Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55659
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

Summary

Vi beskriver her protokoller for måling av antistoff-antigen-bindende affiniteten og kinetikk ved hjelp av fire som vanligvis brukes biosensor plattformer.

Abstract

Label-free optiske biosensorer er kraftige verktøy i medisiner for karakterisering av biomolekylære interaksjoner. I denne studien, beskriver vi bruken av fire brukes rutinemessig biosensor plattformer i vårt laboratorium for å bedømme bindingsaffiniteten og kinetikken til ti høy-affinitets monoklonale antistoffer (mAbs) mot human proprotein konvertase subtilisin Kexin type 9 (PCSK9). Mens både Biacore T100 og ProteOn XPR36 er avledet fra den veletablerte overflate-plasmonresonans (SPR) teknologi, har den førstnevnte fire strømningsceller forbundet med seriestrømningsforhold, mens de sistnevnte presenterer 36 reaksjonssteder i parallell gjennom et improvisert 6 x 6 krysser mikrofluidkanalkonfigurasjonen. IBIS MX96 opererer også basert på SPR sensorteknologi, med et ytterligere avbildningsfunksjon som gir deteksjon i romlig orientering. Denne teknikk for bestemmelse av kombinert med kontinuerlig strømning Microspotter (CFM) utvider gjennomløps betraktelig ved enabling multiplex gruppe trykking og deteksjon av 96 reaksjons sport samtidig. I motsetning til dette er den Oktett RED384 basert på biolaget Interferometry (BLI) optisk prinsipp, med fiberoptiske sonder som virker som biosensor for å påvise interferensmønster endres ved binding interaksjoner på tuppoverflaten. I motsetning til SPR-baserte plattformer, gjør BLI systemet ikke er avhengig av kontinuerlige strømningslufthåndtering; I stedet sensor tips samle inn målinger mens de er nedsenket i analytt-løsninger av en 384-brønners mikroplate under orbital omrøring.

Hver av disse biosensor plattformene har sine egne fordeler og ulemper. For å tilveiebringe en direkte sammenligning mellom de instrumentenes evne til å gi kvalitetskinetiske data, de beskrevne protokoller illustrerer eksperimenter som bruker den samme analyseformatet, og den samme høye kvalitet reagenser for å karakterisere antistoff-antigen-kinetikk som passer den enkle 1: 1 molekylær modell for gjensidig påvirkning .

Protocol

1. Proteiner og Antistoffer

  1. Produsere og rense det humane proprotein konvertase subtilisin Kexin type 9 (PCSK9) og ti mus-avledet anti-PCSK9 mAb som tidligere beskrevet 17.
  2. Bedømme renheten av de rensete produktene ved sekvensiell injisering av 10 ug av hver prøve til en analytisk størrelseseksklusjons-(SEC) under anvendelse av en UPLC system 19.

2. Kinetiske målinger i Biacore T100

  1. Instrument og Reagensforberedelse
    1. Ekvilibrer CM5 sensor chip ved romtemperatur i 15 min.
    2. Tine to 200 pl alikvoter av 200 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC) og to 200 pl alikvoter av 50 mM N-hydroksysuccinimid (NHS) ved romtemperatur.
    3. Fremstill en 1 liters flaske med 1 x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA og 0,005% v / v polysorbat P20) rennende buffer ved diLuting en 10x HBS-EP + stamløsning i vann.
    4. Forbered 1 ml protein A / G ved 30 ug / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) og 500 ul av hver prøve mAb på 0,063 ug / ml i HBS-EP rennende buffer. Tine en frossen ampulle av menneskelig PCSK9 på is.
    5. I kontrollgruppen programvaren, klikk på "Tools | Eject Chip", plasserer sensoren chip inn i skjeden og nær. Klikk "Verktøy | innstilt temperatur", skriv "25" ° C som analysen temperatur og "10" ° C som temperaturen i kupeen.
  2. Surface Immobilisering
    1. I kontrollgruppen programvaren, klikk på "Fil | Åpne / Veiviser for ny mal" og velg "Immobilisering" fra listen i venstre panel.
    2. Klikk "Ny" for å gå inn i immobilisering oppsettvinduet. Velg "CM5" som chip type og velge "1" flyt celle per syklus.
    3. Merk av i boksen ved siden av hver "immobilisere flyt celle 1/2/3/4" til activate alternativene. Velg "Mål for immobilisert nivå" og "Amin" som metode for alle strømningsceller.
    4. Tast inn "30 ug / mL ProA / G" som ligand, sørge for at målnivået er satt til "10000" respons enheter (RU) for alt av strømningsceller.
    5. Sjekk "Prime før run", og klikk "Next". Velg "reagens Rack 2", definerer beliggenheten for de reagenser og pipette til individuelle prøverør tilsvarende. Sett stativet tilbake inn i instrumentet, og klikk på "Start" og skriv et eksperiment navn for å bli frelst for å starte kjøringen.
  3. Analytten Binding og regenerering Cycles
    1. Klikk "Fil | Åpne / New Method", velg "20140812 hu anti-PCSK9 IgG binding til hu PCSK9" og åpne metoden. Anmeldelse av parametrene i fremgangsmåten.
    2. I "Assay-trinn", sikre at det er 10 sykluser i hvilke "hu PCSK9" er navnet med "Sample" valgt i "Purpose". Den replikere tall er satt til '1'.
    3. I "Cycle Types", som ligger kontakttiden til "220" s til digitalisering 1 over strømningsbanen "2", "110" s til digitalisering 2 over strømningsbane "3", og "55" s til digitalisering 3 over strømningsbanen "4". Strømningshastigheten er "10" ul / min for alle de fangst sykluser.
    4. Velg "Sample 1", sjekk "Sample løsning" som variabel. Still kontakttiden å "600" s og dissosiasjonen tid til å "2700" s enn strømningsbane "1, 2, 3, 4". Strømningshastigheten settes til "30" ul / min.
    5. Velg "Regeneration 1", angir "Glycin-HCl pH 1,5" i løsning felt og sette kontakttiden til "20" er mer enn strømningsbane "1, 2, 3, 4".
    6. I "variable innstillinger", angir to-ganger titrere konsentrasjoner av "100 nM - 6,25 nM" for Syklus 1-3, "50 nM - 3.12 nM" for Syklus 4-8, og "5 nM - 0,323 nM" feller Syklus 9-10.
    7. I "Setup Run", velg påvisning strømningsbanen "2-1, 3-1, 4-1", klikk "Next", sjekk "Prime før run", og klikk "Next".
    8. Velg "Sample og reagens Rack 1", definerer beliggenheten for de reagenser og det pipette inn i de enkelte prøverør tilsvarende. Sett stativet inn i instrumentet, og klikk på "Start" og skriv et eksperiment navn for å bli frelst for å starte kjøringen.
  4. Dataanalyse ved hjelp av BIAevaluation
    1. Klikk "Kinetics / Affinity | Surface bundet", velg Fc "2-1", "3-1", eller "4-1" separat og kontrollere alle de viste kurvene fra de ulike analyttkonsentrasjoner samt "null" konsentrasjonen blank.
    2. Klikk "Next" for å få buffer blank trekkes kurver. Klikk deretter på "Kinetics," velg "1: 1 Binding" -modellen, og klikk "Tilpass" for å få montert bevegelses Parameregistre.
    3. For den globale montering av flere mAb-flater, klikk "Multiple R max" nederst og tilsett bindingskurver fra de andre FCS for den samme mAb til listen.
    4. Klikk på "Neste" for å oppnå alle de tomme buffer subtraherte bindingskurver. Klikk deretter på "Kinetics," velg "1: 1 Binding" modellen, og velg "fit lokale" for hver R maks i parametrene for å oppnå globalt montert kinetiske parametre.

3. Kinetiske målinger i ProteOn XPR36

  1. Instrument og Reagensforberedelse
    1. Ekvilibrer en GLM sensorbrikke og en 2-L flaske med PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20, og 3 mM EDTA) kjøre-buffer ved romtemperatur i 15 min.
    2. I kontrollgruppen programvaren, klikk på "Eject" og sett inn GLM chip. Still chip temperaturen til "25" ° C og det autosampler temperaturen til "10" ° C.Klikk "Glyserol initialisering" og følg bedt instruksjonene for å initialisere chip.
    3. Klikk på "File | Open" en preconditioning protokoll fra listen, utarbeide løsninger i en 96-brønns plate. Klikk deretter på "Run", velg protokollen og klikk "Start".
    4. Tine en 1 ml alikvot av 400 mM EDC og en 1 ml alikvot av 100 mM N-hydroksysulfosuksinimid (sulfo-NHS) ved romtemperatur.
    5. Fremstille 2 ml protein A / G ved 60 ug / ml i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) og 500 ul av hver mAb prøve på 0,25 ug / mL, 0,125 ug / ml, og 0,063 ug / ml i PBS-T EDTA rennende buffer. Tine en frossen ampulle av menneskelig PCSK9 på is.
  2. Immobilisering, Analyte innbinding og Regeneration
    1. Klikk "Fil | Ny | Nye Protocol". I "konfigurasjon", angir på eksperimentet, velg "GLM" chip, velg "Mikro", og skriv "2,2" ml volum.
    2. Plukke ut"Protokoller | Samples", definerer "EDC / sulfo-NHS" som "Aktivator" i brønner H1-H6, "Protein A / G" og "ligand" i G1-G6, "Etanolamin" som "Deactivator" i F1-F6 "Glycin" som "Regenerator" i E1-E6, PBS-T-EDTA "som "Blank" i D1-D6, "mAb X sample" som "ligand" i C1-C6, og "human PCSK9" som" Analytt i brønner H1-H6 i en annen 96-brønns plate.
    3. Velg "trinn", dobbeltklikk på "Immobilization" i "Protocol Editor", er fremgangsmåten omfatter tre påfølgende horisontale injeksjoner av EDC / sulfo-NHS, protein A / G, og 1 M etanolamin hver i en strømningshastighet på "30" ul / min og en kontakttid på "300" s.
    4. Klikk på "regenerere", injisere tre "18" -s pulser av glycin (pH 1,5) ved "100" ul / min i både de horisontale og vertikale retninger, fulgt av to "60" -s pulser med PBS-T-EDTA "25" ul / minogså i begge retninger.
    5. Klikk på "Ligand", injiserer mAb mAb 1 2 i vertikal retning ved hjelp av en strømningshastighet på "25" ul / min og en kontakttid på "160" s.
    6. Klikk på "Analytt", injisere fem konsentrasjoner av human PCSK9 (100 nM til 6,25 nM i 2-gangers seriefortynninger) og en tom buffer over 6 horisontale kanaler samtidig, i "40" ul / min for "600" s av krets tid fulgt med "2700" s av dissosiasjon tid.
    7. Klikk på "regenerere", injisere to "18" -s pulser av glycin (pH 1,5) ved "100" ul / min i både de horisontale og vertikale retninger.
    8. Gjenta trinnene ovenfor etter hvert bindingssyklus for de resterende mAbs.
      MERK: I tillegg til den 100 nM - 6,25 nM human PCSK9 konsentrasjonsrekke, 25 nM - 1,56 nM og 5 nM - 0,313 nM konsentrasjon serie blir brukt.
    9. Forbered prøvene og reagensene i to 96-brønns plater i henhold til reagens-stillingenedefinert i trinn 3.2.2, klikk på "Kjør" -kategorien, velg protokollen / eksperiment og klikk "Start".
  3. Data Analysis Bruke ProteOn manager
    1. Klikk på "Panel Type" og velg "Analyte". Klikk deretter på "Protocol Step" og velg alle bindingskurver i listen.
    2. Klikk "Auto Process", og klikk "Process | Kanal Reference | Interspot". Klikk deretter på "Process | Double Reference | Row | A6".
    3. Klikk "Opprett datasett" for å lagre individuelle datasett for hver mAb på alle tre flater for kinetisk analyse.
    4. Klikk "Analyse Datasett", markere hvert mAb datasett og klikk "Analyse | Kinetic". Velg "Langmuir" modellen og "Samtidig ka / kd" og klikk "Next".
    5. Marker både foreningen og dissosiasjon tilpasningsområde, velg "Local" R max, og klikk "Next" for å utføre skikket til å innhentede monterte kinetiske parametre.
    6. Gjenta trinnene ovenfor, men velge "Gruppert" Rmax for montering for å oppnå de eksperimentelle R max verdier for beregning av liganden overflateaktivitet.

4. Kinetiske målinger i Oktett RED384

  1. Reagens og Prøveplatepreparering
    1. Fremstill 50 ml av 1 x KB (Kinetic buffer som inneholdt PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% albumin, og 0,05% natriumazid) ved å fortynne en 10 x stamløsning i PBS.
    2. Tilsett 1x KB inn i en 96-brønn plate med 200 ul per brønn. Hydrat-48-anti-human-fangst (AHC) biosensor tips i de individuelle brønnene i minst 10 min.
    3. Å klargjøre hver mAb prøve ved 20 ug / ml, 10 ug / ml, og 5 pg / ml i 1 x KB, så vel som human PCSK9 7 titrert konsentrasjoner fra 100 nM til 1,56 nM i to gangers seriefortynninger.
    4. Installering av mAb-prøvene inn i en 384-brønners vippet bunnet mikroplate (Referred til som reagens Plate) og de humane PCSK9 soppløsningene i en annen 384-brønn mikroplate (referert til som prøveplate) 90 mL per brønn.
    5. Belastning serie 1x KB og glycin (pH 1,5) oppløsninger i brønnene i prøveplaten.
      MERK: brukes Disse 1x KB brønnene for chip prekondisjonering, skriftlinje stabilisering, og analytt dissosiasjon. Den glycin løsningen brukes for regenerering.
  2. Eksperimentell metode Setup
    1. I datainnsamling programvare, kan du klikke "Experiment | Nytt eksperiment Wizard | New Kinetics Experiment | Basic Kinetics".
    2. I "Plate Definition", følger trinnene nedenfor for å definere prøvetypene og posisjoner.
      1. Velg "16" kanaler og "384-brønnen" format.
      2. Definer prøven og reagensbeholdere steder i platen displayet ved å holde nede Shift mens venstre klikke ved brønnen for å fremheve 16 brønner på en gang.
      3. Høyreklikk påbrønner inneholdende mAb prøvene, og velger "Load" for å betegne det trinn ved hvilket mAbs blir lastet inn (eller fanget) på støtte AHC sensorene. Skriv inn Mab navn og konsentrasjoner i tabellen til høyre.
      4. Høyreklikke på brønnene som inneholdt det humane PCSK9 og velger "Sample" for å indikere det trinn ved hvilket mAb-fangede sensorer er dyppet og bindingsinteraksjonene blir målt. Angi de tilsvarende molare konsentrasjoner i tabellen på høyre side.
      5. Definer brønnene som inneholdt 1 x KB som "buffer" eller "Nøytralisering", og brønnene som inneholder glycin som "Regeneration".
    3. I "analyse Definition", følger du fremgangsmåten nedenfor for å definere den eksperimentelle oppsett:
      1. Klikk på "Legg til" og velg "Baseline", "Regenerering", "Ekvilibrering", "Loading", "foreningen", og "dissosiasjon" trinnene til liste med tider "30" s, "30" s "18" s "200" s "500" s, og "1800" s, hhv. Rystehastigheten er "1000" rpm.
      2. For å legge til fremgangsmåten for å "Analyse Steps List", første klikket på et trinn, klikk deretter på brønnene som ligger i enten prøve eller reagens plate. Trinnene er som følger:
        1. Ekvilibrering-Regeneration: forutsetning AHC sensorene ved hjelp av tre sykluser med "15" -s fall i glycin (pH 1,5), alternerende med "15" -s fall i 1x KB.
        2. Lasting: fange mAb prøvene på AHC sensorene for "200" s.
        3. Baseline: etablere BLI signal for "60" s før foreningen trinnet.
        4. Forening: dypp følerne til brønnene inneholdende varierende konsentrasjoner av human PCSK9 for en "500" -s krets periode.
        5. Dissosiasjon: dypp PCSK9 bundne sensorer i nye brønner på 1x KB for en "1800" -s dissosiasjon periode.
        6. Regenerering: dyppe den mAb-PCSK9 bound sensorer i brønner av glycin (pH 1,5) med to "18" -s puls mellom hvert bindingssyklus.
    4. I "Gjennomgang Experiments", skyver gjennom trinnene og gjøre de nødvendige endringene ved å gå tilbake til forrige kategoriene.
    5. I "kjøre eksperimenter", skriv inn et "60" s forsinkelse og riste prøven plate mens du venter. Sett platetemperaturen til "25" ° C og trykk på "GO".
  3. Data Analysis Bruke ForteBio Data Analysis Software
    1. Klikk "Data Selection | Loaded data | Kinetics | PCSK9 antistoffer binding til PCSK9 7.23.14"
    2. I "Processing", behandle dataene som følger:
      1. I Trinn 1: Klikk på "Sensor Selection" for å markere sensorer i H1-H6, høyreklikk på dem og klikk på "Endre Sensortype | referansesensor."
      2. I trinn 2, sjekk "subtraksjon" og velg "Gjennomsnittlig referansesensorer"; for å subtrahere hver aktiv prøve sensor fra gjennomsnittet av de 6 tomme buffer sensorer.
      3. I trinn 3, klikker "Juster Y-akse" og velger "baseline" for å justere alle bindingseksperimentene kurvene til basislinjen trinn før krets.
      4. I trinn 5, sjekk "Savitsky-Golay Filtering" for å jevne ut bindingskurver ved å øke signal-til-støy-forhold, og klikk "Process data!".
      5. I trinn 6, klikker "prosesserte resultater" for å vise de behandlede bindingskurver.
      6. I trinn 7, gjennom fire felt til høyre viser de bindingskurver etter hvert behandlingstrinn, og klikk "Lagre Behandlet data".
    3. I "Analyse", sjekk "Foreningen og Dissosiasjon" og velg "1: 1" modell.
    4. Markere bindingskurver på "Global (full)" fit og gruppere dem med "farge". Bruk "Rmax bundet" til å utføre gruppen montering på sensorer som er belagt med det samme mAb-konsentrasjon for å oppnå de eksperimentelle R maks for beregning av liganden overflateaktivitet, og "Rmax opphevet koblingen av sensor" for å utføre global montering på sensorer som er belagt med flere mAb-konsentrasjoner.
    5. Klikk "Fit Curves" for å få de montert kinetikk parametere. Lagre resultatene ved slutten av hvert beslag analyse.

5. Kinetic Målinger i IBIS MX96

  1. Instrument og Reagensforberedelse
    1. Ekvilibrer en COOH-G-chip ved romtemperatur i 15 min.
    2. Fremstill en 1 liters flaske systemets løpende buffer (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) og immobilisering buffer (10 mM natriumacetat [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
    3. Å klargjøre hver mAb fra 20 ug / ml til 0,16 ug / ml ved 2-gangers seriefortynninger i både systemet rennende buffer og natriumacetat (pH 5,0) immobilisering buffer.
    4. Tilsett mAb-prøvene i to septemberarate 96-brønners plater hvor hver mAb opptar 8 vertikale brønner i titrerings-konsentrasjoner på 200 mL per brønn.
    5. Tine aliquoter av 400 mM EDC og 100 mM sulfo-NHS ved romtemperatur.
    6. Forbered 300 pl protein A / G ved 50 ug / ml i natriumacetat (pH 5,0) buffer og immobilisering pipette den inn i en ampulle.
    7. Forbered 200 ul av humant PCSK9 fra 100 nM til 0,39 nM av 2-gangers seriefortynninger i systemet rennende buffer. Pipette dem i separate ampuller.
  2. Multi-syklus kinetikk ved at amin-koblet antistoff matriser
    1. Bland EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) alikvoter og dispensere blandingen inn i topp 48 brønnene i en ny 96-brønners plate på 200 mL per brønn.
    2. Plasser mAb kilden platen (fortynnet i natriumacetat, [pH 5,0]) i stilling 2 og EDC / sulfo-NHS-reagens plate i stilling 1 inne i skriveren.
    3. Installere sensorbrikken inn i CFM. Åpne "CFM 2.0" software, og klikk deretter "Last inn innstillinger | 96 Amine Couple". De 10 x 8 antistoffarrangement opprettes som følger:
      1. Lever EDC / sulfo-NHS i den øvre halvdel av reagenset platen til føleren ved hjelp av 48 mikrokanalene, og syklusen dem over sensoroverflaten for "5" min.
      2. Lever mAb prøvene i den øvre halvdel av kildeplaten til føleren og syklusen dem over de aktiverte overflater for "10" min.
      3. Lever immobilisering i bufferen fra en 50 ml konisk rør over antistoffet flate for "5" min.
      4. Gjenta fremgangsmåtene ovenfor for de andre mAb prøvene i den nedre halvdel av kildeplaten.
    4. Forankre den trykte sensorbrikken inn i instrumentet. I kontrollgruppen programvaren, klikk på "File | Koble | Åpne Måling | Eksisterende Measurement" og velg "2014-08-15".
    5. I "Generelt", velg "G - System Prime" under "Full system script". Deretter velger du "G - Quench" for å deaktivere MAb overflater ved å injisere 150 ul 1 M etanolamin.
    6. Klikk "Camera" for å visualisere monoklonalt antistoff arrays og justere kontrasten ved behov. Plasser de røde firkantede bokser å omgi MAB flekker, og flytte de grønne firkantede bokser til interspots ligger mellom de aktive monoklonalt antistoff stedene for å registrere.
    7. I "Analyse Cycle", velg "A - AP Standard Run" under "IBIS skript". Satt 1,0 min for basislinje, 10,0 min for forening, og 90 fremgangsmåten for dissosiasjon ved 8 ul / s hastighet.
    8. Inne i "sykluser", injisere humane PCSK9 en konsentrasjon på et tidspunkt etter fem buffer injeksjoner. Regenerere mAb overflatene med glycin pH 2,0, mellom hvert bindingssyklus.
  3. Single-syklus kinetikk med FC-fanget antistoff arrays
    1. Installer en ny sensor chip inn i CFM. Gjenta trinn 5.2.3 til 5.2.5 ovenfor ved å erstatte mAb prøvene med protein A / G.
    2. Fjernfølerbrikken fra MX96 og sette den tilbake i CFM skriveren.
    3. Lever mAb'er i den øvre halvdel av platen til protein A / G-sensor overflaten ved hjelp av 48 mikrokanalene, og syklusen dem over overflaten ved hjelp av toveisflyt i 10 min.
    4. Gjenta trinnene ovenfor for de resterende mAb prøvene i den nedre halvdel av platen.
    5. Forankre den trykte sensorbrikken inn i MX96 instrumentet. I Data Acquisition Software, klikk "Fil | Koble | Åpne Måling | Eksisterende Måling | Next" og velg "Protein A + G bindende kinetic7.30.14".
    6. Klikk "kamera" for å visualisere monoklonalt antistoff arrays og justere kontrasten ved behov. Plasser de røde firkantede bokser å omgi MAB flekker, og flytte de grønne firkantede bokser til interspots ligger mellom de aktive monoklonalt antistoff stedene for å registrere.
    7. I "Analyse Cycle", velg "A - AP Standard Run" under "IBIS skript". Sett "1,0 min" for baseline ", 10,0min" for forening, og '10' trinn for dissosiasjon ved '8 ul / sek' hastighet.
    8. Inne i "sykluser", injisere humane PCSK9 en konsentrasjon på et tidspunkt etter fem buffer injeksjoner. Ingen regenerering blir utført mellom hver analytt injeksjon.
  4. Dataanalyse Ved hjelp SPRINT og Scrubber
    1. I SprintX sofware, klikk "Fil | Åpne Triangle File", velg alle prøve injeksjoner i listen, og marker "Lagre SprintX fil", "Kalibrering" og "RLL besluttsomhet" før du klikker på "Analyze".
      MERK: RLL-verdiene refererer til de immobiliserte / fangede mAb nivåer på sensoroverflaten.
    2. Sjekk "Referere" og velg "lokale" å bruke de tilstøtende referanse flekker. Sjekk også "Juster" på den første injeksjonen, og klikk deretter på "Start Automation."
    3. I seriemenyen, velg "Vis herskere i verktøylinjen," justere demå velge et lite område av grunnlinjen umiddelbart før den første prøveinjeksjon, og velger "null".
    4. Generere en .IBMX fil til analyse i Scrubber ved å velge "Eksporter til IBMX fil" og deretter "Start Automation."
    5. Lansere Scrubber og laste .IBMX filen. Enter "100n" som "Stock kons" og "2" som "fortynningsfaktoren".
    6. Avlingsdataene, fjerne alle basislinje før start av injeksjonen, og innrette bindingskurver ved starten av krets.
      MERK: For enkeltsykluskinetikk eksperiment, ikke justere kurvene.
    7. Gå til "Kinetics" tab, juster linjal for innsprøytningsenden tid, velger "k d" og passform, deretter "fikse k d." Velg "k et k d" og monter den igjen.
    8. Flyt k d kolonnen og i form igjen for å begrense den passform.
      NB: For montering av en-cyklus bindingskurverKlikk "ALT" og velg bort "Trekk", velg deretter "Separat" og flyte "Start Inj" -kolonnen å passe foreningen profilene tilbake til en teoretisk baseline opprinnelse.
    9. Se gjennom montert kinetiske parameterne i fliken resultater.

Representative Results

Figur 1 viser antistoffarrangement med bildet fra CFM og flekket monoklonalt antistoff nivåene av de to immobilisering metoder, og Figur 2 viser de tilsvarende bindings sensorgrams som genereres i MX96 fra multi-syklus kinetiske og den en-cyklus kinetiske målinger på disse mAb-arrays . Den sanntids-binding og kinetisk montert kurver fra multiple antistoff-belagte overflater som genereres i de fire biosensor plattformene er vist i Figurene 3 - 6. Figur 7 viser sammenligningen av de endelige kinetiske rater og Likevektsbinding konstanter oppnådd fra den globale analyse av disse bindingskurver. Den enkelte assosiasjon (k a), dissosiasjon (k d), og likevekt (KD) bindingskonstanter er presentert i tabell 1. For å demonstrere variabiliteten av datasett generert innenfor samme instrument, k a, k d, og K D ved forskjellige mAb overflate tettheter, og Figur 9 sammenligner de beregnede bindingsaktiviteter for de mAb flatene på tvers av biosensor plattformene ytterligere.

Figur 1
Figur 1. Multipleks ligand Arrays av amin-koblet (A) og Fc-fanget (B) Antistoff Overflater fra CFM Printing i IBIS MX96. Bilder av de trykte arrays er vist i den venstre paneler, hvor de grå områdene omgitt av røde firkanter indikerer tilstedeværelse av antistoff. De mørkere interspots plassert mellom de aktive antistoff-stedene blir brukt for referanse subtraksjon. Hver kolonne inneholder et antistoff som er trykt på titrerings-konsentrasjonene angitt nedenfor, og til venstre i bildet. Mengdene av de trykte antistoffene kvantifisert ved å beregne difference i bulk forskyvninger mellom de aktive og referanse steder er vist i høyre panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning av Real-time Binding Sensorgrams fra Multi-syklus (A) og en-cyklus (B) Kinetiske Forsøk i IBIS MX96. Den sekvensielle injeksjoner av human PCSK9 ved økende konsentrasjoner på tvers av de 10 x 8 antistoff-matriser er angitt over hver tilsvarende sensorgram segment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
(øvre paneler), middels (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De kledde glatte sorte linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1: 1-modell for gjensidig påvirkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Binding Sensorgrams av de fangede antistoffer i samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i ProteOn XPR36. Vekselvirkningen er evaluerte over høy- (øvre paneler), medium- (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De kledde glatte sorte linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1: 1-modell for gjensidig påvirkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Binding Sensorgrams av de fangede antistoffer i samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i Oktett RED384. Vekselvirkningen er evaluerte over høy- (øvre paneler), middels (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De klædd med røde linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1: En modell for gjensidig påvirkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Binding Sensorgrams av aminet koplede (A) og Fc-fangede (B) Antistoffer samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i IBIS MX96. Bindingsprofiler er organisert som 10 x 8 paneler som følger matrise plate kartet på figur 1. De sorte linjer representerer de registrerte bindende svarsignaler på forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner, og som er lagt over røde linjer representerer de monterte kurver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figur 7. Sammenligning av Association k en (A), Dissosiasjon k d (B), og Equilibrium K D (C) bindingskonstanter som frembringes av fire biosensor plattformer. De kinetiske parametere er avledet fra global analyse av bindingskurvene i figur 3 - 6. Instrumentene er representert som følger: Biacore T100 (blå), ProteOn XPR36 (grønn), Oktett RED384 (rød), IBIS MX96, amin-koblet (purpur), og IBIS MX96, Fc-fanget (oransje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Sammenligning av konsistensen av Kinetic hastighetskonstanter over flere Antistoff Surface densiteter i Biac malm T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Oktett RED384 (C), IBIS MX96, amin-koblet (D), og IBIS MX96, Fc-fanget (E). De kinetiske parameterne k a (topp underpanel), k d (midterste underpanel), og K D (bunnunderpanel) er avledet fra gruppeanalyse ved individuell antistoff overflatetetthet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Bindingsaktivitetene av antistoffet overflater og deres standardavvik (feilfelt) i de fire biosensor plattformer. Verdiene er beregnet ved hjelp av ligninger beskrevet i vitenskapelige artikler 17.large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

k en k d K D
(M-1S-1) (e -1) (nM)
mAb 1 11,7 (7,8) x 10 5 4,89 (4,18) x 10 -5 0,052 (0,05)
mAb 2 1,53 (0,28) x 10 5 1,30 (1,54) x 10 -5 0,092 (0,12)
mAb 3 11,4 (8,3) x 10 5 27,6 (11,0) x 10 -5 0,333 (0,20)
mAb 4 3,61 (1,6) x 10 5 20,1 (12,3) x 10 -5 0,659 (0,54)
mAb 5 0,59 (0,21) x 10 5 3,46 (2,50) x 10 -5 0,663 (0,46)
mAb 6 1,19 (0,78) x 10 5 7,21 (3,83) x 10 -5 0,894 (0,64)
mAb 7 1,29 (0,53) x 10 5 16,4 (5,63) x 10 -5 1,57 (1,02)
mAb 8 4,02 (2,23) x 10 5 22,8 (10,7) x 10 -5 0,768 (0,68)
mAb 9 4,20 (2,13) x 10 5 6,67 (4,3) x 10 -5 0,197 (0,16)
mAb 10 1,20 (0,49) x 10 5 12,5 (7,64) x 10 -5 1,27 (0,80)

Tabell 1: Kinetic priser og Equilibrium Binding konstanter av 10 mAbs innhentet av Global Montering av binding Curves fra fire biosensor instrumenter til 1: 1 Interaksjon Model.

Discussion

Vår head-to-head sammenligning studie viser at hver biosensor plattform har sine egne styrker og svakheter. Selv om bindingsprofilene av antistoffene er tilsvarende ved visuell sammenligning (figur 3 - 6), og den rangordningen av de ervervede kinetiske hastighetskonstantene er meget ensartet på tvers av instrumentene (figur 7), viser våre resultater at SPR-baserte instrumenter med kontinuerlige strømnings fluidics) er bedre ved å løse høy-affinitets interaksjoner med langsomme dissosiasjon priser. Drift oppover under dissosiasjon fasen observeres i datasett (f.eks mAb 2, 5 mAb, mAb og 9, figur 5) som genereres av den BLI fluidics-frie instrument. Dette funn kan tilskrives i stor grad til prøve fordampning over tid i mikroplaten, som er en primær begrensning av systemet. Med denne iboende begrensning, er den eksperimentelle tiden også begrenses til mindre enn 12 timer; forsøkene ble derfor programmert med shorter ganger (500 s forening og 30 min dissosiasjon) sammenlignet med de i de andre plattformer (10 min forening og 45 min dissosiasjon). Imidlertid forkorte den eksperimentelle tiden synes ikke å dempe virkningen av fordampning på datakvalitet / konsistens, som hastighetskonstantene genereres av BLI basert instrument vis mindre linearitet som følge av svingninger i noen av av hastighetene (Figur 8C ). I tillegg til prøve fordampning, kan forskjeller i oppbringelsesreagensene som anvendes har også bidratt til forskjellene i de oppnådde resultater. Selv om protein A / G ble anvendt i alle tre Fluidics baserte SPR plattformer, ble AHC sensorer som brukes i den ikke-fluidics BLI plattform. Siden protein A / G er sannsynlig å ha en svakere affinitet for mAbs enn betyr AHC, et antistoff-baserte biosensor overflate, off-hastigheter av mAb-antigen-komplekset fra protein A / G-overflater på kunstig vis kan vises hurtigere enn de som er oppnås fra AHC overflate. Denne mulighet er understøttet by de eksperimentelle data som viser at off-frekvensverdier generert av BLI plattformen var gjennomgående lavere enn de som oppnås fra de andre instrumenter (figur 7, rød linje). Likevel har BLI plattform forskjellige fordeler fremfor de andre plattformene. For eksempel, er den svært fleksibel med hensyn til valg sensor og analyse konfigurasjon på grunn av de forskjellige forbelagte sensorer for umiddelbar bruk. I våre eksperimenter bruk av AHC Sensorene bli eliminert behovet for liganden immobilisering trinn, noe som reduserer forberedelsestid. Videre krever BLI plattformen mye mindre vedlikehold sammenlignet med de andre lufthåndtering SPR-plattformer, som har kompliserte slange og verdien bryterkonfigurasjonene. Denne egenskap er en fordel for forsøk med rå prøver som kan føre til tilstopping og forurensningsproblemer.

Ettersom behovet for en effektiv, rask og nøyaktig identifikasjon av terapeutiske kandidater øker, vil behovet for biosensor gjennomstrømning er også økende. Blant de fire biosensor plattformene, gjennomstrømningen fra biosensoren i stand til 96-ligand-matrise trykking er det høyeste, etterfulgt av biosensor koblet til en sikksakk 36-ligand-formatet og det BLI baserte biosensor med 16 kanaler samtidig utlesning, noe som til syvende og sist øker antall interaksjoner målt i et enkelt bindende syklus til 96, 36 og 16, henholdsvis. Disse gjennomløpskapasitet er betydelig høyere enn for den tradisjonelle SPR-plattformen, som er begrenset ved at bare fire strømningsceller forbundet med en enkelt seriestrømning. Siden våre eksperimenter involverte et relativt lite utvalg sett med 10 mAbs evaluert på flere overflate tettheter med lange dissosiasjon ganger, instrumentale throughputs spilt en moderat rolle i å bestemme effektiviteten av forsøkene. Det var ingen signifikante forskjeller i de eksperimentelle tider av de tre high-throughput plattformer, og i alle tilfeller forsøkene ble gjennomført på en dag. På den annen side, den tradisjonelle seriestrømnings SPR eksperimenter kreves 3 dager å fullføre, til tross for walk-away automatisering av datainnsamling etter oppsett. I andre studier som involverer et stort antall prøver (dvs. i flere hundre eller tusen), for off-rate rangerings / kinetisk screening eller epitop binning formål, blir gjennomstrømningen en kritisk faktor.

Selv om gjennomstrømningen i IBIS MX96 er flere størrelsesordener høyere enn den for de andre biosensorer og er derfor et optimalt valg for disse formål, har det noen mangler. Spesielt rekken trykking av CFM viser store overflateuregelmessigheter (figur 1) og redusert data reproduserbarheten (figur 8D og 8E). For nøyaktige kinetiske målinger, er mengden av ligand på biosensor overflate er en kritisk parameter som må kontrolleres for å sikre at bindings responser ikke blir forstyrret av sekundære faktorer såsommasseoverføring eller sterisk hindring. For Biacore T100 og ProteOn XPR36 ble de optimale R-L-nivåene bestemt basert på standarden beregning av settet R max verdier som beskrevet i det forskningsartikkel 17. På den annen side, for de Oktett RED384 og IBIS MX96 plattformer, ble mAb fangstnivåer oppnås empirisk ved hjelp av en serie av 2-ganger seriefortynnede antistoffer i faste tider. Mangelen på kjennskap til eller kontroll av fangst trinn resulterte i en høy tetthet overflate og høy bindingsreaksjonssignaler (figur 2) som kan ha kompromittert nøyaktigheten av de kinetiske hastighetskonstantene. Videre er separeringen av skriveren fra SPR detektoren er også en utfordring når gjennomføre flere bindesyklus målinger som involverer regenereringer. Den eneste måten å utføre multi-syklus kinetikk oppsettet var ved direkte aminkobling av mAb'ene, i motsetning til å fange opp gjennom mAb Fc av det immobiliserte protein A / Goverflate på de tre andre biosensor plattformer. Som et resultat ble en ytterligere regenerering rekognosering eksperiment er nødvendig for å bestemme de optimale regenereringsbetingelsene. Resultatet av dette oppsettet var knyttet til en ~ 90% lavere observerte overflateaktivitet sammenlignet med Fc fangst-metoden (figur 9), i tillegg til en lengre forsøks tid. For å utføre Fc fangstmetode, ble et alternativ single-syklus kinetisk tilnærming vedtatt. Denne fremgangsmåten omfatter den sekvensielle injeksjon av analytt ved økende konsentrasjoner uten regenerering mellom hver injeksjon (figur 2). Denne svært praktisk, men mindre vanlig anvendt tilnærming ikke bare forkortes den eksperimentelle tiden og redusert reagens forbruk, men også produsert kinetiske hastighetskonstanter høyt som ligner de fra de andre biosensorer (figur 7). Derfor er anvendelsen av denne enkelt-sykluskinetikken tilnærmingen overvinner den iboende begrensning konfigurasjon av instrumentet og viser enmulighet for å oppnå høy oppløsning kinetiske hastighetskonstanter i en high-throughput måte.

Til tross for gjennomstrømningen være en stor begrensning i Biacore T100, våre resultater kollektivt viser at det genereres de mest konsistente data med høyeste kvalitet. Dette ble etterfulgt av ProteOn XPR36, som har ~ 10 ganger høyere gjennomstrømning. Deres evne til å generere høy-kvalitetsdata blir en fordel ved karakterisering av høy-affinitets antistoff-antigen-vekselvirkninger som kan være teknisk utfordrende når instrumentenes deteksjonsgrensene er nådd. Mens de systematiske begrensninger i instrumentering av Oktett RED384 hindre nøyaktig måling av dissosiasjon hastighetskonstanter (det vil si fallende kort av følsomheten for å løse tilstrekkelig signal forråtnelse for langsom off-priser), både Biacore T100 og ProteOn XPR36 kan gi følsom og pålitelig deteksjon for differensiering.

Disclosures

Publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Forfatterne takker Noah Ditto og Adam Miles for teknisk assistanse på IBIS MX96.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T100 System GE Healthcare 28975001 The T100 system has been upgraded to T200
CM5 Sensor Chip  GE Healthcare BR100012
BIAevaluation  GE Healthcare Version 4.1
Biacore T100 Control Software GE Healthcare The T100 control software has been upgraded to T200
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 
HBS-EP+ Buffer 10× GE Healthcare BR100669 Concentrated stock solution 
Plastic Vials, o.d. 7 mm GE Healthcare BR100212 
Rubber Caps, type 3 GE Healthcare BR100502
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm GE Healthcare BR100214 
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System Bio-Rad 1760100
ProteOn Manager Software  Bio-Rad 1760200 Version 3.1.0.6
GLM Sensor Chip Bio-Rad 1765012
Amine Coupling Kit Bio-Rad 1762410 It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl 
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers Bio-Rad 1762210 It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution 
2 L PBS/Tween/EDTA buffer Bio-Rad 1762730 It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA 
Octet RED384 System FortéBio
Data Analysis Software FortéBio Version 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors FortéBio 18-5060 One tray of 96 biosensors 
384-Well Tilted-Bottom Plate  FortéBio 18-5080
Biosensor Dispenser FortéBio 18-5016
Kinetics Buffer 10x FortéBio 18-1092 10x concentration. Contains ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi System Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer Wasatch Microfluidics Version 2.0
SensEye COOH-G chip Wasatch Microfluidics 1-09-04-004
Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.19.3.17
SPRint Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.15.2.1
Scrubber 2 BioLogic Software Version 2
Pierce Recombinant Protein A/G ThermoFisher Scientific 21186

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Tags

Biochemistry utgave 122 optiske biosensorer antistoff-antigen-vekselvirkninger bindingskinetikk medisiner overflate-plasmonresonans biolag Interferometry
Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D., Singh, A., Wu, H.,… More

Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659, doi:10.3791/55659 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter