Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55659
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

Summary

Vi beskriver her protokoller til måling af antistof-antigen-bindingsaffinitet og kinetik ved anvendelse af fire almindeligt anvendte biosensor platforme.

Abstract

Label-free optiske biosensorer er stærke værktøjer i lægemiddelforskning til karakterisering af biomolekylære vekselvirkninger. I denne undersøgelse beskriver vi anvendelsen af ​​fire rutinemæssigt anvendte biosensor platforme i vores laboratorium for at evaluere bindingsaffinitet og kinetikken af ​​ti høj affinitet monoklonale antistoffer (mAb'er) mod human proprotein konvertase subtilisin Kexin typen 9 (PCSK9). Mens både Biacore T100 og ProteOn XPR36 er afledt af den veletablerede overfladeplasmonresonans (SPR) teknologi, den tidligere har fire flow-celler forbundet med strømningskonfiguration serial, hvorimod de sidstnævnte præsenterer 36 reaktionsprodukter pletter i parallel gennem en improviseret 6 x 6 kryds og tværs mikrofluidkanal konfiguration. IBIS MX96 fungerer også baseret på den SPR sensor teknologi, med en ekstra billeddannende funktion, der giver detektion i rumlig orientering. Denne detektering teknik kombineret med den kontinuerlige strøm Microspotter (CFM) udvider gennemløbet betydeligt ved eKTIVERING multiplex matrix trykning og detektion af 96 reaktionsprodukter sport samtidigt. I modsætning hertil er den Oktet RED384 baseret på BioLayer interferometri (BLI) optisk princip, med fiberoptiske prober virker som biosensoren til påvisning interferensmønster ændringer ved binding interaktioner ved spidsen overflade. I modsætning til de SPR-baserede platforme, har BLI systemet ikke stole på kontinuerlig flow fluidik; stedet, sensorelementerne tips indsamle aflæsninger, mens de er nedsænket i analyt opløsninger af en 384-brønds mikroplade under orbital omrøring.

Hver af disse biosensor platforme har sine egne fordele og ulemper. At tilvejebringe en direkte sammenligning af disse instrumenter evne til at levere kvalitet kinetiske data, de beskrevne protokoller illustrerer eksperimenter, der bruger samme assayformat og de samme reagenser af høj kvalitet til at karakterisere antistof-antigen kinetik der passer til den enkle 1: 1 molekylære interaktion model .

Protocol

1. Proteiner og antistoffer

  1. Producere og oprense det humane proprotein konvertase subtilisin Kexin typen 9 (PCSK9) og ti museafledte anti-PCSK9 mAb'er som tidligere beskrevet 17.
  2. Vurdere renheden af de oprensede produkter ved sekventiel injektion af 10 ug af hver prøve i et analytisk størrelseseksklusion (SEC) under anvendelse af en UPLC systemet 19.

2. Kinetiske Målinger i Biacore T100

  1. Instrument og Reagensklargøring
    1. Ækvilibrer CM5 sensorchip ved stuetemperatur i 15 min.
    2. Tø to 200 pi alikvoter af 200 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) og to 200 pi alikvoter af 50 mM N-hydroxysuccinimid (NHS) ved stuetemperatur.
    3. Forberede en 1-L flaske 1x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA og 0,005% v / v polysorbat P20) løbebuffer ifølge diLuting en 10x HBS-EP + stamopløsning i vand.
    4. Forberede 1 ml protein A / G ved 30 ug / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) og 500 pi af hver mAb prøve ved 0,063 pg / ml i HBS-EP løbebuffer. Tø en frossen hætteglas med human PCSK9 på is.
    5. I kontrolgruppen softwaren, klik på "Tools | Eject Chip", skal du placere sensoren chippen ind i skeden og lukke. Klik på "Funktioner | Indstil temperatur", skal du indtaste "25" ° C som analysen temperatur og "10" ° C som rummet temperatur.
  2. Surface Immobilisering
    1. I kontrolgruppen softwaren, klik på "Filer | Åben / Ny guiden skabelon" og vælg "Immobilisering" fra listen i panelet til venstre.
    2. Klik på "Ny" for at indtaste vinduet immobilisering opsætning. Vælg "CM5" som chippen type og vælg "1" flowcellen per cyklus.
    3. Marker feltet ud for hver "Stands flow celle 1/2/3/4" til activate mulighederne. Vælg "Sigt efter immobiliseret niveau" og "Amin" som fremgangsmåden til alle flow-celler.
    4. Enter "30 ug / mL ProA / G" som ligand, sikre, at målet er indstillet til "10000" responsenheder (RU) for alle flowcellerne.
    5. Check "Prime før afløb", og klik på "Næste". Vælg "Reagent Rack 2", definerer placeringen for reagenserne og pipette i individuelle prøvehætteglas overensstemmelse hermed. Sæt stativet tilbage i instrumentet, og klik derefter på "Start" og indtaste et eksperiment navn, der skal gemmes for at starte kørslen.
  3. Analytbindende og regenereringscykler
    1. Klik på "File | Open / Ny metode", vælg "20140812 hu anti-PCSK9 IgG binding til hu PCSK9" og åben metode. Gennemgå parametre i metoden.
    2. I "Assay trin", sikre, at der 10 cykler hvor "hu PCSK9" er navnet med "Sample" valgt i "Purpose". Replikatkolonnen nummer er sat til '1'.
    3. I "Cycle typer", sæt kontakttiden til "220"" ere for Capture 1 flere end strømningsvejen "2", "110" s for Capture 2 flere end strømningsvejen "3" og "55" s for Capture 3 flere end strømningsbanen "4". Strømningshastigheden er "10" pl / min for alle de capture cyklusser.
    4. Vælg "Prøve 1", check "Sample løsning" som variabel. Indstille kontakttiden til "600" s og dissociation tid til "2700" ere end strømningsvejen "1, 2, 3, 4". Strømningshastigheden er indstillet til "30" uL / ​​min.
    5. Vælg "Regeneration 1" indtastes "Glycin-HCI pH 1,5" i opløsningen feltet og indstille kontakttiden til "20" s flere end strømningsvejen "1, 2, 3, 4".
    6. I "Variable Settings", indtast 2 gange titrering koncentrationer af "100 nM - 6.25 nM" for cyklus 1-3, "50 nM - 3,12 nM" for cyklus 4-8, og "5 nM - 0,323 nM" feller cyklus 9-10.
    7. I "Setup Kør", vælge påvisning flow sti "2-1, 3-1, 4-1", klik på "Næste", check "Prime før afløb", og klik på "Næste".
    8. Vælg "prøve og reagens Rack 1", definerer placeringen for de anvendte reagenser og pipette til individuelle prøvehætteglas i overensstemmelse hermed. Sæt stativet ind i instrumentet, og klik derefter på "Start" og indtaste et eksperiment navn, der skal gemmes for at starte kørslen.
  4. Dataanalyse Brug BIAevaluation
    1. Klik på "Kinetics / Affinity | Surface bundet", vælg Fc "2-1", "3-1", eller "4-1" hver for sig og kontrollere alle de viste kurver fra de forskellige analytkoncentrationer samt "nul" koncentration blank.
    2. Klik på "Næste" for at opnå den pufferblindprøve trækkes kurver. Klik derefter på "Kinetics," vælg "1: 1 Binding" model, og klik på "Tilpas" for at få den monteret kinetiske Parameters.
    3. For den globale montering af flere mAb overflader, klik på "Multiple R max" i bunden og tilsæt de bindende kurver fra de andre FCS i samme mAb til listen.
    4. Klik på "Næste" for at få alle de buffer datoer trækkes bindende kurver. Klik derefter på "Kinetics," vælg "1: 1 Binding" model, og vælg "fit lokale" for hver R max i de parametre, for at opnå de globalt monteret kinetiske parametre.

3. Kinetiske Målinger i ProteOn XPR36

  1. Instrument og Reagensklargøring
    1. Ækvilibrer en GLM sensor chip og en 2-L flaske PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20 og 3 mM EDTA) løbebuffer ved stuetemperatur i 15 min.
    2. I kontrolgruppen softwaren, klik på "Skub ud", og derefter indsætte GLM chip. Indstil chip temperatur til "25" ° C og autosampleren temperatur til "10" ° C.Klik på "Glycerol Initialisering", og følg bedt instruktioner for at initialisere chippen.
    3. Klik på "File | Open" en konditionering protokol på listen, forberede løsninger ind i en 96-brønds plade. Klik derefter på "Kør", skal du vælge den protokol og klik på "Start".
    4. Tø en 1 ml aliquot af 400 mM EDC og en 1 ml aliquot af 100 mM N-hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) ved stuetemperatur.
    5. Fremstille 2 ml protein A / G ved 60 ug / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) og 500 pi af hver mAb prøve ved 0,25 pg / ml, 0,125 ug / ml, og 0,063 ug / ml i PBS-T EDTA løbebuffer. Tø en frossen hætteglas med human PCSK9 på is.
  2. Immobilisering analytbinding og Regeneration
    1. Klik på "Filer | Ny | Ny protokol". I "Configuration" indtastes eksperimentnavnet Vælg "GLM" chip vælge "Mikroplader", og indtast "2,2" ml volumen.
    2. Vælg"Protokoller | Samples", definere "EDC / sulfo-NHS" som "Activator" i brønde H1-H6, "Protein A / G" som "ligand" i G1-G6, "Ethanolamin" som "Deactivator" i F1-F6 "Glycin" som "Regenerator" i E1-E6, PBS-T-EDTA "som "Blank" i D1-D6, "mAb X prøve" som "ligand" i C1-C6, og "human PCSK9" som" Analyt i brønde H1-H6 i en anden plade med 96 brønde.
    3. Vælg "trin", dobbeltklik "Immobilisering" i "protokol Editor", trinnene indbefatter tre efterfølgende horisontale injektioner af EDC / sulfo-NHS, protein A / G, og 1 M ethanolamin hver ved en strømningshastighed på "30" pi / min og en kontakttid på "300" s.
    4. Klik "Regenerere", injicere tre "18" -s impulser af glycin (pH 1,5) ved "100" uL / ​​min i både vandret og lodret retning, efterfulgt af to "60" -s impulser af PBS-T-EDTA ved "25" uL / ​​minogså i begge retninger.
    5. Klik "ligand", injicere mAb 1 mAb 2 i lodret retning ved anvendelse af en strømningshastighed på "25" pl / min og en kontakttid på "160" s.
    6. Klik "Analyt", injicere fem koncentrationer af humant PCSK9 (100 nM til 6,25 nM i 2-gange serielle fortyndinger) og en tom buffer over 6 vandrette kanaler samtidigt i "40" uL / ​​min i "600" s vedtægter tid efterfulgt ved "2700" ere af dissociation tid.
    7. Klik "Regenerere", injicere to "18" -s impulser af glycin (pH 1,5) ved "100" uL / ​​min i både vandret og lodret retning.
    8. Gentage ovenstående trin efter hver bindende cyklus for de resterende mAb'er.
      BEMÆRK: Ud over de 100 nM - 6.25 nM PCSK9 koncentration human serie, 25 nM - 1,56 nM og 5 nM - 0,313 nM koncentration serien benyttes.
    9. Forberede prøverne og reagenserne i to plader med 96 brønde ifølge reagens- positionerdefineret i trin 3.2.2 og derefter klikke på "Run" fanen, skal du vælge den protokol / eksperiment og klik på "Start".
  3. Dataanalyse Brug ProteOn manager
    1. Klik på "Panel Type" og vælg "analyt". Klik derefter "Protokol Step" og vælg alle de bindende kurver på listen.
    2. Klik på "Auto Process", og klik på "Proces | Kanal reference | InterSPOT". Klik derefter på "Proces | Dobbelt reference | Row | A6".
    3. Klik på "Opret datasæt" for at gemme individuelle datasæt for hver mAb på alle tre overflader til kinetisk analyse.
    4. Klik på "Analyse datasæt", fremhæve hver mAb datasæt og klik på "Analyse | Kinetic". Vælg "Langmuir" model og "Samtidig ka / kd" og klik "Næste".
    5. Fremhæv både foreningen og dissociation fit rækkevidde, skal du vælge "Lokal" R max, og klik på "Næste" for at udføre den egnet til at opnåde monterede kinetiske parametre.
    6. Gentag ovenstående trin, men vælg "grupperede" R max til montering til opnåelse af de eksperimentelle R max værdier til beregning liganden overfladeaktivitet.

4. Kinetiske Målinger i Oktet RED384

  1. Reagens og prøve Pladefremstilling
    1. Forbered 50 ml 1x KB (Kinetic puffer indeholdende PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% albumin og 0,05% natriumazid) ved fortynding af en 10 x stamopløsning i PBS.
    2. Dispensere 1x KB i en 96-brønds plade ved 200 pi per brønd. Hydrat 48 anti-human capture (AHC) biosensor tip i disse individuelle brønde i mindst 10 min.
    3. Udarbejder hvert mAb prøve ved 20 ug / ml, 10 ug / ml og 5 ug / ml i 1 x KB, såvel som den menneskelige PCSK9 7 titrerede koncentrationer fra 100 nM til 1,56 nM i 2-gange serielle fortyndinger.
    4. Indlæse mAb prøver til et 384-brønds hældende bund mikroplade (Referred til som reagens Plate) og de humane PCSK9 løsninger til en anden 384-brønds mikroplade (benævnt prøvepladen) ved 90 pi per brønd.
    5. Belastning række 1x KB og glycin (pH 1,5) opløsninger i brønde inden prøvepladen.
      BEMÆRK: Disse 1x KB brønde anvendes til chip forkonditionering baseline stabilisering, og analyt dissociation. Glycin opløsning anvendes til regenerering.
  2. Eksperimentel fremgangsmåde Setup
    1. I dataopsamlingssoftware, klik på "Eksperiment | Guiden Ny Experiment | Ny Kinetics Experiment | Grundlæggende Kinetics".
    2. I "Plate Definition" følge trinene nedenfor for at definere prøvetyper og positioner.
      1. Vælg "16" kanaler og "384-godt" format.
      2. Definer prøve og reagens steder i pladen displayet ved at holde Shift-tasten nede mens venstre-klikke på brønden for at fremhæve 16 brønde ad gangen.
      3. Højreklik påbrønde indeholdende mAb prøver og vælg "Load" til at betegne det trin, hvor mAb'erne indlæses (eller captured) onto AHC sensorer. Indtast mAb navne og koncentrationer i tabellen til højre.
      4. Højreklik på brøndene, der indeholder det humane PCSK9 og vælg "Sample" for at angive trinnet, ved hvilket mAb-tilfangetagne sensorer dyppes og bindingsinteraktioner måles. Angive de tilsvarende molære koncentrationer i tabellen til højre.
      5. Definer brøndene indeholdende 1x KB som "buffer" eller "Neutralisering", og brøndene indeholdende glycin som "Regeneration".
    3. I "Assay Definition" følge trinene nedenfor for at definere forsøgsopstillingen:
      1. Klik på "Tilføj" og vælg "Baseline", "Regeneration", "Ligevægtsindstilling", "Loading", "Foreningen", og "dissociation" skridt til listen med tider med "30" s, "30" er, "18" s, "200" s, "500" s samt "1800" s, henholdsvis. The shake hastighed er "1000" rmp.
      2. At tilføje trinene til "assaytrin List" først klikke på et trin og derefter klikke på boringer placeret i enten prøven eller reagenset plade. Trinene er som følger:
        1. Ækvilibrering-Regeneration: forudsætning AHC sensorer ved tre cykler af "15" -s dyk i glycin (pH 1,5), skiftevis med "15" -s dips i 1x KB.
        2. Loading: fange de mAb prøver onto AHC sensorer til "200" s.
        3. Baseline: etablere BLI signal for "60" s før foreningen skridt.
        4. Association: dyppe sensorerne til brønde indeholdende forskellige koncentrationer af humant PCSK9 for en "500" -s forening periode.
        5. Dissociation: dyppe PCSK9-bundne sensorer i nye brønde i 1x KB for en "1.800" -s dissociationsperiode.
        6. Regenerering: dyppe mAb-PCSK9 bound sensorer i boringer af glycin (pH 1,5) med to "18" -s impulser mellem hver bindende cyklus.
    4. I "Gennemgå Eksperimenter", glide gennem trinene og foretag de nødvendige ændringer ved at gå tilbage til de forrige faner.
    5. I "Kør Eksperimenter", indtaste et "60" s forsinkelse og ryst prøven plade, mens du venter. Indstil pladetemperaturen til "25" ° C og tryk på "GO".
  3. Dataanalyse Brug ForteBio Data Analysis Software
    1. Klik "Data Selection | Loaded data | Kinetik | PCSK9 antistoffer binder til PCSK9 7.23.14"
    2. I "Processing", behandle data på følgende måde:
      1. I trin 1: klik på "Sensor Selection" for at fremhæve sensorer i H1-H6, skal du højreklikke på dem og klikke på "Skift Sensortype | Henvisning Sensor."
      2. I trin 2, check "subtraktion" og vælg "Gennemsnitlige reference Sensorer"; at subtrahere hvert aktivt prøve sensor fra gennemsnittet af de 6 datoer buffer sensorer.
      3. I trin 3, skal du klikke på "Juster Y-akse" og vælg "Baseline" at tilpasse alle de bindende kurver til baseline skridt forud for foreningen.
      4. I trin 5, check "Savitsky-Golay Filtrering" for at udjævne de bindende kurver ved at øge signal-støj-forholdet, og klik på "Process data!".
      5. I trin 6 klikke "forarbejdede Results" at se de forarbejdede bindingskurver.
      6. I trin 7, gennemgå de fire paneler i højre viser de bindende kurver efter hvert procestrin, og klik på "Gem behandlede data".
    3. I "Analyse", check "Foreningen og Dissociation" og vælg "1: 1" model.
    4. Fremhæv de bindende kurver for "Global (fuld)" fit og gruppere dem med "farve". Bruge "Rmax forbundet" til udføre gruppen montering på sensorer overtrukket med den samme mAb-koncentration til opnåelse af de eksperimentelle R max værdier til beregning liganden overfladeaktiviteten, og "R max fjernet tilknytningen af føleren" for at udføre global montering på sensorer overtrukket med flere mAb koncentrationer.
    5. Klik på "Fit Kurver" for at opnå de monteret kinetik parametre. Gem resultaterne i slutningen af ​​hver fitting analyse.

5. Kinetiske Målinger i IBIS MX96

  1. Instrument og Reagensklargøring
    1. Ækvilibrer en COOH-G chip ved stuetemperatur i 15 min.
    2. Forberede en 1-L flaske systemets drift buffer (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) og immobilisering buffer (10 mM natriumacetat [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
    3. Udarbejder hvert mAb fra 20 ug / ml til 0,16 ug / ml af 2 gange serielle fortyndinger i både systemet løbebufferen og natriumacetat (pH 5,0) immobilisering puffer.
    4. Dispensere mAb prøver i to Septemberarate 96-brønds plader, hvor hvert mAb optager 8 vertikale brønde i titreringsforsøg koncentrationer ved 200 pi per brønd.
    5. Tø alikvoter af 400 mM EDC og 100 mM sulfo-NHS ved stuetemperatur.
    6. Forbered 300 pi protein A / G ved 50 pg / ml i natriumacetat (pH 5,0) immobilisering puffer og pipette det i et hætteglas.
    7. Forbered 200 pi humant PCSK9 fra 100 nM til 0,39 nM med 2 gange serielle fortyndinger i systemet løbebufferen. Pipette dem i separate hætteglas.
  2. Multi-cycle kinetik med amin-koblet antistof arrays
    1. Bland EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) portioner og dispensere blandingen ind i top 48 brønde i en ny plade med 96 brønde ved 200 pi per brønd.
    2. Placer mAb kildepladen (fortyndet i natriumacetat [pH 5,0]) i position 2 og EDC / sulfo-NHS-reagens plade i position 1 inde i printeren.
    3. Installere sensorchippen i CFM. Åbn "CFM 2.0" Software, og klik derefter på "Indlæs indstillinger | 96 Amin Couple". 10 x 8 antistofarray oprettes på følgende:
      1. Levere EDC / sulfo-NHS i den øverste halvdel af reagenset plade til sensoren ved hjælp af 48 mikrokanaler, og cyklus dem over sensoroverfladen for "5" min.
      2. Levere mAb prøver i den øverste halvdel af kildepladen til sensoren og cyklus dem på tværs af de aktiverede overflader til "10" min.
      3. Levere immobiliseringen buffer fra en 50 ml konisk rør over antistoffet overflade til "5" min.
      4. Gentag ovenstående procedurer for de resterende mAb prøver i den nederste halvdel af kildepladen.
    4. Forankre den trykte sensor chip i instrumentet. I kontrolgruppen softwaren, klik på "Filer | Connect | Open Måling | Eksisterende måling" og vælg "2014/08/15".
    5. I "Generelt", vælge "G - System Prime" under "Full-system script". Vælg derefter "G - QuEnch" for at deaktivere mAb overflader ved at injicere 150 pi 1 M ethanolamin.
    6. Klik på "Camera" for at visualisere mAb arrays og justere kontrasten om nødvendigt. Placer de røde firkantede kasser at omgive mAb pletter, og flyt den grønne firkantede kasser til interspots placeret mellem de aktive mAb spots for henvisninger.
    7. I "Analyse Cycle", vælg "A - AP Standard Kør" under "IBIS Scripts". Indstille 1,0 min for baseline, 10,0 minutter for association, og 90 trin til dissociation ved 8 pl / s hastighed.
    8. Inde i "cykler", injicere human PCSK9 én koncentration ad gangen efter fem buffer injektioner. Regenerere mAb overflader med glycin pH 2,0 mellem hver bindende cyklus.
  3. Med enkelt cyklus kinetik med Fc-fanget antistof arrays
    1. Installer en ny sensor chip ind i CFM. Gentage trin 5.2.3 til 5.2.5 ovenfor ved at erstatte mAb prøver med protein A / G.
    2. Fjernsensor-chip fra MX96, og sæt den tilbage i CFM printeren.
    3. Levere mAb'er i den øverste halvdel af pladen til protein A / G sensoroverfladen på 48 mikrokanaler, og cyklus dem over overfladen med tovejsstrømning i 10 min.
    4. Gentag ovenstående trin for de resterende mAb prøverne i den nederste halvdel af pladen.
    5. Forankre den trykte sensor chip i MX96 instrument. I Data Acquisition Software, klik på "Filer | Connect | Open Måling | Eksisterende Måling | Næste" og vælg "Protein A + G bindende kinetic7.30.14".
    6. Klik på "kamera" for at visualisere mAb arrays og justere kontrasten om nødvendigt. Placer de røde firkantede kasser at omgive mAb pletter, og flyt den grønne firkantede kasser til interspots placeret mellem de aktive mAb spots for henvisninger.
    7. I "Analyse Cycle", vælg "A - AP Standard Kør" under "IBIS Scripts". Indstil "1,0 minut" for baseline, "10,0min" for association, og "10" trin for dissociation ved "8 pi / sec" hastighed.
    8. Inde i "cykler", injicere human PCSK9 én koncentration ad gangen efter fem buffer injektioner. Ingen regenerering udføres mellem hver analyt injektion.
  4. Dataanalyse Brug Sprint og skrubber
    1. I SprintX downloads, klik på "Filer | Open Triangle File", vælge alle prøve injektioner på listen, og marker "Gem SprintX fil," "kalibrering", og "RLL beslutsomhed", før du klikker på "Analyze".
      BEMÆRK: RLL værdier gælder for de immobiliserede / indfangede mAb niveauer på sensoroverfladen.
    2. Check "Referencering" og vælg "Local" for at bruge de tilstødende referenceværdier pletter. Du kan også læse "Juster" på den første injektion og derefter klikke på "Start Automation."
    3. På fanen Serial, skal du vælge "Vis herskere i værktøjslinjen," justere demat vælge et lille område af umiddelbart før den første prøve injektion basislinjen, og vælg "Zero".
    4. Generer en .IBMX fil til analyse i Scrubber ved at vælge "Eksporter til IBMX fil" og derefter klikke på "Start Automation."
    5. Start Scrubber og indlæse .IBMX fil. Indtast "100N" som "Stock konc" og "2" som "Fortyndingsfaktor".
    6. Crop data, fjerne alle baseline før starten af ​​injektion og tilpasse bindingskurverne i starten af ​​foreningen.
      BEMÆRK: enkelt-cyklus kinetik eksperiment ikke justere kurverne.
    7. Gå til "Kinetics" fanen, justere linealen til injektion sluttidspunkt, skal du vælge "k d" og pasform, derefter "fix k d." Vælg "k en k d" og passer det igen.
    8. Flyde k d kolonne og passer igen for yderligere at forfine pasform.
      BEMÆRK: montering af enkelt-cyklus bindingskurverKlik på "vælger" og fravælge "Træk" og derefter vælge "Separate" og flyde kolonnen "Begin Inj" til at passe foreningen profiler tilbage til en teoretisk baseline oprindelse.
    9. Gennemgå monteret kinetik parametre i fanen Resultater.

Representative Results

Figur 1 viser antistofarray billedet fra CFM og plettede mAb niveauer ved de to immobiliseringsmetoder, og figur 2 viser de tilsvarende bindende sensorgrammer frembragt i MX96 fra multicyklus kinetiske og med enkelt cyklus kinetiske målinger på disse mAb arrays . Realtid binding og kinetisk monteret kurver fra flere antistof-coatede overflader genereret i de fire biosensor platforme er vist i figurerne 3 - 6. Figur 7 viser sammenligningen af de endelige kinetiske satser og ligevægtsbindingskonstanter opnået fra den globale analyse af disse bindingskurver. Den individuelle association (ka), dissociation (Kd), og ligevægt (KD) bindingskonstanter er vist i tabel 1. For at demonstrere variationen af ​​data indhentet inden for samme instrument, k a, k d, og KD ved forskellige mAb overflade tætheder, og Figur 9 sammenligner endvidere de beregnede bindingsaktiviteter af mAb overflader tværs biosensorelektroderne platforme.

figur 1
Figur 1. Multiplex Ligand Arrays of Amine-koblet (A) og Fc-indfanges (B) Antibody Surfaces fra CFM Udskrivning i IBIS MX96. Billeder af de trykte arrays er vist i de venstre paneler, hvor de grå områder, der afgrænses af røde firkanter indikerer tilstedeværelsen af antistof. De mørkere interspots placeret mellem de aktive antistof pletter anvendes som reference subtraktion. Hver søjle indeholder et antistof trykt på titreringsforsøg koncentrationer identificeret under og til venstre for billedet. Mængderne af de trykte antistoffer kvantificeret ved beregning af difference i løs skift mellem de aktive og referencestoffer steder er vist i de højre paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2. Sammenligning af Real-time Binding sensorgrammer fra Multi-cyklus (A) og Single-cyklus (B) Kinetic Forsøg med IBIS MX96. De sekventielle injektioner af humant PCSK9 ved stigende koncentrationer på tværs af de 10 x 8 antistof arrays er bemærket ovenfor hver tilsvarende sensorgram segment. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
(toppaneler), mellemstor (midterste paneler) og lav (nederste paneler) densitet overflader. De overlejrede glatte sorte linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1: 1 interaktion model. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4. Binding sensorgrammer af Captured Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i ProteOn XPR36. Interaktionerne evalueret i høj- (toppaneler), medium- (midterste paneler) og lav (bundpanel) overflader tæthed. De overlejrede glatte sorte linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1: 1 interaktion model. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5. Binding sensorgrammer af Captured Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i Oktet RED384. Interaktionerne evalueret i høj- (toppaneler), mellemstor (midterste paneler) og lav (nederste paneler) densitet overflader. De overlejrede røde linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1: 1 interaktionsmodel. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 6
Figur 6. Binding sensorgrammer af aminen-koblede (A) og Fc-tilfangetagne (B) Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i IBIS MX96. De bindende profiler er organiseret som 10 x 8 paneler, der følger array pladediagram i figur 1. De sorte linier repræsenterer de registrerede bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer og de overlejrede røde linier repræsenterer de monterede kurver. Klik her for at se en større version af dette tal.

gur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55.659 / 55659fig7.jpg" />
Figur 7. Sammenligning af foreningen k a (A), Dissociation k d (B), og Ligevægt KD (C) bindingskonstanter kommer fra de fire Biosensor platforme. De kinetiske parametre afledt af global analyse af bindingskurverne i figurerne 3 - 6. Instrumenterne er repræsenteret som følger: Biacore T100 (blå), ProteOn XPR36 (grøn), Oktet RED384 (rød), IBIS MX96, amin-koblet (lilla), og IBIS MX96, Fc-indfanges (orange). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 8
Figur 8. Sammenligning af Sammenhæng i kinetiske hastighedskonstanter over flere antistofoverfladen Tætheder i Biac malm T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Oktet RED384 (C), IBIS MX96, amin-koblet (D), og IBIS MX96, Fc-indfanges (E). De kinetiske parametre k a (top underfelter), k d (midterste underfelter), og KD (bottom underfelter) stammer fra gruppe analyse på individuel antistof overfladetæthed. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 9
Figur 9. Bindende aktiviteter af antistoffet Overflader og deres standardafvigelser (fejlmargener) i fire Biosensor platforme. Værdierne beregnes under anvendelse af ligningerne beskrevet i forskningsartikler 17.large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

k en k d KD
(M-1s-1) (s-1) (nM)
mAb 1 11,7 (7,8) x 10 5 4,89 (4,18) x 10 -5 0,052 (0,05)
mAb 2 1,53 (0,28) x 10 5 1,30 (1,54) x 10 -5 0,092 (0,12)
mAb 3 11,4 (8,3) x 10 5 27,6 (11,0) x 10 -5 0,333 (0,20)
mAb 4 3,61 (1,6) x 10 5 20,1 (12,3) x 10 -5 0,659 (0,54)
mAb 5 0,59 (0,21) x 10 5 3,46 (2,50) x 10 -5 0,663 (0,46)
mAb 6 1,19 (0,78) x 10 5 7,21 (3,83) x 10 -5 0,894 (0,64)
mAb 7 1,29 (0,53) x 10 5 16,4 (5,63) x 10 -5 1,57 (1,02)
mAb 8 4,02 (2,23) x 10 5 22,8 (10,7) x 10 -5 0,768 (0,68)
mAb 9 4,20 (2,13) x 10 5 6,67 (4.3) x 10 -5 0,197 (0,16)
mAb 10 1,20 (0,49) x 10 5 12,5 (7,64) x 10 -5 1,27 (0,80)

Tabel 1: Kinetic priser og ligevægtsbindingskonstanterne på 10 mAbs opnås ved Global Montering af binding Kurver fra Fire Biosensor Instrumenter til 1: 1 Interaktion Model.

Discussion

Vores head-to-head sammenligning undersøgelse viser, at hver biosensor-platform har sine egne styrker og svagheder. Selvom bindingsprofiler- af antistofferne er ens ved visuel sammenligning (figur 3 - 6), og rangordenen af de overtagne kinetiske hastighedskonstanter er meget konsistent mellem instrumenterne (figur 7), viser vores resultater, at SPR-baserede instrumenter med kontinuerlige flow fluidik) er bedre til at løse høj affinitet interaktioner med langsomme dissociationshastigheder. Gradvise stigning i dissociationsfasen observeres i datasæt (fx mAb 2, mAb 5, og mAb 9; figur 5) genereres af BLI fluidik-fri instrument. Denne konstatering kan tilskrives en stor del prøvefordampning over tid i mikropladen, som er en primær begrænsning af systemet. Med denne iboende begrænsning, er det eksperimentelle tid også begrænset til mindre end 12 timer; forsøgene blev derfor programmeret med shOrter gange (500 associering og 30 min dissociation) sammenlignet med de øvrige platforme (10 min forening og 45 min dissociation). Imidlertid afkorte eksperimentelle tid ikke syntes at afbøde virkningerne af fordampning på data kvalitet / konsistens, som hastighedskonstanterne genereret af BLI-instrument udviser mindre linearitet som følge af udsving i nogle af off-rates (figur 8C ). Foruden prøvefordampning kan forskelle i indfangningsreagenserne anvendte også have bidraget til forskellene i de opnåede resultater. Mens protein A / G blev anvendt i alle tre fluidik-baserede SPR platforme blev AHC sensorer anvendes i den ikke-fluidik BLI platform. Da protein A / G er sandsynligvis har en svagere affinitet for mAb'erne end agter AHC, et antistof-baserede biosensoroverflade, off-rates for mAb-antigen-komplekset fra protein A / G-overflader kan kunstigt forekomme hurtigere end opnået fra AHC overflade. Denne mulighed understøttes by de eksperimentelle data, der viser, at de off-rate værdier genereret af BLI platformen var konsekvent lavere end dem, der opnås fra de andre instrumenter (Figur 7, red line). Ikke desto mindre er det BLI platformen har forskellige fordele i forhold til de andre platforme. For eksempel er det meget fleksibel med hensyn til sensor valg og analysekonfiguration grund af de forskellige præcoatede sensorer til øjeblikkelig brug. I vores eksperimenter anvendelse af AHC sensorer elimineret behovet for ligand immobiliseringstrin, hvilket reducerer forberedelsestid. Endvidere BLI platform kræver meget mindre vedligeholdelse sammenlignet med de andre fluidik SPR platforme, som byder komplicerede slanger og værdi switch konfigurationer. Dette træk er en fordel for forsøg med rå prøver, der kan forårsage tilstopning og forureningsproblemerne.

Da efterspørgslen efter effektiv, hurtig og nøjagtig identifikation af terapeutiske kandidater stiger, behovet for biosensor gennemløb stiger også. Blandt de fire biosensor platforme, gennemløbet fra biosensoren i stand til 96-ligandsamlingen trykning er den højeste, efterfulgt af biosensoren koblet til en kryds og tværs 36-ligand-formatet og BLI-baserede biosensor med 16-kanals samtidige udlæsning, som i sidste ende øge antallet af interaktioner målt i en enkelt binding cyklus til 96, 36 og 16, henholdsvis. Disse throughput kapaciteter er væsentligt højere end for den traditionelle SPR platform, som er begrænset ved at have kun fire flow-celler forbundet med en enkelt seriel strømning. Da vore forsøg involverede en relativt lille prøve sæt med 10 mAb'er evalueret ved multiple overflade densiteter med lange dissociation gange, de instrumentale gennemløb spillede en moderat rolle ved bestemmelse af effektiviteten af ​​forsøgene. Der var ingen signifikante forskelle i de eksperimentelle tidspunkter af de tre high-throughput platforme, og i alle tilfælde forsøgene blev afsluttet på én dag. På den anden side, krævede de traditionelle serielle flow SPR eksperimenter 3 dage til at fuldføre, på trods af walk-away automatisering af datafangst efter opsætning. I andre undersøgelser, der involverer et stort antal prøver (dvs. i hundreder eller tusinder), for off-rate ranking / kinetisk screening eller epitop binning formål, gennemløbet en kritisk faktor.

Skønt gennemløbet i IBIS MX96 er størrelsesordener højere end for de andre biosensorer og er derfor et optimalt valg til disse formål, det har et par mangler. Især arrayet trykning af CFM viser store overflader uoverensstemmelser (figur 1) og reducerede data reproducerbarhed (figur 8D og 8E). For præcise kinetiske målinger, mængden af ​​ligand på biosensoroverfladen er en kritisk parameter, der skal kontrolleres for at sikre, at de bindende reaktioner ikke forstyrres af sekundære faktorer, såsommassetransport eller sterisk hindring. For Biacore T100 og ProteOn XPR36 blev de optimale R L niveauer bestemmes baseret på standard beregning af sæt R max værdier som beskrevet i forskningen artiklen 17. På den anden side, for Oktet RED384 og IBIS MX96 platforme blev mAb capture niveauer opnås empirisk under anvendelse af en serie af 2-fold serielt fortyndede antistoffer ved konstante tider. Manglen på kendskab til eller kontrol opfangningstrinnet resulterede i en høj massefylde overflade og høje bindende svarsignaler (figur 2), der kan have kompromitteret nøjagtigheden af de kinetiske hastighedskonstanter. Endvidere adskillelsen af ​​printeren fra SPR detektoren præsenterer også en udfordring, når der udføres flere bindende cyklus målinger involverer regenereringer. Den eneste måde at udføre multi-cyklus kinetik setup var gennem direkte aminkobling af mAb'erne, i modsætning til at fange gennem mAb Fc af det immobiliserede protein A / Goverflade i de andre tre biosensor platforme. Som et resultat blev en yderligere regenerering scouting eksperiment kræves for at bestemme de optimale regenereringsbetingelser. Resultatet af denne opsætning var knyttet til en ~ 90% lavere observerede overflade aktivitet sammenlignet med Fc capture metoden (figur 9), ud over en længere eksperimentel tid. For at udføre Fc capture metode blev et alternativ single-cyklus kinetisk indfaldsvinkel. Denne fremgangsmåde involverer sekventiel indsprøjtning af analyt ved stigende koncentrationer uden regenerering mellem hver injektion (figur 2). Denne yderst bekvem, men mindre almindeligt anvendt fremgangsmåde ikke blot forkortet den eksperimentelle og reduceret reagensforbruget men også produceret kinetiske hastighedskonstanter meget ligner dem fra de andre biosensorer (Figur 7). Derfor anvender dette med enkelt cyklus kinetik fremgangsmåde overvinder den iboende konfiguration begrænsning af instrumentet og præsenterer enmulighed for at opnå høj opløsning kinetiske hastighedskonstanter i en high-throughput måde.

På trods af gennemløb være en stor begrænsning i Biacore T100, vores resultater viser kollektivt, at det genererede de mest konsistente data med den højeste kvalitet. Dette blev efterfulgt af ProteOn XPR36, som har ~ 10 fold højere gennemløb. Deres evne til at frembringe data af høj kvalitet bliver en fordel, når karakterisering høj affinitet antistof-antigen-interaktioner, der kan være teknisk udfordrende, når instrumenternes detektionsgrænser er nået. Mens de systematiske begrænsninger i instrumentering af Oktet RED384 hindrer nøjagtig måling af dissociationshastighedskonstanter (dvs. falder kort af følsomheden til at løse tilstrækkelig signal henfald til langsom off-satser), både Biacore T100 og ProteOn XPR36 kan tilvejebringe følsomme og pålidelige detektion til differentiering.

Disclosures

Offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Forfatterne takker Noah Ditto og Adam Miles til teknisk bistand på IBIS MX96.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T100 System GE Healthcare 28975001 The T100 system has been upgraded to T200
CM5 Sensor Chip  GE Healthcare BR100012
BIAevaluation  GE Healthcare Version 4.1
Biacore T100 Control Software GE Healthcare The T100 control software has been upgraded to T200
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 
HBS-EP+ Buffer 10× GE Healthcare BR100669 Concentrated stock solution 
Plastic Vials, o.d. 7 mm GE Healthcare BR100212 
Rubber Caps, type 3 GE Healthcare BR100502
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm GE Healthcare BR100214 
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System Bio-Rad 1760100
ProteOn Manager Software  Bio-Rad 1760200 Version 3.1.0.6
GLM Sensor Chip Bio-Rad 1765012
Amine Coupling Kit Bio-Rad 1762410 It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl 
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers Bio-Rad 1762210 It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution 
2 L PBS/Tween/EDTA buffer Bio-Rad 1762730 It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA 
Octet RED384 System FortéBio
Data Analysis Software FortéBio Version 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors FortéBio 18-5060 One tray of 96 biosensors 
384-Well Tilted-Bottom Plate  FortéBio 18-5080
Biosensor Dispenser FortéBio 18-5016
Kinetics Buffer 10x FortéBio 18-1092 10x concentration. Contains ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi System Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer Wasatch Microfluidics Version 2.0
SensEye COOH-G chip Wasatch Microfluidics 1-09-04-004
Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.19.3.17
SPRint Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.15.2.1
Scrubber 2 BioLogic Software Version 2
Pierce Recombinant Protein A/G ThermoFisher Scientific 21186

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Tags

Biokemi optiske biosensorer antistof-antigen-interaktioner bindingskinetik lægemiddelforskning overfladeplasmonresonans BioLayer interferometri
Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D., Singh, A., Wu, H.,… More

Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659, doi:10.3791/55659 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter