Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder til klassificering af cytoplasmatiske foci som spædbørn

Published: May 12, 2017 doi: 10.3791/55656
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.
* These authors contributed equally

Summary

Stress Granuler (SG'er) er ikke-membraniske cytoplasmatiske strukturer, der dannes i celler udsat for en række stress. SG'er indeholder mRNA'er, RNA-bindende proteiner, små ribosomale underenheder, translationsrelaterede faktorer og forskellige cellesignalproteiner. Denne protokol beskriver en workflow, der bruger flere eksperimentelle metoder til at detektere, karakterisere og kvantificere bona fide SG'er.

Abstract

Celler udfordres ofte af pludselige miljømæssige ændringer. Stress Granuler (SG'er), cytoplasmatiske ribonukleoproteinkomplekser, der dannes i celler udsat for stressbetingelser, indgår i forskellige aspekter af celle metabolisme og overlevelse. SG'er modulerer cellulære signalveje, post-transkriptionelle genekspression og stressresponsprogrammer. Dannelsen af ​​disse mRNA-holdige granulater er direkte forbundet med cellulær translation. SG-samling udløses af inhiberet translationsinitiering, og SG-disassembling fremmes ved translationaktivering eller ved inhiberet translationsforlængelse. Dette forhold fremhæves yderligere af SG-sammensætningen. Core SG-komponenter er forsinket translation pre-initieringskomplekser, mRNA og udvalgte RNA-bindende proteiner (RBP'er). Formålet med SG-samling er at bevare cellulær energi ved at sekvestrere translationally stalled housekeeping mRNAs, hvilket tillader den forbedrede translation af stress-responsive proteiner. I additiPå kernekomponenterne, såsom forældede translationsforinitiationskomplekser, indeholder SG'er en overflod af andre proteiner og signalmolekyler. Fejl i SG-dannelse kan forringe cellulær tilpasning til stress og kan således fremme celledød. SG'er og lignende RNA-indeholdende granulater er blevet bundet til et antal humane sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser og cancer, hvilket fører til den nylige interesse i at klassificere og definere RNA-granuletsubtyper. Denne protokol beskriver analyser for at karakterisere og kvantificere pattedyrs-SG'er.

Introduction

Celler anvender mange mekanismer til at reagere på stress. Nogle svar forekommer på post-transkriptionelt niveau og involverer regulering af mRNA-oversættelse og / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmoduleret mRNA-translationsarrest og nedbrydning er forbundet med dannelsen af ​​specifikke ikke-membrancellulære foci, den mest velkendte karakteristiske er Stress Granules (SGs) 3 . SG'er er cytoplasmatiske foci, der koncentrerer ikke-translaterende mRNP'er i translationelt-arresterede celler, som reagerer på stress ( f.eks. Oxidation, varmchok, næringsstov og virusinfektion) 4 . Foruden ikke-translaterende mRNA'er indeholder SG'er translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindende proteiner og forskellige signaleringsproteiner 5 . SG'er er biomarkører af inhiberet proteinoversættelse og ændret RNA-metabolisme og er blevet bundet til celleoverlevelse og apoptose, signalvejeS og nukleare processer 5 .

SG'er er dynamiske enheder, og deres dannelse er tæt forbundet med status for cellulær oversættelse 6 . På trods af deres tilsyneladende solide udseende byder de fleste SG proteinkomponenter hurtigt ind og ud, med en opholdstid på sekunder. Mens SG'er vedvarer i minutter til timer, er de fleste af deres komponenter i hurtig flux. Inhiberingen af ​​translationsinitiering og den deraf følgende disassembling af translatoriske polysomer fremmer dannelsen af ​​SG'er; SG'er er således i ligevægt med oversættelse af polysomer. Denne polysom ​​/ SG-ligevægt er nøglen til at skelne bona fide SG'er fra andre stress-inducerede foci 6 , 7 .

Arresterende translationsinitiering indebærer omdannelse af translation-kompetente præ-initieringskomplekser, der indeholder mRNA, translationsinitieringsfaktorer (eIF) og 40S ribosomale underenheder (s O-kaldte 48S-komplekser) til translationelt stallede komplekser (såkaldte 48S * komplekser), som kan samle sig i SG 4 , 6 . SG'er fremmes ved translationel anholdelse i to forskellige trin opstrøms for 48S kompleksdannelse: interferens med funktionerne af det cap-bindende eIF4F-kompleks ( f.eks. Målretning af dets eIF4A-underenhed) eller phosphorylering af a-underenheden af ​​translationsinitieringsfaktor eIF2 medieret af en Eller flere af de fire eIF2-kinaser. Tilstedeværelsen af ​​stablede 48S-komplekser ( dvs. 40S ribosomale underenheder og udvalgte translationsinitieringsfaktorer) er et kendetegn for SG 8 , 9 .

SG'er har været forbundet med forskellige patologiske tilstande, såsom virale infektioner, neurodegeneration, autoimmunitet og kræft 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Muterede former af flere SG-komponenter er forbundet med neurodegenerative sygdomme ( fx amyotrofisk lateralsklerose), hvori neuroner viser intracellulære patologiske indeslutninger, der kan spille aktive roller i neuronal død 13 . Nogle vira kapsler SG komponenter til at hæmme SG dannelse og forøge viral replikation 14 . Nylige undersøgelser forbinder også SG'er med cancer 15 og kræftcelleoverlevelse under kemo- og strålebehandlinger 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Mens sådanne resultater har stimuleret stor interesse for SG biologi, mangler mange af de offentliggjorte rapporter vigtige kontroller for at skelne dannelsen af bona fide SG'er fra andre stress-inducerede foci.

SG'er blev oprindeligt beskrevet som ikke-membraniske cytoplasmiske foci sammensat af udvalgte mRNA-bindende proteiner (RBP'er), herunder T-celle ntracellulært antigen 1 (TIA-1) og Poly-A-bindingsprotein (PABP); Translation initiation factors; Polyadenyleret mRNA; Og små ribosomale underenheder 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionelt er deres sammensætning blevet bestemt ved teknikker såsom immunfarvning og det ektopiske udtryk af fluorescensmærkede proteiner 23 , 24 . På grund af deres højdynamiske karakter forbliver immunokalokalisering af SG-proteiner og / eller mRNA'er den definerende metode til detektering af SGs 23 , 24 . Til dato er mange RBP'er og andre proteiner (over 120 forskellige proteiner) beskrevet som SG-bestanddele 11 . Så mange SG-lokaliserede proteiner ændrer deres lokalisering både på en stressafhængig og en selvstændig måde og kan akkumulere i andre intracellulære rum og foci. Det er vigtigt at vælge korrekte SG markører og at anvende funktionelle kriterier for at skelne SG'er fra andre typer stressfremkaldt brændpunkter. Bona fide SG'er indeholder mRNA, translationsinitieringsfaktorer og små ribosomale underenheder og er i dynamisk ligevægt med translation.

Denne simple workflow er designet til at bestemme, om stress-inducerede foci er bona fide SG'er. Denne arbejdsgang indeholder flere eksperimentelle tilgange ved hjælp af U2OS-celler, celler, der almindeligvis anvendes til at studere SG'er. Disse celler er ideelle, da de har en stor cytoplasma, er relativt flade og fastgøres stærkt til glasdæksler. Andre celletyper kan bruges til at studere SG'er, men det er vigtigt at være opmærksom på, at forskelle i timing, lægemiddelkoncentration og overflod af SG-nucleerende proteiner kan ændre kinetikken og compomensætning. Derudover reagerer nogle celler på paraformaldehydfiksering ved dannelse af celleoverflader, hvilket giver et ruflet udseende, der forårsager punktatlokalisering af nogle SG-markører; Uden omhyggelig analyse kan disse kategoriseres som SG'er. Dette understreger nødvendigheden af ​​at vurdere alle kriterier, der er nødvendige for at identificere stress-inducerede foci som bona fide SG'er. Vinorelbine (VRB), en kræftbehandling, der fremmer SGS 20 , samt Sodium Arsenite (SA), en robust og velkarakteriseret SG inducer, anvendes som stress for forsøgene i denne protokol.

Canoniske SG'er indeholder flere SG markører (både proteiner og mRNA'er), som kolokaliseres i cytoplasmatiske foci. Denne protokol anvender både immunofluorescens og fluorescens in situ hybridisering (FISH) for at detektere lokalisering af proteinmarkører og polyadenyleret mRNA 22 . Kort sagt bruger indirekte immunofluorescens antistoffer ( dvs.e. Primære antistoffer), der er specifikke for et givet protein for at detektere det i cellen. Derefter genkender sekundære antistoffer (normalt arterespecifikke), der er knyttet til fluorochromer, det primære antistof og afslører målproteinlokaliseringen. Fluorescerende mikroskopi bruges til at detektere det lokaliserede signal i cellen. Ved anvendelse af antistoffer produceret i forskellige arter og påvisning af forskellige farvede sekundære antistoffer gør det muligt at påvise kolokalisering af flere antistoffer, hvilket indikerer, at deres proteinmål er fundet på samme sted 23 . Det er vigtigt at markere markører, der er blevet verificeret for at kolocalisere på bona fide SG'er.

FISH bruger en mærket probe, der baserer par til en specifik RNA- eller DNA-sekvens 25 . For at detektere mRNA bruger denne protokol en biotinyleret oligo (dT) 40 probe, som hybridiserer (eller basepar) til polyA-halen af ​​mRNA ( dvs. polyA FISH). Den biotinylerede probe detekteres derefter under anvendelse af fluorescenskonjugeret streptavidin, da streptavidin har en høj affinitet for biotin. Ved vurderingen af ​​SG'er er det vigtigt at forbinde polyA FISH med immunofluorescens, der registrerer en SG-markør, som i bona fide SG'er, skal de to signaler kolokalisere.

Ved anvendelse af denne protokol vurderes kolokalisering på flere måder. I et flerkanalsbillede ( dvs. RGB: rødt, grønt og blåt) vil kolokalisering ændre farven på det overlappede signal ( fx colocalized rød og grøn vises gul) 23 . Derudover kvantificeres kolokalisering grafisk ved anvendelse af linjeskanningsanalyse, hvor intensiteten af ​​hver af farve måles på tværs af en given linje 8 , 20 . Denne protokol beskriver to linjens scanningsanalyseprocedurer ved hjælp af ImageJ 26 . En procedure er manuel og går igennem hele processen, hviDen anden bruger en makro eller et simpelt program, der automatiserer de manuelle trin. Det er vigtigt at gennemgå det manuelle program for at forstå makroproceduren.

SG'er danner i celler, hvor oversættelse er undertrykt; Derfor skal celler med SG'er vise nedsat niveau af global translation sammenlignet med ubehandlede celler. Eksperimentelt anvendes ribopuromycylering. Puromycin og emetin tilsættes til celler i en kort varighed forud for fiksering, hvilket tillader puromycinet at inkorporere i aktivt dannende polypeptider, hvilket forårsager opsigelse 27 , 28 . Behandling med emetin er nødvendig for at forhindre geninitiering 29 . Puromycin kan derefter detekteres ved anvendelse af anti-puromycin-antistof, hvilket giver et øjebliksbillede af aktiv oversættelse. Denne metode anvendes, fordi den er hurtig, kræver ikke forsvulmer med et medium, der mangler en bestemt aminosyre (og potentielt forspænder cellerne) og afslørerSubcellulær lokalisering af proteinoversættelse. Andre metoder, især ved anvendelse af modificerede aminosyreanaloger, såsom methioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kombineret med "click-it" -kemi 30 , er blevet anvendt til at vise, at celler indeholdende SG'er udviser meget lavere oversættelse end naboceller 31 . Denne teknik kræver imidlertid methionin-sultning efterfulgt af pulsmærkning i 15-30 minutter. Methionin-sulten udgør en ekstra stress, mens den lange mærkningstid ( dvs. 15-30 minutter) resulterer i måling af kumulativ snarere end løbende oversættelse og også gør det muligt for de nyligt syntetiserede proteiner at flytte fra deres syntese til deres endelige destination inden for celle. I modsætning hertil er ribopuromycylering meget hurtigere og er kompatibel med ethvert medium, såsom det glucosefrie medium, der anvendes til at inducere SG'er via glucosesultation.

Canonical SG'er er i dynamisk ligevægtMed aktivt at oversætte polysomer. Dette kan vurderes eksperimentelt ved at behandle prøver med de lægemidler, der stabiliserer eller destabiliserer polysomer, og dermed tipper balancen mellem SG'er og polysomer 23 . Cycloheximid (eller emetin, som opfører sig tilsvarende) blokerer forlængelse ved "frysning" af ribosomer på mRNA, hvilket således nedsætter puljen af ​​tilgængelige ikke-polysomale mRNP'er, der er i stand til at danne SG'er. Eksperimentelt kan dette anvendes på to måder: ved at tilføje cycloheximid (eller emetin) før stress for at forhindre dannelse af SG eller ved at tilføje cycloheximid (eller emetin) efter at SG'erne har dannet, selv uden at fjerne stressemidlet, der forårsager SG-demontering, som standset Præinitiationskomplekser indføres langsomt i polysomfraktionen. I modsætning hertil forårsager puromycin for tidlig termination og fremmer polysom-demontering, hvilket øger puljen af ​​initierende mRNA'er, der er i stand til at samle i SG'er. Eksperimentelt øger puromycinbehandling antallet af SG'er eller sænker thresholetD, hvor de danner som svar på graderet stress eller lægemiddeldosering. Ved vurderingen af ​​virkningen af ​​puromycin er det vigtigt at anvende et sub-maksimalt niveau af lægemidlet af interesse, idet puromycin forventes at forøge lægemidlets virkning og forøge antallet af celler, der udviser SG'er - dette kan ikke ske, hvis stoffet / Stress forårsager SG'er i 100% af cellerne i begyndelsen. Dette modsætter sig cycloheximidbehandling, som adskiller SG'er og fungerer bedst, når ~ 95% af cellerne oprindeligt viser SG'er, så det størst mulige fald kan observeres og kvantificeres nøjagtigt.

Denne protokol tilvejebringer en ramme for at studere SG'er i mammale celler. Metoder omfatter: (1) immunfluorescerende farvning og ImageJ analyse til vurdering af kolokaliseringen af ​​de klassiske SG-associerede markører eIF4G, eIF3b og Ras GTPase-aktiverende proteinbindende protein 1 (G3BP1) i formodede SG'er; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) til påvisning af polyadenyleret mRNA; (3) cycloheximid og puromycinbehandling til bestemmelse af, om stress-inducerede foci er i dynamisk ligevægt med polysomer; Og (4) ribopuromycylering for at vurdere translationsstatus for celler indeholdende formodede SG'er. Sammen kan disse analyser bestemme, om stress-inducerede foci kan klassificeres som bona fide SG'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellpræparation

  1. Tilføj autoklaverede dækglas til 12 brønde i en 24-brønds plade, som angivet i figur 1A ; Dette kan gøres ved hjælp af en steril Pasteur pipette fastgjort til et vakuum for at hente hver dæksel. Tryk forsigtigt dækslet på siden af ​​brønden for at frigøre sugningen, så dækslet falder i brønden.
  2. Plade 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkomceller pr. Brønd ved et slutvolumen på 500 μl medium. Flyt pladen side til side og op og ned flere gange for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt.
  3. Tryk forsigtigt dækslisterne ned med en ren P1000-spids for at sikre, at dækslet er på bunden af ​​brønden, og at der ikke er bobler under dækslet.

2. Stressceller

  1. Den følgende dag skal du tjekke pladen visuelt for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt og jævnt sammenflettet over dækslet, som variationer mellem saMples kan have negativ indflydelse på reproducerbarheden af ​​resultaterne. Brug et 10X objektiv på et inverteret vævskulturmikroskop.
  2. Forvarm mediet til 37 ° C. Undgå at anvende koldt eller varmt medium til cellerne, da disse forårsager koldt stød eller varmeskud.
  3. Fortynd narkotika i forvarmede medier. For hver forskellig lægemiddelkoncentration fremstilles 2 brønde indeholdende 500 μl medium. Forbered yderligere 500 μL for at tillade tab under pipettering. Aliquot 4 rør, der hver indeholder 1,5 ml.
    1. Til natrium arsenit: Til hver brønd indeholdende 500 μl tilsættes 1,5 μl 100 mM natriumarsenit (slutkoncentration: 100 μM) eller tilsættes 0,75 μl 100 mM natriumarsenit (slutkoncentration: 50 μM).
    2. Til vinorelbin: Til hver brønd indeholdende 500 μl tilsættes 22,5 μL 10 mM vinorelbin (slutkoncentration: 150 μM) eller tilsættes 18,75 μl 10 mM vinorelbin (slutkoncentration: 100 μM).
      BEMÆRK: Sodium arsenit Er en velkendetegnet og almindeligt anvendt stressgranuleringsinducer og anvendes derfor klassisk som en positiv kontrol.
  4. Fjern og kassér mediet fra brøndene B1 - 4 og C1 - 4. Tilsæt medierne med stoffer og vent i 60 minutter (Figur 1A).
    1. Tilsæt 500 μl medium med 100 μM natriumarsenit til brøndene B1 og B2. Tilsæt 500 μL medium med 50 μM natriumarsenit til brøndene B3 og B4.
    2. Tilsæt 500 μl medium med 150 μM vinorelbin til brøndene C1 og C2. Tilsæt 500 μl medium med 125 μM vinorelbin til brøndene C3 og C4.
  5. 30 minutter forud for fiksering behandles brøndene i søjle 2 med 5 μl cycloheximid (1 mg / ml lager) og brøndene i søjle 4 med 2 μl puromycin (1,25 mg / ml stamme). Ryst forsigtigt pladen for at blande, før du sætter pladen tilbage i 37 ° C inkubatoren.

3. Cell Fixation og Immunofluorescence

NB: Før forsøget skal man sørge for, at metanol afkøles til -20 ° C. Lav buffere, herunder fosfatbufret saltvand (PBS), 5% normal hesteserum (NHS) i PBS og 4% paraformaldehyd (PFA ) I PBS.

  1. Kassér mediet og vask brøndene med dækglas med PBS. Afhængigt af de anvendte lægemidler kan det være vigtigt at kassere mediet, der indeholder lægemidler, korrekt. Kontakt det lokale miljøkontor for specifikke anvisninger. For at vaske effektivt, skal du fylde en klemflaske med PBS, skære spidsen for at tillade en mild strømning frem for en tæt strøm, og brug dette til at tilføje PBS til hver brønd efter aspirering af den oprindelige PBS.
  2. Fastgør cellerne ved brug af ~ 250 μl 4% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. Helt dække toppen af ​​dækslet med PFA; 250 μL bør være tilstrækkeligt, men hvis ikke, tilføj mere. Undgå altid pipettering direkte på dækslisterne, da nogle celler (eller stressbehandlingen af ​​celler) kan ændre vedhæftningen, og tHan tvinger fra pipettering kan løsne cellerne.
  3. Fjern PFA'en og kassér korrekt. Kontakt det lokale miljøkontor for nærmere oplysninger om, hvordan man kan kassere paraformaldehyd korrekt.
  4. Tilsæt ~ 250 μL methanol (-20 ° C) og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur under forsigtig gnibning; Dette permeabiliserer og flader cellerne.
  5. Fjern og kassér metanolen og bloker cellerne ved at anvende ~ 250 μL 5% NHS i 1 time ved RT O / N ved 4 ° C. Kontakt det lokale miljøkontor for nærmere oplysninger om, hvordan methanol skal kasseres korrekt.
  6. For primære antistoffer fortyndes antistofferne i 5% NHS.
    BEMÆRK: Brug af flere SG markører er nøglen til at bekræfte, om de observerede granulater er bona fide SG'er. Antallet af SG markører, der kan bruges, afhænger af filtre i mikroskopet. Hvis der findes standard grønne, røde og farrøde filtersæt, skal du bruge G3BP1, eIF4G og eIF3b ved en 1/250 fortynding.
  7. Vask brøndene 3x med PBS, og inkuber hver vask i 5 minutter.
  8. For sekundære antistoffer fortyndes alle sekundære antistoffer (1/250 fortynding) og Hoechst-farvestof (1 / 1.000 fortynding) i 5% NHS.
    1. Til dette forsøg tilsættes 12 μl af hver af følgende: 12 coverlips ved 250 μl hver-totalt: 3 mL 5% NHS): Cy2-Mouse, Cy3-kanin og Cy5-geit (en 1/250 fortynding af hver ) Og tilsæt 3 μL Hoechst farvestof.
    2. Inkubér dækslerne med de sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Under dette og følgende trin skal du beskytte prøverne fra lys ved at dække pladen med en kasse eller ved at placere folie over toppen af ​​vævskulturskålen.
  9. Vask viLls tre gange med PBS i 5 minutter hver.
  10. Monter dækslipene på mærkede glasskinner med monteringsmedium. Varm monteringsmediet i en 37 ° C varmeblok i 10 minutter; Dette reducerer viskositeten og gør det lettere at pipette. Med et snit P200 tip, pipetter 25 μL monteringsmedium pr. Dækslip på en glasskinne; 4-8 dækglas kan passe på et glasdia, forudsat at mikroskopfasen tillader dette. Overfør dækslet fra brønden til diablet ved at bruge fine tang, og sørg for at sætte cellesiden ned på monteringsmediet. Brug en ren P200 tip ved at trykke dækslet nedad.
  11. Når alle dækslisterne er monteret, skal du bruge foldet laboratorievæv til at rydde op for overskydende monteringsmedium ved at trykke laboratorievævet meget fast på glideren. Brug en klemflaske med H 2 O til at skylle det overskydende monteringsmedium og gentag derefter blottet med foldet laboratorievæv for at fjerne vandet.

4. Fluorescens i situ </ Em> Hybridisering (FISH)

  1. Plade og behandle cellerne ved hjælp af trin 1 og 2.1-4 som vejledning Det er kun nødvendigt at plader cellerne i kolonne 1, da kun 3 coverlips er nødvendige i det følgende eksperiment.
  2. Sørg for at alle buffere er tilberedt ( dvs. 4% PFA i PBS, 70% ethanol i vand, 2x saltvand-natrium-citrat (SSC) og 5% NHS), at metanolen afkøles til -20 ° C, og at Hybridiseringsovnen opvarmes til den passende temperatur.
  3. Udfør trin 3.1-3.3 for at vaske og reparere cellerne.
  4. Permeabiliser celler ved at tilsætte -20 ° C methanol i 10 minutter.
  5. Fjern metanol og inkubér afdækningen i 70% ethanol. Placer pladen ved 4 ° C natten over. Pak pladen med parafilm for at forhindre fordampning.
  6. Den følgende dag fjern ethanolen og rehydrere cellerne ved at tilsætte 500 μl 2x SSC. Inkuber dækglasene i 5 minutter med forsigtig omrøring ved stuetemperatur.
  7. Fjern 2x SSC og tilføj 500ΜL 2X SSC. Inkubér i 5 minutter under forsigtig omrøring.
  8. Placér et stykke parafilm fladt på bunden af ​​hybridiseringsovnen. Pipetter 25 μl hybridiseringsbuffer på parafilmen for hvert dækglas. Fjern dækslet fra 24-brøndsskålen (på dette tidspunkt er dækslisterne celle-side op) og læg dækslet ned på hybridiseringsbufferen. Gør dette ved 42 ° C eller eventuelt ved 65 ° C i 15 minutter.
    BEMÆRK: Gennemførelse af dette trin ved 65 ° C vil denaturere cellulære RNA'er; Dette kan forbedre signalet, hvis polyA er maskeret ved interaktioner med proteiner.
  9. Fortynd Biotin-Oligo (dT) sonden (100 ng / μl) i hybridiseringsbuffer til en koncentration på 2 ng / μl; 25 μL pr. Dækslip er tilstrækkelig.
  10. For hver dækglas pipetteres 25 μl hybridiseringsbuffer indeholdende Biotin-Oligo (dT) på parafilmen. Tag dækslipet med tang og rør forsigtigt kanten af ​​dækslet på et laboratorievæv for at fjerne overskudHybridiseringsbuffer. Overfør dækslet til hybridiseringsbufferen med Biotin-Oligo (dT); Husk at holde cellens side nede.
  11. Placer afdækningen i en hybridiseringskasse for at begrænse fordampningen. Inkubér dækglas med Biotin-Oligo (dT) i hybridiseringsbuffer i 60 minutter ved 42 ° C.
  12. Placer 2x SSC i hybridiseringsovnen for at gøre det ligeligt at ligge til 42 ° C.
  13. Tilsæt ~ 500 μL opvarmet 2x SSC til brøndene i 24-brønds fadet og brug tang for at overføre dækglasene til brønden. Inkubér i 10 minutter.
  14. Gentag ovennævnte vaske trin to gange ved 42 ° C og derefter to gange ved stuetemperatur.
  15. Komplet trin 3.5-3.10, sørg for at bruge en streptavidin fluorochrom til at detektere Biotin-Oligo (dT) i stedet for et konventionelt antistof.

5. Ribopuromycyleringsassay til vurdering af translationsstatus

  1. Plader U2OS-celler på coverslips, som angivet i trin 1, men kun plade et dækslip pr. Tilstand (i detteTilfælde, 3 dæksler: ubehandlet, 100 μM natriumarsenit og 150 μM vinorelbin) ( Figur 1 A).
  2. Stressceller, der anvender protokollen i trin 2, fuldfører trin 2.1-2.4.
  3. 5 min før fiksering, tilsæt 2 μl puromycin (stamme: 1,25 mg / ml, fortynd 2 μL i 500 μl for at opnå en endelig puromycinkoncentration på 5 μg / ml) og 2,9 μl emetin (stamme: 20 μg / ml; 2,9 μl til den samme opløsning, der allerede indeholder puromycinet) til hver brønd indeholdende 0,5 ml.
  4. Komplet trin 3.1-3.10 som angivet ovenfor, ved anvendelse af et anti-puromycin-antistof (1/1000 fortynding) for at detektere puromycin. Ideelt set brug to andre SG markører i de resterende kanaler.
  5. Når du kvantificerer puromycinsignalet, skal du tage alle billeder ved hjælp af samme eksponering. Vælg denne eksponering ved at bruge den lyseste (ubelastede) prøve og tage et billede så lyst som muligt uden mætning.
    BEMÆRK: Intensiteten af ​​anti-puromycin fluorescerende signal reprEnts løbende oversættelse, som puromycinsubstitutter for en aminosyre, inkorporerer i det fremspringende protein og styrker den tidlige terminering af proteinet.

6. Billedforsamling og analyse

  1. Kvantificering af stresskorn
    1. For at kvantificere SG'er, erhverver 3 - 5 billeder på i alt> 100 celler pr. Prøve ved hjælp af et 40X objektiv. Alternativt kan du erhverve billeder ved hjælp af andre mål, men sørg for at> 100 celler tælles pr. Dækglas, og at forstørrelsen er stor nok til klart at visualisere granulerne. Gør dette ved at dividere dækslet i fem stort set lige områder og tilfældigt vælge et felt fra hver region ( figur 1B ); Billeder af samme felt skal indeholde alle kanaler for at vurdere kolokalisering af markører.
    2. Når alle billeder er blevet erhvervet, flettes kanalerne. Nogle kamera software vil automatisk gøre dette, mens andre kræver manuel fusion; Dette kan gøres medImageJ ved at åbne alle billederne og derefter vælge [Billede | Farve | Flette kanaler].
    3. Manuelt tælle det totale antal celler ved at tælle antallet af kerner ved anvendelse af Hoechst som kernemarkør. Tæl manuelt antallet af celler, der indeholder mere end to SG'er pr. Celle.
      BEMÆRK: Hvis du f.eks. Bruger et fusioneret trekanalsbillede, der viser G3BP1 (grønt), eIF4G (rødt) og Hoechst (blå), skal du tælle kernerne (eller antallet af celler) ved hjælp af den blå kanal. Tæl derefter SG-positive celler som dem med to eller flere gule foci pr. Celle. Granulerne vil fremstå gule, idet grøn fra G3BP1 og rød fra eIF4G virker gul, hvis de er colocalized.
    4. Bestem procentdelen af ​​celler, der er SG positive ved at kombinere dataene fra de 3-5 uafhængige regioner og derefter beregne:
      Antal SG positive / antal kerner) * 100 = procent af SG-positive celler
  2. Vurdering af kolokalisering ved line Scan Analysis - Manuel metode
    1. ÅbenImageJ. Hent det gratis fra ()
    2. Åbn ROI-manager: [Analysér | Værktøjer | ROI manager ...].
    3. Åbn det fusionerede billede i ImageJ: [File | Åben].
    4. Brug linjeværktøjet placeret i værktøjslinjen ImageJ, og tilføj en linje, der går gennem en SG, og sørg for at inkludere før og efter SG. Tilføj denne linje til ROI-lederen ved at klikke på [Tilføj] i vinduet for investeringsafkast.
    5. Split det fusionerede billede i separate kanaler for at vurdere lokaliseringen af ​​hver markør til granulatet: [Billede | Farve | Split Channel]; Dette vil opdele det fusionerede billede i tre sort-hvide billeder.
    6. Sørg for, at linjen er valgt i det sort-hvide billede. Linjen er valgt, hvis den vises på billedet. Hvis ikke, klikker du på linjen i panelet i vinduet ROI manager. Dette vil fremhæve linjen i blåt i vinduet ROI manager og gøre linjen synlig på det sort-hvide billede. Hvis linjen stadig ikke vises, skal du være sikker på at "Vis alle" er chEcked i ROI manager og derefter klikke på linjen i billedet.
    7. Analyser linjens intensitet: [Analysér | Plot Profile]; Dette vil hente vinduet "Plot Profile", som tegner signalets intensitet på tværs af linjen.
    8. Inden for "Plot Profile" vinduet, klik på [List], der bringer et vindue indeholdende de rå data fra grafen. Kopier alle dataene i dette vindue og indsæt det i en regnearkfil. For at gøre dette skal du vælge alle data i vinduet: [Rediger | Vælg alle]. Kopier datoen: [Rediger | Kopi]. Åbn en regnearkfil og indsæt dataene: [Rediger | Sæt ind].
    9. Udfør trin 6.2.6 - 6.2.8 for hver kanal separat. Sørg for at holde styr på den kanal, der vurderes.
    10. I et regneark generer du en linjediagram af resultaterne. Vælg de kolonner, der indeholder data ved at trykke på [kontrol] og klikke på brevet øverst i hver kolonne. Vælg derefter linjediagram: [Indsæt | Linjediagram].
    11. Gentag denne analyse for multIple stress granulater på tværs af flere uafhængige eksperimenter.
  3. Vurdering af kolokalisering ved line Scan Analysis - ImageJ Plugin
    1. Download og installer RGB-profilværktøjet fra ImageJ-webstedet (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Når korrekt installeret, skal der vises en rød, grøn og blå (RGB) -linjet ikon på værktøjslinjen.
    2. Åbn billedet ( f.eks. Tiff, JPG) i ImageJ: [File | Åben].
    3. Klik på RGB-ikonet, der findes i ImageJ-værktøjslinjen.
    4. Klik og træk for at tilføje en linje, der strækker sig gennem en SG, og sørg for at inkludere tilstødende regioner; Et billede af histogrammet vises i et pop op-vindue.
    5. Gem dataene som et billede: [Fil | Gem som | Tiff]. Alternativt kan du eksportere og derefter grave dataene i et andet grafprogram ved hjælp af trin 6.2.8 ovenfra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stressinducerede foci er ikke nødvendigvis SG'er. SG'er klassificeres som cytoplasmatiske foci, der indeholder mRNA'er, translationsinitieringsfaktorer og RNA-bindende proteiner og er i ligevægt med aktiv translation. Ovennævnte protokol kan anvendes som en skabelon for at karakterisere, om en given stress inducerer bona fide SG'er.

SG'er kolokalisere med andre kendte SG markører, herunder både proteiner og mRNA. SA og VRB inducerer cytoplasmatiske foci, der indeholder G3BP1, eIF4G og eIF3b ( figur 2A ). Kolokaliseringen af ​​disse markører bekræftes ved hjælp af line scan-analyse og enkeltkanalbilleder med øget forstørrelse ( figur 2A ). Derudover indeholder disse foci Mrna, som angivet af polyA FISH, og oligo (dT) -signalet kolokaliseres med G3BP1-immunfluorescenssignalet ( Figur 2B ). Det er kritisk at vise, at polyA-FISHSignal overlapper med en kendt SG markør, da en stress kunne fremme flere typer af foci.

SG'er forekommer under en translationelt hæmmet tilstand. Både VRB og SA fremmer en translationelt undertrykt tilstand, som eksperimentelt vurderet med ribopuromycylering ( Figur 3 ). Bona fide SG'er er i dynamisk ligevægt med aktivt oversættelse af polysomer. SA- og VRB-inducerede SG'er opløses med CHX, som fælder polysomer på mRNA'er, således at man stopper polysom-demontering og forhindrer SG'er ( figur 4A, 4B ). Omvendt induceres flere SA og VRB SG'er efter behandling med puro, idet puro fremmer polysom-demontering, hvilket således favoriserer SG-dannelse ( Figur 4A, 4C ).

Sammenfattende frembringer VRB som med positivkontrol SA bona fide SG'er, som: (1) kolokaliserer med kendte SG markører, (2) indbefatter både protein og mRNA ( Figu Re 2), (3) findes i celler, hvor oversættelse er undertrykt ( figur 3 ) og (4) er i dynamisk ligevægt med aktiv oversættelse ( figur 4A-4C ).

figur 1
Figur 1: Eksperimentelle diagrammer. ( A ) Frøceller på dæksler, der tidligere er anbragt i en brønd med 24 brønde, som angivet. Behandl rækker A og B i 60 minutter med SA eller VRB ved anvendelse af koncentrationen i μM som angivet. Efter 60 minutter tilsættes CHX (slutkoncentration: 20 μg / ml for søjle 2) eller puro (20 μg / ml puromycin til søjle 4) til det lægemiddelholdige medium. Fortsæt inkubation i yderligere 30 minutter forud for fiksering og farvning. ( B ) Diagram af et dækslip, der angiver de felter, der skal afbildes til optælling. Dækglasset er opdelt i fem omtrent lige områder; Et billede er taget i hver region."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: SA og VRB inducerer cytoplasmisk Foci, der indeholder SG Markers anPoly (A) mRNA. ( A ) U2OS-celler immunfarvet for G3BP1 (grøn), eIF3b (rød) og eIF4G (blå). Celler blev behandlet med 100 μM SA eller 150 μM VRB i 60 minutter eller blev ikke behandlet (kontrol). Zoomede regioner forstørres (2X) og vises som separate kanaler i sort / hvid (nedenfor). Grafen angiver linjeskanningsanalysen af ​​en region (hvid linje) granulat og viser omfanget af overlapning eller kolokalisering. Skalestangen repræsenterer 10 μm. ( B ) PolyA-FISH koblet med immunfarvning detekterer polyA mRNA med en oligo (dT) 40 probe (rød), G3BP1 (grøn) detekteres under anvendelse af en anti-G3BP antistof, og nukleært DNA påvises under anvendelse af Hoechst-farvestof (blå). Zoomede regioner (2X), enkeltkanalbilleder og linjeskanningsanalysen viser kolokalisering. Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: SA og VRB Behandling Årsag Undertrykkelse. Immunofluorescensen af ​​U2OS-celler puls-mærket med puromycin i 5 minutter efter de angivne behandlinger. Puromycin (grøn), eIF3b (rød) og nukleær DNA farvet med Hoechst (blå). Cellerne blev behandlet med 100 μM SA eller 150 μM VRB i 60 minutter eller blev ikke behandlet (kontrol). Skalestang = 10 μm. Klik her for at se et større versIon af denne figur.

Figur 4
Figur 4: SA og VRB inducerer cytoplasmisk Foci, der er i dynamisk ligevægt med polysomer. ( A ) Generel skema, der beskriver polysom ​​/ SG forholdet. ( BC ) U2OS-celler farvet for G3BP1 (grøn), eIF3b (rød) og nukleært DNA ved anvendelse af Hoechst (blå). Celler blev behandlet med 100 μM SA eller 150 μM VRB i 60 minutter eller blev ikke behandlet (kontrol) før tilsætningen af ​​( B ) CHX (cycloheximid, 20 μg / ml), ( C ) puro (Puromycin, 10 μg / ml ) Eller intet additiv i yderligere 30 minutter inkubation. Tallene svarer til procentdelen af ​​celler med SG'er i et repræsentativt eksperiment. Skalbjælke = 25 μm, i (BC). Klik her for at se en størreVersion af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som det fremgår af immunhistologiske studier i flere sygdomme, fører kronisk stress til dannelsen af ​​forskellige intracellulære foci. For eksempel er de fleste neurodegenerative sygdomme præget af intracellulære aggregater af uopløselige proteiner. Tilstedeværelsen af ​​SG-associerede proteiner i sådanne aggregater er ofte grundlaget for at konkludere, at sådanne foci er SG'er. En lignende konklusion er også tegnet, når SG markør-positive cytoplasmiske foci observeres i celler behandlet med nye stress-stimuli. Denne protokol giver en simpel workflow for at identificere bona fide SG'er.

Flere kriterier skal opfyldes for formodede SG'er, der skal bekræftes som sådanne, herunder karakterisering af både sammensætning og dynamik. For det første er SG'er cytoplasmatiske foci, der indeholder translationelt stalled mRNPs. Således er den første tilgang at karakterisere deres sammensætning ved anvendelse af to mikroskopi-baserede teknikker, nemlig polyA-FISH og IF. FISH er en pålidelig metode til visuelIze mRNA'er, der kolokaliseres med SG'er. En oligo (dT) 40 probe anvendes til at detektere polyadenylerede mRNA'er, der pakker ind i SG'er under spændingsbetingelser. Da oligo (dT) ikke vil detektere deadenylerede mRNA'er, som er kernekomponenter i behandlingsorganer (PBs), er tilstedeværelsen af ​​et stærkt oligo (dT) -signal i cytoplasmatiske foci en første indikation (men ikke nok til definition) at disse foci er strain gauges. Den anden test er at demonstrere kolokalisering af et poly (A) signal med andre SG markører ( fx G3BP1) ( Figur 2A ). Dette gøres ved at udføre IF mod SG markørproteiner. SG-markørerne eIF3b, eIF4G og G3BP1 anvendes rutinemæssigt, fordi eIF3b og eIF4G er translationsinitieringsfaktorer, der vides at være komponenter af 48S * -komplekser, og G3BP1 er påkrævet til SG-dannelse ( figur 2B ). Det er vigtigt at understrege, at der kræves mere end en SG-markør, da forskellige belastninger rekrutterer forskellige SG-associerede faktorer til SG'er, og nogle spændinger kan cAuse protein aggregering, der kunne forveksles med SG dannelse.

For det andet dannes SG'er på grund af translationsinhibering. Mens inhiberingen af ​​translation kan påvises ved forskellige fremgangsmåder ( fx ved traditionel [ 35 S] Met chase-mærkning) foretrækkes ribopuromycylering, da det detekterer løbende proteinoversættelse i behandlede celler. Denne teknik er også kompatibel med standardimmunofluorescens mod SG markører, hvilket muliggør samtidig overvågning af SG'er og graden af ​​translationsinhibering i individuelle celler. Som set i figur 3 fremmer både SA og VRB både SG-dannelse i forskellige grader. Mens SA forårsager SG i næsten 100% af cellerne, fremmer VRB SG dannelse i ca. 75% af cellerne. Evnen til at fremme SG'er korrelerer med graden af ​​translationinhibering: Selvom ubehandlede celler har et højt basalt niveau for translation, hæmmer SA fuldstændigt oversættelsen, men VRB er kun paHæmmer retalt oversættelse ( figur 3 ).

For det tredje er SG'er dynamiske og er i ligevægt med oversættelse af polysomer. Behandling af celler med cycloheximid før stress eller samtidig med stress forhindrer polysomdisponering og SG-dannelse. SG-polysome-ligevægten er tovejs, da stressede celler, der udviser SG'er, kan behandles med cycloheximid for at håndhæve SG-demontering ved at fange mRNA'er i polysomer eller monosomer, når de produktivt initieres. En vigtig kontrol er at anvende puromycin, som hæmmer forlængelse ved at fremme for tidlig ophør, hvilket således øger mængden af ​​ikke-polysomale mRNP'er, der er tilgængelige for SG-dannelse. Dramatiske ændringer i SG'er observeres, når SA- eller VRB-behandling kombineres med CHX eller puro-behandling ( figur 4 ). Vurderingen af, om formodede SG'er er opløst ved cycloheximidbehandling, men som er forstærket eller upåvirket af puromycin, er således en nøgleeksperimentel parameter, der skal anvendes i SG-identifikationenkation. Den emetin-håndhævede SG-demontering i meget små, ikke-klæbende, primære humane knoglemarv CD34 + celler blev påvist med succes ved behandling af cellerne i suspension forud for cytospinning 32 .

Natriumarsenit anvendes i vid udstrækning til at udløse SG'er ved at inducere eIF2-a-phosphorylering 33 , men den bør omhyggeligt titreres , da den målretter mod mange proteiner og aktiverer et antal signaleringsveje 34 , 35 . Forskellige cellelinier udviser varierende grader af følsomhed over for natriumarsenit. U2OS er relativt følsomme (100 μM), mens COS7, MEF'er og HeLa kræver 200 μM. DU-145 6 , primære normale humane knoglemarv CD34 + -celler 32 , humane lymfoblaster 36 , musekortikale neuroner 37 og Huh7-celler 31 kræver 500-1.000 μM.

Den eksperimentelle arbejdsgang, der beskrives her tillader detektion af SG'er i forskellige celler og under forskellige belastninger. Den største fordel ved denne arbejdsgang er, at den er enkel og muliggør den entydige påvisning af bona fide SG'er, såvel som for den samtidige sondering af cellulær translation i stressbehandlede celler. Denne protokol bruger U2OS-celler, men den kan ændres til forskellige cellelinjer eller endog til primære celler. En nylig og omfattende liste over celler anvendt til stressgranulestudier er anmeldelse 11 . Antallet af celler skal justeres for at nå 80% konfluens på dagen for lægemiddelbehandling. Koncentrationen og varigheden af ​​lægemiddelbehandling bør også justeres, da cellerne reagerer forskelligt. Selvom denne protokol er konfigureret til et 24-brøndsformat, kan det justeres til enhver størrelse plade eller skål, hvor coverlips (af enhver størrelse) kan ligge fladt under plating og medicinbehandlingnt. Cellelinier, der stabilt udtrykker SG / PB markører, er blevet anvendt i high-throughput, siRNA-baserede skærme 33 og levende celledannelse 38 . Billedbaseret screening blev anvendt ved anvendelse af HeLa-celler farvet for den endogene SG-markør PABP for at detektere kemiske forbindelser, som blokerede SG-samling 39 . Det forventes, at denne arbejdsgang vil være nyttig i fremtidige studier og applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Ivanov og Anderson labs for deres nyttige diskussion og feedback på dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [GM111700 og CA168872 til PA, NS094918 til PI], National Science Center i Polen [bevilge UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 til WS]. WS anerkender også ministeriet for videnskab og videregående uddannelse i Polen (Mobility Plus Program) og den polsk-amerikanske Fulbright-kommission for deres økonomiske støtte til sin forskning i USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).

Tags

Cellular Biology RNA granulater stress granulater mRNA translation repression immunfarvning, stress respons
Metoder til klassificering af cytoplasmatiske foci som spædbørn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski,… More

Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter