Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55659
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

Summary

Burada tarif afinite ve dört yaygın biçimde kullanılan biyosensör platformları kullanarak kinetiği bağlayıcı antikor-antijen ölçümü için protokolleri.

Abstract

Etiket içermeyen optik biyosensörler biomoleküler etkileşimlerin karakterizasyonu için ilaç keşfi güçlü araçlardır. Bu çalışmada, bağlanma afinitesi, insan minimal bölünme sinyalini hatırlatmaktadır subtilisin kexin tip 9 karşı on yüksek afiniteli monoklonal antikorlar (mAb'ler) (PCSK9) kinetiklerini değerlendirmek için laboratuarda dört rutin olarak kullanılan biyosensör platformları kullanılmasını tarif eder. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hem köklü Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) teknolojisi elde edilir olsa da, önceki yapımı bir 6 x 6 CrissCross ile paralel Bu tutucu ise 36 Reaksiyon noktalar, seri akış konfigürasyonu ile bağlı dört akış hücresinin sahip mikroakışkan kanal konfigürasyonu. IBIS MX96 da mekansal yönlenmede algılama sağlayan ek bir görüntüleme özelliği ile, SPR sensor teknolojisine dayalı olarak çalışır. Sürekli Akış Microspotter (CFM) ile bağlandığında, bu algılama tekniği e oranını önemli ölçüde genişletirAynı anda 96 reaksiyon sporları çoklu dizi baskı ve algılama nabling. Bunun aksine, Sekizli RED384 fiber optik prob girişim deseni tespit etmek için biyosensör olarak hareket ile BioLayer İnterferometri (BLI) optik prensibine dayanan uç yüzeyinde etkileşimleri bağlanması üzerine değişir. SPR tabanlı platformlar farklı olarak, BLI sistemi sürekli akış akıskanlar tekni˘gi dayanmaz; onlar yörünge ajitasyon sırasında 384 mikroplakanın analit çözümleri dalmış iken yerine, sensör ipuçları okumaları toplar.

Bu biyosensör platformları her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 1 moleküler etkileşim modeli: anlatılan protokoller basit 1 uygun bir antikor-antijen kinetiği karakterize etmek için aynı deney formatı ve aynı yüksek kalitede reaktif maddeleri deneyleri göstermektedir kalite kinetik veri sağlamak için bu araçların kabiliyetinin doğrudan karşılaştırma sağlamak için .

Protocol

1. Proteinler ve Antikorlar

  1. Daha önce tarif edildiği gibi 17 tip 9 (PCSK9) kexin insan minimal bölünme sinyalini hatırlatmaktadır subtilisin on fare-türevli anti-PCSK9 mAb'ler üretmek ve saflaştırmak.
  2. Ardışık UPLC sistemi 19 kullanılarak bir analitik boyut dışlama (SEC) sütuna her numune için 10 ug enjekte edilerek saflaştırılmış ürünlerin saflığını değerlendirmek.

Biacore T100 2. Kinetik ölçümler

  1. Enstrüman ve Reaktif Hazırlama
    1. 15 dakika oda sıcaklığında CM5 sensör çipi dengelenmesi.
    2. 200 mM 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC) ve oda sıcaklığında 50 mM N-hidroksisüksinimit (NHS) iki 200 uL alikotlar iki 200 uL alikot çözülme.
    3. 1x HBS-EP 1 L'lik bir şişe hazırlanır (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCI, 3 mM EDTA ve% 0.005 h / h polisorbat P20) ve di çalışan tamponsu içinde 10x HBS-EP + stok solüsyonu yapıştırıcı.
    4. 0.063 ug, 10 mM sodyum asetat (pH 4.5) ve 500 her mAb'nin numunenin uL 30 ug / mL protein A / G 1 mL Hazırlama / HBS-EP çalışma tamponu içinde ml. Buz üzerinde insan PCSK9 donmuş şişe çözülme.
    5. Kontrol yazılımında, tıklayın "Araçlar | Çıkar Chip", kılıf ve yakın içine sensör çipi yerleştirin. kompartman sıcaklığı olarak ° C analiz sıcaklığı olarak C ve "10" ° "25" girin, | "Set Sıcaklık Araçlar" tıklayın.
  2. Yüzey Hareketsizleştirme
    1. "| / Aç Yeni Sihirbazı Şablon Dosyası" ve sol taraftaki panelde listeden "Tutuklaması" seçeneğini kontrol yazılımında, tıklayın.
    2. immobilizasyon Ayarlar penceresine girmek için "Yeni" ye tıklayın. çip türü olarak "CM5" seçin ve döngü başına "1" akış hücreyi seçin.
    3. Bir sonraki activa her "immobilise akış hücresi 1/2/3/4" seçeneğini işaretleyinseçeneklerini te. Bütün akış hücreleri için bir yöntem olarak ve "Amin" "immobilize seviyeye hedefleyin" seçeneğini seçin.
    4. , Ligand olarak "30 ug / mL ProA / G" Giriş hedef seviye, ayarlanmış sağlamak için akış hücrelerinin tüm "10000" yanıt birimi (RU).
    5. "Yayınlanmadan önce Prime" işaretleyin ve "İleri" ye tıklayın. Seç "Reaktif 2 Raf" buna göre tek tek örnek şişelere reaktifler ve pipet için bir konum tanımlar. geri aracı haline raf yerleştirin ve ardından "Başlat" ve koşmak başlatmak için kaydedilmesine Bir deneme adı girin.
  3. Analit bağlanması ve rejenerasyon döngüleri
    1. "20140812 hu anti-PCSK9 lgG'ler hu PCSK9 bağlanma" seçeneğini | "Aç / Yeni Yöntem Dosyası" ve yöntemi açmak tıklayın. yönteminde parametrelerini gözden geçirin.
    2. "Test adımları" olarak, amacı ü "seçilmiş "Numune" ile adı, "hu PCSK9" olan 10 döngü vardır sağlamakose 1 '". suret sayısı olarak ayarlanır'.
    3. temas süresi set "Döngü türleri", akış yolu üzerinden yakalama 1 için "220" in "2", akış yolu üzerinden yakalama 3 için akış yolu üzerinden yakalama 2 için "110" s "3" ve "55" un içinde "4". akış hızı yakalama çevrimlerinin tüm "10" uL / ​​dk.
    4. değişken olarak "Örnek çözüm" kontrol "Örnek 1" i seçin. temas süresi için "600" ler ve ayrılma süresi, akış yolu boyunca "2700" s "1, 2, 3, 4" olarak ayarlayın. akış hızı "30" uL / ​​dakika olarak ayarlanır.
    5. temas süresi çözeltisi alanında "Glisin-HCl, pH 1.5" butonu, "Rejenerasyon 1" seçip belirlemek için akış yolu boyunca "20" s "1, 2, 3, 4".
    6. "Değişken Ayarlar", "100 nM - 6.25 nM", titrasyon yapan konsantrasyonlarında 2 kat girin döngü 1-3 için "50 nM - 3.12 nM" Döngü 4-8 için, ve "5 nM - 0.323 nM", fveya Döngüsü 9-10.
    7. "Kur Çalıştır" olarak, algılama akış yolu seçmek "2-1, 3-1, 4-1", "İleri" ye tıklayın "yayınlanmadan önce Prime" kontrol ve "İleri" ye tıklayın.
    8. Seç "numune ve reaktif 1 Raf", buna göre tek tek örnek şişelere reaktifler için konum ve pipet tanımlar. aracı haline raf yerleştirin ve ardından "Başlat" ve koşmak başlatmak için kaydedilmesine Bir deneme adı girin.
  4. BIAevaluation kullanma Veri Analizi
    1. Click |, "3-1" "2-1" Fc seçin veya "4-1" ayrı ayrı ve aynı zamanda "sıfır" gibi çeşitli analit konsantrasyonları görüntülenen eğrilerin tümünü kontrol "Kinetik / Affinity Yüzeye bağlanan" konsantrasyon boş.
    2. Tampon Blank çıkarılır eğrilerinin elde edilmesi için "İleri" tıklayın. monte kinetik parametrelerle elde etmek: "1 Bağlanma 1" modelini ve "Fit" 'ı "Kinetik," seçim tıklayınçözücüleri.
    3. Birden çok mAb yüzeyleri genel montaj için, altta "Çok R max" tıklayarak listeye aynı mAb için diğer FCS gelen bağlanma eğrileri ekleyin.
    4. Tampon boş çıkarılır bağlanma eğrileri, tüm elde etmek için "İleri" tıklayın. Ardından "Kinetik," seçim tıklayın: modeli "1 Bağlanma 1" ve küresel donatılmış kinetik parametreleri elde etmek parametrelerinde her R max için "yerel uyum" seçin.

ProteOn XPR36 3. Kinetik ölçümler

  1. Enstrüman ve Reaktif Hazırlama
    1. bir GLM sensör çipi ve PBS-T-EDTA, 2-L şişe (PBS [pH 7.4],% 0.005 Tween-20 ve 3 mM EDTA), 15 dakika boyunca oda sıcaklığında çalışan tampon dengelenmesi.
    2. Kontrol yazılımında, tıklayın "Çıkart" ve ardından GLM çipi takın. C ve C ° otomatik numune alıcı sıcaklığı "10" ° çip sıcaklığına "25" e ayarlayın."Gliserol Başlatma" ı tıklayın ve çip başlatmak için istenir talimatları izleyin.
    3. Listeden bir ön şartlandırma protokolü 96 plaka içine çözümler hazırlamak | "Dosya Aç" ı tıklayın. Ardından, "Çalıştır" ı tıklayın protokolü seçin ve "Başlat" a tıklayın.
    4. 400 mM EDC biri 1 ml kısım ve oda sıcaklığında, 100 mM N-hidroksi-(sülfo-NHS), bir 1 ml kısım çözülme.
    5. 0.25 ug / mL, 0.125 mg / mL, ve PBS-T ile 0.063 ug / ml 10 mM sodyum asetat (pH 4.5) ve 500 her mAb'nin numunenin uL 60 ug / ml, 2 ml protein A / G hazırlanması -EDTA çalışan tampon. Buz üzerinde insan PCSK9 donmuş şişe çözülme.
  2. Hareketsizleştirme, analit bağlanması ve rejenerasyon
    1. "| Yeni | Yeni Protokol Dosya" tıklayın. "Yapılandırma" olarak, "Mikroplaklar" seçeneğini "GLM" çip seçin deneme adını girin ve "2.2" ml hacmi girin.
    2. seçmek"Protocols | Örnekler", H1-H6 "Protein A / G" in "deaktivatörü" olarak G1-G6 olarak "Ligand", "Etanolamin" olarak F1-F6 kuyularında "Aktivatör" olarak "EDC / sülfo-NHS" tanımlamak Boş "olarak "E1-E6, PBS-T-EDTA "Regenerator" olarak, "Glisin"" D1-d6, "analit "olarak" "C1-C6 içinde ve" ligand, insan PCSK9" olarak" mAb X örneği ikinci bir 96-yuvalı plaka içindeki yuvalara H1-H6 içinde.
    3. adım "30" uL bir akış oranında, EDC / sülfo-NHS, protein A / G takip eden üç yatay enjeksiyon ve 1 M etanolamin her arasında, "Protokol Editör" in "adımlar", çift tıklama "hareketsiz kılma" Seç / dakika ve "300" s bir temas süresi.
    4. PBS-T-EDTA darbeleri -s iki "60" ve ardından yatay ve ne de dikey yönde "100" uL / ​​dakika, glisin (pH 1.5) darbeleri -s üç "18" enjekte "yeniden oluşturun" tıklayın "25" uL / ​​dakikaAyrıca, her iki yönde de.
    5. "25" uL / ​​dakikalık bir akış oranı ve "160" s bir temas süresi kullanılarak dikey yönde mAb 2 mAb 1 enjekte "Ligand" tıklayın.
    6. , "Analit" tıklayın insan PCSK9 beş konsantrasyonları enjekte ardından ilişki süresi "600" s için "40" uL / ​​dakika ve aynı zamanda 6 yatay kanal üzerinden, boş bir tampon (100 nM, 6.25 için seri seyreltiler, 2-kat) ayrışma zamanı "2700" s tarafından.
    7. , "Yeniden oluşturun" tıklayın iki "18" hem yatay hem de dikey yönde "100" uL / ​​dakika glisin (pH 1.5) darbeleri -s enjekte edilir.
    8. Kalan mAb için, her bağlama döngüsünün ardından yukarıdaki adımları tekrarlayın.
      Not: 100 nM ek olarak - 6.25 nM insan PCSK9 konsantrasyonu serisi, 25 nM - 1.56 nM ve 5 nM - 0.313 nM konsantrasyon serisi kullanılmıştır.
    9. Reaktif durumuna göre iki 96-yuvalı plakalar içinde örnekleri ve reaktifler hazırlanmasıadım 3.2.2 tanımlanan, o zaman, "Çalıştır" sekmesini protokol / deneme seçtikten ve "Başlat" a tıklayın.
  3. ProteOn Yöneticisini Kullanarak Veri Analizi
    1. "Panel Türü" tıklayın ve "analit" i seçin. Sonra "Protokol Adım" tıklayın ve listedeki tüm bağlanma eğrileri seçin.
    2. "| Kanal Referans | Interspot Süreci" "Otomatik işlem" tıklatın ve tıklayın. Ardından "| Çift Referans | Sıra | A6 Süreci" tıklayın.
    3. Kinetik analiz için her üç yüzeylerinde her mAb için bireysel veri setlerini kaydetmek için "Veri Kümesi Oluşturma" tıklayın.
    4. "Analiz Dataset" Click her mAb'nin veri kümesini vurgulamak ve "Analiz | Kinetiğe". "Langmuir" modelini ve "Eşzamanlı ka / kd" seçin ve "İleri" ye tıklayın.
    5. , Dernek ve ayrışma uyum aralığı hem vurgulayın "Yerel" R max seçin ve elde etmek için uyum gerçekleştirmek için "İleri" yimonte kinetik parametreleri.
    6. Yukarıdaki adımı tekrar fakat ligand yüzey aktivitesini hesaplamak için, deneysel Rmax değerlerini elde etmek için montaj için "Gruplanmış" R max seçin.

Sekizli RED384 4. Kinetik ölçümler

  1. Reaktif ve Örnek Plaka Hazırlama
    1. 1x KB 50 mL PBS içinde 10x stok çözelti seyreltilerek (PBS, pH [7.4],% 0.02 Tween-20,% 0.1 albümin ve% 0.05 sodyum azid ihtiva eden Kinetik Tamponu) hazırlayın.
    2. oyuk başına 200 uL bir 96-kuyucuklu plaka içerisine 1x KB dağıtın. En az 10 dakika boyunca bu tek tek kuyularda hidrat 48, anti-insan yakalama (AHK) biyosensör ipuçları.
    3. 1.56 nM ila 100 nM ila 7 titre konsantrasyonlarda 20 ug / ml, 10 ug / ml ve 5 ug 1x KB / ml, ve aynı zamanda insan PCSK9 her mAb örnek hazırlayın seri seyreltileri, 2-kat.
    4. 384 gözlü eğik dipli mikroplakaya mAb örnekleri yük (referred Reaktif plaka) ve oyuk başına 90 uL örnek plaka olarak adlandırılan başka bir 384-çukurlu mikrolevhanm (), insan PCSK9 çözeltiler gibi.
    5. Yük 1x KB serileri ve glisin (pH 1.5) Örnek plaka içindeki gözlerdeki solüsyonlar.
      Not: Bu 1x KB kuyu çip ön koşullandırma, taban çizgisi stabilizasyonu ve analit ayrışma için kullanılır. glisin çözeltisi rejenerasyonu için kullanılır.
  2. Deneysel Yöntem Kurulumu
    1. veri toplama yazılımında, "| Yeni Deneme Sihirbazı | Yeni Kinetik Deney | Temel Kinetik Deneme" tıklayın.
    2. "Levha Tanımı", numune tiplerini ve konumlarını belirlemek için aşağıdaki adımları.
      1. "16" kanalları ve "384-iyi" biçimini seçin.
      2. her seferinde 16 kuyu vurgulamak için oyuk sol tıklayarak Shift tuşu basılı tutarak plaka ekranda numune ve reaktif konumları tanımlar.
      3. sağ tıklayınmAb örnekleri ve "Yükleme" seçeneğini içeren deney levhaları mAb'ler AHC sensör üzerine yüklenmiş olan (veya yakalanan) olan en aşamasını belirtmek için. yandaki tabloda yer mAb isimleri ve konsantrasyonlarını girin.
      4. Sağ insan PCSK9 içeren kuyu tıklayıp mAb yakalanan sensörler daldırılır ve bağlayıcı etkileşimleri ölçüldüğü adım belirtmek için "Sample" seçeneğini seçin. yandaki tablosunda karşılık gelen molar konsantrasyonları girin.
      5. "Tampon" ya da "Nötralizasyon" olarak 1x KB içeren kuyu ve "Rejenerasyon" olarak glisin içeren kuyu tanımlar.
    3. "Test Tanımı" olarak, deney düzeneği tanımlamak için aşağıdaki adımları izleyin:
      1. Click 3", "30" s süreleri ile listeye "Baseline", "Rejenerasyon", "Dengenin", "Yükleniyor", "Derneği" ve "Ayrılma" adımlar "Ekle" seçeneğini0" , "18" un "200" in, "500" ler ve "1800" lü s sırasıyla. Çalkalama hızı "1000" e rpm.
      2. "Test Adımları Listesi" adımlarını eklemek için, adım ilk tıklamasıysa numunede veya reaktif plakası birinde bulunan kuyular tıklayın. Adımlar şunlardır:
        1. Dengeleme-Rejenerasyon: bir ön koşuldur glisin (pH 1.5) içinde "15" -s eğimler üç döngü AHC sensörleri, "15" ile dönüşümlü olarak 1 x KB batırma -s.
        2. Yükleme: "200" s için AHC sensörler üzerine mAb örnekleri yakalamak.
        3. Taban çizgisi: ilişki aşamasından önce, "60" s için BLI bir sinyalin oluşturulması.
        4. Derneği: "500" -s ilişki süreyle insan PCSK9 değişken konsantrasyonlarda içeren kuyu içine sensörleri daldırma.
        5. Ayrışma: Bir "1800" -s ayrışma dönemi için 1x KB yeni kuyulara PCSK9 bağlı sensörler daldırın.
        6. Rejenerasyon: mAb PCSK9 bou daldırmand, iki "18" ile glisin (pH 1.5) oyuklarına sensörleri her bağlanma döngüsü arasındaki darbeleri -s.
    4. "Gözden Denemelerde" olarak, adımlarda slayt ve önceki sekmelerin geri giderek gerekli değişiklikleri yapın.
    5. "Deney" olarak, "60" s gecikme süresini girip beklerken örnek plaka sallayın. C ve basın ° plaka sıcaklığına "25" Set "GO".
  3. ForteBio Veri Analizi Yazılım Kullanma Veri Analizi
    1. Click "Veri Seçimi | Loaded Veriler | Kinetik | PCSK9 antikorlar PCSK9 7.23.14 bağlanma"
    2. "İşleme", işlem verileri aşağıdaki gibidir:
      1. 1. Adımda: H1-H6 sensörleri vurgulamak için "Sensör Seçimi" tıklayın sağ üzerlerine tıklayın ve "Değiştir Sensör Tipi | Referans Sensörü."
      2. 2. Adımda, "Çıkarma" kontrol ve "Ortalama Referans Sensörleri" seçeneğini; 6 boş tampon sensörlerin ortalama her bir aktif örnek sensörü çıkarmak için.
      3. Aşama 3'te, "Align Y ekseni" tıklayarak birlikte önce taban çizgisi aşamasından tüm bağlanma eğrileri hizalamak için "temel" seçin.
      4. 5. Adımda, "Savitsky-Golay Filtreleme" sinyal-gürültü oranını artırarak bağlanma eğrileri pürüzsüz ve tıkla kontrol "Süreç Verileri!".
      5. Adım 6'da, işlenmiş bağlanma eğrileri görüntülemek için "İşlenmiş Sonuçlar" tıklayın.
      6. Adım 7, her işlem aşamasından sonra bağlama eğrileri gösteren sağdaki dört panel gözden geçirmek ve tıklayın "Veri İşlenmiş Kaydet".
    3. "Analiz" olarak, "birleşme ve ayrılma" seçeneğini işaretleyin ve "1: 1" modelini.
    4. "(Tam) Küresel" "renk" ile uyum ve grup onları için bağlayıcı eğrileri vurgulayın. Grubu, aynı m kaplanmış sensörleri montaj yapmak için "bağlı R max" kullanınAb konsantrasyonu çok mAb konsantrasyonları ile kaplanmış sensörler global uyum gerçekleştirmek için deneysel ligandı yüzey Etkinliğin hesaplanması için R maksimum değerleri, ve "R max sensör tarafından Bağlantı kaldırıldıktan" elde edildi.
    5. monte kinetik parametrelerini elde etmek "Fit eğriler" tıklayın. Her uydurma analizin sonunda sonuçlarını kaydedin.

IBIS MX96 5. Kinetik Ölçümler

  1. Enstrüman ve Reaktif Hazırlama
    1. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir COOH-G çip dengelenmesi.
    2. Sistemin çalışma tamponu (PBS [pH 7.4],% 0.01 Tween-20) ve hareketsiz hale getirme tamponu (10 mM sodyum asetat [pH 5.0],% 0.01 Tween-20) 'in bir 1-L şişesi hazırlayın.
    3. Sistem çalışırken tamponu ve sodyum asetat (pH 5.0) hareketsiz hale getirme tamponu hem de 2-kat seri seyreltme ile 0.16 ug / mL ila 20 ug / mL, her bir mAb hazırlayın.
    4. İki sep içine mAb örnekleri dağıtınarate 96 oyuklu her mAb'nin, oyuk başına 200 uL titrasyon konsantrasyonlarda 8 dikey kuyu işgal ettiği plakalar.
    5. Oda sıcaklığında 400 mM EDC ve 100 mM sülfo-NHS çözülme alikotları.
    6. sodyum asetat, 50 ug / mL (pH 5.0) bir şişe içinde hareketsiz hale getirme tamponu ve pipetle bu protein A / G, 300 uL hazırlayın.
    7. çalışan tampon sisteminde 2-kat seri seyreltme ile 0.39 nM ila 100 nM insan PCSK9 200 uL hazırlayın. Ayrı şişeleri içine Pipet.
  2. Amin-bağlı antikor dizileri ile Çok döngüsü kinetiği
    1. EDC / sülfo-NHS (400 mM / 100 mM) alikotları karıştırın ve oyuk başına 200 uL yeni bir 96 oyuklu plakanın üst 48 kuyu içine karışımı dağıtmak.
    2. 2 konumunda mAb kaynağı plakasını (sodyum asetat [pH 5.0]) ve yazıcının içindeki 1 konumunda EDC / sülfo-NHS tepkin madde plaka koyun.
    3. CFM içine sensör çipi takın. "CFM 2.0" Softwar açe, sonra "Ayarları Yükle | 96 Amine Çift" tıklayın. aşağıdaki gibi, 10 x 8 antikor dizisi oluşturulur:
      1. 48, mikrokanallar kullanılarak sensöre reaktif plakasının üst yarısında, EDC / sülfo-NHS teslim ve "5" dakika boyunca sensor yüzeyi üzerine çevrim bunları.
      2. "10" dakika boyunca aktive edilmiş yüzeyler üzerinde sensör ve çevrim bunları kaynak plakasının üst yarısında mAb örnekleri sunun.
      3. "5" dakika için antikor yüzeyi üzerinde bir 50 mL konik tüp immobilizasyon tampon verin.
      4. Kaynak plakasının alt yarısı içinde kalan mAb örnekleri için yukarıdaki prosedürleri tekrarlanır.
    4. alet içine basılı sensör çipi bağlantı istasyonu. ve "2014-08-15" seçeneğini "Mevcut Ölçüm | Bağlan | | Açık Ölçümü Dosya" kontrol yazılımında, tıklayın.
    5. "Tam sistem script" altında - "Genel" olarak, "Sistem Prime G" seçin. Daha sonra "G seç - QuEnch" 150 ul, 1 M etanolamin enjekte edilerek mAb yüzeyleri devre dışı bırakmak için.
    6. mAb diziler görselleştirmek ve gerekirse kontrastı ayarlamak için "Kamera" tıklayın. mAb noktalar çevrelemek için kırmızı kare kutuları yerleştirin ve referans aktif mAb noktalar arasında bulunan interspots yeşil kare kutuları taşımak.
    7. "IBIS Scripts" altında - "AP Standart Run Bir" "Analiz Döngüsü" olarak seçin. taban 1.0 dk, bağlantı için 10.0 dakika ve 8 uL / ​​s hızda ayrılması için 90 adımları ayarlayın.
    8. "Cycles" içinde, beş tampon enjeksiyonları takiben her seferinde, insan PCSK9 bir konsantrasyonu enjekte edilir. Her bağlanma döngüsü arasındaki glisin pH 2.0 ile mAb yüzeyleri yeniden.
  3. Fc çekilen antikor dizileri ile tek döngüsü kinetiği
    1. CFM yeni bir sensör çipi takın. Tekrar, protein A / G mAb örnekleri değiştirerek yukarıda 5.2.5 5.2.3 adımları tekrarlayın.
    2. KaldırSensör MX96 gelen çip ve geri CFM yazıcıya yerleştirin.
    3. 48 mikrokanallar kullanılarak protein A / G sensör yüzeyine plakanın üst yarısında mAb'leri teslim ve 10 dakika için iki yönlü akışını kullanarak yüzey üzerinde çevrim bunları.
    4. plakanın alt yarısı içinde kalan mAb örnekleri için, yukarıda yineleyin.
    5. MX96 alet içine basılı sensör çipi bağlantı istasyonu. "| Bağlan | Açık Ölçüm | Mevcut Ölçüm | İleri Dosya" ve "kinetic7.30.14 bağlayıcı protein A + G" seçeneğini Veri Toplama Yazılımı yılında tıklayın.
    6. mAb diziler görselleştirmek ve gerekirse kontrastı ayarlamak için "kamera" tıklayın. mAb noktalar çevrelemek için kırmızı kare kutuları yerleştirin ve referans aktif mAb noktalar arasında bulunan interspots yeşil kare kutuları taşımak.
    7. "IBIS Scripts" altında - "AP Standart Run Bir" "Analiz Döngüsü" olarak seçin. "Taban-hattı için 10.0 "1.0 dak" Setmin" ilişki için, ve '8 uL / ​​sn 'hızda 10' de ayrılması için adımlar'.
    8. "Cycles" içinde, beş tampon enjeksiyonları takiben her seferinde, insan PCSK9 bir konsantrasyonu enjekte edilir. Resim yenilenmesi her analit enjeksiyon arasında gerçekleştirilir.
  4. Sprint ve Scrubber kullanarak Veri Analizi
    1. , | "Açık Üçgen Dosya Dosya" listedeki tüm numune enjeksiyonları seçin ve Analizi "tıklamadan önce" "Kaydet SprintX dosyasını," "Kalibrasyon" ve "RLL kararlılığını kontrol" SprintX tasarim programina olarak, tıklayın.
      NOT: RLL değerleri sensör yüzeyine immobilize / yakalanan mAb seviyelerine bakın.
    2. "Referans" Kontrol ve bitişik referans noktaları kullanmak için "Yerel" i seçin. Ayrıca kontrol ilk enjeksiyondan üzerinde "hizalama" ve ardından "Başlat Otomasyon."
    3. Seri sekmesinde, bunları ayarlamak "araç çubuğundaki Cetvelleri göster" seçeneğiniİlk örnek, enjeksiyondan hemen önce taban küçük bir bölge seçin ve seçmek için "sıfır".
    4. "Dosyasını IBMX ver" ve ardından seçerek Scrubber analiz için bir .IBMX dosyası oluşturun "Başlat Otomasyon."
    5. Scrubber başlatın ve .IBMX dosyasını yüklemek. "Seyreltme faktörü" olarak "Stok kons" olarak "100N" ve "2" girin.
    6. Mahsul veriler, enjeksiyon başlamadan önce tüm taban çizgisi kaldırmak ve esas başlangıcında bağlanma eğrileri hizalayın.
      NOT: Tek çevrim kinetik deney için, eğriler bağdaşmıyor.
    7. "Kinetik" sekmesine gidin enjeksiyon bitiş saati için cetvel ayarlamak, "k d" ve formda, ardından "düzeltme k d." Seç "Bir k d k" ve tekrar takın.
    8. Kd sütun Float ve daha fazla uyum sınırlandırmak için daha uygun.
      Not: tek döngü bağlama eğrileri montajı için"Seçmesi" tıklayıp işareti kaldırın "Çıkart", sonra "Ayrı" seçin ve geri teorik temel kökeni dernek profillerini sığdırmak için "Enj Başlat" sütununu yüzer.
    9. Sonuçları sekmesinde takılan kinetik parametrelerini gözden geçirin.

Representative Results

Şekil 1, iki hareketsizleştirme yöntemleri ile CFM ve benekli mAb düzeyde antikor dizisi görüntü gösterir, ve Şekil 2, bu mAb dizileri çoklu döngüsünden MX96 kinetik oluşturulan karşılık gelen bağlama sensörgramları tek döngülü kinetik ölçümleri göstermektedir . 6 - bağlanması ve dört biyosensör platformlarda üretilen çoklu antikor kaplı yüzeylerden kinetik donatılmış eğrileri gerçek zamanlı, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Şekil 7, bu bağlanma eğrilerinin, küresel analizinden elde edilen nihai kinetik oranları ve denge bağlanma sabitleri karşılaştırılmasını göstermektedir. Birey (k a), ayrılma (kd) ve denge (KD), bağlanma sabitleri Tablo 1 'de sunulmaktadır. aynı alet içinde üretilen veri setleri değişkenliğini göstermek için, k a, k, d, K, D grafiklerini gösterir ve Şekil 9, ayrıca biyo-algılayıcı platformlarında mAb yüzeyleri hesaplanan bağlanma aktivitelerini karşılaştırır.

Şekil 1
Amin-bağlı (A) ve IBIS MX96 CFM baskı (B) Antikor yüzeyleri Fc ele Şekil 1. Multipleks Ligand dizileri. Baskılı dizilerin görüntüleri kırmızı kareler ile kapalı gri alanlar, antikorun varlığını gösterir sol panel, gösterilmiştir. Aktif antikor noktalar arasında yer alan koyu interspots referans çıkarma için kullanılır. Her bir sütun altında ve resmin solunda tespit titrasyon konsantrasyonlarda basılmış bir antikor içerir. di hesaplamak suretiyle ölçülür baskılı antikor miktarlarıAktif ve referans konumları arasında yığın vardiyada fference sağ paneller gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Çok döngüsü (A) 'dan, sensor Bağlama Gerçek zamanlı ve tek döngülü (B) IBIS MX96 Kinetik Deneylerin Şekil 2. karşılaştırılması. 10 x 8 antikoru diziler arasında artan konsantrasyonlarda insan PCSK9 sıralı enjeksiyon her biri karşılık gelen sensorgram kesimi üzerinde belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
(üst panel), orta (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyleri üzerinde değerlendirilir. 1 etkileşimi modeli: kaplanmış düz siyah çizgiler bir 1 farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
ProteOn XPR36 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 4. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Yakalanan Antikorların sensor bağlanması. Etkileşimleri yüksek (üst panel), medi üzerinden değerlendirilirum- (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyler. 1 etkileşimi modeli: kaplanmış düz siyah çizgiler bir 1 farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Sekizli RED384 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 5. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Yakalanan Antikorların sensor bağlanması. Etkileşimleri Yüksek- (üst panel), orta (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyleri üzerinde değerlendirilir. kaplanmış kırmızı çizgileri 1'e farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum temsil etmektedir: 1 etkileşimi modeli. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
IBIS MX96 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 6. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Amin bağlanmış (A) ve Fc yakalanan (B) Antikorların sensor bağlanması. Bağlama profilleri Şekil 1 'de bir dizi plaka harita takip 10 x 8 panel olarak düzenlenir. Siyah çizgiler farklı insan PCSK9 konsantrasyonlarda Kaydedilen bağlanma yanıt sinyallerini temsil eden ve kaplanmış kırmızı çizgiler donatılmış eğrilerini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Güre gösterir 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Şekil Esas 7. karşılaştırması dört Biyosensör Platformlar tarafından oluşturulan bağlama sabitleri A (a), Ayrışma Kd (B) k ve denge KD (C). 6 - kinetik parametreler Şekil 3 bağlanma eğrileri genel analizinden türetilmiştir. aşağıdaki gibi enstrümanlar temsil edilir: Biacore T100 (mavi), ProteOn XPR36 (yeşil), Sekizli RED384 (kırmızı), amin çiftli (mor) IBIS MX96 ve IBIS MX96, (turuncu) Fc yakalanan. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 8,
Biac Çoklu Antikor Yüzey Sıklıklarında Üzeri Kinetik Hız Sabitlerinin Kıvamı Şekil 8. Karşılaştırılması cevher T100 (A) ProteOn XPR36 (B) Sekizli RED384 (C) IBIS MX96, amin bağlanmış olan (D), ve yakalanan Fc IBIS MX96, (E). Kinetik parametreler (üst alt paneller) k d (orta alt paneller) k ve KD (alt alt paneller) tek tek antikor yüzeyi yoğunluğunda grup analizi elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 9,
Şekil dört Biyo-algılayıcı Platformlar Antikor yüzeyleri ve standart sapmalar (hata çubukları) 9. bağlama aktivitesi. Değerleri araştırma makalelerinde 17'de tarif denklemler kullanılarak hesaplanmıştır.large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

k bir k d K D
(M-1 s-1) (s-1) (nM)
mAb 1 (7.8) 11.7 10 5 x (4.18) 4.89 10 -5 x 0.052 (0.05)
mAb 2 (0.28) 1.53 10 5 x (1.54) 1.30 10 -5 x 0.092 (0.12)
mAb 3 (8.3) 11.4 10 5 x (11.0) 27.6 10 -5 x 0.333 (0.20)
mAb 4 (1.6) 3.61 10 5 x (12.3) 20.1 10 -5 x 0.659 (0.54)
mAb 5 (0.21) 0.59 10 5 x (2.50) 3.46 10 -5 x 0.663 (0.46)
mAb 6 (0.78), 1.19 10 5 x (3.83) 7.21 10 -5 x 0.894 (0.64)
mAb 7 (0.53) 1.29 10 5 x (5.63) 16.4 10 -5 x 1.57 (1.02)
mAb 8 (2.23), 4.02 10 5 x (10.7) 22.8 10 -5 x 0.768 (0.68)
mAb 9 (2.13) 4.20 10 5 x (4.3) 6.67 10 -5 x 0.197 (0.16)
mAb 10 (0.49) 1.20 x 10 5 (7.64) 12.5 10 -5 x 1.27 (0.80)

Tablo 1: 1 Etkileşim Modeli: Kinetik Oranları ve Denge 1 Dört Biyosensör Araçlardan Cilt Eğrilerin Küresel uydurularak elde edilen 10 mAb'nin Bağlanma Sabitlerinin.

Discussion

Bizim kafa kafaya karşılaştırma çalışması her biyosensör platformu kendi güçlü ve zayıf yönleri olduğunu gösteriyor. Antikorların bağlanma profilleri (Şekiller 3-6), karşılaştırma yapılarak benzer olsa da, ve elde edilen kinetik hız sabitleri sıra düzeni aletleri üzerinde oldukça tutarlıdır (Şekil 7), elde edilen sonuçlar ile aletleri SPR dayalı olduğunu göstermektedir sürekli akış flüidik) yavaş ayrılma hızlarına sahip, yüksek afiniteli etkileşimler çözülmesi daha iyidirler. Ayrışma safhasında yukarı sürüklenme veri setleri gözlemlenmektedir (örneğin, mAb 2 mAb 5 ve mAb 9; Şekil 5) BLI flüidik içermeyen cihaz tarafından oluşturulan. Bu bulgu, sistemin bir birincil kısıtlamasıdır mikroplakanın, zaman içinde örnek buharlaştırma için büyük ölçüde atfedilebilir. bu içsel sınırlılığı, ile, deneme süresi de en az 12 saat ile sınırlandırılmıştır; Bu yüzden deneyler sh programlandıÖrter kez diğer platformlara kişilerce (10 dakika birlikte ve 45 dakika ayrışma) ile karşılaştırıldığında (500 s birleşme ve 30 dakika ayrışma). BLI tabanlı alet tarafindan üretilen hızı sabitleri, off-hızları bazı dalgalanmalar sonucu (Şekil 8C gibi daha az doğrusallığı gösteren Ancak, deney süresini kısaltarak, veri kalitesi / tutarlılık buharlaştırma etkilerini hafifletmek için görünmedi ). Örnek buharlaştırma ek olarak, kullanılan tutucu reaktifler farklılıklar da elde edilen sonuçlar farklılıklar katkıda bulunmuş olabilir. Protein A / G, tüm üç flüidik tabanlı SPR platformlarında kullanılan iken, AHC sensörleri olmayan flüidik BLI platformu kullanılmıştır. Protein A / G AHC, bir antikor-bazlı biyosensör yüzey protein A / G yüzeylerinden mAb antijen kompleksinin dışı oranları yapay olarak daha hızlı görünebilir yaptığından daha mAb için daha zayıf bir afiniteye sahip muhtemel olduğundan AHC yüzeyden elde edilmiştir. Bu olasılık, b desteklenirY BLI platformu tarafından oluşturulan kapalı-hızı değerleri için diğer araçlar (Şekil 7, kırmızı çizgi) elde edilenlere nazaran tutarlı şekilde daha düşük olduğunu gösteren deneysel veriler. Bununla birlikte, BLI platformu diğer platformlara üzerinde farklı avantajlara sahiptir. Örneğin, bunun nedeni hemen kullanım için çeşitli ön kaplanmış sensörler, sensör seçimi ve deney konfigürasyonu ile ilgili olarak yüksek derecede esnektir. Deneylerde, AHC sensör kullanımı hazırlama süresini azaltmak, ligand immobilizasyon proseslerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmıştır. Bundan başka, BLI platformu karmaşık boru ve değer anahtarı yapılandırmaları özelliği diğer flüidik SPR platformları ile kıyaslandığında çok daha az bakım gerektirir. Bu özellik tıkanma ve kirlilik sorunlarına neden olabilir ham örneklem içeren deneyler için bir avantajdır.

Terapötik adaylar artar, verimli, hızlı ve doğru tanımlama için talep, bi ihtiyacı olarakosensor verim de artıyor. Dört biyosensör platformlar arasında, 96-ligand dizi baskı yapabilen bir biyosensör ile ilgili verim sonuçta artış bir crisscrossing 36-ligandı biçimi ve 16 kanallı eş zamanlı okuma ile BLI bazlı biyosensör bağlanmış biyosensör ile en yüksek olup sırasıyla 96, 36 ve 16 için tek bir bağlanma döngü ölçülen etkileşim sayısı. Bu verim özellikleri olan tek bir seri akım ile bağlı dört akış hücrelere sahip ile sınırlıdır geleneksel SPR platform, önemli ölçüde daha yüksektir. Bizim deneyler uzun ayrılma süreleri ile çok sayıda yüzey yoğunlukları değerlendirilen 10 mAb'nin nispeten küçük bir numune seti dahil olduğundan, enstrümantal çıktılar deneyler verimliliğinin belirlenmesinde ılımlı bir rol oynamıştır. Üç yüksek verimlilik platformların deneysel zamanlarda önemli bir fark vardı ve her durumda deneyler bir günde tamamlanmıştır. Öte yandan, geleneksel seri akış SPR deneyleri kurulumdan sonra veri toplama yürüyüş uzağa otomasyon rağmen tamamlamak için 3 gün gerektiriyordu. Off-rate sıralaması / kinetik tarama ya da özüdür kümeleştirme amaçlı, (yüzlerce hatta binlerce yani) örneklerin çok sayıda içerir diğer çalışmalarda, üretilen iş kritik bir faktör haline gelir.

IBIS MX96 içinde üretilen iş diğer biyosensörlerinin o birkaç kat daha yüksektir ve bu nedenle bu amaçlar için en uygun seçimdir rağmen, birkaç eksiklikleri vardır. Özellikle, CFM ile dizi baskı büyük yüzey tutarsızlıklar (Şekil 1) ve düşürülmüş veri tekrarlanabilirliği (Şekil 8D ve 8E) göstermektedir. doğru kinetik ölçümler için, biyoalgılayıcı yüzey üzerinde ligand miktarı bağlanma tepkileri gibi ikincil faktörlere bozulmazlar sağlamak için kontrol edilmesi gereken kritik bir parametre olduğukütle transferi ya da sterik engelleme. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 için en uygun RL seviyeleri araştırma makalesinde 17'de tarif edildiği gibi resim Rmax değerlerinin standart hesaplanması ile belirlenmiştir. Öte yandan, Sekizli RED384 ve IBIS MX96 platformları için mAb yakalama seviyesi ampirik sabit zamanlarda 2-kat seri olarak seyreltilmiş bir antikor serileri kullanılarak elde edildi. Bilgi veya yakalama aşamasının kontrol eksikliği, yüksek yoğunluklu yüzey ve kinetik hız sabitleri doğruluğunu tehlikeye olabilir yüksek bağlanma cevap sinyalleri (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. rejenerasyon içeren çok sayıda bağlanma döngüsü ölçümleri gerçekleştirirken Ayrıca, SPR detektörden gelen yazıcı ayrılması da zordur. çoklu döngüsü kinetiği kurulum gerçekleştirmek için tek yol immobilize edilmiş Protein A / G ile mAb Fc ile ele karşı mAb'ler direkt amin birleştirme yoluyla olduDiğer üç biyosensör platformlarda yüzeyi. Bunun bir sonucu olarak, ek bir rejenerasyon keşif deney optimum dönüşüm koşulları belirlemek için gerekli oldu. Bu kurulum sonucunun daha uzun bir deneme süresinden ek olarak Fc yakalama yöntemi (Şekil 9) ile karşılaştırıldığında bir ~% 90, daha düşük gözlenen yüzey aktivitesi bağlantılıydı. Fc yakalama yöntemi yürütmek için, alternatif bir tek döngüsü kinetik yaklaşım benimsenmiştir. Bu yaklaşım, her bir enjeksiyon (Şekil 2) arasında, yenileme olmaksızın artan konsantrasyonlarda analitin sıralı enjeksiyon içerir. Bu son derece uygun, fakat daha az yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, sadece deney süresi kısaltılabilir ve reaktif tüketimi düşük değil, aynı zamanda diğer biyosensörler (Şekil 7) elde edilenlere benzer yüksek kinetik hız sabitleri üretti. Bu nedenle, bu tek döngüsü kinetiği yaklaşımı uygulanarak aletin doğal yapılandırma sınırlama üstesinden gelir ve sunuluryüksek verimli bir şekilde yüksek çözünürlüklü kinetik hız sabitlerinin elde etmek için bir fırsat.

üretilen iş Biacore T100 önemli bir sınırlama olmasına rağmen, sonuçlarımız topluca en yüksek kalite ile en tutarlı veri oluşturulan olduğunu göstermektedir. Bu ~ 10-kat daha yüksek bir kapasiteye sahip olmasına ProteOn XPR36 izledi. araçların tespit limitleri ulaşıldığında teknik olarak zor olabilir yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini karakterize Yüksek kalitede verileri oluşturmak için kabiliyetleri bir avantajdır. Sekizli RED384 arasında enstrümantasyon sistematik sınırlamalar ayrılma oran sabitleri doğru ölçüm engel ise (yani, duyarlılık altında kalan yavaş off-hızları için yeterli sinyal çürüme gidermek için), her iki Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hassas ve güvenilir sağlayabilir farklılaşması için tespiti.

Disclosures

Bu video yazı için Yayın ücretleri Boehringer Ingelheim İlaç tarafından ödendi.

Acknowledgments

Yazarlar IBIS MX96 üzerinde teknik yardım için Noah Ditto ve Adam Miles teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T100 System GE Healthcare 28975001 The T100 system has been upgraded to T200
CM5 Sensor Chip  GE Healthcare BR100012
BIAevaluation  GE Healthcare Version 4.1
Biacore T100 Control Software GE Healthcare The T100 control software has been upgraded to T200
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 
HBS-EP+ Buffer 10× GE Healthcare BR100669 Concentrated stock solution 
Plastic Vials, o.d. 7 mm GE Healthcare BR100212 
Rubber Caps, type 3 GE Healthcare BR100502
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm GE Healthcare BR100214 
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System Bio-Rad 1760100
ProteOn Manager Software  Bio-Rad 1760200 Version 3.1.0.6
GLM Sensor Chip Bio-Rad 1765012
Amine Coupling Kit Bio-Rad 1762410 It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl 
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers Bio-Rad 1762210 It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution 
2 L PBS/Tween/EDTA buffer Bio-Rad 1762730 It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA 
Octet RED384 System FortéBio
Data Analysis Software FortéBio Version 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors FortéBio 18-5060 One tray of 96 biosensors 
384-Well Tilted-Bottom Plate  FortéBio 18-5080
Biosensor Dispenser FortéBio 18-5016
Kinetics Buffer 10x FortéBio 18-1092 10x concentration. Contains ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi System Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer Wasatch Microfluidics Version 2.0
SensEye COOH-G chip Wasatch Microfluidics 1-09-04-004
Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.19.3.17
SPRint Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.15.2.1
Scrubber 2 BioLogic Software Version 2
Pierce Recombinant Protein A/G ThermoFisher Scientific 21186

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Tags

Biochemistry Sayı 122 optik biyosensörler antikor-antijen etkileşimleri bağlanma kinetiği ilaç keşfi Plazmon Rezonansı BioLayer İnterferometre Yüzey
Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D., Singh, A., Wu, H.,… More

Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659, doi:10.3791/55659 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter