Summary
يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .
Abstract
الأوعية الدموية توريد الأكسجين والمواد المغذية في جميع أنحاء الجسم، وتشكيل شبكة الأوعية الدموية تحت السيطرة التنموية الضيقة. كفاءة في التصور الجسم الحي من الأوعية الدموية وكمية موثوق بها من تعقيدها هي المفتاح لفهم البيولوجيا والمرض للشبكة الوعائية. هنا، ونحن نقدم طريقة مفصلة لتصور الأوعية الدموية مع صبغ الفلورسنت المتاحة تجاريا، والبلازما البشرية أسيتيلات منخفضة الكثافة البروتين الدهني مجمع الجاذبة (ديي أكلدل)، وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . يمكن وصف الأوعية الدموية عن طريق حقن بسيط من الجاذبة- أكلدل في قلب الضرب من الجنين، والأوعية الدموية في الجنين بأكمله يمكن تصويرها في الأجنة الحية أو الثابتة. جنبا إلى جنب مع اضطراب الجينات من قبل ميكروينجكتيون المستهدفة من الأحماض النووية و / أو تطبيق حمام الكواشف الدوائية، وأدوار الجين أو مسار الإشارات على التنمية الأوعية الدموية يمكن أن يكونفي غضون أسبوع واحد دون اللجوء إلى الحيوانات المتطورة وراثيا. بسبب النظام الوريدي المعرفة جيدا من القيطم وتوليد الأوعية النمطية، تنبت من السفن الموجودة من قبل، يمكن أن يكون كميا تعقيد السفينة بكمية بكفاءة بعد التجارب الاضطراب. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول بسيط نسبيا بمثابة أداة يمكن الوصول إليها بسهولة في مجالات متنوعة من البحوث القلب والأوعية الدموية.
Introduction
تشكيل الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة من الخلايا البطانية المولودة حديثا، والأوعية الدموية، وتشكيل سفن جديدة من السفن الموجودة من قبل، هي عمليتين متميزة التي تشكل الأوعية الدموية الجنينية 1 . أي اختلال في هذه العمليات يؤدي إلى أمراض القلب المختلفة والتشوهات الهيكلية للسفن. وعلاوة على ذلك، يرتبط نمو الورم مع نمو السفن غير المنضبط. على هذا النحو، والآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية والأوعية الدموية هي موضوع تحقيق مكثف 2 .
القيطم والزرد هي نماذج جذابة الفقاريات لدراسات الأوعية الدموية ودراسات الأوعية الدموية، لعدة أسباب. أولا، أجنة صغيرة. وبالتالي، فمن السهل نسبيا لصورة الأوعية الدموية بأكملها. ثانيا، التطور الجنيني هو سريع. يستغرق سوى بضعة أيام ل الأوعية الدموية بأكملها لتطوير، وخلال ذلك الوقت الأوعية الدموية النامية أتيور يمكن تصويرها. ثالثا، التدخلات الجينية والدوائية قبل وأثناء تشكيل السفن هي سهلة لأداء، مثل من خلال ميكروينجكتيون من النيوكليوتيدات مورفولينو مضادات (موس) في الجنين النامي أو من خلال تطبيق حمام من المخدرات 3 ، 4 ، 5 .
ميزة فريدة من القيطم على الزرد هو أن التلاعب الجنينية لا يمكن أن يؤديها لأن القيطم يتبع الانقسامات هوليوبلاستيك النمطية وخريطة مصير الجنينية محددة جيدا 6 . على سبيل المثال، فمن الممكن لتوليد الجنين حيث يتم التلاعب الجانب الجانبي واحد فقط عن طريق حقن مو موتزين إلى خلية واحدة في مرحلة اثنين من الخلايا. ومن الممكن أيضا لزرع القلب الأولي من جنين إلى آخر لتحديد ما إذا كان الجين يمارس وظيفته من خلال خلية جوهرية أو آلية -extrinsicأس = "كريف"> 7. على الرغم من أن هذه التقنيات قد وضعت في الغالب في القيطم ليفيس، وهو ألوتيترابلويد، وبالتالي ليست مثالية للدراسات الوراثية، ويمكن تطبيقها مباشرة على الزينوبوس تروبيكاليس ، وهو نوع من الأنواع ثنائية الارتباط وثيقة الصلة 8 .
طريقة واحدة لتصور الأوعية الدموية في جنين القرد الحية هو حقن صبغة الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية. أسيتيلد البروتين الدهني منخفض الكثافة (أكلدل) المسمى مع جزيء الفلورسنت مثل الجاذبة هو مسبار مفيد جدا. على عكس لدل أونستيتيلاتد، أكلدل لا يرتبط لمستقبلات لدل 9 ولكن إندوسيتوسد بواسطة الضامة والخلايا البطانية. حقن داي-أكلدل في قلب نتائج الحيوانات الحية في وضع العلامات الفلورسنت محددة من الخلايا البطانية، ويمكن تصوير الأوعية الدموية بأكملها من قبل المجهر مضان في الأجنة الحية أو الثابتة 4 .
هنا، نحن بريسفي بروتوكولات مفصلة لتصور وتقدير الكميات من الأوعية الدموية باستخدام دالي-أكلدل في القيطم تروبيكاليس ( الشكل 1 ). نحن نقدم نقاط عملية رئيسية، مع أمثلة من التجارب الناجحة وغير الناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم طريقة واضحة للتحليل الكمي للتعقيد الأوعية الدموية، والتي قد تكون مفيدة في تقييم آثار العوامل الوراثية والبيئية على تشكيل شبكة الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب امتثلت للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية جامعة يونسي كلية الطب رعاية الحيوان واستخدام اللجان.
1. إعداد القيطم تروبيكاليس الأجنة
ملاحظة: تم إنتاج أجنة القيطم تروبيكاليس كما هو موضح سابقا 10 ، مع تعديل طفيف. نظمت أجنة القيطم الاستوائي وفقا لجداول نيوكوب وفابر 11 .
- تحريض الإباضة
- لمرحلة ما قبل رئيس، وحقن موجهة موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية) في كيس الليمفاوية الظهرية من زوج من الضفادع (ذكر واحد وإناث واحدة) في اليوم السابق ليوم التزاوج. حقن 20 وحدة لكل ضفدع أنثى و 10 وحدة لكل ذكور. منزل الذكور والإناث في نفس خزان بين عشية وضحاها (لأكثر من 18 ساعة).
- لرئيسي، في اليوم التالي، حقن 200 وحدة من قوات حرس السواحل الهايتيه إلى الإناث معدة مسبقا و 100 وحدة من قوات حرس السواحل الهايتيه إلى مسبقةالذكر؛ فإن الإناث معدة تبدأ في وضع البيض في حوالي 3 ساعات وسوف تستمر في القيام بذلك على مدار اليوم. الحفاظ على الزوجين الذكور والإناث معا للتزاوج الطبيعي أو في خزانات منفصلة للتخصيب في المختبر (الخطوة 1.2).
- التخصيب
ملاحظة: يمكن تسميد البيض عن طريق التزاوج الطبيعي أو التخصيب في المختبر . في التزاوج الطبيعي، يتم تسميد البيض كما هي وضعت، وبالتالي، توقيت التسميد لا يمكن السيطرة عليها. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون مقرها الضفدع الإناث تحت عنوان في خزان منفصل والبيض غير المخصب يمكن جمعها في الإخصاب في المختبر ، الذي يولد مئات الأجنة المخصبة في نفس الوقت. هذا النهج الأخير مفيد عندما سيتم تنفيذ ميكروينجكتيون تستهدف بلاستومير قبل وضع العلامات على السفن. ومع ذلك، في هذا النهج، يتم التضحية من الذكور.- التزاوج الطبيعي
- اترك زوجا من الذكور والإناث في نفس الخزان. فإن الذكور قفل fإيمال، مما يؤدي إلى التسميد الفوري للبيض وضعت. جمع البيض مع الزجاج أو ماصة بلاستيكية ونقلها إلى طبق بتري. لمنع البيض من الالتصاق إلى ماصة، معطف السطح الداخلي للماصة مع 0.5٪ ألبومين المصل البقري (بسا).
- الإخصاب في المختبر (إيف)
- فصل الإناث معدة من الذكور بعد فتيلة. سوف تبدأ الإناث لوضع البيض تلقائيا في حوالي 3 ساعات. نقل عدد قليل من البيض وضعت باستخدام ماصة المغلفة بسا إلى طبق بتري والتحقق من جودتها تحت المجهر. إذا وضعت بيض صحية (الصباغ واضحة، مرنة على شكل الكرة)، وإعداد لتشريح الخصيتين من الذكور معدة.
- جعل 0.4٪ ميثان سلفونات (MS222) للقتل الرحيم وحقن 300 ميكرولتر في كيس الليمفاوية الظهرية من الذكور تستعد. في حوالي 10 دقيقة، فإن الذكر يفقد إحساسه من التوازن، وسوف تبقى واقفا على قدميه. تأكيد أن الموت الرحيم للذكور من قبل معسر الساق الخلفية معزوج من ملقط حادة ومراقبة أي رد.
- تشريح اثنين من الخصيتين، وتنظيفها عن طريق التنصت بسرعة على ورقة خالية من الوبر، ونقلها إلى ميكروتوب تحتوي على 1 مل من 60٪ ليبوفيتز في L-15 المتوسطة (60٪) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس). يرد وصف لإجراء مفصل في مكان آخر 10 .
- بلطف اللحم المفروم الخصيتين مع مدقة لاستخراج الحيوانات المنوية. في هذا التركيز ( أي 2 الخصيتين في 1 مل من 10٪ فبس في 60٪ L-15)، بضع قطرات من محلول الخصية (0.1 مل) يمكن أن تسمد ما يقرب من ثلاثمائة بيضة. ويمكن تخزين الحيوانات المنوية المتبقية في 4 درجات مئوية في أنبوب مختومة بإحكام وتستخدم ل إيف في اليوم التالي.
- ضغط البيض من الأنثى إلى طبق بتري صغير. عقد الجزء العلوي من الإناث رأسا على عقب على النخيل ووضع السبابة بين أرجلها الخلفية. انتشار ساقيه الخلفيتين مع السبابة واليد الأخرى لفضح مجرور. لمس مجرفة لصحن بيتري. معطف tانه طبق بتري مع 0.5٪ بسا لتوزيع بالتساوي البيض كما أحادي الطبقة خلال إيف.
- إضافة بضع قطرات (0.1 مل) من الحيوانات المنوية التي تحتوي على L-15 المتوسطة إلى البيض. للتسميد متزامن، وإثارة بلطف حل الحيوانات المنوية عبر الطبق. بعد 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وملء طبق بتري مع 0.01x المالحة بارث المالحة (مبس)، واحتضان لمدة 10 دقيقة، واستبدال الحل مع 0.1X مبس. سوف تخضع البيض المخصب للانقسام الأول في حوالي 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. 1x مبس هو 88 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي بوكل، 2.5 ملي ناهكو 3 ، 5 ملي هيبيس، 1 ملي مغسو 4 ، و 0.7 ملي كاكل 2 ، ودرجة الحموضة 7.5.
- التزاوج الطبيعي
- (اختياري) حقن أنتيسنز مورفولينو أوليغونوكلأوتيدس (موس) و / أو مرناس
- للتحقيق في تأثير الجين من الفائدة على تشكيل السفن، وإجراء ميكروينجكتيون من مضادة للعدوى مو و / أو مرناس.
- لمثل هذه التجارب، دي هلام البيض مع 2٪ L- السيستين في 1X مبس (الرقم الهيدروجيني 7.5-7.8).استبدال 0.1X مبس في طبق يحتوي على الأجنة المخصبة مع 2٪ L- السيستين في 1X مبس. دوامة بلطف الطبق لخلط الحل.
ملاحظة: يستغرق عادة حوالي 5 دقائق للأجنة لتكون دي جيليد. خلال هذه الخطوة، ومراقبة البيض في كثير من الأحيان للتأكد من أنها ليست الإفراط في التعرض للحل. إذا كانت البيض أكثر من التعرض، فإنها سوف تفقد مرونة وتصبح بالارض، الأمر الذي سيسبب التنمية الشاذة والفتك. - غسل بيض ديليد خمس مرات مع 0.1x مبس. إجراء ميكروينجكتيون في 4٪ فيكول المذاب في 0.1x مبس. عادة، حقن 4 نانوغرام من مو و 600 بيكوغرام من مرنا في بلاستومير في مرحلة اثنين من الخلايا. حقن في خلية واحدة للتلاعب التعبير الجيني على جانب واحد فقط من الجنين. استخدام الجانب ونينجكتد من نفس الجنين كعنصر تحكم.
- كما سيطرة أخرى على خصوصية التلاعب الجينات، وحقن نفس الكمية من السيطرة مو (كومو) أو السيطرة مرنا (على سبيل المثال، مرنا بيتا غالاكتوزيداز). كومو يجب أن يكون لها نفس موزن أولي كما مو معين الجينات ويجب ألا تستهدف أي جين في جينوم القيطم . لتصور سهلة من الجانب حقن، واستخدام فلوريسئين الموسومة مو أو شارك في حقن التتبع (على سبيل المثال، إغف مرنا).
- ترك الأجنة حقن في 4٪ فيكول لمدة 2 ساعة ومن ثم نقلها إلى طبق بتري 60 ملم جديد مليئة 0.1X مبس.
- مقوي
- رفع الأجنة في 23 درجة مئوية. على الرغم من أن سرعة التنمية يمكن أن تباطأ أو تسارع باستخدام درجات حرارة أقل أو أعلى 23 درجة مئوية، على التوالي (مجموعة: 16-26 درجة مئوية)، فمن المستحسن لرفعها عند 23 درجة مئوية.
- (اختياري) العلاج مع الكواشف الدوائية
- للتلاعب الدوائية، وإدارة الأدوية إلى الأجنة النامية عن طريق تطبيق حمام.
2. إعداد ديي-أكلدل حقن
- جعل ماصة الزجاج مستدق باستخدام ميكر القياسيةأوبيبيت بولير. وضع أنبوب الزجاج البورسليكات في مجتذب ميكروبيبيت واستخدام الإعدادات التالية: الضغط، 200؛ الحرارة، 30؛ سحب، 30؛ السرعة، 120؛ الوقت، 200.
- مخزن دي-أكلدل حل المخزون في 4 درجات مئوية. خذ الجزء العلوي العلوي من الحل للحقن، ولكن ليس الجسيمات عجلت على الجزء السفلي من الأنبوب. أي حطام في ماصة الزجاج سوف يزعج طرد الصحيح من الحل.
- ملء ماصة الزجاج أعدت مع كمية مناسبة من الحل ديي أكلدل (~ 5 ميكرولتر) باستخدام ميكروودلوادر.
- مقطع قبالة غيض من ماصة الزجاج شيئا فشيئا باستخدام زوج غرامة من ملقط (عدد 55). إعداد نظام حقن الضغط التي تسيطر عليها بحيث يتم إخراج ما يقرب من 5 نل من الحل في وقت واحد. 50-60 نل من الحل ديي-أكلدل يكفي لصمة عار الأوعية من جنين واحد.
- لا تترك ماصة دالي-أكلدل محملة في الهواء لفترة طويلة من الزمن من أجل تجنب التجفيف. إبقاء غيض من ماصة المغمورة في مس 0.04٪222 في 0.1X مبس الحل. قبل حقنه في الجنين (الخطوة 4.2.1)، تحقق لمعرفة ما إذا كان نفس الكمية من الصبغة يخرج.
3. إعداد الحقن
- قالب سيلغارد
- لإعداد قالب سيلغارد صغير، خلط قاعدة سيلغارد وكيل علاج مع نسبة الوزن من 10 إلى 1. ملء ما يقرب من نصف طبق بتري صغير (35 مم أو 60 ملم طبق) مع هذا الحل المختلط ومن ثم تركه لترسيخ لما يقرب من 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تخدير
- استخدام 0.04٪ MS222 في 1X مبس (الرقم الهيدروجيني 7.5-8.0) للتخدير. عند الحاجة إلى التخدير الطويل (على سبيل المثال، أثناء التصوير الحي)، استخدم 0.04٪ MS222 في 0.1x مبس للحد من الاختلال التناضحي. لضبط درجة الحموضة، إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (~ 20 ميكرولتر) والتحقق من درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني.
- انتظر حتى توقف الأجنة المنقولة تتحرك. لمس الزعانف الظهرية من الأجنة وتفحص ما إذا كانت تستجيب لتأكيد استكمال أnesthesia.
- الأجنة لتحديد المواقع للحقن
- المسافة البادئة سطح صلب سيلغارد العفن مع شفرة رقيقة وحادة. جعل المسافة البادئة مقعرة على شكل حرف V الذي لوضع الأجنة (انظر الشكل 2D ). وضع الجنين تخدير، بطني الجانب حتى، بطريقة مائلة قليلا (حوالي 30 درجة) ( الشكل 2D ).
- ملء القالب مع الحل MS222 ووضع الأجنة في القالب.
4. دي-أكلدل حقن
- شق الجلد المغطي للقلب
- إعداد اثنين من الدبابيس (مينوتينز، 0.10 ملم) لقطع الجلد المغطي القلب. إصلاح بإحكام كل دبوس إلى دبوس حامل. يجب أن يكون القلب التعرف عليها بسهولة كما أنه ينبض ( الشكل 2A-2C ، الوردي).
- ثقب الجلد من جنين مع دبوس واحد. إدراج دبوس من خلال ثقب في الفضاء بين القلب والجلد ( الشكل 2C
- إجراء شق خطي عن طريق فرك بلطف دبوس آخر عقد خارج الجلد ضد دبوس إدراجها. توسيع بلطف هذا شق مع اثنين من الدبابيس، وفضح القلب ( الشكل 2B " و 2D ' ، السهم). ماصة محملة ديي أكلدل يمكن الآن الاقتراب مباشرة من القلب ( الشكل 2D ' ).
- حقنة
- إدراج غيض من ماصة الزجاج تحميلها في القلب وحقن 50-60 نل من حل ديدي-أكلدل في ما يقرب من 10 نبضات طرد. لا تضخ كمية مفرطة من الحل، لأنها تسبب القلب إلى تمزق. تحقق ما إذا كان القلب لا يزال للفوز بعد الحقن. بعد كل الحقن، وتحقق ما إذا كان يتم إخراج نفس المبلغ من الجاذبة- أكلدل. وإلا، قد يتم حظر غيض من ماصة (انظر الخطوة 2.5).
- نقل الأجنة حقن إلى طبق بتري جديدة مليئة 0.1X مبس للانتعاش. بعد 5-10 دقيقة، يجب أن تستعيد الشرغوف وعيه والبدء في التحرك. في هذا الوقت، يمكن تصوير السفن المسمى. فمن المستحسن أن الشاشة بصريا الأجنة المسمى بنجاح تحت المجهر مضان ( الشكل 3A و 3 B). إذا تم حقن كمية كافية من الجاذبة- أكلدل في الجنين، ويمكن حقنه مرة أخرى ( الشكل 3C ).
- تجاهل الشرغوف التي لديها أجهزة أخرى المسمى ( الشكل 3D ). تستمر حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من الأجنة المسمى بنجاح.
- للتصوير أكثر دقة من الأوعية الدموية، واستخدام المجهر متحد البؤر. قد يكون من الأسهل لإصلاح الأجنة وصفها للمجهر متحد البؤر. تخدير الأول الأجنة المسمى في MS02 0.04٪ في 1X مبS (الرقم الهيدروجيني 7.5-8.0) ومن ثم إصلاحها في بارافورمالدهيد 4٪ في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الأجنة الثابتة يمكن تخزينها لعدة أيام في 4 درجات مئوية. حماية عينات حقن من الضوء لتجنب فوتوبلاشينغ من الجاذبة.
5. التصوير من الجاذبة- أكلدل
- التصوير مجسمة
- التقاط الصور تحت المجهر مضان مجسمة ( الشكل 3 ) لتقييم التشكل العام للأوعية الدموية.
- تذوب 1٪ الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X للأجنة ثابتة أو في 1X مبس للتصوير الحي. صب الاغاروز ذاب في طبق بتري وانتظر حتى يصلب. جعل المسافة البادئة الضحلة على سطح هلام الاغاروز التي تناسب الجنين ليتم تصويرها عند الكذب على الجانب الجانبي. ملء الطبق مع العازلة (MS222 حل للأجنة تخدير أو برنامج تلفزيوني 1X للأجنة ثابتة).
- المجهر مضان (تصفية رودامين سير)
- كما ديي هو الصباغ الأخضر متحمس والأحمر التي ينبعث منها، صورة باستخدام مجموعة مرشح القياسية ل رودامين أو فلوروفوريس ذات الصلة الطيفية (أقصى الإثارة في 554 نانومتر والانبعاثات في 571 نانومتر). وضع الأجنة حقن في المسافات البادئة على العفن الاغاروز والتقاط الصور ( الشكل 3 ).
- المجهر متحد البؤر
ملاحظة: لتحليل أقرب من الهندسة المعمارية الأوعية الدموية، واستخدام المجهر متحد البؤر.- إذا باستخدام المجهر مقلوب، ووضع الأجنة على طبق قاع الزجاج. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني 1X وتجميد لهم عن طريق وضع زلة غطاء على القمة. إزالة بس الزائدة. إذا الأجنة الحية هي أن تصور، واستخدام الأجنة تخدير واستخدام 0.015٪ MS222 في مبس 0.1x بدلا من برنامج تلفزيوني.
- للتصوير منخفضة التكبير، استخدم 4X إلى 10X الهدف للعثور على مجال الاهتمام. الجزء منقاري من الوريد الكاردينال الخلفي (يكف) هو منطقة مفيدة للتحقيق الأوعية الدموية التنموية (الشكل 4، متقطعمربعات).
- استخدام إعداد اكتساب فلوروفور الانبعاثات الحمراء (مثل رودامين).
- جعل الصور مكدسة z عن طريق تصوير النصف الجانبي من الجنين. أولا، التركيز على يكف على الجانب الجانبي بالقرب من الهدف ومن ثم تعيين الحد الأدنى من التركيز في الموقف حيث السفن الأقرب إلى الهدف هي في التركيز. تعيين الحد الأعلى في الموقف حيث الجزء وسطي من يكف يجري تصويرها يمكن أن تركز. صورة هذا النصف الجانبي بأكمله من الجنين. استخدام البرامج التي تخزن البيانات الوصفية على إعدادات الاستحواذ، مثل x، y، z، حيث أنها مطلوبة لحساب أطوال السفينة.
- إذا لزم الأمر، استخدم وضع المسح البلاط إلى صورة الأوعية الدموية بأكملها من الجنين. تحديد تجريبيا عدد من البلاط الأفقي والرأسي.
- للتصوير عالية التكبير، اتبع الإجراءات أعلاه لصورة جزء منقاري من يكف و 4 منقاري معظم الأوردة إنترسوميتيس (إيسفس) ( الشكل 4 ،مربع متقطع). ضبط عدد من مداخن (ض المكدس) والبلاط (مسح البلاط) بشكل مناسب.
6 - التحديد الكمي للسفن التي تحمل اسم الجاذبة
ملاحظة: يمكن أن تعقب السفن ديي المسمى يدويا أو باستخدام البرمجيات. نحن نستخدم "بسيطة نيوريت التتبع"، مجانا إيماجيج (نيه) البرنامج المساعد، والذي يسمح تتبع شبه التلقائي للبنى مثل أنبوب مثل الأوعية الدموية و نيوريتس 12 . باستخدام هذا البرنامج المجاني، يمكن حساب المعلمات التالية. ويرد وصف إجراء مفصل لاستخدام هذا البرنامج في مكان آخر (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . أدناه، ونحن نستخدم أمثلة من الأوعية الدموية من الأجنة التي يتم تثبيط إشارة Tie2 أو تعزيز ( الشكل 4A-4C ) 5 . مضاد للأجسام Tie2MO حقن الأجنة المعرض يقلل الأوعية الدموية ويقصر إيسفس ( الشكل 4B )، في حين أن شارك في حقن نشط بشكل نشيط Tie2مرنا متحولة (caTie2 مرنا) الإفراط في إنقاذ هذا النمط الظاهري، مما أدى إلى فروع إيسف مندفعا ( الشكل 4C ).
- طول إيسف
- باستخدام بسيطة نيوريت التتبع، وحساب طول كل تتبع السفينة. حساب أطوال 4 إيسفز منقاري معظم.
- فروع إيسف
ملاحظة: في الأجنة ويلديب، سوى عدد قليل من الفروع قصيرة تنبت من معظم إيسفس منقاري في المرحلة 42.- في التتبع العصبي بسيط، تتبع هذه الأوعية الصغيرة بعد صنع إيسف التي تنشأ من الفرع الأساسي. حساب المعلمات التالية من هذه الفروع الناشئة من إيسفس.
- إجمالي رقم الفرع
- مرة واحدة يتم تتبع كل من إيسفس والفروع المرتبطة بها، وحساب العدد الإجمالي للفروع ( الشكل 5B-5D ).
- ترتيب فرع
- كما يسجل نيوريت التتبع بسيطة ترتيب كل فرع ( الشكل 5A )، كالكولاته عدد الفروع لكل أمر. يجب أن تكون غالبية السفن في الأجنة ويلديب فروع رئيسية ( أي إيسفس).
- مؤشر تعقيد الوريد (فسي)
- كما فسي هو معلمة مفيدة لتعقيد السفينة، مما يعطي المزيد من الوزن إلى فروع أعلى ترتيب، حساب فسي لكل جنين باستخدام الصيغة في الشكل 5A . على سبيل المثال، Tie2MO حقن الأجنة لديها فسي أقل مقارنة للسيطرة ( الشكل 5B و 5 C )، و caTie2 مرنا حقن الأجنة لديها فسي أعلى ( الشكل 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجدول الزمني للتجارب (الشكلان 1 و 2)
بعد فترة قصيرة من الإخصاب، يمكن أن يؤديها ميكروينجكتيون المستهدفة لتعديل التعبير الجيني. على سبيل المثال، مو أنتيزنس التي تربط على وجه التحديد إلى كودون بدء من TNA2 مرنا الذاتية يمكن حقن، مما يثبط ترجمة Tie2 الهدف مرنا بواسطة عائق ستيري. يمكن مو مترافق إلى فلوريسئين لفحص البصرية سهلة من الأجنة حقنها بنجاح. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون مرنا التتبع (على سبيل المثال، مرنا ترميز إغف) شارك في حقن مع مو. بالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج المخدرات عن طريق تطبيق حمام بعد الفقس (مرحلة تيلبود في وقت مبكر، حول نف المرحلة 26). حل الدواء في 0.1X مبس وإضافته إلى الأجنة. لعلاج سابق، يمكن تحرير الأجنة من الأغشية مع زوج من ملقط. يمكن حقن ديدي-أكلدل في القلب حول المرحلة 33/34 للتحقيق في ديناميات شكل السفينةولكن عادة ما نقوم بحقن في مرحلة 37/38 أو في وقت لاحق ( الشكل 2 ، المناطق الملونة).
أمثلة نموذجية للحقن الناجحة وغير الناجحة (الخطوة 4.3) (الشكل 3)
التصوير مجسمة مناسب للفحص البصري. إذا تم حقن كمية كافية من الجاذبة- أكلدل في القلب، وينبغي أن يكون يكف مرئية على الفور تحت المجسام مضان ( الشكل 3A و 3 B). غير كافية أو غير صحيحة حقن الأجنة هي سهلة لتحديد ( الشكل 3C و 3D ). الأجنة مع كمية كافية من الجاذبة- أكلدل ( الشكل 3C ) يمكن حقنها مرة أخرى مع نفس الصبغة حتى الأوعية واضحة للعيان. صورة حقن الأجنة بنجاح تحت المجهر متحد البؤر، ويعيش أو بعد التثبيت.
تطوير بوستيريأو الوريد الكاردينال (يكف) والأوردة إنتيرسوميتيس (إيسفس)
يمتد ال يكف في الاتجاه من ملكي إلى ذيلية، وينتهي هذا التمديد حول المرحلة 37/38. تظهر إيسفس ظهريا من يكف في الموجة الأمامية إلى الخلفية. هذه الموجة من تشكيل إيسف تبدأ في المرحلة 36 وتنتهي حول المرحلة 40/41؛ تستمر إيسفس في النمو وتصبح تشعبت طفيفة حتى المرحلة 43 ( الشكل 3A و 3 B ).
Tie2 يشير ضوابط التنمية إيسف المتفرعة (الشكل 4)
و يكف و إيسفس تنمو في نمط نمطي، وتنميتها تحت سيطرة مشددة ( الشكل 4A ). تشكيل إيسفس من يكف يمكن وصفها بأنها الأوعية الدموية، وبالتالي فإنه هو نموذج مفيد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية. نحن نقدم نتيجة دراستنا الأخيرة شوينانوغرام أن الإشارات التنموية تمنع إشارات Tie2 في إيسف للحد من المتفرعة 5 . ضربة قاضية من Tie2 مما يدل على مضادات مو يقلل من طول وتعقيد إيسفس (الشكل 4B)، والتعبير عن الشكل النشط التأسيسية من Tie2 (caTie2) يسبب المفرط إيسف المتفرعة ( الشكل 4C ).
الكمي للتعقيد إيسف (الشكل 5)
بالإضافة إلى أطوال وأرقام فرع من إيسفس، يمكن حساب "مؤشر تعقيد الوريد" (فسي) لتقييم تعقيدها ( الشكل 5A ). اعتمدنا "مؤشر التعقيد" التي وضعتها كوهين-كوري والزملاء، والتي تم تصميمها لتحديد مدى تعقيد العصبية العصبية أو الشجيرات أربورس 13 . في هذا الفهرس، جنين مع أكثر من فروع عالية الترتيب يتلقى أعلى درجة من الجنين مع نفس العدد من النخالة الإجماليةولكن مع المزيد من الفروع منخفضة الترتيب. لذلك، أعلى فسي يشير إلى أن هذا الجنين لديه شبكة وريدي أكثر تعقيدا. "بسيطة نيوريت التتبع" هو برنامج مفيد لتتبع النظام وطول الفروع الفردية. ومن الممكن أيضا لتوليد "مسارات المقدمة"، وهو وسيلة مفيدة لتصور العمارة الشاملة للأوعية الدموية ( أرقام 5B-5D ، لوحات الحق).
الشكل 1: الجدول الزمني للتجارب. في يوم الإخصاب، مورفولينوس (موس)، الحمض النووي، رنا، أو البروتين يمكن حقنه في البيض المخصب في نف المرحلة 1 (st1) أو 2 (st2). إذا حقن فقط في بلاستومير واحد في st2، فإن كاشف حقن تؤثر على جانب واحد فقط الجانبية. الجانب أونينجكتد يمكن استخدامها كعنصر تحكم. شارك في حقن التتبع (على سبيل المثال، إغف مرنا) لتحديد الجانب حقن. في اليوم الثاني، إيرلي تايلبود المرحلة (~ st24) الأجنة يمكن علاجها مع الكواشف الدوائية عن طريق تطبيق الحمام. القلب واضح للعيان في اليوم الثالث. يمكن حقن ديلي-أكلدل في القلب والأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد فترة وجيزة من الحقن. استخدام الأجنة st33-37 إلى صورة ديناميات نمو الأوعية أو الأجنة st42 إلى صورة الأوعية المتقدمة بالكامل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: موقع حقن الجاذبة- أكلدل في st42. الجانبي ( أب ' ) والبطنية (سد) وجهات النظر من المرحلة 42 الجنين. يتم تلوين القلب باللون الوردي في أس، في الصور المأخوذة من زينباس (www.xenbase.org). وتظهر الصور مجسمة التمثيلية في A ' ،
الشكل 3: النتائج المتوقعة (صور مجسمة). صور مضان ممثل من المرحلة 37/38 ( A ) والمرحلة 42 ( B ) الأجنة. يظهر الجانبان الأيسر من الأجنة. الوريد الكاردينالي الخلفي (يكف) يمتد كاودالي، والتي من الأوردة إنتيرسوميتيس (إيسفس) فرع بشكل ظهري في الوريد منقاري إلى الذيليةه. ولا تظهر سوى مرآبات إيسف المنقارية في المرحلة 37/38 ( أ )، وقد شكلت معظم أنواع الدعم الدولي حسب المرحلة 42 ( باء ). إذا تم حقن كمية كافية من الجاذبة- أكلدل، فإن يكف لا تكون واضحة للعيان، حتى بعد 30 دقيقة ( C ). في هذه الحالة، يمكن حقن المزيد من دي-أكلدل. إذا تم حقن ديدي-أكلدل عن طريق الخطأ في أجهزة أخرى ( D )، وتجاهل الأجنة. شريط مقياس = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار إشارات Tie2 على تطوير إيسف. تم طرد Tie2 التعبير الجيني أسفل عن طريق الحقن بلاستومير من حجب ترجمة العقاقير مورفولينو أوليغونوكلأوتيدس (Tie2MO). السيطرة مورفولينو (كومو) له نفس الوزن الجزيئي ولكن لا نأوت تستهدف أي جين في القيطم الاستوائية . مرنا ترميز كونتوتوتيلي نشط Tie2 متحولة (caTie2) شارك في حقن لانقاذ النمط الظاهري ضربة قاضية Tie2. وعلى النقيض من التحكم ( A )، أدى الحقن TT22MO إلى انخفاض كبير في طول وعدد من إيسفس ( B ). وقد تم إنقاذ هذا النمط الظاهري من قبل caTie2، والتي أظهرت إيسفس مع فروع الضمان مندفعا ( C ). يتم تحديد تعقيد إيسفس في المناطق المشار إليها من قبل صناديق متقطع الأزرق في الشكل 5. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الكمي لتعقيد الوريد. ( A ) تعقيد إيسف يمكن أن يمثله مؤشر تعقيد الوريد (فسي).(بد) تم حساب فسي من الأجنة هو مبين في الشكل 4. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المقدمة هنا وضعت لأول مرة من قبل علي H. بريفنلو وزملائه للتحقيق في الأحداث التنموية خلال تشكيل الأوعية الدموية في القيطم ليفيس 4 ، ولكن، كما هو مبين في هذه المخطوطة، فإنه يمكن تطبيقها على الحيوانات الصغيرة الأخرى. صبغ الحقن في القلب هو بسيط لأداء، وشبكة الأوعية الدموية بأكملها يمكن تصويرها تحت المجهر تشريح مضان، فضلا عن المجهر متحد البؤر. إذا تم حقن الصبغة في القلب أثناء تطوير السفن، وديناميات نمو السفن والتفرع يمكن تصويرها في الوقت الحقيقي 4 . باستخدام الشبكة الوريدية محددة جيدا، وخاصة يكف و روسترال-معظم إيسفس، آثار الاضطراب الجيني أو البيئي على الأوعية الدموية يمكن تقييم كميا.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو حقن ديي-أكلدل (الخطوة 4). نحن نقدم أمثلة على الحقن الناجحة وغير الناجحة (فيغور 3). وينبغي أن يتم فحص الأجنة حقن بنجاح تحت المجهر مضان، كما هو موضح في الخطوة 4.3. إذا كان يكف غير مرئية 30 دقيقة بعد الحقن، لم يتم حقن ما يكفي من الجاذبة- أكلدل ( الشكل 3C ). قد يتم تخدير الأجنة حقن ناجحة وحقن مرة أخرى. في بعض الحالات، قد يتم حقن ديدي-أكلدل في موقع غير صحيح، وفي هذه الحالة سيتم وصف الأجهزة الأخرى ( الشكل 3D ). تجاهل الأجنة حقن بشكل غير صحيح.
الأوعية الدموية من الجنين حقن بنجاح تكون مرئية بعد فترة وجيزة من الحقن، ومضان يستمر لعدة ساعات. لذلك، إذا تم تنفيذ الحقن قبل تشكيل إيسفس، ويمكن تصوير تطورها في جنين الحية، وتوفير أداة قوية للتحقيق في تطوير نظام القلب والأوعية الدموية في الوقت الحقيقي وفي الجسم الحي 4 . كما تم استخدام القيطم بنجاح كنموذج لفحص الأوعية الدموية دوكلاء إفساد في الثدييات 14 ، النهج التجريبي الموصوفة هنا قد تكون جنبا إلى جنب مع التجارب الاضطراب الدوائية وتستخدم كمنصة الفرز للعثور على الأدوية التي تعزز أو تمنع الأوعية الدموية.
يمكن تصور الأوعية الدموية عن طريق الأدوات الوراثية، فضلا عن أساليب وضع العلامات على أساس صبغ وصفها هنا. على سبيل المثال، المعدلة وراثيا القيطم 15 أو الزرد 16 التي تعبر عن البروتينات مضان تحت سيطرة المروجين نوع خلية محددة تمكن التصوير الحي من الدم والأوعية اللمفاوية، وأنه من الممكن حتى للتمييز الشرايين من الأوردة 16 . وعلى الرغم من أن النهج الجينية متفوقة وتولد كفاءة أكثر اتساقا في وضع العلامات، فإن الأساليب القائمة على الصباغة يمكن الوصول إليها بسهولة لمعظم المختبرات دون الوصول إلى هذه الحيوانات المحورة جينيا. في القيطم ، ونضح ترانسكارديال من النتائج ديي أكلدل فيووضع العلامات على معظم الخلايا البطانية 4 ، والشرايين والأوردة لا يمكن تمييزها في الصور مضان. ومن المثير للاهتمام، الطماطم ليتين-فلوريسئين بشكل انتقائي تسميات الشرايين في الفئران، وعندما شارك في حقن مع الجاذبة- أكلدل، الشرايين والأوردة يمكن التمييز 17 . على الرغم من أن التطبيق لم يتم اختباره في الأنسجة أو الحيوانات الأخرى، وهذا يوفر اتجاها واعدا للتحقيق في التطور الديناميكي للشرايين والأوردة في القيطم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد استلهمت هذه الدراسة من عمل ليفين وآخرون. ، الذي وصف هذه الطريقة التجريبية وقدم وصفا شاملا للتنمية الأوعية الدموية في القيطم ليفيس . نشكر أعضاء مختبرنا على مدخلاتهم. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مبادرة البحوث الرائدة في المستقبل جامعة يونسي 2015 (2015-22- 0095) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الحيوية والتكنولوجيا الطبية للمؤسسة الوطنية للبحوث (نرف) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي ( جبهة الخلاص الوطني، 2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
