Vi takker medlemmer av laboratoriet for deres innspill. Denne studien ble støttet av Yonsei Universitets fremtidsrettet forskningsinitiativ fra 2015 (2015-22- 0095) og Nasjonalt forskningsfonds bio- og medisinteknologiutviklingsprogram finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
