Summary
אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.
Abstract
פילופודיה הן בליטות תאיות דינמיות, דמויי אצבע, הקשורות בהעברה ובתקשורת תאית. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני האיתות המורכבים העומדים בבסיס החניכה הגופנית, הארכה וייצוב או נסיגה שלאחר מכן, חשוב לקבוע את פעילות החלבון הזמני-הטמפורלי במבנים דינמיים אלה. כדי לנתח את תפקוד החלבון ב filopodia, פיתחנו לאחרונה אלגוריתם חצי אוטומטי מעקב שמתאים לשינויים צורה filopodial, ובכך מאפשר ניתוח מקבילי של הדינמיקה בליטה וריכוז חלבון יחסית לאורך כל אורך filopodial. כאן, אנו מציגים מפורט שלב אחר שלב פרוטוקול עבור טיפול התא אופטימיזציה, רכישת התמונה וניתוח תוכנה. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לשימוש בתכונות אופציונליות במהלך ניתוח תמונות וייצוג נתונים, וכן הנחיות לפתרון בעיות עבור כל השלבים הקריטיים לאורך הדרך. לבסוף, אנו כוללים גם השוואה של דEscribed תוכנת ניתוח תמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodia. יחד, הפרוטוקול המוצג מספק מסגרת לניתוח מדויק של הדינמיקה חלבון ב בליטות filopodial באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
Introduction
שליטה ספציו-טמפורלית של חלבונים רגולטוריים אקטין קשורה דינמיקה פילופודיום 1 , 2 . מעקב ריכוז חלבונים בריכוז מרחבי לאורך כל אורך filopodial דרך הזמן ולכן חיוני כדי לקדם את הבנתנו את המנגנונים ביסוד היזום, הארכה, ייצוב או קריסה של מבנים דינמיים אלה 3 , 4 . שלא כמו ניתוח חלבון cytosol, שבו שינויים רבים צורה התא מתרחשים בקנה מידה גדול יותר, filopodia הם מבנים דינמיים מיקרו אשר כל הזמן אבזם 5 וכופף, ובכך מונע ניתוח באמצעות גישה פשוטה כגון קו סריקה.
פתרונות תוכנה שונים למעקב אחר הצורה filopodial זמינים 6 , 7 , 8 , 9 . כמו כןIse, תוכנה למעקב ratiometric של הדינמיקה חלבון בתוך הגוף התא פותחה 10 , 11 . כדי לשלב מעקב אוטומטי של הצורה filopodial וניתוח חלבון זמן ספטיו, פיתחנו לאחרונה ניתוח תמונה תוכנה המבוססת על קמור גוף האלגוריתם 12 . שיטת ניתוח חדשנית זו, המופעלת באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI), משלבת לראשונה את ריכוז החלבון היחסי לאורך אורך הגדילה ומהירות הגדילה, ומאפשרת מדידה מדויקת של התפלגות חלבונים מזמניים-טמפורליים ללא תלות בתנועה של אלה מבנים דינמיים 12 .
הרעיון מאחורי התוכנה (קוד המקור זמין באופן חופשי, ראה להלן) היא כי אחד הקודקודים של גוף קמור יעלה בקנה אחד עם קצה של פילופודיום ( איור 1 א ). על ידי הסתכלות על מסגרת הבאהR את הקודקוד הקרוב ביותר של גוף קמור, עצה מרגש ניתן לעקוב לאורך כל הסרט. לאחר קצה מזוהה בכל מסגרת, המיקום שלה משמש לצייר ציר על ידי הצטרפות קצה עם נקודת התייחסות בבסיס של פילופודיום ( איור 1 ב ). לבסוף, תוך שימוש בנקודות ראשיות שווה, שתפקידן נקבע על ידי הפיקסל החציוני בעוצמה מקסימלית לאורך הקו האורתוגונלי לציר, משמשות לקביעת עמוד שדרה העוקב אחר הצורה הפילופודיאלית. ניצול של עמוד שדרה זה מסתגל, kymograph מופק כדי לעקוב אחר הצמיחה filopodial ריכוז חלבון עד שלושה ערוצים לאורך אורך filopodial ( איור 1C ).
איור 1: עקרון העבודה של תוכנת ניתוח תמונה. ( א ) האלגוריתם שמאחוריהתוכנה. ב Step1 המשתמש מציין את הפניה (בסיס) ואת קודקוד (קצה) של פילופודיום. בשלב 2-1 את עמוד השדרה של פילופודיום מתקבל באמצעות פיקסל חציון עם ערך אינטנסיביות מקסימלית. בשלב 3 את עמוד השדרה משמש פרופיל חלבון מרחבי פרופיל. בשלב 2-2 התוכנה עוקבת באופן אוטומטי את קצה במסגרת הבאה. כל התהליך חוזר. ( ב ) תצלום של אלגוריתם עם פילופודיום אמיתי מציגה אלמנטים חשובים כגון גוף קמורה כי הוא משמש למעקב. ( ג ) סקירה של פרמטרים שניתן למדוד עם האלגוריתם. נתון זה שונה מהתייחסות 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוכנת ניתוח התמונה מופעלת ב Matlab (המכונה תוכנה תכנות) באמצעות שימוש גרפיממשק. כדי למקסם את הגמישות והחוסן להגדרה הניסויית, המשתמש יכול להתאים סדרה של פרמטרים למעקב ( למשל זווית כיפוף מותרת ותנועה בין-מסגרתית) וכן לבצע כמה תיקונים לסרטים ( למשל חיתוך, סיבוב, הסרת אובייקטים לא רצויים) ( איור 2 א וטבלה 1) .
| GUI | לא. | חובה | תאור | שם (ב- GUI) | ||||
| # 1 | 1 א | Y | טעינת קובץ .tiff מוערמים המייצגים את גוף התא (עם תיבת מסומנת) או ליצור גוף תא superimposed מערוצים | סלבודי | ||||
| # 1 | 1b | Y | חלבון 1 | |||||
| # 1 | 1 ג | Y | טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 2 | חלבון 2 | ||||
| # 1 | 1 ד | Y | טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 3 | חלבון 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | איפוס הכל לטעינת קובצי תמונות מוערמים מראש | אִתחוּל | ||||
| # 1 | 2 א | Y | גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הראשונית לניתוח בחלון GUI # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2 ב | Y | גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הסופית לניתוח בחלון GUI # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2 ג | Y | סרגל גלילה המייצגמסגרת nt | NA | ||||
| # 1 | 2 ד | N | הערך האפור של הפיקסלים שמתחתיו כל הפיקסלים יוגדרו לאפס | NA | ||||
| # 1 | 2e | N | הערך האפור של הפיקסלים שמעליהם כל הפיקסלים יוגדרו לערכים מקסימליים | NA | ||||
| # 1 | 2 ו | N | הגדר את ערכי העוצמה של הפיקסלים שצוינו על ידי <2e> <2f> | מַעֲרֶכֶת | ||||
| # 1 | 2 גרם | N | הפעל את הסרט מותאם-עוצמה | לְשַׂחֵק | ||||
| # 1 | 2h | N | חתוך תמונה | יְבוּל | ||||
| # 1 | 2i | N | סובב תמונה | לְסוֹבֵב | ||||
| # 1 | 2 | N | מחק אזורים בכל הערימה | מחק אזורים | ||||
| # 1 | 3 א | Y | לחץ כדי לפתוח את 'חלון ניתוח' (חלון GUI # 2) | חלון מעקב | ||||
| # 1 | 3 ב | Y | הזן את הגודל של פיקסל במיקרונים | הזן גודל פיקסל | ||||
| # 2 | 4 | Y | לחץ כדי ליצור את התמונה גבול / קצה של גוף התא על גבי | גְבוּל | ||||
| # 2 | 5 | Y | לחץ כדי לבחור את הבסיס ואת קצה filopodia | הפניה | ||||
| # 2 | 6 א | Y | הזן את מספר הפלחים או הצמתים | לא של מקטעים | ||||
| # 2 | 6 ב | Y | הזן את אורך הסריקה (בניצב לציר) | רוחב סריקה | ||||
| # 2 | 6 ג | Y | הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף | דקות מדויקות לאחר | ||||
| # 2 | 6 ד | Y | הזן את הרדיוס של מעגל איתור קצה (כלומר אזור שבו קודקוד יכול להיות מקומי במסגרת הבאה) | רדיוס של איתור קצה | ||||
| # 2 | 6e | Y | הזן את הזווית המקסימלית פילופודיום יכול לכופף מן הציר האנכי | זווית סף | ||||
| # 2 | 6F | N | הוסף נקודות התייחסות לבסיס ולעצה עבור מסגרת ספציפית זו | בחר התייחסות | ||||
| # 2 | 6 גרם | N | הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף עבור מסגרת מסוימת | דקות מדויקות לאחר | ||||
| # 2 | <Td> 6hN | הזן את הרדיוס של מעגל האיתור עבור המסגרת הספציפית הזו | רדיוס של איתור קצה | |||||
| # 2 | 6i | N | לאחר הזנת כל הפרמטרים עבור המסגרת הספציפית לחץ כדי לאחסן את הערכים לזיכרון ולקובץ לעיון נוסף | לְהוֹסִיף | ||||
| # 2 | 6 | N | לחץ כדי למחוק את הפרמטרים באופן ידני עבור אותה מסגרת | לִמְחוֹק | ||||
| # 2 | 6k | N | לחץ כדי למחוק את כל הפרמטרים המאוחסנים ידנית באמצעות 'לוח תכונות אופציונלי' עבור כל המסגרות | אִתחוּל | ||||
| # 2 | 6l | N | בדוק לפני המעקב כדי לאחסן את כל תוצאות המעקב בזיכרון לצורך הפניה בעתיד | היסטוריה עקבות | ||||
| # 2 | 7 | Y | לחץ כדי להתחיל במעקב | לעקוב ולנתח | ||||
| # 2 | 8 א | N | לחץ כדי להתחיל מעקב אחר עוצמת ערוץ חלבון | ניתוח חלבון אינטנסיבות | ||||
| # 2 | 8 ב | N | בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת ערוץ חלבון לאורך אורך filopodial | פילופודיה שלמה | ||||
| # 2 | 8 ג | N | בדוק עבור מעקב אחר חלבון התייחסות או חלבון A | פרוטאין | ||||
| # 2 | 8 ד | N | בדוק את המעקב אחר החלבון B | פרוטיין | ||||
| # 2 | 8e | N | בדוק את המעקב אחר החלבון C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8F | N | בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת החלבון הממוצע ב thעצה | קצה מוביל | ||||
| # 2 | 8g | N | הזן את אורך הקצה | אורך עצה | ||||
| # 2 | 8h | N | הזן את המרחק המינימלי מבסיס שמעליה מתחיל הקצה להיווצר | סף | ||||
| # 2 | 8i | N | לחץ כדי לשמור את התוצאות המוביל ניתוח קצה לקובץ | לחץ על הכפתור | ||||
| # 2 | 9 א | N | לחץ כדי להתחיל ניתוח חלבון ratiometric | לְהַשְׁווֹת | ||||
| # 2 | 9b | N | בדוק כדי להשוות בין חלבון B לגבי A | Log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9 ג | N | בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <Td> 9dN | בדוק כדי להשוות חלבון B ביחס A בקצה | Log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A בקצה | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10 א | N | בחר מפת צבע אחרת (ברירת מחדל: Jetplot) | מפת צבע | ||||
| # 2 | 10 ב | N | ערוך את colormap | עריכת colormap | ||||
טבלה 1: סקירה כללית של כל הפונקציות המופיעות ב- GUI Windows # 1 ו- # 2.
ברגע שזה נעשה, התוכנית יוצרת גוף קמורה באופן אוטומטי מסלולים קצה לאורך הסרט. פרמטרים שחולצו מהסרט, כגון קימוגרפיה רטיומטרית, מהירות גדילה ואורך פילופודיאליRe מוצג גם מאוחסן בתיקיית העבודה כתמונות וכקובצי נתונים. פרמטרים אחרים כגון החיים filopodial, קצב הצמיחה שיעור נסיגה לאחר מכן ניתן לחלץ ונותח נוספת מקבצי הנתונים המאוחסנים ( איור 2 ב ).
איור 2: ממשק משתמש גרפי לשימוש בתוכנת ניתוח התמונות. ( A ) GUI חלון # 1 משמש לטעינה ועיבוד של תמונות. התוכנית יכולה לטעון עד 3 ערוצי חלבון, לפיה 2 ערוצים מושווים זוג חכם. החלון מגיע עם חובה (כחול) תכונות אופציונלי (ירוק) לעיבוד מראש את התמונות לפני המעקב ( B ) GUI חלון # 2 משמש למעקב אחר פילופודיום, כמו גם ספטיו- temporal ו יחס- metric ניתוח חלבון. שוב, תכונות אופציונליות מסומנות בירוק. נתון זה היה modifiEd מתוך התייחסות 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת המדגם וטיפול בתוכנה. אנו מתחילים עם הוראות מפורטות על תאים culturing ו רכישת סרטים אופטימיזציה עבור ניתוח התמונה. סעיף זה על רכישת נתונים ואחריו תיאור מפורט להפעלת תוכנת ניתוח התמונה. לאורך הפרוטוקול, אנו מציגים צעדים קריטיים ותכונות אופציונליות שיש לקחת בחשבון בעת איסוף ועיבוד נתונים. לבסוף, אנו מנתחים filopodia ממערכות מודל שונים עם תוכנת ניתוח התמונה, לפני הסגירה עם השוואה של התוכנה המתוארת ניתוח התמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodial ודיון על מגבלות והכיוון העתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות התא
- תרבות HeLa או תאים COS ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 4.5 גרם / L גלוקוז D, L-alanine-L- גלוטמין dypptide, pyruvate, 10% בסרום שור עוברית, ו 10 יחידות / מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות נוירונים בתרבות התקשורת ללא L- גלוטמין, חומצה גלוטמית או חומצה אספרטית, בתוספת 0.5 מ"מ L-alanine-L- גלוטמין dipeptide, נטול תוסף נוירונים חינם ו -10 יחידות / מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין.
- לאחר 40% confluency הוא הגיע, transfect תאים עם בונה של בחירה באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן. שמור תאים transfected בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 15-18 שעות.
- כדי להפחית את השינויים pH ו osmolarity (עקב אידוי) במהלך רכישת התמונה, למלא את תא התרבות תאים (לפני הדמיה) עד 90% עם 37 ° C מראש חימם בינוני המכיל 20 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1 -Ppiperethethanesulfonic חומצה (HEPES). לאטוםהמכסה, להחיל שכבה דקה של שומן ואקום על החלק הפנימי של המכסה בעדינות לחץ על החדר התרבות המכיל את התאים transfected.
2. רכישת תמונה
הערה: אורך filopodia משתנה מ 2-10 מיקרומטר 13 . Filopodia לגדול במהירות ממוצעת של 0.05-0.1 מיקרומטר / ים 13 , 14 .
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה 60X או 100X ולא binning פיקסל (כאן, מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal). השתמש בשיעורי רכישה גבוהים מ 1 הרץ (הרץ) כדי לעקוב אחר הדינמיקה filopodial. כדי למזער out-of- להתמקד חפצים, filopodia התמונה קרוב לממברנה הבסיסית ( כלומר משטח המצע).
- כדי להבטיח מעקב חלקה, להתאים את זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת לייזר כך יחס אות לרעש (SNR) גדול יותר מאשר 4. הימנע הרוויה של ערוצים בודדים ( כלומר פיקסל ערכים של255 עבור תמונות 8 סיביות ו 65,535 עבור 16 סיביות תמונות), כמו זה ימנע ניתוח התמונה הבאים.
- כדי למנוע דימום, רק להשתמש בתגיות הקרינה תואם קווי לייזר מסננים של המיקרוסקופ (לפרטים ראה התייחסות 15 ).
3. עיבוד תמונה מראש
הערה: השתמש בתוכנת ImageJ או בתוכנה זמינה אחרת כדי לעבד מראש תמונות 16 , 17 .
- אם המדגם נע, נכון להיסחף לרוחב באמצעות תוכנה זמינה ( למשל https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) לפני הניתוח. לא לכלול סרטים עם סחף צירית (כלומר תנועה בכיוון z).
- רקע נכון ( כלומר, ערכים אפורים של אזורים מחוץ לתא), הלבנה ( כלומר הפסד מתמשך אם עוצמת הקרינה עקב פגיעה בחלבונים הקרינה) ו-שוקת דימום אפשרי ( כלומר האות משפעת אחתאו בדיקה של שני ערוצים) באמצעות תוכנה זמינה ( למשל http://imagej.net/Category:Plugins ו 16 , 17 ).
הערה: עוצמות הקרינה של ערוצים בודדים אינם משתנים על ידי התוכנה. - כדי להבטיח את ניתוח התמונה הבאים, לשמור סרטים המתאימים ערוצי חלבון מסוים בקנה מידה אפור כמו ".tiff" בפורמט קובץ מוערמים בתיקייה עבודה.
הערה: המידות ( כלומר , גודל, אורך) של ערימות חייב להיות זהה עבור כל הערוצים.
4. ניתוח תמונה - שלב 1: טען תמונות
הערה: התוכנה המתוארת כאן נכתבה ב- Matlab (המכונה תוכנת תכנות) ותפעל רק עם תוכנית זו.
- הורד את התיקיה zip המכיל את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונות מהאתר הבא: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwהם /. לפתוח ולהעתיק קבצים לתוך תיקיית העבודה.
- לאחר ההתקנה, לפתוח את תוכנת התכנות ולהפעיל 'filopodiaAnalysisM3.fig'. חלון GUI # 1 יפתח כפי שמוצג באיור 2 א .
- טען את הקבצים הנפתחים "tiff" המתאימים לחלבון מסוים של עניין בחלון GUI מס '1 באמצעות הכפתורים <1b> לחלבון A, <1c> לחלבון B, <1d> לחלבון C. ראה איור 2 וטבלה 1 לפרטים.
הערה: חלבון מוצג בחלון GUI # 1 משמש כערוץ הפניה לניתוח הסופי של הראיומטריה. - יצירת תמונה על גבי תא של חלבונים על ידי לחיצה על <1a>.
- לחץ על <a> כדי להקצות את המסגרת הראשונה ואת <2b> למסגרת האחרונה המשמשת לניתוח.
- לחלופין, לחתוך את האזור של ריבית (ההחזר על ההשקעה) המכיל את הפילופודיום של עניין באמצעות לחצן <2h>, לסובב את התמונה uלחצן 'שירה' <2i> או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור החינמי <2j>.
הערה: כדי לייעל את ניתוח התמונה, מומלץ לבודד את ההחזר על ההשקעה ( כלומר , לחתוך, לסובב, למחוק) יחד עם השלבים מראש אחרים (חיסור רקע, תיקונים אקונומיקה, וכו ') באמצעות ImageJ. - להזיז את המחוון <2c> עבור כל מסגרת עבור בקרת איכות ולבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט.
5. ניתוח תמונה - שלב 2: יצירת מעקב
- לחץ על כפתור <3a> בחלון GUI # 1 כדי לפתוח את חלון GUI # 2 (ראה איור 2 ב ).
- לחץ על כפתור <4> בחלון GUI # 2 כדי ליצור את המסכה של גוף התא על גבי (שנוצר בחלון GUI # 1 לאחר לחיצה על <a>>). התוכנית גם יוצרת את הגבול של המסכה, שם הקמור גוף מיושם כדי לקבל את נקודות הקודקוד.
- קליCk כפתור <5>; יופיע סמן. השתמש הסמן כדי לבחור את הבסיס (שממנו משם המרחק של קצה פילופודיאלי נמדדת) ואחריו קצה filopodia במסגרת שבו הוא מופיע לראשונה. לשם כך, הזז את המחוון בחלון מס '2).
הערה: כדי למזער שגיאות בפלט הנתונים, הנח את נקודת הבסיס אנכית מתחת לעצה הגופנית לאורך הציר. מיצוב נקודת הבסיס במקומות אחרים ( כגון מעבר רוחבי) עשוי להציג הטיה כיוונית בערכי הקרינה בתוך גוף התא. - בחר את אורך הסף (מעל אשר filopodia יהיה להתכופף) באמצעות <6c>.
הערה: אורך זה מוגדר כמרחק בין נקודת הבסיס (נבחר באמצעות <5>) וגבול גוף התא ( כלומר האזור שממנו מתחיל הפילופודיה). המרחק נמדד בפיקסלים. - ציין את מספר המקטעים המשמשים כדי להשוות את הצורה של filopodia בתיבה <6a>.
הערה:המספר המרבי של מקטעים תלוי באורך המקסימלי שמגיע על ידי פילופודיום, אבל גם איך פילופודיום מתכופף. אל תבחר מספר מקטעים גדולים ממספר הפיקסלים בין הבסיס לקצה ( כלומר , אורך הסף). בחירת פלחים נוספים מאורך הסף המוגדר בשלב 5.4. ( כלומר מספר פיקסלים בין הבסיס ואת קצה) תביא overestimation של אורך של פילופודיום. - ציין את רוחב הסריקה, הפועל כסורק אופקי למיקום הצמתים, ב <6b>.
הערה: צמתים אלה משמשים את התוכנית כדי להתאים את הקו שהצטרף הבסיס ואת קצה עם הגוף של פילופודיום ( כלומר כדי ליצור את עמוד השדרה). כנקודת התחלה, לשים ערך בפיקסלים שווה אורך המרבי מוכפל גורם
. - ציין את רדיוס הסריקה (בפיקסלים) בתיבה <6d>. השתמש בערך שהוא כ 50% יותר מאשר obשימש בין העקירה עצה בין מסגרת.
הערה: שימוש ברדיוס סריקה גדול מאוד עלול לתפוס נקודות גוף קמור לא רצויות במסגרות שבהן אין עצה פילופודיאלית אמיתית ( למשל, מחוץ לתנועת המטוס או ל- SNR נמוך). - ציין את זווית ההטיה בתיבה <6e>.
הערה: סף הזווית נקבע על ידי הזווית המקסימלית של פילופודיום הוא כיפוף במהלך הניתוח כולו. הגדרת סף הזווית מסייעת התוכנה כדי למנוע מעקב של מבנים לא רצויים גדל בצד של filopodia כאשר filopodia מתכופף לעבר הגוף התא. התוכנית פועלת באופן אמין עבור filopodia עם זווית הטיה פחות מ 45 מעלות מן הציר האנכי. - כדי להתחיל במעקב, לחץ על הלחצן 'מעקב וניתוח' בחלון GUI # 2. לחץ על התיבה 'היסטוריה עקבות' בחלון GUI # 2 כדי לשמור את פרוטוקול המעקב כולו לעיון בעתיד.
הערה: לאחר השלמת הליך המעקב, מאוחסן אורך הפילופודיום בכל מסגרתאת הסדין בשם 'length_vel' של 'dynamics.xlsx' עבור הפניות בעתיד. כמו כן, כל שאר פרמטרים המעקב מאוחסנים בגיליון בשם "פרמטרים" של "dynamics.xlsx". - לחלופין, אם filopodia אינו מזוהה באופן אוטומטי בכל המסגרות, בצע את השלבים הבאים כדי לתקן ידנית עבור זה.
- בקר את המסגרת המתאימה באמצעות המחוון בחלון מס '2 ובחר ידנית את קצה הפילופודיום.
הערה: מסגרות, כאשר נקודות גוף קמור לא מזוהים יוצגו על ידי אזור כחול בחלון המעקב של חלון GUI # 2. זה חובה לבדוק את "ההיסטוריה עקבות" כפתור לפני תוכנית המעקב היה ביוזמת גישה קואורדינטות קדוטיים באותה מסגרת. - בחר את נקודות ההתייחסות (בסיס ואחריו טיפ) באמצעות <6f> ב- GUI Window # 2. ציין את הפרמטרים האחרים כגון 'אורך הסריקה', 'מדידה מדויקת לאחר' ו'זווית כיפוף מרבית '; עבור מסגרת כפי שמתואר צעדים 5.4-5.8.
- לחץ על הלחצן <6i> כדי לשמור את הפרמטרים החדשים (ספציפיים למסגרת אחת). יש לחזור על השלבים עבור כל המסגרות המצוינות על ידי האזור הכחול.
- בסיום, אתחל מחדש את תהליך המעקב באמצעות <7>.
הערה: תיקון זה יכול לשמש גם אם התוכנית פתאום עובר מ filopodial אחד למשנהו בתוך סרט. כחלופה, שקול חיתוך סרטים המכילים filopodia מרובים.
- בקר את המסגרת המתאימה באמצעות המחוון בחלון מס '2 ובחר ידנית את קצה הפילופודיום.
. 6. ניתוח תמונה - שלב 3: ניתוח חלבון זמן ספטיו
- עבור ניתוח ספציו-טמפורלי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי <8b> ולאחר מכן את ערוץ החלבון המעניין (<8c> ו / או <8d> ו / או <8e>).
הערה: חובה לבחור פרוטאין לפני ניתוח רטיומטרי (<9a>, <9b> ו / או <9c>) מאחר וחלבון A משמש כנקודת התייחסות. - לחץ על <8a>כדי ליזום מעקב חלבון לאורך אורך filopodial באמצעות עקבות שנוצר בשלב 5.9.
7. ניתוח תמונה - שלב 4: יחס חלבון ניתוח מטרי
- סמן את תיבת הסימון <9b> או <9c> ולחץ על הכפתור <9a> כדי לקבל את החלקה הרטיומטרית הזמנית-ספקטורלית.
הערה: כדי למנוע מצג שווא של ריכוז חלבון יחסי, התמונה ratiometric אינו מזויפים כמו X / Y אבל כמו יומן (X / Y). לשימוש עתידי, העלילה ratiometric מיוצא קבצי ". PNG" ו ".fig" פורמט, ונתונים מגרש גולמי מאוחסן בתוך "dynamics.xlsx" הקובץ.
8. ניתוח תמונה - שלב 5: ניתוח עצה פילופודיאלי
- סמן את תיבת הסימון <8f> וציין את אורך הטיפ ואת אורך הסף מהבסיס באמצעות <8g> ו- <h>. לחץ על הלחצן <push> כדי לשמור את הנתונים לקובץ 'dynamics.xlsx'. לחץ על <ניתוח חלבון אינטנסיבות> כדי ליצור אתעקבות של עוצמות חלבון של קצה פילופודיאלי לשמור על ניתוח ratiometric.
הערה: אורך העצה קובע את מספר הפיקסלים בקצה המשמש לניתוח. התוכנה תחזיר את הערך הממוצע בעוצמה של פיקסלים בקצה מעל כל מסגרת. אורך הסף קובע את המרחק המינימלי מהבסיס לקצה שמעליה מתחיל הפילופודיום (קצה פילופודיאלי) לגדול (וכאשר התוכנית מתחילה לעקוב אחר עוצמת העוצמה של הטיפ). אז אורך קצה צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הסף. - לחץ על היחס הרצוי כדי לנתח באמצעות <9d> או <9e>.
- לחץ על כפתור ההשוואה <9a> כדי ליצור את הנתונים ratiometric.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות תאים COS transfected עם סמן עבור אקטין נימי (F-tractin 18 , אדום) ואת הפניה cytosolic (ירוק), מצאנו אקטין עשיר filopodial בליטות ( איור 3 א , פאנל העליון). סדרות זמן הראו כי filopodia להרחיב במהירות לחזור ( איור 3 א , לוח באמצע). באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אנו עוקבים אחר filopodia הפרט. השוואה של אורך filopodial נמדד על ידי היד לעומת תוכנת ניתוח התמונה הראה ערך קורלציה חוצה פירסון של 0.947 בטענה כי התוכנה אמינה מעקב סיומת פילופודיאלי 12 . בנוסף לצמיחה שיעורי נסיגה של filopodia הפרט, kymographs בחלק התחתון של איור 3A גם מתארת עוצמות הקרינה של אקטין (למעלה), הפניה cytosolic (באמצע), ואת הריכוז היחסי של אקטין מנורמל הציטוזוייחוס מורשה (למטה). יחד, ניסויים אלה מספקים עדות לכך שהתוכנית מודדת באופן מהימן את הדינמיקה של הצמיחה, כמו גם את הריכוז היחסי של חלבוני חלבון לאורך כל מחזור החיים המלא של פילופודיום יחיד בתאי COS.
הבא, חקרנו דינאמיקה filopodia ב נוירונים בהיפוקמפוס העכבר העכבר ( איור 3 ב , הלוח העליון). לשם כך, נוירונים היו transfected ביום במבחנה (DIV) 8 עם F-tractin (אדום) והפניה cytosolic (ירוק) ( איור 3 ב , לוח באמצע). כמו בניסוי הקודם, kymographs המתארים עוצמות הקרינה של אקטין הפניה cytosolic הראה כי העשרה יחסית של אקטין קודמות היווצרות של filopodia dendritic exploratory ( איור 3 ב , לוח תחתון). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם עבודה שפורסמה, המתאר היווצרות של טלאים עשירים אקטין לפני filopodialהארכה 3 , 19 , 20 .
איור 3: דוגמאות של Filopodia ניתוח על ידי התוכנה. ( A ) תמונה סקירה (הלוח העליון) וסדרת הזמן (פאנל באמצע) של תאים COS transfected עם F- טרקטין (אדום) ו cytosolic סמן (ירוק). להלן, מגרשים המתארים ניתוח של דינאמיקה הצמיחה filopodial וריכוז יחסית של F- טרקטין לאורך פילופודיום (לוחות תחתון) מוצגים. ( B ) סקירה כללית על התמונה של נוירון בהיפוקמפוס transfected עם סמן cytosolic (למעלה) וסדרת הזמן של נוירון transfected עם F- טרקטין (אדום) ו cytosolic סמן (ירוק) (פאנל באמצע), כמו גם העלילה המתאר ניתוח של דנריטי הצמיחה הגדילה דינמיקה ואת הריכוז היחסי של f-tractin לאורך הבליטה (לוחות תחתון).( ג ) תמונה SEM (פאנל שמאל) וסדרת הזמן של תאים hella transfected עם f-tractin (הפאנל הימני). הערה תנודות בעוצמת הקרינה בשל buckling filopodial. סולם ברים = 20 מיקרומטר (A, הדף), 50 מיקרומטר (B, הדף), 10 מיקרומטר (C, הדף). נתון זה שונה מהתייחסות 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
לבסוף, אנו מכוונים לאתגר את התוכנה על ידי ניטור filopodia בתאי HeLa. Filopodia בתאי הלה הם ארוכים ( איור 3 ג , פאנל שמאל) דינמי מאוד, לעתים קרובות לעזוב את המטוס של הרכישה. למרבה הפלא, כאשר מתמקדים קרום הבסיס, ראינו חלק קטן של filopodia לעבור פיתול הסליל ( איור 3C , פאנל הימנית העליונה), לפיו חלקים של טרנספורט טרנספורטעזב את המטוס המוקד. לפיכך, kymographs המתארים את עוצמת הקרינה המוחלטת של F-tractin הראה גל כמו שינויים בעוצמת הקרינה דרך הזמן ( איור 3C , הפאנל הימני התחתון). התנהגות זו מזכירה buckling filopodial, מנגנון שתואר לאחרונה להיות בשימוש על ידי filopodia להפעיל כוחות משיכה 5 .
לסיכום, ניסויים אלה מספקים עדות לכך שהתוכנה עוקבת באופן אמין אחר ריכוז החלבון ודינמיקת הצמיחה של פילופודיאל ממקורות שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למעקב דינמיקה הצמיחה filopodial וניתוח של ריכוזי חלבון יחסית מבנים דינמיים אלה באמצעות אלגוריתם קמור האל. באמצעות התוכנה, עד 3 ערוצים ניתן להשוות זוג חכם בריצה אחת, לפיה הריכוזים היחסיים של שני ערוצים ( כלומר חלבונים) נקבע במהלך מחזור הרחבה / השבת ומאוחסן קבצי תמונה ונתונים בתיקיות נפרדות. בנוסף לפעולות שגרתיות, התוכנה מספקת גם מספר פרמטרים שניתן לשנות כדי לייעל את הניתוח עבור הניסוי בהתאמה. תיאור מפורט של שינויים אלה, כמו גם פתרון בעיות ניתן למצוא בסעיף פרוטוקול בטבלה 1 .
ניתוח תמונה אינו מוגבל סוג מיקרוסקופ מסוים, אלא על ידי איכות התמונה של הסדרה הזמן. בהתחשב הרלוונטיות שלה, איכות התמונה ולכן צריך להיות מותאם עבור eהערוץ במהלך הרכישה. הניסויים שלנו מראים כי האלגוריתם עובד בצורה הטובה ביותר עבור filopodia עם SNR> 4 רכשה ב 1 הרץ באמצעות מטרה עם הגדלה מעל 40X ולא binning פיקסל. כמובן, זה חל רק כל עוד fluorophores תואמים את הגדרות המסנן ( כלומר לא דימום דרך, ראה סעיף פרוטוקול 2 לפרטים). בהתחשב בעוצמות יחסית מושווים אחד נגד השני, הניתוח אינו רגיש להבדלים קטנים עוצמת האות הקרינה המוחלטת בין תאים בודדים. לכן, כדי להסיק נתונים משמעותיים, ערוץ התייחסות מוגדר היטב ( למשל סמן cytosolic) הוא בעל חשיבות רבה. עם זאת, גם אם איכות התמונה טובה יש כמה מגבלות ביולוגיות. לדוגמה, היא אינה מתאימה היטב לנתח מבנים מסתעפים, הטיה של יותר מ -45 מעלות מן הציר אורתוגונלי אל פני התא, או כאשר חפצים אחרים חוצים את המבנה הנחקר.
<P class = "jove_content"> בנוסף למגבלות ניסיוניות אלה, ישנם צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקול שיש להתחשב בהם בעת הפעלת התוכנה, שכן פעולה זו עלולה לגרום להודעות שגיאה אחרות. ראשית, ערוצים המתאימים לחלבון מסוים חייבים להיות בעלי אותו מימד והם מייצגים בדיוק את אותו החזר ROI. שנית, הקבצים הנערמים חייבים להיות בפורמט אפור '.tiff'. שלישית, קובצי התמונות הנערמים חייבים להיות בתיקיית העבודה. ולבסוף, את השמות של קבצי נתונים בתיקייה עבודה לא צריך להיות שונה, אלא אם כן זה מתוקן בקוד.כיצד להשוות את התסריט לשיטות קיימות אחרות? כדי לבדוק את תוכנת ניתוח התמונות שלנו, הורדנו מספר פתרונות תוכנה שפורסמו לאחרונה המנתחים תכונות פילופודיאליות 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 , ונבדקו כולם עבור מספר קריטריונים נבחרים. השוואה מפורטת מובאת בלוח 2 .
| Tsygankov et al. | בארי ואח '. | Nilufar et al. | Fanti et al. | קונסטנטינו ואחרים. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| נייר DOI | 10.1083 / jcb.201306067 | 10.1083 / jcb.201501081 | 10.1186 / 1752-0509-7-66 | 10.1002 / dneu.20866 | 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10.1002 / cyto.a.22569 | 10.1091 / mbc. E16-06-0406 |
| תוכנה (קישור להורדה) | Http: //www.hahnlab. Com / tools / ה דף תוכנה. HTML | Http: // jcb-dataviewer. Rupress.org/jcb/ עיון / 9059 / | Http: //www.perkinslab .ca / pubs / NMLP20XX. HTML | Http: //www.ifc. Unam.mx/ Ffm / download.html | Http: // fournierlab. Mcgill.ca/ מנוסח -7 / fTracker.html | Https: // fdynamics. Wordpress.com/ | Http: // cnblab. Elte.hu/dfma | Https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| סוג התוכנית | מטלאב | ImageJ | מטלאב | ImageJ | מטלאב | מטלאב | ImageJ | מטלאב |
| מבצע | אוטומטי | אוטומטי | אוטומטי | חצי אוטומטי | חצי אוטומטי | חצי אוטומטי | חצי אוטומטי | חצי אוטומטי |
| יחיד לעומת אצווה ניתוח | שניהם | שניהם | יחיד | יחיד | יחיד | יחיד | יחיד | יחיד |
| כל התא לעומת ניתוח תת אזור | כֹּל | כֹּל | שניהם | שניהם | שניהם | תַת | תַת | תַת |
| מספר רב של פילופודיה | מְרוּבֶּה | מְרוּבֶּה | מְרוּבֶּה | מְרוּבֶּה | מְרוּבֶּה | Ind | Ind | Ind |
| זיהוי פילופודיאלי ובדיקה חזותית | כן | כן | לא | כן | כן | כן | כן | |
| עיבוד תמונה אפשרי | לא | לא | לא | כן | לא | לא | לא | כן |
| אורך פילופודיאלי | כן | כן | כן | כן | כן | כן | כן | כן |
| דינמיקה צמיחה פילופודיאלית | כן | כן | לא | כן | כן | כן | כן | כן |
| חיים | כן | כן | לא | כן | כן | כן | כן | כן |
| אנליזה רטיומטרית ב פילופודיה | לא | לא | לא | לא | לא | לא | לא | כן </ Td> |
| פלט / פורמט אחסון | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים | תמונות / קובץ נתונים |
טבלה 2: סקירה של ניתוח תמונה בסיוע ניתוח פתרונות לכימות פילופודיה.
מתוך שמונה פתרונות ניתוח תוכנה נבדק, חמישה הופעלו באמצעות Matlab, בעוד הנותרים שלושה השתמשו ImageJ. שני פתרונות תוכנה ( טבלה 2 , משמאל) היו אוטומטיות לחלוטין אופטימיזציה עבור ניתוח אצווה של אורך filopodia, חיים ודינמיקה בתאים שלמים. מבין שש פתרונות התוכנה הנותרים, חמישה נדרשים קלט ידני נוסף ( כלומר חצי אוטומטי), בעוד אחד היה אוטומטי לחלוטין. עם זאת, רק thפתרונות אוטומטיים למחצה מספקים מידע מפורט על דינאמיקת הצמיחה של פילופודיה, זמן חיים וזהות. בין 5 הנותרים הנותרים, שלושה היו אופטימיזציה עבור ניתוח subcellular של filopodia הפרט, בעוד שני יכול לעבד filopodia מרובים במקביל. חשוב לציין, מכל שמונה פתרונות תוכנה שנבדקו, רק גישה אחת אפשרה לשלב מידע על דינמיקה של צמיחה פילופודיאלית עם לוקליזציה חלבונית רטיומטרית בתוך מבנים דמויי אצבע ( טבלה 2 , מימין).
למרות תוכנת ניתוח התמונה שלנו אינו מתאים אצווה אוטומטית או ניתוח התא כולו, כימות של filopodia מבודד לוקח רק דקות. לכן, אנו רואים כי כימות של הדינמיקה חלבון 40-50 filopodia הוא אפשרי תוך יום אחד עם התוכנה הנוכחית. לעומת זאת, תפוקה גבוהה במסכים עשויים לדרוש תיקונים נוספים לקוד כדי לייעל קלט ואחסון של אלפי filopodia הפרט באופן אוטומטידֶרֶך. בהתבסס על הפרמטרים הנדרשים, פתרונות תוכנה קיימים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר לגישה כזו. שמירה על מגבלות אלה בחשבון, התוכנה מספקת פלטפורמה אמינה לחקר ריכוז חלבון ספורטיבי- temporal בבניינים כמו בליטה בתאים. בהתחשב בכך filopodia הם לא רק מבנים תאיים כמו אצבע, סביר מתקבל על הדעת כי תוכנת ניתוח התמונה המוצגת עשוי גם להיות מתאים ללמוד דינאמיקה חלבון בתהליכים ביולוגיים אחרים ( למשל neurites, cilia העיקרית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מכירים במימון של DFG (EXC-1003 ל- MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116 (2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B. The physics of filopodial protrusion. Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al. Semi-automated quantification of filopodial dynamics. J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).
