Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i Published: May 25, 2017 doi: 10.3791/55652

Summary

Detta protokoll demonstrerar en fluorescensbaserad metod för att visualisera vasculaturen och att kvantifiera dess komplexitet i Xenopus tropicalis . Blodkärl kan avbildas efter en injektion av ett fluorescerande färgämne i ett embryos slagande hjärta efter genetisk och / eller farmakologisk manipulation för att studera kardiovaskulär utveckling in vivo .

Abstract

Blodkärl levererar syre och näringsämnen genom hela kroppen, och bildandet av det vaskulära nätverket är under stram utvecklingskontroll. Den effektiva in vivo- visualiseringen av blodkärl och tillförlitlig kvantifiering av deras komplexitet är nyckeln till förståelse av biologin och sjukdomen i det vaskulära nätverket. Här tillhandahåller vi en detaljerad metod för att visualisera blodkärl med ett kommersiellt tillgängligt fluorescerande färgämne, humant plasma acetylerat lågdensitetslipoprotein DiI-komplex (DiI-AcLDL) och för att kvantifiera deras komplexitet i Xenopus tropicalis . Blodkärl kan märkas genom en enkel injektion av DiI-AcLDL i ett embryos slagande hjärta, och blodkärl i hela embryot kan avbildas i levande eller fasta embryon. Kombinerad med genstörning genom den riktade mikroinjektionen av nukleinsyror och / eller badapplikationen av farmakologiska reagenser kan en gens eller en signalvägs rörelser på vaskulär utveckling vara inveStigit inom en vecka utan att tillgripa sofistikerade genetiskt manipulerade djur. På grund av det väldefinierade venösa systemet för Xenopus och dess stereotypa angiogenes kan spridningen av befintliga kärl, kärlekomplexitet kvantifieras effektivt efter störningsförsök. Detta relativt enkla protokoll bör fungera som ett lättillgängligt verktyg inom olika områden inom kardiovaskulär forskning.

Introduction

Vaskulogenes, bildandet av nya blodkärl från nyfödda endotelceller och angiogenes, bildandet av nya kärl från befintliga kärl, är två separata processer som formar embryonisk kärl 1 . Eventuell dysregulering i dessa processer resulterar i olika hjärtsjukdomar och strukturella abnormiteter hos kärl. Vidare är tumörtillväxt associerad med okontrollerad kärltillväxt. Som sådan är molekylära mekanismer som ligger bakom vaskulogenes och angiogenes föremål för intensiv utredning 2 .

Xenopus och zebrafisk är attraktiva ryggradsmodeller för vaskulogenes och angiogenesstudier av flera skäl. Först är deras embryon små; Därför är det relativt lätt att bilda hela kärlsystemet. För det andra är embryonal utveckling snabb; Det tar bara ett par dagar för hela kärlsystemet att utvecklas, under vilken tid den utvecklas vascul Ature kan avbildas. För det tredje är genetiska och farmakologiska ingrepp före och under kärlbildning lätt att utföra, såsom genom mikroinjektion av antisensmorfolino-nukleotider (MO) i det utvecklande embryot eller genom badapplikationen av läkemedel 3 , 4 , 5 .

Den unika fördelen med Xenopus över zebrafisk är att embryologiska manipuleringar kan utföras, eftersom Xenopus följer stereotypa holoblastiska klyvningar och den embryonska ödet kartan är väldefinierad 6 . Det är till exempel möjligt att generera ett embryo där endast en sidosida är genetiskt manipulerad genom att injicera en antisens MO till en cell i tvåcellssteget. Det är också möjligt att transplantera hjärtprimordet från ett embryo till ett annat för att bestämma huruvida genen utövar sin funktion av en cellinriktad eller -xtrinsisk mekanismRöv = "xref"> 7. Även om dessa tekniker främst har utvecklats i Xenopus laevis , som är allotetraploid och därför inte är idealisk för genetiska studier, kan de direkt applicerasXenopus tropicalis , en närstående diploidart 8 .

Ett sätt att visualisera vasculaturen i ett levande Xenopus- embryo är att injicera ett fluorescerande färgämne för att märka blodkärlen. Acetylerat lågdensitetslipoprotein (AcLDL) märkt med en fluorescerande molekyl såsom DiI är en mycket användbar sond. Till skillnad från oacetylerad LDL binds inte AcLDL till LDL-receptorn 9 men endocytoseras av makrofager och endotelceller. Injektionen av DiI-AcLDL i hjärtat av ett levande djur resulterar i den specifika fluorescensmärkningen av endotelceller, och hela kärlsystemet kan avbildas genom fluorescensmikroskopi i levande eller fasta embryon 4 .

Här presar viEnt detaljerade protokoll för visualisering och kvantifiering av blodkärl med användning av DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi tillhandahåller viktiga praktiska punkter, med exempel på framgångsrika och misslyckade experiment. Dessutom ger vi en enkel metod för kvantitativ analys av vaskulär komplexitet, vilket kan vara användbart vid bedömning av effekterna av genetiska och miljömässiga faktorer vid utformningen av det vaskulära nätverket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök överensstämde med protokoll godkända av Yonsei University College of Medicine Institutionella djurvård och användning kommittéer.

1. Framställning av Xenopus tropicalis- embryon

OBS: Xenopus tropicalis- embryon framställdes som tidigare beskrivits 10 med liten modifikation. Xenopus tropicalis embryon var arrangerade enligt tabellerna från Nieuwkoop och Faber 11 .

  1. Induktion av ägglossning
    1. För pre-prime, injicera human choriongonadotropin (hCG) i dorsallymfacket hos ett par grodor (en man och en kvinna) dagen före dagen för parning. Injicera 20 enheter per kvinnlig groda och 10 enheter per man. Hus en man och en kvinna i samma tank över natten (mer än 18 timmar).
    2. För att primära den följande dagen injicera 200 enheter hCG till den förberedda honan och 100 enheter hCG till pre-primedmanlig; Den primerade kvinnan börjar lägga ägg på cirka 3 h och kommer fortsätta att göra det hela dagen. Håll manliga och kvinnliga paret tillsammans för naturlig parning eller i separata tankar för in vitro fertilisering (steg 1.2).
  2. Befruktning
    OBS: Ägg kan befrukas genom naturlig parning eller in vitro fertilisering. Vid naturlig parning befruktas ägget som de läggs, och därför kan tidpunkten för befruktning inte kontrolleras. Alternativt kan en primed kvinnlig groda vara inrymd i en separat tank och obefruktad ägg kan samlas in för fertilisering i vitro , vilket genererar hundratals embryon befruktade samtidigt. Det senare tillvägagångssättet är användbart när blastomer-målinriktad mikroinjektion utförs före kärlmärkning. I detta tillvägagångssätt offras dock en man.
    1. Naturlig parning
      1. Lämna primed kvinnliga och manliga par i samma tank. Hanen spärrar fEmal, vilket leder till omedelbar befruktning av de lagda äggen. Samla ägg med glas eller plastpipett och överför dem till en petriskål. För att förhindra att äggen klibbar pipetten, belägga pipettens inre yta med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
    2. In vitro fertilization (IVF)
      1. Separera den primerade kvinnan från hanen efter priming. Honan börjar lägga ägg spontant på ungefär 3 timmar. Överför några fågelägg med en BSA-belagd pipett till en Petri-skål och kontrollera deras kvalitet under ett mikroskop. Om friska ägg (klart pigment, elastiskt kulformat) lagts, förbereda sig för att dissekera testiklarna från den primerade hanen.
      2. Gör 0,4% Tricain-metansulfonat (MS222) för eutanasi och injicera 300 μL i den primära hanens dorsala lymfkedja. På ungefär 10 min kommer hanen att förlora sin balans av balans och kommer att hålla sig flytande; Bekräfta att hanen är euthanized genom att knyta ett bakben med aPar trubbiga tångar och observera inget svar.
      3. Dissektera de två testiklarna, rengör dem genom att snabbt trycka dem på luddfritt papper och överföra dem till en mikrotube innehållande 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS); Ett detaljerat förfarande beskrivs på annat håll 10 .
      4. Försiktigt hakiga testiklarna med en pestel för att extrahera spermierna. Vid denna koncentration ( dvs 2 testiklar i 1 ml 10% FBS i 60% L-15) kan några droppar av testislösningen (0,1 ml) gödsla cirka trehundra ägg. Den återstående spermierna kan förvaras vid 4 ° C i ett tätt förseglat rör och används för IVF nästa dag.
      5. Krama ägg från honan till en liten petriskål. Håll kvinnans övre del upp och ner på handflatan och lägg pekfingret mellan bakbenen. Sprid dess bakben med pekfingret och å andra sidan för att exponera cloaca. Rör vid cloaca till Petri-skålen. Coat tHan Petriskål med 0,5% BSA för att jämnt fördela ägget som ett monoskikt under IVF.
      6. Tillsätt några droppar (0,1 ml) spermieinnehållande L-15-medium till ägget. För synkron gödsel, rör försiktigt spermilösningen över disken. Efter 4 minuter vid rumstemperatur fyller du petriskålen med 0,01x Modifierad Barths Saline (MBS), inkuberas i 10 minuter och ersätter lösningen med 0,1x MBS. De befruktade äggen genomgår den första klyvningen i ungefär 1 h vid rumstemperatur. 1x MBS är 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCOs, 5 mM HEPES, 1 mM MgSO4 och 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
  3. (Valfritt) Injektion av antisensmorfolino-oligonukleotider (MOs) och / eller mRNA
    1. För att undersöka effekten av en gen av intresse vid kärlbildning, utför mikroinjektionen av antisens MO och / eller mRNA.
    2. För sådana experiment, ädelägga ägg med 2% L-cystein i 1x MBS (pH 7,5-7,8).Byt 0,1x MBS i skålen som innehåller befruktade embryon med 2% L-cystein i 1x MBS. Vrid försiktigt skålen för att blanda lösningen.
      OBS! Det tar vanligen ca 5 min för att embryon ska avlindas. Under detta steg övervakar du äggen ofta för att säkerställa att de inte är överexponerade för lösningen. Om äggen är överexponerade, kommer de att förlora elasticitet och bli platta, vilket kommer att leda till avvikande utveckling och dödlighet.
    3. Tvätta de-jellierna ägg fem gånger med 0,1x MBS. Utför mikroinjektionen i 4% Ficoll upplöst i 0,1x MBS. Injicera typiskt 4 ng MO och 600 pg mRNA per blastomerer i tvåcellsteget. Injicera i en cell för att manipulera genuttryck på ena sidan av embryot. Använd den oinjicerade sidan av samma embryo som en kontroll.
    4. Som en annan kontroll för specificiteten av genmanipulationen injiceras samma mängd av en kontroll MO (CoMO) eller kontrollmRNA ( t.ex. beta-galaktosidas-mRNA). CoMO måste ha samma mOlecular vikt som den genspecifika MO och får inte rikta sig mot någon gen i Xenopus genomet. För enkel visualisering av den injicerade sidan, använd fluoresceinmärkt MO eller co-injicera en spårämne ( t.ex. EGFP-mRNA).
    5. Lämna de injicerade embryon i 4% Ficoll i 2 timmar och överför dem sedan till en ny 60 mm petriskål fylld med 0,1x MBS.
  4. Raising
    1. Höj embryonerna vid 23 ° C. Trots att utvecklingshastigheten kan sänkas eller accelereras genom att använda temperaturer under eller över 23 ° C (intervall: 16-26 ° C), rekommenderas att höja dem vid 23 ° C.
  5. (Valfritt) Behandling med farmakologiska reagens
    1. För farmakologiska manipuleringar administrera läkemedel till utvecklingsembryon genom badapplikation.

2. Framställning av DiI-AcLDL-injektion

  1. Gör en avsmalnande glaspipett med en standardmikroOpipette puller. Placera ett borosilikatglasrör i mikropipettdragaren och använd följande inställningar: tryck, 200; Värme, 30; Dra, 30; Hastighet, 120; Tid, 200.
  2. Förvara DiI-AcLDL stamlösning vid 4 ° C. Ta den övre klara delen av injektionslösningen, men inte de utfällda partiklarna på botten av röret. Eventuellt skräp i glaspipetten kommer att störa den lämpliga utstötningen av lösningen.
  3. Fyll den beredda glaspipetten med en lämplig mängd DiI-AcLDL-lösning (~ 5 | il) med användning av en mikrolaster.
  4. Kläm av glaspipettens spets lite efter en gång med ett fint par tångar (nummer 55). Ställ in det tryckstyrda insprutningssystemet så att ca 5 nL lösning utsöndras åt gången. 50-60 nL DiI-AcLDL-lösning är tillräcklig för att fläcka kärlen av ett embryo.
  5. Lämna inte den DiI-AcLDL-laddade pipetten i luft under längre tid för att undvika torkning. Håll pipettspetsen nedsänkt i 0,04% MS222 i 0,1 x MBS-lösning. Strax innan du injicerar det i embryot (steg 4.2.1), kontrollera om samma mängd färgämne sprider ut.

3. Injektionsinställning

  1. Sylgard mögel
    1. Förbereda en liten Sylgard-form, blanda Sylgard-bas och härdare med ett viktförhållande på 10 till 1. Fyll ungefär hälften av en liten petriskål (35 mm eller 60 mm fat) med denna blandade lösning och låt den stelna i ca 48 h vid rumstemperatur.
  2. Anestesi
    1. Använd 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) för anestesi. När långa anestesi behövs ( t.ex. vid live imaging), använd 0,04% MS222 i 0,1x MBS för att minska den osmotiska obalansen. För att justera pH, tillsätt några droppar NaOH (~ 20 μL) och kontrollera pH med pH-papper.
    2. Vänta tills de överförda embryon slutar röra sig. Tryck på embryonernas dorsala fenor och kontrollera om de svarar för att bekräfta fullständigt anesthesia.
  3. Placering av embryon för injektion
    1. Dra in ytan av den härdade Sylgard-formen med ett tunt och skarpt blad. Gör en V-formad konkav inryckning för att placera embryon (se figur 2D ). Placera ett bedövat embryo, ventral-sida upp, på ett något snett sätt (cirka 30 °) ( Figur 2D ).
    2. Fyll mögel med MS222-lösning och placera embryon i formen.

4. DiI-AcLDL-injektion

  1. Inskärning av hud som ligger över hjärtat
    1. Förbered två stift (Minutiens, 0,10 mm) för att skära huden över hjärtat. Tätt fixera varje stift till en stifthållare; Hjärtat bör lätt identifieras eftersom det pulserar ( figur 2A-2C , rosa).
    2. Punktera huden på ett embryo med en stift. Sätt in stiftet genom hålet i utrymmet mellan hjärtat och huden ( Figur 2C
    3. Gör ett linjärt snitt genom att försiktigt gnugga den andra stiftet som hålls utanför huden mot den införda stiftet. Förök försiktigt detta snitt med två pinnar, exponera hjärtat ( Figur 2B ' och 2D' , pil). Den pipett som är laddad med DiI-AcLDL kan nu direkt närma sig hjärtat ( Figur 2D ' ).
  2. Injektion
    1. Sätt in spetsen på den laddade glaspipetten i hjärtat och injicera 50-60 nL DiI-AcLDL-lösning i ungefär 10 utstötningsimpulser. Injicera inte en för stor mängd lösning, eftersom det får hjärtat att brista. Kontrollera om hjärtat fortsätter att slå efter injektionen. Efter varje injektion, kontrollera om samma mängd DiI-AcLDL utstötas. Annars kan pipettens spets vara blockerad (se steg 2.5).
  3. Överför de injicerade embryon till en ny petriskål fylld med 0,1x MBS för återvinning. Efter 5-10 min ska tadpolesna återfå medvetandet och börja flytta. Vid denna tidpunkt kan de märkta kärlen avbildas. Det rekommenderas att visuellt skärm framgångsrikt märkta embryon under ett fluorescensmikroskop ( Figur 3A och 3B ). Om en otillräcklig mängd DiI-AcLDL injiceras i ett embryo kan det injiceras igen ( Figur 3C ).
  4. Förkasta tadpoles som har märkt andra organ ( Figur 3D ). Fortsätt tills det önskade antalet framgångsrikt märkta embryon erhålls.
  • (Valfritt) Fästning av embryon
    1. För mer noggrann bildbehandling av blodkärl, använd konfokal mikroskopi; Det kan vara lättare att fixa märkta embryon för konfokal mikroskopi. Första anestetisera de märkta embryonerna i 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) och fixa sedan dem i 4% paraformaldehyd i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 1 h vid rumstemperatur. Fasta embryon kan förvaras i flera dagar vid 4 ° C; Skydda de injicerade proverna från ljus för att undvika photobleaching av DiI.
  • 5. Bildning av DiI-AcLDL

    1. Stereoscopic imaging
      1. Ta bilder under ett stereoskopiskt mikroskop (fluorescensmikroskop) ( Figur 3 ) för att bedöma vasculaturens övergripande morfologi.
      2. Smält 1% agaros i 1x PBS för fasta embryon eller i 1x MBS för levande bildbehandling. Häll smält agaros i en petriskål och vänta tills det stelnar. Gör en grundig indragning på ytan av agarosgel som passar det embryo som ska avbildas när den ligger på sin sida. Fyll disken med buffert (MS222 lösning för bedövade embryon eller 1x PBS för fasta embryon).
    2. Fluorescensmikroskopi (Rhodamine filter set)
      1. Eftersom DiI är en grön-exciterad och rödemitterande färgämne, används bild med hjälp av en standardfilteruppsättning för rhodamin eller spektralrelaterade fluoroforer (maximal excitation vid 554 nm och emission vid 571 nm). Placera de injicerade embryon i indragningarna på agarosformen och ta fotografier ( Figur 3 ).
    3. Konfokal mikroskopi
      OBS! För en närmare analys av vaskulär arkitektur, använd konfokal mikroskopi.
      1. Om du använder ett inverterat mikroskop placerar du embryonerna på en glasbottenmaträtt. Lägg till några droppar 1x PBS och immobilisera dem genom att placera ett lock på toppen. Ta bort överskott av PBS. Om levande embryon ska avbildas, använd bedövade embryon och använd 0,015% MS222 i 0,1x MBS istället för PBS.
      2. För bildförstoring med låg förstoringsgrad, använd ett 4X till 10X objektiv för att hitta intresseområdet; Den rostrala delen av den bakre kardinalvenen (PCV) är en användbar region för att undersöka utvecklingsangiogenesen (Figur 4, streckadlådor).
        1. Använd en anskaffningsinställning för en fluorescens med röd emission (t.ex. Rhodamin).
        2. Gör z-staplade bilder genom att avbilda den laterala hälften av ett embryo. Först fokuserar du på PCV på sidoväggen nära målet och ställer sedan in den nedre gränsen för fokusen i den position där fartygen närmast målet är i fokus. Ställ in den övre gränsen vid den position där medialdelen av PCV som avbildas kan fokuseras. Bild hela den här halva sidan av embryot. Använd programvara som lagrar metadata i förvärvsinställningarna, som x, y och z-skalor, eftersom de är nödvändiga för att beräkna fartygslängderna.
        3. Om det behövs, använd kakellägesläget för att bilda hela vasculaturen i ett embryo. Bestäm empiriskt antalet horisontella och vertikala plattor.
      3. För högupplösta bilder, följ procedurerna ovan för att bilda den rostrade delen av PCV och 4 rostral-mest intersomitiska vener (ISV) ( Figur 4 ,Streckad låda). Justera antalet stackar (z-stack) och kakel (kakelskanning) på lämpligt sätt.

    6. Kvantifiering av DiI-märkta fartyg

    OBS: DiI-märkta fartyg kan spåras manuellt eller använder programvara. Vi använder "Simple neurite tracer", ett gratis ImageJ (NIH) plugin, vilket möjliggör halvautomatisk spårning av rörliknande strukturer som blodkärl och neuriter 12 . Med hjälp av den här fria programvaran kan följande parametrar beräknas. Ett detaljerat förfarande för användningen av denna programvara beskrivs annorstädes (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Nedan använder vi exempel på vasculatur av embryon där Tie2-signalering hämmas eller förbättras ( Figur 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-injicerade embryonutställningen minskar angiogenesen och förkortar ISVs ( Figur 4B ), medan saminjektionen av konstitutivt aktiv Tie2Mutant mRNA (caTie2 mRNA) överräddar denna fenotyp, vilket resulterar i exuberande ISV-grenar ( Figur 4C ).

    1. ISV längder
      1. Med hjälp av Simple neurite-spårare beräknar du längden på varje spårat kärl. Beräkna längderna för de 4 mest rostrelaste ISV: erna.
    2. ISV-filialer
      ANMÄRKNING: I vildtypsembryon spruter endast några få korta grenar från de mest rostrelska ISV: erna i steg 42.
      1. I enkla neurite spårare spåra dessa små kärl efter att ha gjort ISV från vilken de härstammar från den primära grenen. Beräkna följande parametrar för dessa grenar härrörande från ISV: erna.
      2. Totalt filialnummer
        1. När alla ISV: er och de tillhörande grenarna spåras, beräkna det totala antalet grenar ( Figur 5B-5D ).
      3. Branch order
        1. Eftersom Simple neurite-spåraren registrerar varje grens ordning ( Figur 5A ), beräknasE Antal grenar för varje order. Majoriteten av kärlen i vildtypembryon bör vara primära grenar ( dvs. ISV).
      4. Vinkomplexitetsindex (VCI)
        1. Eftersom VCI är en användbar parameter för fartygskomplexitet, vilket ger större vikt vid högre ordergrenar, beräkna VCI för varje embryo med hjälp av formeln i Figur 5A . Tie2MO-injicerade embryon har till exempel en lägre VCI jämfört med kontroll ( Figur 5B och 5C ), och caTie2 mRNA-injicerade embryon har en högre VCI ( Figur 5D ).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tidslinje för experiment (figurerna 1 och 2)

    Kort efter befruktning kan riktade mikroinjektioner utföras för att modulera genuttryck. Till exempel kan en antisens MO som specifikt binder till initieringskodonet hos det endogena Tie2-mRNA injiceras, inhibera översättningen av Tie2-målmRNA med steriskt hinder. En MO kan vara konjugerad till fluorescein för enkel visuell screening av framgångsrikt injicerade embryon. Alternativt kan ett spårmRNA ( t ex mRNA som kodar för EGFP) injiceras med MO. Dessutom kan droger behandlas med badapplikation efter kläckning (tidigt avloppssteg, runt NF-steg 26). Lös upp läkemedlet i 0,1x MBS och lägg det till embryon. För tidigare behandling kan embryon befrias från membranen med ett par tångar. DiI-AcLDL kan injiceras i hjärtat runt scen 33/34 för att undersöka dynamiken i kärlformenAtjon, men vanligtvis injicerar vi vid stadium 37/38 eller senare ( Figur 2 , färgade områden).

    Typiska exempel på framgångsrika och misslyckade injektioner (steg 4.3) (Figur 3)

    Stereoscopic imaging är lämplig för visuell screening. Om en tillräcklig mängd DiI-AcLDL injiceras i hjärtat, bör PCV omedelbart ses under ett fluorescensstereoskop ( Figur 3A och 3B ). Otillräckligt eller felaktigt injicerade embryon är lätta att identifiera ( Figur 3C och 3D ). Embryon med en otillräcklig mängd DiI-AcLDL ( Figur 3C ) kan injiceras igen med samma färg tills kärlen är tydligt synliga. Bildet framgångsrikt injicerade embryon under ett konfokalt mikroskop, levande eller efter fixering.

    Utveckling av posteriEller kardinal ven (PCV) och de intersomitiska venerna (ISV)

    PCV sträcker sig i rostal-till-caudal riktning, och denna förlängning slutar runt steg 37/38. ISV: er dyker upp dorsalt från PCV i en främre-till-posterior våg. Denna våg av ISV-bildning börjar vid scen 36 och slutar runt steg 40/41; ISV: er fortsätter att växa och blir lättförgrenade till steg 43 ( Figur 3A och 3B ).

    Tie2-signalering kontrollerar utveckling av ISV-förgrening (Figur 4)

    PCV- och ISV: erna växer i ett stereotypt mönster, och deras utveckling är under stram kontroll ( Figur 4A ). Bildandet av ISV: erna från PCV kan beskrivas som angiogenes och därför är det en användbar modell för att undersöka molekylära mekanismer som ligger bakom angiogenesen. Vi presenterar resultatet av vår senaste studie showiNg att utvecklingssignaler hämmar Tie2-signalering i ISV för att begränsa deras förgrening 5 . Nedbrytningen av Tie2-signaleringen med antisens MO minskar ISV: s längd och komplexitet (Figur 4B) och uttrycker den konstitutiva aktiva formen av Tie2 (caTie2) orsakar överdriven ISV-förgrening ( Figur 4C ).

    Kvantifiering av ISV-komplexitet (Figur 5)

    Förutom ISV: s längder och grennummer kan "veinkomplexitetsindex" (VCI) beräknas för att bedöma deras komplexitet ( Figur 5A ). Vi antog "komplexitetsindex" utvecklat av Cohen-Cory och kollegor, som var utformat för att kvantifiera komplexiteten hos neuronala axonala eller dendritiska arbors 13 . I detta index får ett embryo med fler högordnade grenar en högre poäng än ett embryo med samma antal totalt kliChes men med mer lågordnade grenar. Därför indikerar en högre VCI att detta embryo har ett mer komplext venöst nätverk. "Simple neurite tracer" är användbar programvara för att hålla reda på ordning och längd för enskilda grenar. Det är också möjligt att generera "gjorda vägar", vilket är ett användbart sätt att visualisera vasculaturens övergripande arkitektur (figurerna 5B-5D , högra paneler).

    Figur 1
    Figur 1: Tidslinjen för experimenten. På dagen för befruktning kan morfolinos (MOs), DNA, RNA eller protein injiceras i befruktade ägg vid NF-steg 1 (st1) eller 2 (st2). Om det injiceras endast i den ena blastomeren vid st2, kommer det injicerade reagenset att påverka endast en lateral sida. Den oinjicerade sidan kan användas som en kontroll. Injicera en spårämne ( t.ex. EGFP mRNA) för att identifiera den injicerade sidan. På andra dagen, eaRly-stammar (~ st24) embryon kan behandlas med farmakologiska reagens genom badapplikation. Hjärtat är tydligt synligt på tredje dagen. DiI-AcLDL kan injiceras i hjärtat och blodkärlen kan avbildas kort efter injektionen. Använd st33-37 embryon för att bilda dynamiken i kärltillväxt eller st42-embryon till bild fullt utvecklade kärl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

    Figur 2
    Figur 2: Placering av DiI-AcLDL-injektionen vid st42. Lateral ( AB ' ) och ventral ( CD ) vyer av stadium 42 embryot. Hjärtat är färgat i rosa i AC , i bilder tagna från Xenbase (www.xenbase.org). Representativa stereoskopiska bilder visas i A ' , D. För injektion punktera huden över hjärtat ( C , fast pil), gör ett linjärt snitt och öppna huden i sidled för att exponera hjärtat (röda pilar). Efter snittet kommer hjärtat tydligt att särskiljas för injektion ( D ' ). Skalstänger = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

    Figur 3
    Figur 3: Förväntade resultat (stereoskopiska bilder). Representativa fluorescensbilder från steg 37/38 ( A ) och steg 42 ( B ) embryon. De vänstra sidorna av embryonerna visas. Den bakre kardinalvenen (PCV) sträcker sig caudalt, varifrån intersomitära vener (ISV) grenar dorsalt i en rostral-till-caudal wave. Endast rostral ISV är synliga på scen 37/38 ( A ), och de flesta ISV har bildats av steg 42 ( B ). Om en otillräcklig mängd DiI-AcLDL injiceras, kommer PCV inte att vara tydligt synlig, även efter 30 min ( C ). I detta fall kan mer DiI-AcLDL injiceras. Om DiI-AcLDL oavsiktligt injiceras i andra organ ( D ), kassera embryonerna. Skalstång = 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

    Figur 4
    Figur 4: Effekter av Tie2-signalering på ISV-utveckling. Tie2-genuttryck slogs ned av blastomereinjektionen av translations-blockerande antisensmorfolino-oligonukleotider (Tie2MO). Kontrollmorfolino (CoMO) har samma molekylvikt men gör nOt mål någon gen i Xenopus tropicalis . MRNA-kodande konstitutivt aktiv Tie2-mutant (caTie2) injicerades för att rädda Tie2-knockdown-fenotypen. I motsats till kontrollen ( A ) ledde theTie2MO-injektionen till en dramatisk minskning av längden och antalet ISV ( B ). Denna fenotyp var överräddad av caTie2, som visade ISV med överflödiga säkerhetsgrenar ( C ). ISV: s komplexitet i regioner som anges med blåa streckade rutor kvantifieras i Figur 5. Skalstång = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

    Figur 5
    Figur 5: Kvantificering av venekomplexitet. ( A ) Komplexiteten hos ISV kan representeras av venkomplexitetsindexet (VCI).( BD ) VCIs beräknades från de embryon som visas i Figur 4. Skalstång = 200 | im. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokollet som presenteras här utvecklades först av Ali H. Brivanlou och kollegor för att undersöka utvecklingshändelser under kärlbildning i Xenopus laevis 4 , men som det kan visas i detta manuskript kan det tillämpas på andra små djur. Färginsprutning i hjärtat är enkelt att utföra, och hela kärlsystemet kan avbildas under ett fluorescensdissektionsmikroskop, såväl som ett konfokalt mikroskop. Om färgämnet injiceras i hjärtat under fartygsutveckling kan dynamiken i kärltillväxt och förgrening avbildas i realtid 4 . Med hjälp av det väldefinierade venösa nätverket, i synnerhet PCV och rostral-flesta ISV, kan effekterna av genetisk eller miljömässig störning på angiogenes bedömas kvantitativt.

    Det mest kritiska steget i detta protokoll är injektionen av DiI-AcLDL (steg 4). Vi ger exempel på framgångsrika och misslyckade injektioner ( FiGure 3). Framgångsrikt injicerade embryon bör screenas under ett fluorescensmikroskop, såsom beskrivs i steg 4.3. Om PCV inte är synligt 30 min efter injektion injicerades inte tillräckligt DiI-AcLDL ( Figur 3C ). Misslyckade injicerade embryon kan bedövas och injiceras igen. I vissa fall kan DiI-AcLDL injiceras på en felaktig plats, i vilket fall andra organ kommer att märkas ( Figur 3D ). Kassera felaktigt injicerade embryon.

    Blodkärlen hos ett framgångsrikt injicerat embryo kommer att synas kort efter injektionen, och fluorescensen varar i flera timmar. Om injektionen utförs före bildandet av ISV, kan deras utveckling avbildas i ett levande embryo, vilket ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka utvecklingen av kardiovaskulärsystemet i realtid och in vivo 4 . Som Xenopus har framgångsrikt använts som en modell för att skärma vaskulär dStörande medel i däggdjur 14 kan det experimentella tillvägagångssätt som beskrivs här kombineras med farmakologiska störningsexperiment och användas som en screeningsplattform för att hitta läkemedel som förstärker eller hämmar angiogenes.

    Blodkärl kan visualiseras genom genetiska verktyg, liksom genom de färgämnesbaserade märkningsmetoderna som beskrivs här. Exempelvis möjliggör transgen Xenopus 15 eller zebrafisk 16 som uttrycker fluorescensproteiner under kontroll av celltypsspecifika promotorer levande avbildning av blod och lymfatiska kärl, och det är även möjligt att diskriminera artärer från vener 16 . Även om genetiska metoder är överlägsna och genererar mer konsekvent märkningseffektivitet är färgämnesbaserade metoder lättillgängliga för de flesta laboratorier utan tillgång till sådana genetiskt manipulerade djur. I Xenopus resulterar transkardiell perfusion av DiI-AcLDL iMärkning av de flesta endotelceller 4 , och artärer och vener skiljer sig inte från fluorescensbilder. Intriguingly märker tomatelektin-fluorescein selektivt artärer i möss och när de injiceras med DiI-AcLDL kan arterier och vener diskrimineras 17 . Även om applikationen inte testades i andra vävnader eller djur, ger detta en lovande riktning för att undersöka den dynamiska utvecklingen av artärer och vener i Xenopus .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna har ingenting att avslöja.

    Acknowledgments

    Denna studie inspirerades av Levine et al. , Som beskrev denna experimentella metod och gav en omfattande beskrivning av vaskulär utveckling i Xenopus laevis. Vi tackar medlemmarna i vårt laboratorium för deras inmatning. Den här studien stöddes av Yonsei Universitets framtidsledande forskningsinitiativ från 2015 (2015-22- 0095) och National Research Foundation (NRF) Bio & Medical Technology Development Program finansierat av ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering ( NRF-2013M3A9D5072551)

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    35 mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
    60 mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
    Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
    BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
    CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1x MBS component
    Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
    DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
    FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
    Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
    Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
    Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
    Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
    needle tip cutting
    Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
    hCG MNS Korea For priming of frogs
    HEPES Sigma H3375 Buffering agent
    Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
    KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
    L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
    L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
    MgSO4 Sigma M7506 MBS component
    Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
    MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
    NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
    NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
    Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
    PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
    pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
    PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
    Pin Pinservice 26002-10 For incision
    Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
    Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
    Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
    SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
    Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
    embryo collection

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
    2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
    3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
    4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
    5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
    6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
    7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
    8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
    9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
    10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
    11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
    12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
    13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
    14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
    15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
    16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
    17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

    Tags

    Utvecklingsbiologi utgåva 123 vaskulogenes angiogenes kardiovaskulär utveckling, Mikroinjektion DiI-AcLDL bildbehandling venekomplexitetsindex
    Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ohk, J., Jung, H. Visualization andMore

    Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter