Summary
Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .
Abstract
Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes em todo o corpo, ea formação da rede vascular está sob controle de desenvolvimento apertado. A eficiente visualização in vivo dos vasos sanguíneos e a quantificação fiável da sua complexidade são fundamentais para a compreensão da biologia e da doença da rede vascular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para visualizar vasos sanguíneos com um corante fluorescente comercialmente disponível, complexo DiI de lipoproteína de baixa densidade acetilada no plasma humano (DiI-AcLDL) e para quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser marcados por uma simples injeção de DiI-AcLDL no coração batendo de um embrião, e os vasos sanguíneos em todo o embrião podem ser visualizados em embriões vivos ou fixos. Combinado com a perturba�o gen�ica pela microinjec�o direccionada de �idos nucleicos e / ou a aplica�o em banho de reagentes farmacol�icos, as fun�es de um gene ou de uma via de sinaliza�o no desenvolvimento vascular podem ser inveStigated dentro de uma semana sem recorrer a sofisticados animais geneticamente modificados. Devido ao sistema venoso bem definido de Xenopus e sua angiogênese estereotipada, o surgimento de vasos pré-existentes, complexidade vascular pode ser quantificado eficientemente após experimentos de perturbação. Este protocolo relativamente simples deve servir como uma ferramenta facilmente acessível em diversos campos da investigação cardiovascular.
Introduction
A vasculogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de células endoteliais recém-nascidas ea angiogênese, a formação de novos vasos de vasos pré-existentes, são dois processos distintos que moldam a vasculatura embrionária 1 . Qualquer desregulação nestes processos resulta em várias doenças cardíacas e anormalidades estruturais dos vasos. Além disso, o crescimento tumoral está associado com o crescimento descontrolado do vaso. Como tal, os mecanismos moleculares subjacentes à vasculogênese e à angiogênese são objeto de intensa investigação 2 .
Xenopus e zebrafish são modelos de vertebrados atraentes para estudos de vasculogênese e angiogênese, por várias razões. Primeiro, seus embriões são pequenos; Portanto, é relativamente fácil imaginar toda a vasculatura. Em segundo lugar, o desenvolvimento embrionário é rápido; Leva apenas um par de dias para toda a vasculatura desenvolver, durante o qual o desenvolvimento vascular Pode ser visualizada. Em terceiro lugar, as intervenções genéticas e farmacológicas antes e durante a formação do vaso são fáceis de realizar, como por meio da microinjeção de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) no embrião em desenvolvimento ou através da aplicação do banho de fármacos 3 , 4 , 5 .
A vantagem única de Xenopus sobre o peixe-zebra é que as manipulações embriológicas podem ser realizadas porque Xenopus segue clivagens holoblásticas estereotipadas eo mapa de destino embrionário é bem definido 6 . Por exemplo, é possível gerar um embrião em que apenas um lado lateral é geneticamente manipulado por injecção de um MO anti-sentido a uma célula no estádio de duas células. É também possível transplantar o primórdio cardíaco de um embrião para outro para determinar se o gene exerce a sua função por um mecanismo intrínseco ou -extrínseco da célulaAss = "xref"> 7. Embora essas técnicas tenham sido desenvolvidas principalmente em Xenopus laevis , que é alotetraplóide e, portanto, não é ideal para estudos genéticos, elas podem ser aplicadas diretamente a Xenopus tropicalis , uma espécie diploide estreitamente relacionada 8 .
Uma forma de visualizar a vasculatura num embrião vivo de Xenopus é injectar um corante fluorescente para marcar os vasos sanguíneos. A lipoproteína de baixa densidade acetilada (AcLDL) marcada com uma molécula fluorescente tal como DiI é uma sonda muito útil. Ao contrário da LDL não acetilada, a AcLDL não se liga ao receptor LDL 9, mas é endocitados por macrófagos e células endoteliais. A injecção de DiI-AcLDL no coração de um animal vivo resulta na marcação fluorescente específica das células endoteliais, e toda a vasculatura pode ser visualizada por microscopia de fluorescência em embriões vivos ou fixos 4 .
Aqui, nós presProtocolos detalhados para a visualização e quantificação de vasos sanguíneos usando DiI-AcLDL em Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Fornecemos pontos-chave práticos, com exemplos de experiências bem sucedidas e mal sucedidas. Além disso, fornecemos um método direto para a análise quantitativa da complexidade vascular, que pode ser útil na avaliação dos efeitos de fatores genéticos e ambientais na formação da rede vascular.
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Protocol
Todos os experimentos obedeceram a protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Yonsei.
1. Preparação de Xenopus tropicalis Embryos
NOTA: Os embriões de Xenopus tropicalis foram produzidos como descrito anteriormente 10 , com ligeira modificação. Os embriões de Xenopus tropicalis foram encenados de acordo com as tabelas de Nieuwkoop e Faber 11 .
- Indução da ovulação
- Para pré-primário, injetar gonadotropina coriônica humana (hCG) no saco linfático dorsal de um par de rãs (um macho e uma fêmea) no dia anterior ao dia do acasalamento. Injectar 20 unidades por rã fêmea e 10 unidades por macho. Casa um macho e uma fêmea no mesmo tanque durante a noite (por mais de 18 h).
- Para iniciar, no dia seguinte, injetar 200 unidades de hCG para a fêmea pré-preparada e 100 unidades de hCG para o pré-fermentadomasculino; A fêmea iniciada começará a pôr ovos em aproximadamente 3 h e continuará a fazê-lo durante todo o dia. Manter o par macho e fêmea juntos para acasalamento natural ou em tanques separados para fertilização in vitro (passo 1.2).
- Fertilização
NOTA: Os ovos podem ser fertilizados por acasalamento natural ou fertilização in vitro . No acasalamento natural, os ovos são fertilizados como eles são colocados, e, portanto, o momento da fertilização não pode ser controlada. Alternativamente, uma rã fêmea preparada pode ser alojada num tanque separado e os ovos não fertilizados podem ser recolhidos para fertilização in vitro , o que gera centenas de embriões fertilizados ao mesmo tempo. A última abordagem é útil quando a microinjecção dirigida a blastómeros será realizada antes da marcação do vaso. Nesta abordagem, no entanto, um macho é sacrificado.- Acasalamento natural
- Deixe o par preparado fêmea e macho no mesmo tanque. O macho fecho a fLevando à fertilização imediata dos ovos postos. Recolher os ovos com uma pipeta de vidro ou plástico e transferi-los para uma placa de Petri. Para evitar que os ovos fiquem presos à pipeta, revestir a superfície interna da pipeta com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA).
- Fertilização in vitro (FIV)
- Separar o macho aprisionado do macho após a iniciação. A fêmea começará a pôr os ovos espontaneamente em aproximadamente 3 h. Transferir alguns ovos colocados usando uma pipeta revestida com BSA para uma placa de Petri e verificar a sua qualidade sob um microscópio. Se os ovos saudáveis (pigmento claro, elástico em forma de bola) foram colocados, prepare-se para dissecar os testículos do macho preparado.
- Faça 0,4% de metanossulfonato de Tricaine (MS222) para a eutanásia e injete 300 μL no saco linfático dorsal do macho preparado. Em aproximadamente 10 min, o macho perderá seu senso de equilíbrio e permanecerá à tona; Confirmar que o macho é eutanizado por beliscar uma perna traseira com umaPar de fórceps rombos e observando nenhuma resposta.
- Dissecar os dois testículos, limpá-los rapidamente batendo-os em papel sem fiapos e transferi-los para um microtubo contendo 1 mL de 60% de Leibovitz's L-15 Medium (60%) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS); Um procedimento detalhado é descrito em outra parte 10 .
- Mergulhe suavemente os testículos com um pilão para extrair o esperma. Nesta concentração ( isto é, 2 testículos em 1 mL de FBS a 10% em 60% de L-15), algumas gotas da solução de testículo (0,1 mL) podem fertilizar cerca de 300 ovos. O esperma restante pode ser armazenado a 4 ° C em um tubo hermeticamente fechado e usado para FIV no dia seguinte.
- Esprema os ovos da fêmea em uma pequena placa de Petri. Segure a parte superior da fêmea de cabeça para baixo na palma da mão e coloque o indicador entre as patas traseiras. Espalhe as patas traseiras com o dedo indicador e a outra mão para expor a cloaca. Toque a cloaca para a placa de Petri. CasacoEle prato de Petri com 0,5% de BSA para distribuir uniformemente os ovos como uma monocamada durante a FIV.
- Adicionar algumas gotas (0,1 mL) de espermatozóide contendo L-15 meio para os ovos. Para fertilização síncrona, mexa suavemente a solução de esperma através do prato. Após 4 min à temperatura ambiente, encher a placa de Petri com 0,01x de solução salina de Barth modificada (MBS), incubar durante 10 min e substituir a solução por 0,1 x MBS. Os ovos fertilizados sofrerão a primeira clivagem em aproximadamente 1 h à temperatura ambiente. 1x MBS é NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO3 2,5 mM, HEPES 5 mM, MgSO4 1 mM e CaCl2 0,7 mM, pH 7,5.
- Acasalamento natural
- (Opcional) Injec�o de oligonucle�idos (MOs) e / ou ARNm morfolino anti-sentido
- Para investigar o efeito de um gene de interesse na formação de vasos, efectuar a microinjecção de MO e / ou mRNAs anti-sentido.
- Para tais experi�cias, desengorduram os ovos com 2% de L-ciste�a em 1x MBS (pH 7,5-7,8).Substituir 0,1x MBS no prato contendo os embriões fertilizados com 2% de L-cisteína em 1x MBS. Agitar suavemente o prato para misturar a solução.
NOTA: Geralmente leva cerca de 5 min para que os embriões sejam desjelados. Durante esta etapa, monitorar os ovos com freqüência para garantir que eles não estão sobre-expostos à solução. Se os ovos são sobre-expostos, eles vão perder elasticidade e tornar-se achatado, o que irá causar desenvolvimento aberrante e letalidade. - Lavar os ovos de gelatina cinco vezes com 0,1 x MBS. Realizar a microinjeção em Ficoll 4% dissolvido em 0,1x MBS. Tipicamente, injectar 4 ng de MO e 600 pg de mRNA por blastómero no estádio de duas células. Injetar em uma célula para manipular a expressão gênica em apenas um lado do embrião. Use o lado não injetado do mesmo embrião como um controle.
- Como outro controlo para a especificidade da manipulação de genes, injetar a mesma quantidade de um controlo MO (CoMO) ou ARNm de controlo ( eg, mARN de beta-galactosidase). CoMO deve ter o mesmo mOlecular como o MO específico do gene e não deve alvejar nenhum gene no genoma de Xenopus . Para visualização fácil do lado injetado, use MO marcado com fluoresceína ou co-injeção de um marcador ( eg, EGFP mRNA).
- Deixar os embriões injetados em Ficoll 4% por 2 h e, em seguida, transferi-los para uma nova placa de Petri 60 mm preenchido com 0.1x MBS.
- Elevação
- Levantar os embriões a 23 ° C. Embora a velocidade de desenvolvimento possa ser abrandada ou acelerada usando temperaturas abaixo ou acima de 23 ° C, respectivamente (intervalo: 16-26 ° C), recomenda-se elevá-los a 23 ° C.
- (Opcional) Tratamento com reagentes farmacológicos
- Para manipulações farmacológicas, administrar medicamentos aos embriões em desenvolvimento por aplicação de banho.
2. Preparação de Injecção de DiI-AcLDL
- Faça uma pipeta de vidro afilada usando um micr padrãoOpipette puller. Coloque um tubo de vidro de borossilicato no extrator de micropipeta e use as seguintes configurações: pressão, 200; Calor, 30; Puxar, 30; Velocidade, 120; Tempo, 200.
- Armazenar a solução-mãe DiI-AcLDL a 4 ° C. Tome a parte clara superior da solução para injeção, mas não as partículas precipitadas no fundo do tubo. Qualquer detrito na pipeta de vidro irá perturbar a ejecção adequada da solução.
- Encher a pipeta de vidro preparada com uma quantidade adequada de solução DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando um microcarregador.
- Retirar a ponta da pipeta de vidro pouco a pouco usando um fino par de pinças (número 55). Configure o sistema de injeção controlado por pressão para que aproximadamente 5 nL de solução seja ejetado de cada vez; 50-60 nL de solução DiI-AcLDL é suficiente para manchar os vasos de um embrião.
- Não deixe a pipeta carregada com DiI-AcLDL no ar por um longo período de tempo para evitar a secagem. Manter a ponta da pipeta submersa em MS a 0,04%222 em solução de MBS a 0,1X. Antes de injectá-lo no embrião (passo 4.2.1), verifique se a mesma quantidade de corante é ejectada.
3. Configuração da Injeção
- Molde Sylgard
- Para preparar um pequeno molde de Sylgard, misture a base de Sylgard e o agente de cura com uma razão de peso de 10 para 1. Encha aproximadamente metade de uma pequena placa de Petri (placa de 35 mm ou 60 mm) com esta solução mista e deixe-a solidificar durante aproximadamente 48 h à temperatura ambiente.
- Anestesia
- Utilizar 0,04% de MS222 em 1x MBS (pH 7,5-8,0) para anestesia. Quando é necessária anestesia prolongada ( por exemplo, durante a imagiologia ao vivo), use MS222 a 0,04% em 0,1x MBS para reduzir o desequilíbrio osmótico. Para ajustar o pH, adicione algumas gotas de NaOH (~ 20 μL) e verifique o pH usando papel pH.
- Espere até que os embriões transferidos parar de se mover. Toque as barbatanas dorsais dos embriões e verifique se eles respondem para confirmarNestesia.
- Posicionamento de embriões para injeção
- Recorte a superfície do molde Sylgard endurecido com uma lâmina fina e afiada. Faça um recuo côncavo em forma de V para colocar os embriões (ver Figura 2D ). Coloque um embrião anestesiado, lado ventral para cima, de forma ligeiramente oblíqua (aproximadamente 30 °) ( Figura 2D ).
- Encha o molde com solução MS222 e coloque os embriões no molde.
4. Injecção DiI-AcLDL
- Incisão da pele sobre o coração
- Preparar dois pinos (Minutiens, 0,10 mm) para cortar a pele sobre o coração. Aperte firmemente cada pino em um porta-pinos; O coração deve ser facilmente identificável à medida que pulsa ( Figura 2A-2C , rosa).
- Perfure a pele de um embrião com um alfinete. Insira o pino através do orifício no espaço entre o coração ea pele ( Figura 2C
- Faça uma incisão linear esfregando suavemente o outro pino segurado fora da pele contra o pino inserido. Gentilmente alargar esta incisão com dois pinos, expondo o coração ( Figura 2B ' e 2D' , seta). A pipeta carregada com DiI-AcLDL pode agora aproximar-se directamente do coração ( Figura 2D ' ).
- Injeção
- Insira a ponta da pipeta de vidro carregada no coração e injete 50-60 nL de solução DiI-AcLDL em aproximadamente 10 pulsos de ejeção. Não injetar uma quantidade excessiva de solução, pois faz com que o coração se rompa. Verifique se o coração continua a bater após a injeção. Após cada injeção, verifique se a mesma quantidade de DiI-AcLDL é ejetada; Caso contrário, a ponta da pipeta pode ser bloqueada (ver passo 2.5).
- Transfira os embriões injetados para uma nova placa de Petri cheia de 0,1x MBS para recuperação. Após 5-10 min, os girinos devem recuperar a consciência e começar a se mover. Neste momento, os vasos marcados podem ser visualizados. Recomenda-se a visualização visual de embriões marcados com sucesso sob um microscópio de fluorescência ( Figura 3A e 3B ). Se uma quantidade insuficiente de DiI-AcLDL é injetada em um embrião, ela pode ser injetada novamente ( Figura 3C ).
- Descarte os girinos que têm outros órgãos rotulados ( Figura 3D ). Continue até obter o número necessário de embriões marcados com êxito.
- Para uma imagem mais completa dos vasos sanguíneos, use microscopia confocal; Pode ser mais fácil fixar os embriões marcados para microscopia confocal. Primeiramente, anestesiar os embriões marcados em MS222 a 0,04% em 1x MBS (pH 7,5-8,0) e depois fixa-os em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Embriões fixos podem ser armazenados por vários dias a 4 ° C; Proteger as amostras injectadas da luz para evitar o foto-branqueamento da DiI.
5. Imagem de Di-AcLDL
- Imagem estereoscópica
- Tomar fotografias sob microscópio estereoscópico de fluorescência ( Figura 3 ) para avaliar a morfologia geral da vasculatura.
- Derreta 1% de agarose em 1x PBS para embriões fixos ou em 1x MBS para imagens ao vivo. Derrame a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até solidificar. Faça um recuo raso na superfície do gel de agarose que irá encaixar o embrião a ser visualizado quando deitado em seu lado lateral. Encha o prato com tampão (solução MS222 para embriões anestesiados ou 1x PBS para embriões fixos).
- Microscopia de fluorescência (Rhodamine filter seT)
- Como DiI é um corante verde-excitado e emissor vermelho, imagem usando um conjunto de filtros padrão para rodamina ou fluoróforos relacionados espectralmente (excitação máxima a 554 nm e emissão a 571 nm). Colocar os embriões injetados nas cavidades no molde de agarose e tirar fotografias ( Figura 3 ).
- Microscopia confocal
NOTA: Para uma análise mais detalhada da arquitetura vascular, use microscopia confocal.- Se estiver usando um microscópio invertido, posicione os embriões num prato de fundo de vidro. Adicionar algumas gotas de 1x PBS e imobilizá-los, colocando um cobertor no topo. Remova o excesso de PBS. Se os embriões vivos forem fotografados, use embriões anestesiados e use 0,015% MS222 em 0,1x MBS em vez de PBS.
- Para imagens de baixa ampliação, use um objetivo de 4X a 10X para localizar a área de interesse; A parte rostral da veia cardinal posterior (PCV) é uma região útil para investigar a angiogênese do desenvolvimento (Figura 4,Caixas).
- Use um ajuste de aquisição para um fluoróforo de emissão vermelha (tal como Rhodamine).
- Faça imagens z-empilhadas por imagem da metade lateral de um embrião. Primeiro, focalize o PCV no lado lateral perto do objetivo e, em seguida, defina o limite inferior do foco na posição onde os vasos mais próximos do objetivo estão em foco. Defina o limite superior na posição em que a parte mediana do PCV que está sendo fotografado pode ser focalizada. Imagem toda esta metade lateral do embrião. Use um software que armazena metadados nas configurações de aquisição, como escalas x, y e z, uma vez que são necessários para calcular os comprimentos do vaso.
- Se necessário, use o modo de varredura de telha para imagem toda a vasculatura de um embrião. Empiricamente determinar o número de telhas horizontais e verticais.
- Para imagens de alta ampliação, siga os procedimentos acima para a imagem da parte rostral do PCV e 4 rostral mais veias intersomitic (ISVs) ( Figura 4 ,Caixa tracejada). Ajuste o número de pilhas (z-stack) e tiles (tile scan) apropriadamente.
6. Quantificação de vasos marcados com DI
NOTA: Os recipientes Di-rotulados podem ser rastreados manualmente ou usando software. Usamos o "Simple neurite tracer", um plugin ImageJ (NIH) gratuito, que permite o rastreamento semi-automático de estruturas semelhantes a tubos, como vasos sanguíneos e neurites 12 . Usando este software livre, os seguintes parâmetros podem ser calculados. Um procedimento detalhado para o uso deste software é descrito em outro lugar (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Abaixo, usamos exemplos da vasculatura de embriões em que a sinalização de Tie2 é inibida ou aumentada ( Figura 4A-4C ) 5 . A exposição de embriões injectados Tie2MO anti-sentido reduz a angiogénese e reduz os ISVs ( Figura 4B ), enquanto que a co-injecção de Tie2 constitutivamente activoMRNA mutante (mRNA caTie2) sobre-resgata este fenótipo, resultando em exuberantes ramos ISV ( Figura 4C ).
- Comprimentos ISV
- Usando o traçador de neurite simples, calcule o comprimento de cada vaso traçado. Calcule os comprimentos dos 4 ISVs mais rostral.
- Filiais de ISV
NOTA: Em embriões de tipo selvagem, apenas alguns ramos curtos brotam do rostral, a maioria dos ISVs no estágio 42.- No traçador de neurite simples, rastrear esses pequenos vasos após fazer o ISV de onde eles originam o ramo primário. Calcule os seguintes parâmetros desses ramos originários dos ISVs.
- Número total de filial
- Uma vez que todos os ISVs e os ramos associados sejam rastreados, calcule o número total de ramos ( Figura 5B-5D ).
- Ordem de filial
- Como simples neurite traçador registra a ordem de cada ramo ( Figura 5A ), calculatE o número de agências para cada ordem. A maioria dos vasos em embriões de tipo selvagem deve ser ramos primários ( ie, ISVs).
- Índice de complexidade veia (VCI)
- Como VCI é um parâmetro útil para a complexidade do vaso, o que dá mais peso aos ramos de ordem superior, calcule o VCI para cada embrião usando a fórmula na Figura 5A . Por exemplo, os embriões injectados com Tie2MO têm uma VCI inferior em comparação com o controlo ( Figura 5B e 5C ) e os embriões injectados com mRNA caTie2 têm uma VCI mais elevada ( Figura 5D ).
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Representative Results
Cronologia dos experimentos (Figuras 1 e 2)
Logo após a fecundação, a microinjecção direccionada pode ser realizada para modular a expressão do gene. Por exemplo, um MO anti-sentido que se liga especificamente ao codão de iniciação do ARNm de Tie2 endógeno pode ser injectado, inibindo a tradução do mRNA alvo de Tie2 por impedimento estérico. Um MO pode ser conjugado com fluoresceína para o rastreio visual fácil de embriões com sucesso injetado. Alternativamente, um ARNm marcador ( por exemplo, ARNm que codifica EGFP) pode ser co-injectado com MO. Adicionalmente, os fármacos podem ser tratados por aplicação de banho após a eclosão (fase de tailbud precoce, em torno do estádio NF 26). Dissolver o fármaco em 0,1 x MBS e adicioná-lo aos embriões. Para o tratamento anterior, os embriões podem ser libertados das membranas com um par de fórceps. DiI-AcLDL pode ser injetado no coração em torno do estágio 33/34 para investigar a dinâmica da forma do vasoMas tipicamente injetamos no estádio 37/38 ou posterior ( Figura 2 , regiões coloridas).
Exemplos típicos de injecções bem sucedidas e mal sucedidas (passo 4.3) (Figura 3)
A imagem estereoscópica é apropriada para a triagem visual. Se uma quantidade suficiente de DiI-AcLDL é injectada no coração, o PCV deve ser imediatamente visível sob um estereoscópio de fluorescência ( Figura 3A e 3B ). Insuficiência ou injeção incorreta de embriões são fáceis de identificar ( Figura 3C e 3D ). Embriões com uma quantidade insuficiente de DiI-AcLDL ( Figura 3C ) podem ser injectados novamente com o mesmo corante até os vasos serem claramente visíveis. Imagem com sucesso injetado embriões sob um microscópio confocal, vivo ou após a fixação.
Desenvolvimento do posteriOu veia cardinal (PCV) e as veias intersomiticas (ISVs)
O PCV estende-se na direcção rostal-para-caudal, e esta extensão termina em torno da fase 37/38. Os ISVs emergem dorsalmente do PCV em uma onda anterior-para-posterior. Esta onda de formação de ISV começa na fase 36 e termina em torno da fase 40/41; Os ISVs continuam a crescer e tornam-se ligeiramente ramificados até à fase 43 ( Figura 3A e 3B ).
A sinalização Tie2 controla a ramificação ISV desenvolvida (Figura 4)
O PCV e ISVs crescem em um padrão estereotipado, e seu desenvolvimento está sob controle apertado ( Figura 4A ). A formação dos ISVs do PCV pode ser descrita como angiogénese, e por isso é um modelo útil para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à angiogénese. Apresentamos o resultado do nosso recente estudo showiNg que sinais de desenvolvimento inibem Tie2 sinalização em ISVs para limitar a sua ramificação 5 . O knockdown da sinalização de Tie2 por MO anti-sentido diminui o comprimento e complexidade dos ISVs (Figura 4B), e expressar a forma activa constitutiva de Tie2 (caTie2) provoca excessiva ramificação ISV ( Figura 4C ).
Quantificação da complexidade do ISV (Figura 5)
Além dos comprimentos e números de ramificação dos ISVs, o "índice de complexidade de veias" (VCI) pode ser calculado para avaliar sua complexidade ( Figura 5A ). Adotamos o "índice de complexidade" desenvolvido por Cohen-Cory e colaboradores, que foi projetado para quantificar a complexidade de neuronal axonal ou dendríticas mandris [ 13] . Neste índice, um embrião com ramos de maior ordem recebe uma pontuação maior do que um embrião com o mesmo número de farelo totalMas com ramos mais baixos. Portanto, uma maior VCI indica que este embrião tem uma rede venosa mais complexa. "Simple neurite tracer" é um software útil para acompanhar a ordem eo comprimento de ramos individuais. Também é possível gerar "caminhos renderizados", o que é uma maneira útil de visualizar a arquitetura global da vasculatura ( Figuras 5B-5D , painéis à direita).
Figura 1: Cronologia dos experimentos. No dia da fecundação, os morfolinos (MOs), DNA, RNA ou proteína podem ser injetados em óvulos fertilizados na NF estádio 1 (st1) ou 2 (st2). Se injectado apenas no blastómero em st2, o reagente injectado afectará apenas um lado lateral. O lado não injetado pode ser usado como um controle. Co-injectar um marcador ( eg, EGFP mRNA) para identificar o lado injetado. No segundo dia, eaRly tailbud-stage (~ st24) podem ser tratados com reagentes farmacológicos por aplicação de banho. O coração é claramente visível no terceiro dia. DiI-AcLDL pode ser injetado no coração e os vasos sanguíneos podem ser visualizados logo após a injeção. Use embriões st33-37 para a imagem da dinâmica do crescimento do vaso ou embriões st42 imagem vasos completamente desenvolvidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Localização da injecção DiI-AcLDL em st42. Lateral ( AB ' ) e ventral ( CD ) do embrião do estágio 42. O coração é colorido em rosa em AC , em imagens tiradas de Xenbase (www.xenbase.org). As imagens estereoscópicas representativas são mostradas em A ' ,
Figura 3: Resultados esperados (imagens estereoscópicas). Imagens de fluorescência representativas de embriões de fase 37/38 ( A ) e fase 42 ( B ). Os lados esquerdos dos embriões são mostrados. A veia cardinal posterior (PCV) estende-se caudalmente, a partir da qual as veias intersomiticas (ISVs) se ramificam dorsalmente em um wav rostral-caudalE. Somente os ISV rostrados são visíveis na fase 37/38 ( A ), ea maioria dos ISVs formou-se pela fase 42 ( B ). Se uma quantidade insuficiente de DiI-AcLDL for injetada, o PCV não será claramente visível, mesmo após 30 min ( C ). Neste caso, mais DiI-AcLDL pode ser injetado. Se DiI-AcLDL é acidentalmente injetado em outros órgãos ( D ), descarte os embriões. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos da sinalização Tie2 no desenvolvimento de ISV. A expressão do gene Tie2 foi derrubada pela injecção de blastómero de oligonucleótidos morfolino anti-sentido de bloqueio de tradução (Tie2MO). O morfolino de controlo (CoMO) tem o mesmo peso molecular, mas nAlvo qualquer gene em Xenopus tropicalis . O mutante Tie2 constitutivamente activo codificador de ARNm (caTie2) foi co-injectado para resgatar o fenótipo de knockdown de Tie2. Em contraste com o controlo ( A ), a injecção Tie2MO conduziu a uma diminuição dramática no comprimento e número de ISVs ( B ). Este fenótipo foi sobre-resgatado por caTie2, que mostrou ISVs com ramos colaterais exuberantes ( C ). A complexidade dos ISVs nas regiões indicadas por caixas azuis tracejadas é quantificada na Figura 5. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação da complexidade da veia. ( A ) A complexidade do ISV pode ser representada pelo índice de complexidade veia (VCI).( BD ) As VCI foram calculadas a partir dos embriões mostrados na Figura 4. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido pela primeira vez por Ali H. Brivanlou e colegas para investigar eventos de desenvolvimento durante a formação vascular em Xenopus laevis 4 , mas, como mostrado neste manuscrito, pode ser aplicado a outros pequenos animais. Injecção de corante no coração é simples de realizar, e toda a rede vascular pode ser visualizada sob um microscópio de dissecção de fluorescência, bem como um microscópio confocal. Se o corante é injetado no coração durante o desenvolvimento do vaso, a dinâmica do crescimento do vaso e ramificação pode ser visualizada em tempo real 4 . Usando a rede venosa bem definida, particularmente o PCV eo rostral, a maioria dos ISVs, os efeitos da perturbação genética ou ambiental sobre a angiogênese podem ser avaliados quantitativamente.
A etapa mais crítica neste protocolo é a injeção de DiI-AcLDL (etapa 4). Fornecemos exemplos de injeções bem sucedidas e mal sucedidas ( FiGura 3). Os embriões injectados com sucesso devem ser rastreados sob um microscópio de fluorescência, como descrito no passo 4.3. Se o PCV não for visível 30 min após a injecção, não foi injectado DiI-AcLDL suficiente ( Figura 3C ). Embriões injetados sem êxito podem ser anestesiados e injetados novamente. Em alguns casos, DiI-AcLDL pode ser injetado em um local incorreto, caso em que outros órgãos serão rotulados ( Figura 3D ). Descartar embriões incorretamente injetados.
Os vasos sanguíneos de um embrião com êxito injetado serão visíveis logo após a injeção ea fluorescência dura várias horas. Portanto, se a injeção é realizada antes da formação de ISVs, seu desenvolvimento pode ser visualizado em um embrião vivo, proporcionando uma poderosa ferramenta para investigar o desenvolvimento do sistema cardiovascular em tempo real e in vivo 4 . Como Xenopus tem sido utilizado com sucesso como um modelo para tela vascular d, A abordagem experimental aqui descrita pode ser combinada com experiências de perturbação farmacológica e utilizada como uma plataforma de rastreio para encontrar fármacos que aumentam ou inibem a angiogénese.
Os vasos sanguíneos podem ser visualizados por ferramentas genéticas, bem como pelos métodos de marcação baseados em corantes descritos aqui. Por exemplo, o Xenopus transgénico 15 ou o peixe-zebra 16 que expressam proteínas de fluorescência sob o controlo de promotores específicos do tipo celular permitem a formação de imagens ao vivo de vasos sanguíneos e linfáticos e é mesmo possível discriminar artérias de veias 16 . Embora as abordagens genéticas sejam superiores e gerem uma eficiência de rotulagem mais consistente, os métodos baseados em corantes são facilmente acessíveis à maioria dos laboratórios sem acesso a tais animais geneticamente modificados. Em Xenopus , a perfusão transcardial de DiI-AcLDL resulta naRotulagem da maioria das células endoteliais 4 , e artérias e veias não são distinguíveis em imagens de fluorescência. Curiosamente, lectina de tomate fluoresceína seletivamente rótulos artérias em ratos, e quando co-injetado com Di-ACLDL, artérias e veias podem ser discriminados [ 17] . Embora a aplicação não tenha sido testada em outros tecidos ou animais, esta fornece uma direção promissora para investigar o desenvolvimento dinâmico de artérias e veias em Xenopus .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi inspirado no trabalho de Levine et al. , Que descreveu este método experimental e forneceu uma descrição abrangente do desenvolvimento vascular em Xenopus laevis. Agradecemos aos membros do nosso laboratório por sua contribuição. Este estudo foi apoiado pela Universidade de Yonsei Iniciativa de Investigação Futuro de 2015 (2015-22-0095) eo Programa de Desenvolvimento de Tecnologia Biológica e Médica da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planeamento Futuro NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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