Summary
Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .
Abstract
Les vaisseaux sanguins fournissent de l'oxygène et des nutriments dans tout le corps, et la formation du réseau vasculaire est soumise à un contrôle étroit du développement. La visualisation efficace in vivo des vaisseaux sanguins et la quantification fiable de leur complexité sont essentielles à la compréhension de la biologie et de la maladie du réseau vasculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour visualiser les vaisseaux sanguins avec un colorant fluorescent disponible dans le commerce, un complexe DII-lipoprotéine à faible densité acétylée plasmatique humain (DiI-AcLDL) et à quantifier leur complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être étiquetés par une simple injection de DiI-AcLDL dans le coeur battant d'un embryon, et les vaisseaux sanguins dans l'ensemble de l'embryon peuvent être imagés dans des embryons vivants ou fixes. Combinée à la perturbation du gène par la micro-injection ciblée d'acides nucléiques et / ou l'application du bain de réactifs pharmacologiques, les rôles d'un gène ou d'une voie de signalisation sur le développement vasculaire peuvent être inveStigmatisé dans une semaine sans recourir à des animaux génétiquement modifiés. En raison du système veineux bien défini de Xenopus et de son angiogenèse stéréotypée, la germination des vaisseaux préexistants, la complexité des vaisseaux peut être quantifiée efficacement après les expériences de perturbation. Ce protocole relativement simple devrait servir d'outil facilement accessible dans divers domaines de la recherche cardiovasculaire.
Introduction
La vasculogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins provenant de cellules endothéliales nouvellement nées et l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants sont deux processus distincts qui forment la vascularisation embryonnaire 1 . Toute dysrégulation dans ces processus entraîne diverses maladies cardiaques et anomalies structurelles des vaisseaux. En outre, la croissance tumorale est associée à une croissance non surveillée des vaisseaux. En tant que tel, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la vasculogenèse et à l'angiogenèse font l'objet d'une enquête intense 2 .
Xenopus et le poisson zèbre sont des modèles attrayants de vertébrés pour les études de vasculogenèse et d'angiogenèse, pour plusieurs raisons. Premièrement, leurs embryons sont petits; Par conséquent, il est relativement facile d'imaginer l'ensemble du système vasculaire. Deuxièmement, le développement embryonnaire est rapide; Il ne faut que quelques jours pour développer l'ensemble du système vasculaire, période pendant laquelle le vasculisme en développement L'image peut être imagée. Troisièmement, les interventions génétiques et pharmacologiques avant et pendant la formation des vaisseaux sont faciles à réaliser, par exemple grâce à la micro-injection de nucléotides morpholino-antisens (MO) dans l'embryon en développement ou par l'application du bain de médicaments 3 , 4 , 5 .
L'avantage unique de Xenopus sur le poisson zèbre est que des manipulations embryologiques peuvent être effectuées car Xenopus suit des clivages holoblastiques stéréotypés et la carte du sort embryonnaire est bien définie 6 . Par exemple, il est possible de générer un embryon dans lequel un seul côté latéral est manipulé génétiquement en injectant un MO antisens à une cellule au stade à deux cellules. Il est également possible de transplanter le primordium cardiaque d'un embryon à un autre pour déterminer si le gène exerce sa fonction par un mécanisme cellulaire intrinsèque ou extrinsèqueAss = "xref"> 7. Bien que ces techniques aient surtout été développées chez Xenopus laevis , qui est allotetraploïde et n'est donc pas idéale pour les études génétiques, elles peuvent être directement appliquées à Xenopus tropicalis , une espèce diploïde étroitement liée 8 .
Une façon de visualiser le système vasculaire dans un embryon Xenopus vivant consiste à injecter un colorant fluorescent pour étiqueter les vaisseaux sanguins. La lipoprotéine de basse densité acétylée (AcLDL) marquée avec une molécule fluorescente telle que DiI est une sonde très utile. Contrairement aux LDL non acétylées, les LDL ne se lient pas au récepteur LDL 9 mais sont endocytées par les macrophages et les cellules endothéliales. L'injection de DiI-AcLDL dans le cœur d'un animal vivant entraîne l'étiquetage spécifique des cellules endothéliales par fluorescence et toute la vascularisation peut être imagée par microscopie fluorescente dans des embryons vivants ou fixes 4 .
Ici, nous présDes protocoles détaillés pour la visualisation et la quantification des vaisseaux sanguins utilisant DiI-AcLDL dans Xenopus tropicalis ( figure 1 ). Nous fournissons des points pratiques clés, avec des exemples d'expériences réussies et infructueuses. En outre, nous fournissons une méthode simple pour l'analyse quantitative de la complexité vasculaire, ce qui pourrait être utile pour évaluer les effets des facteurs génétiques et environnementaux sur la mise en forme du réseau vasculaire.
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Protocol
Toutes les expériences ont respecté les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Université de Yonsei.
1. Préparation des embryons de Xenopus tropicalis
NOTE: Les embryons de Xenopus tropicalis ont été produits comme décrit précédemment 10 , avec une légère modification. Les embryons de Xenopus tropicalis ont été mis en scène selon les tableaux de Nieuwkoop et Faber 11 .
- Induction de l'ovulation
- Pour pré-amorcer, injecter une gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans le sac lymphatique dorsal d'une paire de grenouilles (un mâle et une femelle) le jour précédant le jour de l'accouplement. Injecter 20 unités par grenouille et 10 unités par homme. Entrez un homme et une femelle dans le même réservoir pendant la nuit (plus de 18 h).
- Pour amorcer, le lendemain, injectez 200 unités de hCG à la femelle pré-apprêtée et 100 unités de hCG au pré-apprêtémâle; La femelle amorcée commencera à mettre des oeufs environ 3 h et continuera à le faire tout au long de la journée. Gardez la paire masculine et féminine pour un accouplement naturel ou dans des réservoirs séparés pour la fécondation in vitro (étape 1.2).
- Fertilisation
NOTE: Les œufs peuvent être fécondés par accouplement naturel ou fertilisation in vitro . Dans l'accouplement naturel, les œufs sont fertilisés au fur et à mesure qu'ils sont posés et, par conséquent, le moment de la fécondation ne peut être contrôlé. Alternativement, une grenouille apprêtée peut être logée dans un réservoir séparé et les œufs non fertilisés peuvent être collectés pour la fertilisation in vitro , ce qui génère des centaines d'embryons fertilisés en même temps. Cette dernière approche est utile lorsque la micro-injection ciblée par blastomère sera effectuée avant l'étiquetage du navire. Dans cette approche, cependant, un homme est sacrifié.- Accouplement naturel
- Quitter la paire femelle et mâle dans le même réservoir. Le mâle serra le fEmale, entraînant une fertilisation immédiate des œufs pondus. Recueillir les oeufs avec une pipette en verre ou en plastique et les transférer dans une boîte à pétri. Pour empêcher les oeufs de coller à la pipette, enduire la surface interne de la pipette avec une albumine de sérum bovin (BSA) à 0,5%.
- Fertilisation in vitro (FIV)
- Séparer la femelle apprêtée du mâle après l'amorçage. La femelle commencera à pondre spontanément les œufs dans environ 3 h. Transférer quelques œufs posés à l'aide d'une pipette enduit de BSA dans une boîte de Petri et vérifier leur qualité au microscope. Si des œufs sains (pigments clairs, élastiques en forme de boule) ont été posés, préparez-vous à disséquer les testicules du mâchoire apprêté.
- Faire 0,4% de méthanesulfonate de tricaine (MS222) pour l'euthanasie et injecter 300 μL dans le sac lymphatique dorsal du mâchoir apprêté. En environ 10 min, le mâle perd son sens de l'équilibre et restera à flot; Confirmez que le mâle est euthanasié en pinçant une patte arrière avec unPaire de pinces émoussées et n'observe aucune réponse.
- Dissectez les deux testicules, nettoyez-les en les tapant rapidement sur du papier sans peluches et transférez-les dans un microtube contenant 1 mL de 60% de milieu L-15 de Leibovitz additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS); Une procédure détaillée est décrite ailleurs 10 .
- Masser doucement les testicules avec un pilon pour extraire le sperme. À cette concentration ( c.-à-d. 2 testicules dans 1 mL de FBS à 10% dans 60% de L-15), quelques gouttes de solution de testicule (0,1 mL) peuvent fertiliser environ trois cents oeufs. Le sperme restant peut être stocké à 4 ° C dans un tube hermétiquement fermé et utilisé pour la FIV le lendemain.
- Pressez les œufs de la femelle dans une petite boîte de Petri. Tenez la partie supérieure de la femelle à l'envers sur la paume et placez l'index entre ses pattes postérieures. Faites passer les pattes postérieures avec l'index et l'autre pour exposer le cloaca. Touchez le cloaca dans la boîte de Petri. Manteau tHe Petri avec 0,5% de BSA pour répartir uniformément les œufs en monocouche pendant la FIV.
- Ajoutez quelques gouttes (0,1 ml) de milieu L-15 contenant du sperme aux oeufs. Pour une fertilisation synchrone, remuer légèrement la solution de sperme sur le plat. Après 4 min à température ambiante, remplir la boîte de Petri avec 0.01x Modified Barth's Saline (MBS), incuber pendant 10 minutes et remplacer la solution par 0.1x MBS. Les œufs fertilisés subiront le premier clivage en environ 1 h à température ambiante. 1x MBS est 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 2,5 mM de NaHC03, 5 mM d'HEPES, 1 mM de MgS04 et 0,7 mM de CaCl2, pH 7,5.
- Accouplement naturel
- (Facultatif) Injection d'oligonucléotides morpholino antisens (MO) et / ou d'ARNm
- Pour étudier l'effet d'un gène d'intérêt sur la formation des vaisseaux, effectuer la micro-injection de MO antisens et / ou d'ARNm.
- Pour de telles expériences, dégraisser les oeufs avec 2% de L-cysteine dans 1x MBS (pH 7,5-7,8).Remplacer 0.1x MBS dans le plat contenant les embryons fertilisés avec 2% de L-cysteine dans 1x MBS. Tournez doucement le plat pour mélanger la solution.
REMARQUE: il faut généralement environ 5 minutes pour que les embryons soient déshumelés. Au cours de cette étape, surveillez fréquemment les oeufs pour s'assurer qu'ils ne sont pas trop exposés à la solution. Si les œufs sont surexposés, ils perdront de l'élasticité et deviendront aplaties, ce qui entraînera un développement aberrant et une létalité. - Laver les oeufs dégelés cinq fois avec 0,1x MBS. Effectuer la micro-injection dans 4% de Ficoll dissous dans 0,1 x MBS. Typiquement, injecter 4 ng de MO et 600 pg d'ARNm par blastomère au stade à deux cellules. Injecter dans une cellule pour manipuler l'expression des gènes sur un seul côté de l'embryon. Utilisez le côté non injecté du même embryon comme un témoin.
- Comme autre contrôle pour la spécificité de la manipulation des gènes, injectez la même quantité d'un MO de contrôle (CoMO) ou contrôlez l'ARNm ( par exemple, l'ARNm de la bêta-galactosidase). CoMO doit avoir le même mLe poids moléculaire comme MO spécifique du gène et ne doit pas cibler aucun gène dans le génome de Xenopus . Pour une visualisation facile du côté injecté, utilisez un MO marqué par fluorescéine ou co-injectez un traceur ( p. Ex., MRNA EGFP).
- Laissez les embryons injectés dans Ficoll 4% pendant 2 h puis transférez-les dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm remplie de 0,1 x MBS.
- Élevage
- Relever les embryons à 23 ° C. Bien que la vitesse de développement puisse être ralentie ou accélérée en utilisant des températures inférieures ou supérieures à 23 ° C, respectivement (portée: 16-26 ° C), il est conseillé de les élever à 23 ° C.
- (Facultatif) Traitement avec des réactifs pharmacologiques
- Pour les manipulations pharmacologiques, administrer des médicaments aux embryons en développement par application de bain.
2. Préparation de l'injection de DiI-AcLDL
- Faire une pipette en verre effilé à l'aide d'un micromètre standardExtracteur d'opiette. Placez un tube en verre borosilicate dans l'extracteur à micropipette et utilisez les réglages suivants: pression, 200; Chaleur, 30; Pull, 30; Vitesse 120; Temps, 200.
- Stocker la solution mère DiI-AcLDL à 4 ° C. Prenez la partie supérieure transparente de la solution pour injection, mais pas les particules précipitées au fond du tube. Tout débris dans la pipette en verre perturbera l'éjection correcte de la solution.
- Remplissez la pipette en verre préparée avec une quantité appropriée de solution DiI-AcLDL (~ 5 μL) à l'aide d'un microchargeur.
- Retirez la pointe de la pipette en verre peu à peu à l'aide d'une pince fine (numéro 55). Mettre en place le système d'injection à pression contrôlée afin d'éjecter environ 5 nL de solution à la fois; 50-60 nL de la solution DiI-AcLDL suffit à tacher les vaisseaux d'un embryon.
- Ne laissez pas la pipette chargée DiI-AcLDL dans l'air pendant une période prolongée afin d'éviter le séchage. Garder la pointe de la pipette immergée dans 0,04% MS222 dans la solution MBS 0,1X. Juste avant de l'injecter dans l'embryon (étape 4.2.1), vérifiez si la même quantité de colorant éjecte.
3. Configuration de l'injection
- Moule de Sylgard
- Pour préparer un petit moule de Sylgard, mélanger la base Sylgard et le durcisseur avec un rapport pondéral de 10 à 1. Remplir environ la moitié d'une petite boîte de Petri (plat 35 mm ou 60 mm) avec cette solution mélangée puis laissez-la solidifier pendant environ 48 h à température ambiante.
- Anesthésie
- Utilisez 0,04% de MS222 dans 1x MBS (pH 7,5-8,0) pour l'anesthésie. Lorsqu'une longue anesthésie est nécessaire ( p. Ex., Lors de l'imagerie en direct), utilisez MSC222 0,04% dans 0,1% de MBS pour réduire le déséquilibre osmotique. Pour ajuster le pH, ajouter quelques gouttes de NaOH (~ 20 μL) et vérifier le pH en utilisant du papier pH.
- Attendez que les embryons transférés cessent de bouger. Touchez les nageoires dorsales des embryons et vérifiez s'ils répondent pour confirmer compléter unNesthésie.
- Positionnement des embryons pour injection
- Déposer la surface du moule Sylgard durci avec une lame mince et pointue. Faire une indentation concave en forme de V pour placer les embryons (voir la figure 2D ). Placez un embryon anesthésié, côté ventrale vers le haut, de manière légèrement oblique (environ 30 °) ( Figure 2D ).
- Remplissez le moule avec une solution MS222 et placez les embryons dans le moule.
4. DiI-AcLDL Injection
- Incision de la peau qui recouvre le cœur
- Préparez deux broches (Minutiens, 0,10 mm) pour couper la peau qui recouvre le cœur. Fixez complètement chaque goupille sur un porte-épingle; Le cœur doit être facilement identifiable car il pulsse ( Figure 2A-2C , rose).
- Percer la peau d'un embryon avec une épingle. Insérez la broche dans le trou dans l'espace entre le cœur et la peau ( figure 2C
- Faites une incision linéaire en frottant doucement l'autre cheville maintenue à l'extérieur de la peau contre la broche insérée. Agrandissez doucement cette incision avec deux épingles, exposant le cœur ( Figure 2B ' et 2D' , flèche). La pipette chargée avec DiI-AcLDL peut maintenant s'approcher directement du coeur ( Figure 2D ' ).
- Injection
- Insérez la pointe de la pipette de verre chargée dans le cœur et injectez 50 à 60 nL de solution DiI-AcLDL dans environ 10 impulsions d'éjection. Ne pas injecter une quantité excessive de solution, car elle provoque une rupture du cœur. Vérifiez si le cœur continue de battre après l'injection. Après chaque injection, vérifiez si la même quantité de DiI-AcLDL est éjectée; Sinon, la pointe de la pipette peut être bloquée (voir l'étape 2.5).
- Transférer les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Petri remplie de 0,1 x MBS pour récupérer. Après 5 à 10 minutes, les têtards doivent retrouver la conscience et commencer à bouger. À l'heure actuelle, les vaisseaux étiquetés peuvent être imagés. Il est recommandé d'examiner visuellement des embryons étiquetés avec succès sous un microscope à fluorescence ( Figure 3A et 3B ). Si une quantité insuffisante de DiI-AcLDL est injectée dans un embryon, elle peut être à nouveau injectée ( Figure 3C ).
- Jeter les têtards qui ont d'autres organes marqués ( figure 3D ). Continuez jusqu'à ce que le nombre requis d'embryons étiquetés avec succès soit obtenu.
- Pour une imagerie plus approfondie des vaisseaux sanguins, utiliser une microscopie confocale; Il pourrait être plus facile de réparer les embryons marqués pour la microscopie confocale. Anesthésier les embryons marqués dans 0,04% MS222 en 1x MBS (pH 7,5-8,0) et ensuite les réparer dans du paraformaldéhyde à 4% dans de la solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS) pendant 1 h à température ambiante. Les embryons fixés peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C; Protéger les échantillons injectés de la lumière pour éviter le photoblanchage du DII.
5. Imagerie de DiI-AcLDL
- Imagerie stéréoscopique
- Prenez des photos sous un microscope à fluorescence stéréoscopique ( Figure 3 ) pour évaluer la morphologie globale du système vasculaire.
- Faire fondre 1% d'agarose dans 1x PBS pour des embryons fixes ou en 1x MBS pour l'imagerie en direct. Verser l'agarose fondu dans une boîte de Petri et attendre jusqu'à ce qu'elle se solidifie. Effectuez une échancrure superficielle à la surface du gel d'agarose qui s'adaptera à l'embryon à imager lorsqu'il est couché sur son côté latéral. Remplir le plat avec un tampon (solution MS222 pour des embryons anesthésiés ou 1x PBS pour des embryons fixes).
- Microscopie de fluorescence (filtre à rhodamineT)
- Comme DiI est un colorant émoussé vert et émetteur rouge, une image utilisant un ensemble de filtres standard pour la rhodamine ou des fluorophores apparentés à la spectralité (excitation maximale à 554 nm et émission à 571 nm). Placez les embryons injectés dans les indentations sur le moule d'agarose et prenez des photos ( Figure 3 ).
- Microscopie confocale
NOTE: Pour une analyse plus approfondie de l'architecture vasculaire, utilisez une microscopie confocale.- Si vous utilisez un microscope inversé, placez les embryons sur un plat en verre. Ajouter quelques gouttes de 1x PBS et les immobiliser en plaçant un slip sur le dessus. Enlevez l'excès de PBS. Si les embryons vivants doivent être imagés, utiliser des embryons anesthésiés et utiliser 0,015% de MS222 dans 0,1x MBS au lieu de PBS.
- Pour une imagerie à faible grossissement, utilisez un objectif 4X à 10X pour trouver la zone d'intérêt; La partie rostrale de la veine cardiaque postérieure (PCV) est une région utile pour étudier l'angiogenèse du développement (figure 4, pointillédes boites).
- Utilisez un paramètre d'acquisition pour un fluorophore à émission rouge (tel que Rhodamine).
- Faites des images empilées en z par imagerie de la moitié latérale d'un embryon. Tout d'abord, mettez l'accent sur le PCV sur le côté latéral près de l'objectif, puis réglez la limite inférieure de la mise au point à la position où les vaisseaux les plus proches de l'objectif sont concentrés. Réglez la limite supérieure à la position où la partie médiane du PCV en cours d'image peut être focalisée. Image cette moitié latérale entière de l'embryon. Utilisez un logiciel qui stocke les métadonnées sur les paramètres d'acquisition, telles que les échelles x, y et z, car elles sont nécessaires pour calculer les longueurs des navires.
- Si nécessaire, utilisez le mode balayage de la tuile pour imaginer l'ensemble du système vasculaire d'un embryon. Déterminer de façon empirique le nombre de carreaux horizontaux et verticaux.
- Pour une imagerie à grand grossissement, suivez les procédures ci-dessus pour imaginer la partie rostrale du PCV et 4 veines intersomiites (ISVs) rostrales ( figure 4 ,Boîte pointillée). Ajustez le nombre de piles (z-stack) et les tuiles (balayage de la tuile) de manière appropriée.
6. Quantification des navires étiquetés DiI
REMARQUE: les navires étiquetés DiI peuvent être tracés manuellement ou utiliser un logiciel. Nous utilisons le «traceur de neurites simple», un plugin gratuit ImageJ (NIH), qui permet le traçage semi-automatique de structures tubulaires telles que les vaisseaux sanguins et les neurites 12 . En utilisant ce logiciel gratuit, les paramètres suivants peuvent être calculés. Une procédure détaillée pour l'utilisation de ce logiciel est décrite ailleurs (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Ci-dessous, nous utilisons des exemples du système vasculaire d'embryons dans lequel la signalisation Tie2 est inhibée ou améliorée ( figure 4A-4C ) 5 . L'exposition aux embryons antisens Tie2MO-injectée réduit l'angiogenèse et raccourcit les ISV ( Figure 4B ), alors que la co-injection de Tie2 active constitutivementL'ARNm mutant (ARNm caTie2) surpasse ce phénotype, ce qui entraîne des branches exubérantes d'ISV ( Figure 4C ).
- Longueurs ISV
- En utilisant le traceur de neurites simple, calculez la longueur de chaque vaisseau tracé. Calculez les longueurs des 4 ISV plus grands de Rostral.
- Branches ISV
NOTE: Dans les embryons de type sauvage, seules quelques branches courtes jaillissent de la plupart des ISV au rostral au stade 42.- Dans le traceur de neurites simple, tracez ces petits vaisseaux après avoir fait l'ISV d'où ils proviennent la branche primaire. Calculez les paramètres suivants de ces branches provenant des ISV.
- Numéro de branche totale
- Une fois que tous les ISV et les branches associées sont tracés, calculez le nombre total de branches ( Figure 5B-5D ).
- Ordre de succursale
- Comme le traceur de neurites simple enregistre l'ordre de chaque branche ( Figure 5A ), calculerE le nombre de succursales pour chaque commande. La majorité des navires dans les embryons de type sauvage devraient être des branches primaires ( c'est-à-dire les ISV).
- Indice de complexité des veines (VCI)
- Comme VCI est un paramètre utile pour la complexité des navires, qui donne plus de poids aux branches d'ordre supérieur, calculez le VCI pour chaque embryon en utilisant la formule de la Figure 5A . Par exemple, les embryons injectés Tie2MO ont une VCI plus faible par rapport au contrôle ( Figure 5B et 5C ), et les embryons injectés par ARNm caTie2 ont un VCI plus élevé ( Figure 5D ).
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Representative Results
Chronologie des expériences (figures 1 et 2)
Peu de temps après la fécondation, une micro-injection ciblée peut être effectuée pour moduler l'expression des gènes. Par exemple, un MO antisens qui se lie spécifiquement au codon d'initiation de l'ARNm Tie2 endogène peut être injecté, inhibant la traduction de l'ARNm cible Tie2 par un empêchement stérique. Un MO peut être conjugué à la fluorescéine pour le dépistage visuel facile des embryons injectés avec succès. En variante, un ARNm de traceur ( par exemple, un ARNm codant pour EGFP) peut être co-injecté avec MO. En outre, les médicaments peuvent être traités par une application de bain après l'éclosion (stade de la queue de départ précoce, autour du stade NF 26). Dissoudre le médicament dans 0.1x MBS et l'ajouter aux embryons. Pour un traitement antérieur, les embryons peuvent être libérés des membranes avec une pince. DiI-AcLDL peut être injecté dans le cœur autour de l'étape 33/34 pour étudier la dynamique de la forme du vaisseau, Mais généralement nous nous injectons à l'étape 37/38 ou ultérieure ( figure 2 , régions colorées).
Exemples typiques d'injections réussies et infructueuses (étape 4.3) (Figure 3)
L'imagerie stéréoscopique est appropriée pour le dépistage visuel. Si une quantité suffisante de DiI-AcLDL est injecté dans le cœur, le PCV doit être immédiatement visible sous un stéréoscope à fluorescence ( Figure 3A et 3B ). Des embryons insuffisamment ou incorrectement injectés sont faciles à identifier ( figure 3C et 3D ). Les embryons avec une quantité insuffisante de DiI-AcLDL ( Figure 3C ) peuvent être injectés à nouveau avec le même colorant jusqu'à ce que les vaisseaux soient clairement visibles. Image injectée avec succès des embryons sous un microscope confocal, en direct ou après fixation.
Développement de la posteriOu la veine cardinale (PCV) et les veines intersomiites (ISV)
Le PCV s'étend dans le sens rostal à caudal, et cette extension se termine autour de l'étape 37/38. Les ISV émergent dorsalement du PCV dans une vague antérieure à postérieure. Cette onde de formation ISV commence à l'étape 36 et se termine autour de la phase 40/41; Les ISV continuent de croître et deviennent légèrement ramifiés jusqu'à l'étape 43 ( Figure 3A et 3B ).
La signalisation Tie2 contrôle la dérivation ISV du développement (Figure 4)
Le PCV et les ISV se développent dans un schéma stéréotypé, et leur développement est étroitement contrôlé ( Figure 4A ). La formation des ISV du PCV peut être décrite comme une angiogenèse et, par conséquent, elle est un modèle utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'angiogenèse. Nous présentons le résultat de notre étude récenteSi ces signaux de développement inhibent la signalisation Tie2 dans les ISV pour limiter leur ramification 5 . Le décrochage de la signalisation Tie2 par MO antisens diminue la longueur et la complexité des ISV (Figure 4B), et l'expression de la forme active constitutive de Tie2 (caTie2) provoque une ramification excessive de l'ISV ( Figure 4C ).
Quantification de la complexité ISV (Figure 5)
En plus des longueurs et des branches des ISV, l'indice de complexité des veines (VCI) peut être calculé pour évaluer leur complexité ( Figure 5A ). Nous avons adopté le «indice de complexité» développé par Cohen-Cory et ses collègues, qui a été conçu pour quantifier la complexité des alvéoles axonales ou dendritiques neuronales 13 . Dans cet indice, un embryon avec plus de branches de haut ordre reçoit un score plus élevé qu'un embryon avec le même nombre de son totalMais avec des branches plus bas. Par conséquent, un VCI supérieur indique que cet embryon a un réseau veineux plus complexe. «Simple neurite tracer» est un logiciel utile pour suivre l'ordre et la longueur des branches individuelles. Il est également possible de générer des «chemins rendus», ce qui est un moyen utile de visualiser l'architecture globale du système vasculaire ( figures 5B-5D , panneaux droits).
Figure 1: Chronologie des expériences. Le jour de la fécondation, les morpholinos (MO), l'ADN, l'ARN ou la protéine peuvent être injectés dans des oeufs fécondés au stade NF (st1) ou 2 (st2). S'il n'est injecté que dans le blastomere à st2, le réactif injecté n'affecte qu'un seul côté latéral. Le côté non injecté peut être utilisé comme un contrôle. Co-injecter un traceur ( par exemple, EGRV mRNA) pour identifier le côté injecté. Le deuxième jour, aLes embryons peuvent être traités avec des réactifs pharmacologiques par application de bain. Le cœur est clairement visible au troisième jour. Le DiI-AcLDL peut être injecté dans le cœur et les vaisseaux sanguins peuvent être imagés peu de temps après l'injection. Utilisez les embryons st33-37 pour imaginer la dynamique de la croissance des vaisseaux ou des embryons st42 pour imaginer des vaisseaux entièrement développés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Localisation de l'injection de DiI-AcLDL à st42. Vue latérale ( AB ' ) et ventrale ( CD ) de l'embryon de l'étape 42. Le coeur est coloré en rose en AC , en images tirées de Xenbase (www.xenbase.org). Les images stéréoscopiques représentatives sont présentées dans A ' ,
Figure 3: résultats escomptés (images stéréoscopiques). Des images fluorescentes représentatives des embryons de l'étape 37/38 ( A ) et de l'étape 42 ( B ). Les côtés gauche des embryons sont présentés. La veine cardiaque postérieure (PCV) s'étend de manière caudale, à partir de laquelle les veines intersomitiques (ISV) se ramifient dorsalement dans un wav de rostral à caudalE. Seuls les ISV rostrales sont visibles à l'étape 37/38 ( A ), et la plupart des ISV se sont formés à l'étape 42 ( B ). Si une quantité insuffisante de DiI-AcLDL est injectée, le PCV ne sera pas clairement visible, même après 30 minutes ( C ). Dans ce cas, plus DiI-AcLDL peut être injecté. Si DiI-AcLDL est injecté accidentellement dans d'autres organes ( D ), jeter les embryons. Barre d'échelle = 500 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Effets de la signalisation Tie2 sur le développement de l'ISV. L'expression du gène Tie2 a été abattu par l'injection de blastomère d'oligonucléotides morpholino antisens bloquant la traduction (Tie2MO). Le morpholino de contrôle (CoMO) a le même poids moléculaire mais nCibler n'importe quel gène chez Xenopus tropicalis . Le mutant Tie2 constitutivement actif codant l'ARNm (caTie2) a été co-injecté pour sauver le phénotype Tie2 knockdown. Contrairement au contrôle ( A ), l'injection Tie2MO a entraîné une diminution spectaculaire de la longueur et du nombre d'ISV ( B ). Ce phénotype a été surélevé par caTie2, qui a montré des ISV avec des branches collatérales exubérantes ( C ). La complexité des ISV dans les régions indiquées par les cases à pointes bleues est quantifiée à la Figure 5. Barre d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Quantification de la complexité de la veine. ( A ) La complexité de l'ISV peut être représentée par l'indice de complexité veine (VCI).( BD ) Les VCI ont été calculés à partir des embryons présentés à la Figure 4. Barre d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici a d'abord été développé par Ali H. Brivanlou et ses collègues pour enquêter sur les événements de développement lors de la formation vasculaire dans Xenopus laevis 4 , mais, comme le montre ce manuscrit, il peut être appliqué à d'autres petits animaux. L'injection de teinture dans le cœur est simple à réaliser, et l'ensemble du réseau vasculaire peut être imagé sous un microscope à dissection de fluorescence, ainsi qu'un microscope confocal. Si le colorant est injecté dans le cœur pendant le développement du vaisseau, la dynamique de croissance et de ramification des vaisseaux peut être imagée en temps réel 4 . En utilisant le réseau veineux bien défini, en particulier le PCV et le plus grand nombre d'ISV, les effets de la perturbation génétique ou environnementale sur l'angiogenèse peuvent être évalués quantitativement.
L'étape la plus critique dans ce protocole est l'injection de DiI-AcLDL (étape 4). Nous fournissons des exemples d'injections réussies et infructueuses ( FiGure 3). Les embryons injectés avec succès doivent être examinés sous un microscope à fluorescence, comme décrit à l'étape 4.3. Si le PCV n'est pas visible 30 min après l'injection, il n'a pas été injecté assez de DiI-AcLDL ( Figure 3C ). Les embryons injectés sans succès peuvent être anesthésiés et injectés à nouveau. Dans certains cas, DiI-AcLDL peut être injecté dans un endroit incorrect, auquel cas d'autres organes seront étiquetés ( Figure 3D ). Jeter les embryons injectés incorrectement.
Les vaisseaux sanguins d'un embryon injecté avec succès seront visibles peu de temps après l'injection et la fluorescence dure plusieurs heures. Par conséquent, si l'injection est effectuée avant la formation des ISV, leur développement peut être imagé dans un embryon vivant, fournissant un outil puissant pour étudier le développement du système cardiovasculaire en temps réel et in vivo 4 . Comme Xenopus a été utilisé avec succès comme modèle pour l'analyse vasculaire dDes agents d'isolement chez les mammifères 14 , l'approche expérimentale décrite ici peut être combinée avec des expériences de perturbation pharmacologique et utilisée comme plate-forme de dépistage pour trouver des médicaments qui améliorent ou inhibent l'angiogenèse.
Les vaisseaux sanguins peuvent être visualisés par des outils génétiques, ainsi que par les méthodes d'étiquetage à base de colorant décrites ici. Par exemple, Xenopus 15 transgénique ou poisson zèbre 16 qui expriment des protéines de fluorescence sous le contrôle de promoteurs spécifiques de type cellulaire permettent l'imagerie en direct du sang et des vaisseaux lymphatiques, et il est même possible de discriminer les artères des veines 16 . Bien que les approches génétiques soient supérieures et génèrent une efficacité d'étiquetage plus cohérente, les méthodes basées sur le colorant sont facilement accessibles à la plupart des laboratoires sans accès à de tels animaux génétiquement modifiés. Chez Xenopus , la perfusion transcardiale de DiI-AcLDL entraîne laL'étiquetage de la plupart des cellules endothéliales 4 , et les artères et les veines ne se distinguent pas en images de fluorescence. D'une manière intrigante, la lectine-fluorescéine à la tomate étiquette sélectivement les artères chez la souris et, lorsqu'elle est co-injectée avec DiI-AcLDL, les artères et les veines peuvent être discriminées 17 . Bien que la demande n'a pas été testée dans d'autres tissus ou animaux, cela fournit une direction prometteuse pour étudier le développement dynamique des artères et veines de Xenopus .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette étude a été inspirée par le travail de Levine et al. , Qui décrit cette méthode expérimentale et fournit une description complète du développement vasculaire chez Xenopus laevis. Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur contribution. Cette étude a été soutenue par l'Initiative de recherche de l'Université de Yonsei en 2015 (2015-22-0095) et le Programme de développement de la technologie biologique et médicale de la Fondation nationale de la recherche (NRF) financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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