Summary
Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .
Abstract
I vasi sanguigni forniscono ossigeno e sostanze nutritive in tutto il corpo, e la formazione della rete vascolare è sotto stretto controllo dello sviluppo. L'efficace visualizzazione in vivo dei vasi sanguigni e la quantificazione affidabile della loro complessità sono fondamentali per comprendere la biologia e la malattia della rete vascolare. Qui forniamo un metodo dettagliato per la visualizzazione dei vasi sanguigni con un colorante fluorescente disponibile in commercio, il complesso di Di-AcLDL lipoproteinico a bassa densità acetilato plasmatico umano (DiI-AcLDL) e per quantificare la loro complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere etichettati con una semplice iniezione di Di-AcLDL nel cuore battente di un embrione ei vasi sanguigni in tutto l'embrione possono essere immaginati in embrioni vivi o fissi. Combinata con la perturbazione del gene mediante la microinezione mirata di acidi nucleici e / o l'applicazione del bagno di reagenti farmacologici, i ruoli di un gene o di un percorso di segnalazione sullo sviluppo vascolare possono essere inveStregata entro una settimana senza ricorrere a sofisticati animali geneticamente modificati. A causa del sistema venoso ben definito di Xenopus e della sua angiogenesi stereotipica, lo spruzzo di vasi preesistenti, la complessità dei vasi può essere quantificata in modo efficiente dopo gli esperimenti di perturbazione. Questo protocollo relativamente semplice dovrebbe servire come strumento facilmente accessibile in diversi settori della ricerca cardiovascolare.
Introduction
La vasculogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni delle cellule endoteliali appena nate e l'angiogenesi, la formazione di nuovi vasi da recipienti preesistenti, sono due processi distinti che formano la vasculatura embrionale 1 . Qualsiasi disregolazione in questi processi provoca diverse malattie cardiache e anomalie strutturali delle navi. Inoltre, la crescita tumorale è associata a una crescita incontrollata dei vasi. Come tali, i meccanismi molecolari che sottendono la vasculogenesi e l'angiogenesi sono oggetto di un'intensa ricerca 2 .
Xenopus e zebrafish sono modelli vertebrati attraenti per studi di vasculogenesi e angiogenesi, per diversi motivi. In primo luogo, i loro embrioni sono piccoli; Pertanto, è relativamente facile immaginare l'intera vascolarizzazione. Secondo, lo sviluppo embrionale è rapido; Ci vorranno solo un paio di giorni per sviluppare l'intera vasculatura, durante il quale la vascul in via di sviluppo Può essere ripresa. Terzo, gli interventi genetici e farmacologici prima e durante la formazione della nave sono facili da eseguire, come per esempio attraverso la microinezione di anticorpi nucleotidi morfologici (MOs) nell'embrione in via di sviluppo o attraverso l'applicazione della droga dei farmaci 3 , 4 , 5 .
Il vantaggio unico di Xenopus sullo zebrafish è che le manipolazioni embriologiche possono essere eseguite poiché Xenopus segue scomponi stereotipari olooblastici e la mappa del destino embrionale è ben definita 6 . Ad esempio, è possibile generare un embrione in cui solo un lato laterale viene manipolato geneticamente iniettando un MO antisenso a una sola cellula a due stadi. È anche possibile trapianto il primordio cardiaco da un embrione all'altro per determinare se il gene esercita la sua funzione da un meccanismo intrinseco o extrinsico a celluleAss = "xref"> 7. Anche se queste tecniche sono state sviluppate per lo più in Xenopus laevis , che è allotetraploide e quindi non è ideale per gli studi genetici, possono essere direttamente applicati a Xenopus tropicalis , una specie diploide strettamente correlata 8 .
Un modo per visualizzare la vascolarizzazione in un embrione live Xenopus è quello di iniettare un colorante fluorescente per etichettare i vasi sanguigni. La lipoproteina a bassa densità acetilata (AcLDL) etichettata con una molecola fluorescente come DiI è una sonda molto utile. A differenza di LDL nonacetilato, AcLDL non si lega al recettore LDL 9 ma è endocitata da macrofagi e cellule endoteliali. L'iniezione di DiI-AcLDL nel cuore di un animale vivo produce l'etichettatura fluorescente specifica delle cellule endoteliali e l'intera vascolarizzazione può essere rappresentata mediante microscopia a fluorescenza in embrioni vivi o fissi 4 .
Qui, ci aspettiamoI protocolli dettagliati per la visualizzazione e la quantificazione dei vasi sanguigni usando DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Forniamo punti chiave pratici, con esempi di esperimenti di successo e non riusciti. Inoltre, forniamo un metodo diretto per l'analisi quantitativa della complessità vascolare, che potrebbe essere utile per valutare gli effetti dei fattori genetici e ambientali sulla formazione della rete vascolare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati conformi ai protocolli approvati dai comitati istituzionali di cura e uso degli animali di Yonsei University College of Medicine.
1. Preparazione degli embrioni di Xenopus tropicalis
NOTA: Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati prodotti come descritto in precedenza 10 , con leggera modifica. Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati organizzati secondo le tabelle di Nieuwkoop e Faber 11 .
- Induzione dell'ovulazione
- Per pre-prime, iniettare gonadotropina corionica umana (hCG) nel sacro linfatico dorsale di un paio di rane (un maschio e una femmina) il giorno prima del giorno di accoppiamento. Iniettare 20 unità per rana femminile e 10 unità per maschio. Casa un maschio e una femmina nello stesso carro armato durante la notte (per più di 18 h).
- Per prime, il giorno successivo, iniettare 200 unità di hCG alla femmina pre-primata e 100 unità di hCG al pre-preparatomaschio; La femmina iniziata comincerà a gettare le uova in circa 3 ore e continuerà a farlo per tutta la giornata. Tenere la coppia maschile e femminile insieme per l'accoppiamento naturale o in vasche separate per la fertilizzazione in vitro (punto 1.2).
- Fecondazione
NOTA: Le uova possono essere fertilizzate mediante fertilizzazione naturale o fertilizzazione in vitro . Nell'accoppiamento naturale, le uova vengono fecondate in quanto sono state posate, e quindi il tempo della fecondazione non può essere controllato. In alternativa, una rana femminile iniziata può essere alloggiata in un serbatoio separato e le uova non fertilitate possono essere raccolte per la fecondazione in vitro , che genera centinaia di embrioni fertilizzati allo stesso tempo. Quest'ultimo approccio è utile quando viene effettuata la microinezione a blastomere prima dell'etichettatura dei recipienti. In questo approccio, tuttavia, un maschio viene sacrificato.- Accoppiamento naturale
- Lasciare la coppia primaria femminile e maschile nello stesso serbatoio. Il maschio stringerebbe la fEmale, che porta alla fecondazione immediata delle uova posate. Raccogliere le uova con una pipetta di vetro o di plastica e trasferirle in un piatto di Petri. Per evitare che le uova si attaccino alla pipetta, stendere la superficie interna della pipetta con 0,5% di albumina bovina secca (BSA).
- Fecondazione in vitro (IVF)
- Separare la femmina primed dal maschio dopo la priming. La femmina comincerà a posare le uova spontaneamente in circa 3 ore. Trasferire alcune uova posate usando una pipetta BSA-rivestita in un piatto di Petri e controllare la loro qualità sotto un microscopio. Se sono state posate uova sane (pigmento trasparente, palla a forma di elastico), preparatevi a disseccare i testicoli dal maschio primato.
- Crea 0,4% di metanesolfonato di tricaina (MS222) per l'eutanasia e inietta 300 μL nel sacro linfatico dorsale del maschio primogenito. In circa 10 minuti, il maschio perderà il suo senso di equilibrio e rimarrà a galla; Confermare che il maschio è eutanizzato premendo una gamba posteriore con aDue pinze sbilanciate e osservando nessuna risposta.
- Disseccare i due testicoli, pulirli tagliandoli velocemente su carta sporca e trasferirli in un microtubo contenente 1 ml del 60% di Leibovitz L-15 Medium (60%) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS); Una procedura dettagliata è descritta altrove 10 .
- Mescolare delicatamente i testicoli con un pestello per estrarre lo sperma. A questa concentrazione ( cioè 2 teste in 1 ml di 10% di FBS in 60% di L-15), alcune gocce della soluzione testica (0,1 ml) possono concimare circa trecento uova. Lo sperma rimanente può essere conservato a 4 ° C in un tubo ben sigillato e usato per il IVF il giorno successivo.
- Spremere le uova dalla femmina in un piccolo piatto di Petri. Tenere la parte superiore della femmina a testa in giù sulla palma e mettere l'indice tra le gambe posteriori. Diffondere le gambe posteriori con l'indice e l'altra mano per esporre la cloaca. Tocca la cloaca al piatto di Petri. Coat tPiatto di Petri con 0,5% BSA per distribuire uniformemente le uova come monostrato durante l'IVF.
- Aggiungere le gocce (0,1 mL) di substrato contenente spermatozoi L-15 alle uova. Per la fecondazione sincrona, mescolare delicatamente la soluzione spermatica attraverso il piatto. Dopo 4 minuti a temperatura ambiente, riempire il piatto di Petri con 0.01x Saline modificata di Barth (MBS), incubare per 10 minuti e sostituire la soluzione con 0.1x MBS. Le uova fecondate subiranno la prima scissione in circa 1 ora a temperatura ambiente. 1x MBS è 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO 3 , 5 mM HEPES, 1 mM MgSO 4 e 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
- Accoppiamento naturale
- (Facoltativo) Iniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso (MOs) e / o mRNA
- Per studiare l'effetto di un gene di interesse sulla formazione della nave, eseguire la microinezione di antisense MO e / o mRNA.
- Per tali esperimenti, de-gelatina le uova con 2% di L-cisteina in 1x MBS (pH 7,5-7,8).Sostituire 0,1 x MBS nel piatto contenente gli embrioni fecondati con 2% di L-cisteina in 1x MBS. Versare delicatamente il piatto per mescolare la soluzione.
NOTA: richiede solitamente circa 5 minuti per l'eliminazione degli embrioni. Durante questo passaggio, monitorare spesso le uova per assicurarsi che non siano esagerate alla soluzione. Se le uova sono esposte, perdono elasticità e diventano appiattite, che provocheranno uno sviluppo aberrante e una letalità. - Lavare le uova de-jellied cinque volte con 0.1x MBS. Eseguire la microinezione nel 4% di Ficoll disciolto in 0.1x MBS. In genere, iniettare 4 ng di MO e 600 pg di mRNA per blastomere alla fase a due cellule. Iniettare in una sola cellula per manipolare l'espressione genica solo su un lato dell'embrione. Usa il lato iniettato dello stesso embrione come un controllo.
- Come un altro controllo per la specificità della manipolazione genica, iniettare la stessa quantità di un controllo MO (CoMO) o mRNA di controllo ( ad esempio, beta-galattosidasi mRNA). CoMO deve avere lo stesso mPeso olecolare come MO specifico per i geni e non deve indirizzare alcun gene nel genoma di Xenopus . Per una facile visualizzazione del lato iniettato, utilizzare MO con taglio a fluoresceina o co-iniettare un tracciante ( es. EGFP mRNA).
- Lasciare gli embrioni iniettati nel 4% di Ficoll per 2 ore e poi trasferirli in un nuovo piatto di Petri da 60 mm riempito di 0,1 x MBS.
- raccolta
- Sollevare gli embrioni a 23 ° C. Anche se la velocità di sviluppo può essere rallentata o accelerata utilizzando temperature inferiori o superiori a 23 ° C (range: 16-26 ° C), si raccomanda di sollevare a 23 ° C.
- (Facoltativo) Trattamento con reagenti farmacologici
- Per manipolazioni farmacologiche, somministrare farmaci agli embrioni in via di sviluppo mediante applicazione di bagno.
2. Preparazione dell'iniezione DiI-AcLDL
- Creare una pipetta di vetro conica utilizzando un micr standardEstrattore opiper. Posizionare un tubo di vetro borosilicato nel tirante della micropipetta e utilizzare le seguenti impostazioni: pressione, 200; Calore, 30; Tirare, 30; Velocità, 120; Tempo, 200.
- Conservare la soluzione di base di Di-AcLDL a 4 ° C. Prendi la parte superiore libera della soluzione per l'iniezione, ma non le particelle precipitate sul fondo del tubo. Eventuali detriti nella pipetta di vetro disturberanno la corretta espulsione della soluzione.
- Riempire la pipetta di vetro preparata con una quantità adeguata di soluzione DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando un microelaboratore.
- Spingere la punta della pipetta di vetro a poco a poco usando un paio di pinze (numero 55). Impostare il sistema di iniezione controllato dalla pressione in modo che circa 5 nL di soluzione venga espulsa alla volta; 50-60 nL di DiI-AcLDL è sufficiente per macchiare i vasi di un embrione.
- Non lasciare in aria la pipetta caricata da DiI-AcLDL per un lungo periodo di tempo per evitare l'essiccazione. Tenere la punta della pipetta sommersa in 0,04% MS222 in soluzione 0.1S MBS. Poco prima di iniettarlo nell'embrione (passo 4.2.1), verificare se la stessa quantità di colorante viene espulsa.
3. Impostazione dell'iniezione
- Stampo di Sylgard
- Per preparare un piccolo stampo Sylgard, mescolare la base Sylgard e l'agente di stiro con un rapporto di peso compreso tra 10 e 1. Riempire con questa soluzione mista circa la metà di un piccolo piatto di Petri (piatto da 35 mm o 60 mm) e lasciarlo solidificare per circa 48 h a temperatura ambiente.
- Anestesia
- Utilizzare 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) per l'anestesia. Quando è necessaria una lunga anestesia ( ad es. Durante l'imaging in diretta), utilizzare 0.04% MS222 in 0.1x MBS per ridurre lo squilibrio osmotico. Per regolare il pH, aggiungere alcune gocce di NaOH (~ 20 μL) e controllare il pH utilizzando carta pH.
- Attendere finché gli embrioni trasferiti non si muovono. Toccare le alette dorsali degli embrioni e verificare se rispondono per confermare la completa anesthesia.
- Posizionamento degli embrioni per iniezione
- Inserisci la superficie dello stampo temprato Sylgard con una lama sottile e affilata. Fare un indentazione concava a forma di V in cui collocare gli embrioni (vedere la Figura 2D ). Posizionare un embrione anestetizzato, con l'aspetto ventrale, in modo leggermente obliquo (circa 30 °) ( Figura 2D ).
- Riempire lo stampo con la soluzione MS222 e collocare gli embrioni nello stampo.
4. Iniezione DiI-AcLDL
- Incisione della pelle che sovrasta il cuore
- Preparare due perni (Minutiens, 0,10 mm) per tagliare la pelle sovrastante il cuore. Fissare bene ogni perno ad un porta-pin; Il cuore deve essere facilmente identificabile mentre pulsava ( Figura 2A-2C , rosa).
- Puntare la pelle di un embrione con un perno. Inserire il perno attraverso il foro nello spazio tra il cuore e la pelle ( Figura 2C
- Effettuare un'incisione lineare strofinando delicatamente l'altro perno tenuto fuori dalla pelle contro il perno inserito. Estendete delicatamente questa incisione con due punte, esponendo il cuore ( figura 2B ' e 2D' , freccia). La pipetta caricata con DiI-AcLDL può ora avvicinarsi direttamente al cuore ( figura 2D ' ).
- Iniezione
- Inserire la punta della pipetta di vetro caricata nel cuore e iniettare 50-60 nL di soluzione DiI-AcLDL in circa 10 impulsi di espulsione. Non iniettare una quantità eccessiva di soluzione, in quanto provoca il rottura del cuore. Controllare se il cuore continua a battere dopo l'iniezione. Dopo ogni iniezione, controllare se venga espulsa la stessa quantità di DiI-AcLDL; Altrimenti, la punta della pipetta può essere bloccata (vedere passo 2.5).
- Trasferite gli embrioni iniettati in un nuovo piatto di Petri riempito di 0,1x MBS per il recupero. Dopo 5-10 minuti, i tadpoles dovrebbero riconquistare la coscienza e iniziare a muoversi. A questo punto le imbarcazioni contrassegnate possono essere riprese. Si raccomanda di visualizzare visivamente embrioni con etichettatura con successo con un microscopio a fluorescenza ( Figura 3A e 3B ). Se una quantità insufficiente di DiI-AcLDL viene iniettata in un embrione, può essere nuovamente iniettata ( Figura 3C ).
- Scartare i tadpoles che hanno altri organi etichettati ( Figura 3D ). Continuare fino a ottenere il numero richiesto di embrioni con etichettatura con successo.
- Per una più approfondita imaging dei vasi sanguigni, utilizzare la microscopia confocale; Potrebbe essere più facile fissare gli embrioni etichettati per la microscopia confocale. Prima di anestetizzare gli embrioni etichettati in 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) e poi fissarli in 4% di paraformaldeide in 1X salina fosfato-tamponata (PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni fissi possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C; Proteggere i campioni iniettati dalla luce per evitare la fotolibrazione del DiI.
5. Imaging di DiI-AcLDL
- Imaging stereoscopico
- Scattare fotografie sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza ( Figura 3 ) per valutare la morfologia complessiva della vasculatura.
- Sciogliere 1% agarosio in 1x PBS per embrioni fissi o in 1x MBS per imaging live. Versate l'agarosio fuso in un piatto di Petri e aspettate che si solidifichi. Effettuare una indentazione poco profonda sulla superficie del gel agarosico che si adatta all'embrione da imaging quando si trova sul lato laterale. Riempire il piatto con tampone (soluzione MS222 per embrioni anestetizzati o 1x PBS per embrioni fissi).
- Microscopia a fluorescenza (Rhodamine filter set)
- Poichè DiI è un colorante verde emesso e emesso di rosso, l'immagine utilizza un set di filtri standard per rodamine o fluorofori spettrali collegati (massima eccitazione a 554 nm e emissione a 571 nm). Posizionare gli embrioni iniettati negli indentazioni dello stampo agarosio e fotografare ( Figura 3 ).
- Microscopia confocale
NOTA: Per un'analisi più approfondita dell'architettura vascolare, utilizzare la microscopia confocale.- Se si utilizza un microscopio invertito, posizionare gli embrioni su un piatto in vetro. Aggiungere alcune gocce di 1x PBS e immobilizzarle mettendo un coperchio di copertura sulla parte superiore. Rimuovere l'eccesso di PBS. Se si devono immaginare embrioni vivi, utilizzare embrioni anestetizzati e utilizzare 0.015% MS222 in 0.1x MBS anziché PBS.
- Per l'imaging a basso ingrandimento, utilizzare un obiettivo 4X a 10X per trovare l'area di interesse; La parte rostrale della vena cardinale posteriore (PCV) è una regione utile per indagare l'angiogenesi dello sviluppo (Figura 4, tratteggiatascatole).
- Utilizzare un'impostazione di acquisizione per un fluoroforo di emissione rossa (come Rhodamine).
- Effettuare immagini z-stacked facendo imaging la metà laterale di un embrione. Innanzitutto, concentrarsi sul PCV sul lato laterale vicino all'obiettivo e quindi impostare il limite inferiore del fuoco nella posizione in cui i vasi più vicini all'obiettivo sono concentrati. Impostare il limite superiore nella posizione in cui la parte mediale del PCV in scansione può essere focalizzata. Immagine l'intera metà laterale dell'embrione. Utilizzare software che memorizza i metadati sulle impostazioni di acquisizione, ad esempio le scale x, y e z, in quanto sono necessarie per calcolare le lunghezze del vaso.
- Se necessario, utilizzare la modalità di scansione delle mattonelle per rappresentare l'intera vasculatura di un embrione. Determinare empiricamente il numero di piastrelle orizzontali e verticali.
- Per l'imaging ad alta ingrandimento, seguire le procedure sopra descritte per rappresentare la parte rostrale del PCV e delle 4 vene rostral-intersomitiche (ISV) ( Figura 4 ,Casella tratteggiata). Regolare il numero di stack (z-stack) e delle piastrelle (scansione delle piastrelle) in modo appropriato.
6. Quantificazione delle navi con marchio DiI
NOTA: Le navi con marchio DiI possono essere tracciate manualmente o utilizzando software. Utilizziamo un semplice tracciatore di neurite, un plugin gratuito ImageJ (NIH), che consente il tracciamento semi-automatico di strutture tubolari come i vasi sanguigni e le neurite 12 . Utilizzando questo software libero, è possibile calcolare i seguenti parametri. Una procedura dettagliata per l'utilizzo di questo software è descritta altrove (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Sotto, usiamo esempi della vasculatura di embrioni in cui la segnalazione Tie2 è inibita o migliorata ( Figura 4A-4C ) 5 . L'esposizione di embrioni iniettati da Antisense Tie2MO riduce l'angiogenesi e riduce gli ISV ( Figura 4B ), mentre la coinezione di Tie2 costitutivamente attivaL'mRNA mutante (caTie2 mRNA) sovrascrive questo fenotipo, provocando rami esuberanti di ISV ( Figura 4C ).
- Lunghezze ISV
- Usando il semplice tracciatore neurite, calcolare la lunghezza di ogni vaso tracciato. Calcola le lunghezze dei 4 ISV più rostral.
- Fili ISV
NOTA: Negli embrioni di tipo selvatico, solo alcuni rami corti germinano dai più severi ISV di rostral alla fase 42.- Nel semplice tracciante Neurite traccia questi piccoli vasi dopo aver fatto l'ISV da cui provengono il ramo primario. Calcolare i seguenti parametri di queste filiali provenienti dagli ISV.
- Numero totale del ramo
- Una volta che tutti i ISV ei rami associati sono tracciati, calcolare il numero totale di rami ( Figura 5B-5D ).
- Ordine di filiale
- Come semplice tracciante Neurite registra l'ordine di ogni ramo ( Figura 5A ), calcolareE il numero di rami per ogni ordine. La maggioranza delle navi in embrioni di tipo selvatico dovrebbe essere rami primari ( cioè ISV).
- Indice di complessità delle vene (VCI)
- Poiché VCI è un parametro utile per la complessità delle vasche, che dà maggiore peso ai rami di ordine superiore, calcolare il VCI per ogni embrione utilizzando la formula nella figura 5A . Ad esempio, gli embrioni iniettati da Tie2MO hanno un VCI più basso rispetto al controllo ( Figura 5B e 5C ) e gli embrioni iniettati con mTG2 hanno un VCI più elevato ( Figura 5D ).
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Representative Results
Timeline degli esperimenti (figure 1 e 2)
Poco dopo la fecondazione, si può eseguire una microinezione mirata per modulare l'espressione genica. Ad esempio, un MO antisensivo che si lega specificamente al codone di iniziazione del mRNA Tie2 endogeno può essere iniettato, inibendo la traduzione del mRNA di bersaglio Tie2 da ostacoli sterici. Un MO può essere coniugato alla fluoresceina per una facile visualizzazione degli embrioni iniettati con successo. In alternativa, un mRNA tracciante ( ad es., MRNA codificante EGFP) può essere co iniettato con MO. Inoltre, le droghe possono essere trattate con l'applicazione del bagno dopo la coitura (fase iniziale del tailbud, attorno alla fase NF 26). Sciogliere il farmaco in 0,1x MBS e aggiungerlo agli embrioni. Per un trattamento precedente, gli embrioni possono essere liberati dalle membrane con una coppia di pinze. DiI-AcLDL può essere iniettato nel cuore intorno alla fase 33/34 per esaminare la dinamica della forma del vasoMa tipicamente iniettiamo a livello 37/38 o successivo ( Figura 2 , regioni colorate).
Esempi tipici di iniezioni riuscite e non riuscite (punto 4.3) (Figura 3)
L'imaging stereoscopico è appropriato per lo screening visivo. Se una quantità sufficiente di DiI-AcLDL viene iniettata nel cuore, il PCV deve essere immediatamente visibile sotto uno stereoscopio a fluorescenza ( Figura 3A e 3B ). Gli embrioni iniettati in modo insufficiente o errato sono facilmente identificabili ( Figura 3C e 3D ). Gli embrioni con una quantità insufficiente di DiI-AcLDL ( Figura 3C ) possono essere nuovamente iniettati con lo stesso colorante fino a quando le vaschette sono chiaramente visibili. L'immagine ha iniettato con successo embrioni sotto un microscopio confocale, vivo o dopo la fissazione.
Sviluppo dei posteriO la vena cardinale (PCV) e le vene intersomite (ISV)
Il PCV si estende nella direzione rostale-caudale, e questa estensione termina attorno alla fase 37/38. I ISV emergono dorsalmente dal PCV in un'onda anteriore-posteriore. Questa onda di formazione ISV inizia nella fase 36 e termina attorno alla fase 40/41; Gli ISV continuano a crescere e diventano leggermente ramificati fino alla fase 43 ( Figura 3A e 3B ).
Il segnalamento Tie2 controlla la ramificazione dello sviluppo ISV (Figura 4)
I PCV e gli ISV crescono in un modello stereotipo e il loro sviluppo è sotto stretto controllo ( Figura 4A ). La formazione degli ISV dal PCV può essere descritta come angiogenesi, e quindi è un modello utile per indagare i meccanismi molecolari alla base dell'angiogenesi. Introduciamo il risultato del nostro recente studio showiNg che i segnali di sviluppo inibiscono la segnalazione Tie2 in ISV per limitare la loro ramificazione 5 . La rottura del segnale Tie2 da parte di antisense MO diminuisce la lunghezza e la complessità degli ISV (Figura 4B) e l'espressione della forma attiva costitutiva di Tie2 (caTie2) provoca eccessive ramificazioni ISV ( Figura 4C ).
Quantificazione della complessità dell'ISV (Figura 5)
Oltre alle lunghezze ei numeri delle filiali degli ISV, è possibile calcolare l'indice di complessità delle vene (VCI) per valutare la loro complessità ( Figura 5A ). Abbiamo adottato il "indice di complessità" sviluppato da Cohen-Cory e colleghi, che è stato progettato per quantificare la complessità degli archi axonali o dendritici neuronali 13 . In questo indice, un embrione con più rami di alto ordine riceve un punteggio più alto di un embrione con lo stesso numero di crusca totaleMa con più rami di basso ordine. Pertanto, un VCI più alto indica che questo embrione ha una rete venosa più complessa. "Semplice tracciatore di neuriti" è un software utile per tenere traccia dell'ordine e della lunghezza dei singoli rami. È inoltre possibile generare "percorsi resi", che è un modo utile per visualizzare l'architettura complessiva della vasculatura ( figure 5B-5D , pannelli a destra).
Figura 1: Timeline degli esperimenti. Il giorno della fecondazione, morpholinos (MOs), DNA, RNA o proteine possono essere iniettati in uova fecondate alla fase 1 di NF (st1) o 2 (st2). Se iniettato solo in uno blastomere a st2, il reagente iniettato influenzerà solo un lato laterale. Il lato non iniettato può essere utilizzato come controllo. Co-iniettare un tracciante ( es. EGFP mRNA) per identificare il lato iniettato. Il secondo giorno, eaGli embrioni di stadio in fase di ritardo (~ st24) possono essere trattati con reagenti farmacologici mediante l'applicazione del bagno. Il cuore è chiaramente visibile il terzo giorno. DiI-AcLDL può essere iniettato nel cuore e i vasi sanguigni possono essere imaged subito dopo l'iniezione. Usi gli embrioni st33-37 per descrivere le dinamiche della crescita dei vasi o degli embrioni st42 a vaschette pienamente sviluppate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Posizione dell'iniezione DiI-AcLDL a st42. Viste laterali ( AB ' ) e ventrale ( CD ) della fase 42 embrione. Il cuore è colorato in rosa in AC , in immagini tratte da Xenbase (www.xenbase.org). Le immagini stereoscopiche rappresentative sono mostrate in A ' ,
Figura 3: Risultati attesi (immagini stereoscopiche). Immagini rappresentative di fluorescenza da embrioni di fase 37/38 ( A ) e fase 42 ( B ). Sono mostrati i lati sinistro degli embrioni. La vena cardinale posteriore (PCV) si estende caudalmente, da cui le vene intersomite (ISV) si ramificano dorsalmente in un wav rostral-caudalee. Solo gli ISV rostrali sono visibili alla fase 37/38 ( A ), e la maggior parte dei ISV sono formati dalla fase 42 ( B ). Se viene iniettata una quantità insufficiente di DiI-AcLDL, il PCV non sarà chiaramente visibile, anche dopo 30 minuti ( C ). In questo caso, è possibile iniettare più DiI-AcLDL. Se DiI-AcLDL viene accidentalmente iniettato in altri organi ( D ), scartare gli embrioni. Barra di scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti del segnale Tie2 sullo sviluppo ISV. L'espressione del gene Tie2 è stata abbattuta dall'iniezione di blastomere di oligonucleotidi morfologici antisensanti (Tie2MO). Il controllo morpholino (CoMO) ha lo stesso peso molecolare, ma ne nOt bersaglio qualsiasi gene in Xenopus tropicalis . Il mutante Tie2 (caTie2), che codifica mRNA, è stato co-iniettato per salvare il fenotipo di abbattimento Tie2. A differenza del controllo ( A ), l'iniezione di Tie2MO ha portato ad una drastica diminuzione della lunghezza e del numero di ISV ( B ). Questo fenotipo è stato eccessivamente salvato da caTie2, che ha mostrato ISV con rami collaterali esuberanti ( C ). La complessità di ISV in regioni indicata con scatole a tazze blu è quantificata in Figura 5. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione della complessità delle vene. ( A ) La complessità dell'ISV può essere rappresentata dall'indice della complessità delle vene (VCI).( BD ) VCI sono stati calcolati dagli embrioni mostrati in Figura 4. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato è stato innanzitutto sviluppato da Ali H. Brivanlou e colleghi per indagare gli eventi di sviluppo durante la formazione vascolare in Xenopus laevis 4 , ma, come mostrato in questo manoscritto, può essere applicato ad altri piccoli animali. L'iniezione di tintura nel cuore è semplice da eseguire, e l'intera rete vascolare può essere ripresa in un microscopio di dissezione a fluorescenza, così come un microscopio confocale. Se il colorante viene iniettato nel cuore durante lo sviluppo del vaso, la dinamica della crescita e della ramificazione dei vasi può essere ripresa in tempo reale 4 . Utilizzando la rete venosa ben definita, in particolare i PCV e gli ISV più rostrali, possono essere valutati quantitativamente gli effetti della perturbazione genetica o ambientale sull'angiogenesi.
Il passaggio più critico in questo protocollo è l'iniezione di DiI-AcLDL (fase 4). Forniamo esempi di iniezioni riuscite e non riuscite ( Fi3). Gli embrioni iniettati con successo devono essere sottoposti a screening sotto un microscopio a fluorescenza, come descritto nel punto 4.3. Se il PCV non è visibile 30 minuti dopo l'iniezione, non è stata iniettata sufficiente DiI-AcLDL ( Figura 3C ). Gli embrioni iniettati senza successo possono essere anestetizzati e iniettati di nuovo. In alcuni casi, DiI-AcLDL può essere iniettato in una posizione errata, nel qual caso altri organi saranno etichettati ( Figura 3D ). Scartare embrioni iniettati erroneamente.
I vasi sanguigni di un embrione iniettato con successo saranno visibili poco dopo l'iniezione e la fluorescenza dura per diverse ore. Pertanto, se l'iniezione viene eseguita prima della formazione di ISV, il loro sviluppo può essere rappresentato in un embrione vivo, fornendo un potente strumento per indagare lo sviluppo del sistema cardiovascolare in tempo reale e in vivo 4 . Poiché Xenopus è stato utilizzato con successo come modello per la visualizzazione del vascolareAgenti che irrompono nei mammiferi 14 , l'approccio sperimentale descritto qui potrebbe essere combinato con esperimenti di perturbazione farmacologica e utilizzato come piattaforma di screening per trovare farmaci che aumentano o inibiscono l'angiogenesi.
I vasi sanguigni possono essere visualizzati con strumenti genetici, così come con i metodi di etichettatura a base di coloranti descritti qui. Ad esempio, il Xenopus 15 o il pesce zebra transgenico 16 che esprimono proteine di fluorescenza sotto il controllo di promotori specifici di tipo cellulare consentono l'imaging in tensione di vasi sanguigni e linfatici e è anche possibile discriminare le arterie dalle vene16. Sebbene gli approcci genetici siano superiori e generino un'efficienza di etichettatura più consistente, i metodi a base di coloranti sono facilmente accessibili alla maggior parte dei laboratori senza l'accesso a tali animali geneticamente modificati. In Xenopus , la perfusione transcartica di DiI-AcLDL determina il risultatoL'etichettatura della maggior parte delle cellule endoteliali 4 e le arterie e le vene non sono distinguibili nelle immagini di fluorescenza. Intriguamente, la lectin-fluorescein del pomodoro selettivamente etichetta le arterie nei topi e quando co-iniettato con DiI-AcLDL, le arterie e le vene possono essere discriminate 17 . Anche se l'applicazione non è stata testata in altri tessuti o animali, questo fornisce una direzione promettente per indagare lo sviluppo dinamico delle arterie e delle vene in Xenopus .
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato ispirato dall'opera di Levine et al. , Che descriveva questo metodo sperimentale e forniva una descrizione completa dello sviluppo vascolare in Xenopus laevis. Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per il loro contributo. Questo studio è stato sostenuto dall'iniziativa di ricerca futura diretta dell'università di Yonsei 2015 (2015-22- 0095) e dal Programma di Sviluppo Tecnologico Bio & Medical della Fondazione Nazionale di Ricerca (NRF) finanziato dal Ministero della Scienza, delle TIC e del Futuro Pianificazione ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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