Summary
We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.
Abstract
Cellen constant veranderen hun membraan architectuur en eiwitverdeling, maar het is zeer moeilijk om deze te visualiseren op temporele en ruimtelijke resolutie in de orde van ms en nm. We hebben een time-resolved elektronenmicroscopie techniek, "flash-and-vries," dat cellulaire gebeurtenissen induceert met optogenetics en visualiseert de resulterende membraan dynamiek door het bevriezen van de cellen op bepaalde tijdstippen na stimulatie ontwikkeld. Deze techniek tonen, uitgedrukt we channelrhodopsin, een lichtgevoelige kationenkanaal in muis hippocampale neuronen. Een lichtflits stimuleert neuronale activiteit en induceert neurotransmitter afgifte van synaptische uiteinden door de fusie van synaptische blaasjes. Optogenetic de stimulatie van neuronen gekoppeld met hogedruk vriezen morfologische veranderingen in synaptische transmissie te volgen. Met behulp van een commercieel instrument, gevangen we de fusie van synaptische blaasjes en het herstel van de synaptic vesicle membraan. De volgorde van gebeurtenissen te visualiseren, werden grote datasets gegenereerd en blind geanalyseerd, aangezien morfologische veranderingen in verschillende cellen in de tijd gevolgd. Niettemin, flash-en-vries maakt de visualisatie van het membraan dynamiek elektronenmicrofoto met ms tijdsresolutie.
Introduction
Visualiseren membraan eiwit dynamiek binnen een cel een belangrijke stap naar het begrijpen van de celbiologie van bepaalde processen. Dynamische handel gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met behulp van licht of fluorescentie microscopie. Echter, de subcellulaire context mate ontbreekt in zulke beelden omdat subcellulaire structuren niet volledig door kleurstoffen of fluorescerende probes "geschilderd" en ruimtelijk gescheiden en spectraal 1, 2. Anderzijds, terwijl elektronenmicroscopie subcellulaire architectuur kunnen omlijnen in verfijnde details, kan het niet vastleggen cellulaire dynamiek, omdat monsters voorafgaand aan beeldvorming moet worden vastgesteld. Zo is het meestal niet voldoende om volledig te begrijpen cellulaire dynamiek met behulp van slechts één beeldvormende modaliteit.
Om de beperkingen van het licht en elektronenmicroscopie te overwinnen, hebben correlatieve microscopie technieken ontwikkeld. Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie(CLEM) visualiseert intracellulaire dynamica behulp van lichtmicroscopie en onderliggende subcellulaire structuren elektronenmicroscopie. In CLEM cellen betrokken bij verschillende werkwijzen, zoals cytokinese en endocytose 3, 4, 5, 6, live beeld voorziene en vervolgens verwerkt voor elektronenmicroscopie. Hoewel CLEM vangt bepaalde aspecten van intracellulaire dynamiek, zijn er vier factoren die de bruikbaarheid van deze benadering te beperken. Eerst wordt de temporele resolutie beperkt door de snelheid waarmee de cellen kunnen worden geïmmobiliseerd, wat gewoonlijk s - min door de langzame diffusie en reactie van fixeermiddelen 7. Ten tweede wordt de subcellulaire architectuur waargenomen post facto 8; Zo kan de dynamische morfologische veranderingen niet worden gevangen met behulp van deze aanpak. Ten derde, de fluorescentie en elektron micrografische afbeeldingen kan niet nauwkeurig worden uitgelijnd vanwege weefsel shrinkage veroorzaakt door uitdroging tijdens de monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie 9, 10. Ten vierde, evenementen zoals cytokinese en endocytose niet op hetzelfde moment te nemen elke cel 5, 11, en dus moet een bepaalde cel die is betrokken bij afgeleid worden uit een grote populatie van cellen. Dit proces is vaak tijdrovend. Aldus werd een nieuwe methode nodig om bepaalde gebeurtenissen in elke cel induceert en de resulterende cellulaire dynamiek door de snelle immobilisatie van cellen op gedefinieerde tijdstippen vangen.
Onlangs heeft een aantal instrumenten ontwikkeld om bepaalde cellulaire dynamiek met behulp van licht (optogenetics) induceren. Channelrhodopsin een lichtgevoelige, niet-selectief kationkanaal geïsoleerd uit Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Wanneer channelrhodopsin wordt uitgedrukt in neuronal membranen, een korte lichtflits induceert een instroom van natriumionen tot neuronen en veroorzaakt een actiepotentiaal 14, 15. Het actiepotentiaal propageert vervolgens in de synaptische uiteinden, waarbij synaptische blaasjes fuseren binnen milliseconden 16, 17, 18 dus channelrhodopsin induceert neuronale activiteit. Aan membraan dynamiek synaptische uiteinden volgen, moeten neuronen worden geïmmobiliseerd op bepaalde tijdstippen na stimulatie met ms precisie.
Om membraan dynamiek maken nadat inducerende neuronale activiteit, gekoppeld wij lichtstimulatiebron met hogedruk vriezen 17, 18, 19. Hoge druk invriezen maakt het vrijwel direct immobilisatie van cellen met verminderde ijskristalvorming 20. Ijskristallen can scheuren membranen en verstoren de subcellulaire architectuur 21. Door variëren van de tijdsintervallen tussen stimulatie en invriezen, membraantransport in synaptische uiteinden werd gevangen na de inductie van een actiepotentiaal.
Hier tonen we experimentele procedures met behulp van een handel hogedruk diepvriezer die koppelt een ms temporele controle lichtstimulatie met hogedruk vriezen. In tegenstelling tot andere instrumenten die een extern apparaat lichtstimulatie en invriezen controle nodig is lichtstimulatiebron volledig geïntegreerd in het systeem en kan worden toegepast ms nauwkeurig 19. Dit proces bestaat uit meerdere stappen. 1) muis hippocampale neuronen gekweekt op saffier schijven en geïnfecteerd met lentivirus dragende een expressievector voor channelrhodopsin 18. 2) Neuronen gestimuleerd en ingevroren op gedefinieerde tijdstippen na stimulatie. 3) Het verglaasde water vervangingd met een organisch oplosmiddel, terwijl lipiden en eiwitten zijn verknoopt door fixeermiddelen met de intracellulaire architectuur te behouden. 4) De monsters worden geïnfiltreerd en ingebed in epoxyhars. 5) Ultradunne secties worden verzameld met behulp van een ultramicrotoom. 6) Dunne secties worden afgebeeld op een transmissie-elektronenmicroscoop. 7) Afbeelding acquisitie en analyse worden blindelings uitgevoerd met betrekking tot tijdstippen of genotypes. Cellulaire dynamiek kan worden bepaald door reconstructie van tijdsopgeloste afbeeldingen 17, 18. Voorbereiding van het monster (stappen 2-5 hierboven) vereist een week, maar de daaropvolgende beeldanalyse vereist maanden tot een jaar.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van het gebruik van dieren door de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Johns Hopkins School of Medicine.
1. Isolatie en cultuur van muis hippocampale neuronen
- Ontleden cortex uit een postnatale dag 0 - dag 2 (P0 - 2) muizenhersenen 18. Isoleer de astrocyten van de cortex.
NB: De hersenen van muizen werd geïsoleerd na onthoofding. Astrocyten dienen als een voedingslaag van hippocampale neuronen. - Behandel de cortex met 800 ui 0,05% trypsine-EDTA gedurende 15 minuten bij 37 ° C om de astrocyten dissociëren.
- Cultuur de astrocyten in een T-75 kolf met 13 ml DMEM dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,2% penicilline-streptomycine gedurende één week bij 37 ° C en 5% CO2.
- Plaats een zuur gewassen en gesteriliseerde 18 mm glazen dekglaasje per putje van een 12-wells plaat.
- Spoel even twee 6 mm koolstof beklede saffier schijven in 70% ethanol en plaats ze op elkaar dekglaasje.
- Bereid Poly-D-lysine-oplossing (PDL) door mengen van 3 ml 17 nM azijnzuur met 1 ml rattenstaart collageen en 1 ml PDL (1 mg / ml). Toepassing 200 pi van PDL oplossing van het saffier schijven en dekglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de PDL-oplossing en drogen. Vóór gebruik steriliseren plaat zoals bereid in de stappen 1,4-1,6 gedurende 30 min onder ultraviolet licht.
- Zaad van de astrocyten uit stap 1.3 in 2 ml DMEM met een dichtheid van 5x10 4 cellen / putje in de plaat zoals bereid in de stappen 1,4-1,6. Ze groeien bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende één week.
- Voeg 20 ul van fluor-deoxyuridine (eindconcentratie 80 uM) aan elk putje gedurende ten minste een paar uur voor het kweken van de neuronen.
OPMERKING: Fluor-deoxyuridine stopt astrocyten divisie. - Verander het medium 1,5 ml van neuronale basal medium (zie tabel of Materials) dat 1% L-alanyl-L-glutamine (zie tabel of Materials), 2% serumvrij supplement voor neuronale cellen (zie de tabel van Materialen), en 0,2% penicilline-streptomycine .
- Bereid papaïne oplossing door toevoeging van 20 eenheden van papaïne 5 ml enzymoplossing (1,65 mM cysteine, 1 mM CaCl2 en 0,5 mM EDTA in DMEM). Zuur de oplossing door het passeren CO2 gas gedurende 20 minuten. Filter-steriliseren met een 0,22 urn filter.
- Oogst de hersenen van een P0 - 2 muis 18. Onmiddellijk overdracht van de hersenen om ijskoude Hanks'-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Ontleden de hippocampus onder een stereomicroscoop, waarbij het weefsel ondergedompeld in HBSS.
- Zet de twee hippocampus in 1 ml van de papaïne bereid in stap 1.11. Incubeer gedurende 1 uur op een thermomixer bij 37 ° C en 750 rpm.
- Vervang papaïne met 1 ml oplossing die inactiverende2,5 mg trypsineremmer en 0,5 mg albumine per ml DMEM. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Aspireren uit het inactiverende oplossing.
- Voeg 200 ul van neuronale basale medium (zie de tabel van Materialen) aan de geïsoleerde hippocampus. Vermaal behulp van een 200 pi pipettip om de cellen te dissociëren. Wacht tot de gedissocieerde cellen naar de bodem zakken. Verwijder het medium voorzichtig met cellen van de top.
- Herhaal stap 1.15 3x. Zwembad alle gedissocieerde cellen in een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis.
- Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Neuronen plaat bij een dichtheid van 6,5 x 10 4 cellen / putje bovenop de astrocyten laag bereid in stappen 1,1-1,10.
- Infecteren de neuronen met lentivirus expressie channelrhodopsin ten DIV 3 (3 d in vitro) 18.
- Uitvoeren van flash-en-bevriezing van DIV 14, volgens de beschrijving bij 2,1-2,5, hieronder.
2. Flash-and-Freeze
- Bereiding van Fixatief
- Onder een chemische motorkap, de volgende stoffen een conische buis met het fixeermiddel bereid: 2,5 ml glutaaraldehyd (10% voorraad in aceton), 0,25 g osmiumtetroxide, 0,25 ml water en 22,25 ml watervrije aceton.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elke component moet 1% in aceton zijn. Glutaaraldehyde toegevoegd aan de eiwitstructuur tijdens bevroren bewaren substitutie. LET OP: De acute toxiciteit van osmiumtetroxide is hoog. Blootstelling aan de dampen kan het hoornvlies van het oog beschadigen. Het mag alleen in een gecertificeerde chemische kap worden behandeld. - Aliquot 1 ml fixeeroplossing in genummerde cryogene flesjes (2 ml). Houd het fixeermiddel ingevroren in vloeibare stikstof tot gebruik.
OPMERKING: Osmiumtetroxide en glutaaraldehyde kruisreageren en precipiteren; Wanneer dus gemengd monster onmiddellijk cap de buizen, en dompel de cryotubes in vloeibare stikstof om het fixeermiddel bevriezen. Gebruik een potlood om de cryo nummerenoestrogene flesjes, kan aangezien aceton wassen markers.
- Onder een chemische motorkap, de volgende stoffen een conische buis met het fixeermiddel bereid: 2,5 ml glutaaraldehyd (10% voorraad in aceton), 0,25 g osmiumtetroxide, 0,25 ml water en 22,25 ml watervrije aceton.
- Bereiding van fysiologische zoutoplossing
- Voeg fysiologische zoutoplossing door mengen Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) en glucose (10 mM).
LET OP: Deze waarden zijn uiteindelijke concentraties. Cryo-beschermingsmiddelen worden niet gebruikt voor monolayer kweken. Echter, is een goede cryo-beschermende vereist voor monsters dikker dan 5 urn. Het gebruik van 20% BSA wordt gewoonlijk aanbevolen. Gist plakken en E. coli OP50 kan ook worden gebruikt als cryo-beschermers voor vliegenlarven of C. elegans. - Voeg CaCl2 bij 4 mM MgCl2 en 1 mM eindconcentratie.
LET OP: De concentraties van CaCl2 en MgCl2 variëren afhankelijk van experimenten. De vangst van exocytose tussenproducten waarborgen, wordt 4 mM calciumchloride gebruikt voor deze specifieke experimenten om de afgifte waarschijnlijkheid van 18 vesicles verhogen. - Controleer deosmolariteit met behulp van een osmometer. Zorg ervoor dat het 300 ± 5 mOsm.
- Voeg AMPA receptorantagonist (NBQX) tot een eindconcentratie van 3 uM en GABA receptor antagonist (bicuculline) tot een eindconcentratie van 30 uM.
OPMERKING: Neurotransmitter receptorantagonisten worden toegevoegd om de vaste netwerkactiviteit volgende neuronale stimulatie 18 voorkomen. - Warm het fysiologische zoutoplossing tot 37 ° C voor gebruik.
- Voeg fysiologische zoutoplossing door mengen Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) en glucose (10 mM).
- Bereiding van de gespecialiseerde Hogedruk vriezer en een Automated Freeze Substitutie Unit
- Vóór hogedruk vriezen, koelen een automatische bevriezing substitutie eenheid tot -90 ° C door het vullen van de tank met vloeibare stikstof.
- Afkoelen aceton in een kleine beker tot -90 ° C door deze in de monsterkamer.
- Vult de vloeibare stikstof Dewar en opslag Dewar van de hogedruk vriezer (zie tabel of Materials) met vloeibaar nitrogen.
- Stel het licht stimuleringsprotocol via het touch screen monitor.
- Noem het programma door te klikken op "Bewerken" naast "Program naam" aan het licht stimulatie venster. Een ander venster verschijnt.
- Een programma van typen "15000 ms" in "donkere fase," "100 ms" in "periode" "10 ms" in "puls" en "1" in "aantal perioden" voor een enkele stimulus van 10 Mevr. Bevries de cellen 90 ms later (figuur 1C).
OPMERKING: De "donkere fase" kan de cellen om te herstellen van blootstelling aan licht tijdens het laden van het monster. "Periode" bepaalt de stimulatiefrequentie. Bijvoorbeeld, als de stimulus worden toegepast bij 20 Hz, deze kolom worden ingesteld op 50 ms. "Pulse" bepaalt de duur van het licht stimulus. Tenslotte het "aantal perioden" definieert het totale aantal stimuli toegepast. Voor het opzetten van een hoogfrequente stimulatie, zie
- Een "geen stimulatie" control, type "15 s" in "donkere fase," "0 ms" in "periode" "1 ms" in "puls" en "0" in "aantal perioden" in het licht stimulatie setup venster, zoals beschreven in stap 2.3.4.
OPMERKING: Standaard wordt de "puls" moet ten minste 1 ms. - Op het hoofdscherm, zorg ervoor dat de doos voor lichte stimulatie wordt gecontroleerd.
- Stel de opslag protocol door te klikken op "Specimen Storage" op het hoofdscherm. Klik op "Bewerken". In het volgende venster toetsen "+" of "-," naar "2" selecteren 2 schijven opgeslagen in elk kanaal (3 kanalen in totaal). Check "Opslag LN2 ingeschakeld."
- Sample laden en bevriezen in de hoge-druk Freezer
LET OP: Alle het monster monteren en beladen stappen worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop met een 7.5-60X vergroting bereik. Een tweezer wordt in stappen 2.4.1 - 2.4.4 met de modellen manipuleren. Experimenten worden uitgevoerd bij fysiologische temperatuur.- Plaats een saffierschijf, cel-zijde naar boven in de put van de zwarte, middenplaat (Figuur 1B).
- Plaats een 100 urn afstandsring via saffierschijf (Figuur 1B).
- Een blanco saffierschijf via afstandsring (Figuur 1B) na onderdompelen ene zijde van de schijf in de voorverwarmde zoutoplossing bij stap 2.2. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee saffier schijven.
- Plaats een 100 urn afstandsring en 400 urn afstandsring (Figuur 1B). Verwijder het extra vloeibare filterpapier.
- Leg het samenstel uit stap 2.4.3 tussen de twee transparante halve cilinders (Figuur 1A). Sluit de top rode kaft op de bevriezing te starten.
OPMERKING: De vooraf ingestelde protocol wordt automatisch uitgevoerd wanneer het deksel gesloten. Het monster blijft in dezelfde oriëntatie in de vrieskamer en een lichtflits wordt van de bovenzijde van het monster samenstel. De rode cover terugspringt automatisch zodra de bevriezing proces is voltooid. - Bewaar het model in de opslag Dewar.
OPMERKING: Na het invriezen wordt het monster automatisch vallen in een opslagbuffer dewarvat gevuld met vloeibare stikstof en daar opgeslagen tot verdere verwerking. Opslag dewarvat drie kamers, en elke kamer kan maximaal 3 samples maximaal. Gewoonlijk worden twee monsters ingevroren onder dezelfde stimuleringomstandigheden, en de hogedruk diepvriezer geprogrammeerd om zowel slaan in dezelfde kamer. - Herhaal stap 2.4.1 - 2.4.6 voor elk monster.
- Ga verder met stap 2.5 als alle kamers vol zijn.
Opmerking Het apparaat werd ingesteld op maximaal 6 monsters in de opslag Dewar tegelijk. Dus na elke 6e monster stap 2.5 moeten worden uitgevoerd. Eenmaal gelost, herhaalt u de stappen 2.4.1 - 2.4.6.
- Monsterverzameling en overbrenging naar een Automated Freeze-substitutie Unit
- Open de deur naar de opslag dewarvat, dat zich onder de tafel van de hogedruk diepvriezer. Verwijder de opslag Dewar en plaats het op de benchtop.
- Gebruik handen, verwijder de monsterkamer van het dewarvat en overbrengen in de gespecialiseerde monsterblad gevuld met vloeibare stikstof. Ontgrendel de knop naar monsterbeker los.
- Verwijder het transparante halfcilinders van het monster beker met behulp van een pincet na het voorkoelen van de uiteinden van de pincet met vloeibare stikstof (-196 ° C ~). Breng voorzichtig de middelste, zwarte plaat een klein kopje met vloeibare stikstof.
OPMERKING: De uiteinden van de pincetten worden voorgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof. Het monster moet onder vloeibare stikstof te allen tijde gehouden ijskristallen te voorkomen.
3. Freeze Vervanging bij Automated Freeze-substitutie Unit
- Gebruik voorgekoelde pincet (tips bij ~ 196 ° C), snel de middenplaat overbrengen van stap 2.5.3 naar de voorgekoelde aceton (-90 ° C).
- Scheid de saffierschijf vanuit het midden plaat door zachtjes te schudden of te tikken.
OPMERKING: Af en toe kan het moeilijk zijn om de saffierschijf scheiden van de middelste plaat. In een dergelijke situatie, laat de middenplaat in vooraf gekoelde aceton (-90 ° C) gedurende enkele minuten. Zachtjes te tikken met een pincet helpt ook om de saffier distantiëren van de middelste plaat. - Plaats een cryogene flacon met fixeermiddelen (stap 2.1) in een monsterkamer van de substitutie-eenheid. Breng de saffier schijf naar de cryogene flacon en plaats een kapje op de flacon.
- Stel de bevriezing substitutie programma als volgt: (i) -90 ° C gedurende 5-30 uur, (ii) -90 - -20 ° C in 14 uur (5 ° C / h), (iii) -20 ° C gedurende 12 uur, en (iv) -20 ° C - 20 ° C in 4 uur (10 ° C / h).
OPMERKING: De duverhouding van de eerste trap bij -90 ° C kan worden gevarieerd. De totale duur van bevriezen substitutie wordt ingesteld zodanig dat het programma eindigt in de ochtend (-1,5 d postexperiment) rond 08:00 zodat de volgende stappen overdag worden uitgevoerd.
4. Infiltratie en Plastic Embedding met epoxyhars
- Zodra het programma eindigt Gebruik handschoenen om de cryogene flesjes die saffieren schijven dragen van de monsterkamer van de substitutie-eenheid aan een chemische kap.
- Gebruik een pipet aceton (kamertemperatuur) aan elk cryogeen flesje en wassen elke saffierschijf 4 - 6x gedurende 1-2 uur.
- Eventueel incubeer de monsters in 0,1% uranyl acetaat gedurende 1 uur als extra contrast nodig. Was 4 - 6x met aceton gedurende 1 - 2 uur.
OPMERKING: WAARSCHUWING: Er is risico inwendige blootstelling na inhalatie van uranyl acetaat, die irritatie van de bovenste luchtwegen veroorzaakt. Hoge blootstelling kan damage bloedcellen. Werken met uranyl acetaat dient onder afzuiging. Beschermende kleding wordt aanbevolen. - Bereid vloeibare epoxyhars medium door weging 6,2 g glycerolpolyglycidylether, 4,4 g bisfenol-A epoxyhars en 12,2 g dodecenylbarnsteenzuuranhydride (DDSA). Meng goed en voeg 800 ul van benzyldimethylamine (BDMA) tijdens het mengen. DE-gas gedurende 10 minuten.
- Bereid 30, 70, en 90% epoxyhars in aceton van 100% epoxyhars bereid in stap 4.4.
- Voeg 30% epoxyhars de cryogene flesjes die saffier schijven en incubeer gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting bij 120 opm.
- Vervang 30% epoxyhars met 70% epoxyhars door pipetteren en incubeer gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting.
- Met een pincet, dragen elk saffierschijf, cel-side-up, om de dop van de capsule insluiten. Voeg 90% epoxyhars met de kap. Incubeer O / N bij 4 ° C.
- De volgende dag vers maken epoxyhars medium, zoals in stap 40,4.
- Transfer elke saffierschijf, cel-zijde naar boven op de kap van de capsule insluiten. Vul de kap met vers bereide 100% epoxyhars. Ga verder met verse 100% epoxyhars elke 2 uur, driemaal herhalen.
- Plaats de monsters in een 60 ° C oven gedurende 48 uur te polymeriseren.
5. Montage Monsters
- Het monster ondersteboven op de stereomicroscoop zodat de saffierschijf bevindt zich aan de bovenkant van het harsbed blok. Verwijder de dunne laag epoxyhars van bovenaf door krassen met een scheermes.
- Met behulp van een scheermesje, snijd een ondiepe lijn langs de rand van de saffierschijf; deze lijn helpt de saffierschijf scheiden van de epoxyhars in stap 5.3.
- Scheid de saffierschijf van de epoxyhars door dompelen in vloeibare stikstof gedurende ongeveer 10 s.
LET OP: De cellen zullen blijven in de epoxyhars. - Na verwijdering van de saffierschijf Gebruik een dissectie scope naar een gebied met cellen te vinden (4-10X vergroting). Knip het interessegebied (~ 2 x 2 mm) met een scheermesje (tweesnijdend). Het model in plaats te houden, voert deze stap terwijl het monster wordt geplakt op het oppervlak van de microscoop.
- Monteer het stukje plastic (~ 2 x 2 x 5 mm) die de cellen met behulp van lijm met ethylcyanoacrylaat een cilindrische dummyblok gemaakt van epoxyhars. Incubeer het blok bij 60 ° C gedurende 1 uur.
6. Sectioning
- Gebruik een ultramicrotoom paragraaf het monster.
- Bekleding van het oppervlak van de kunststof ingebedde specimen met een glazen mes met een snelheid van 3 mm / s en een dikte van 200 nm / sectie. Cut 4-5 delen van het oppervlak waar de astrocyten bevinden.
- Overschakelen naar een diamanten mes en wordt met een snelheid van 0,8 mm / s en een dikte van 40 nm / sectie. Cut 20-25 secties.
- Verzamel linten secties van één slot koperen roosters bedekt met 0,7% polyvinylacetaat (ziede Table of Materials).
7. Imaging Met behulp van een Transmission Electron Microscope (TEM)
- Voorafgaand aan beeldvorming TEM, vlek het gedeelte met 2,5% uranylacetaat in methanol gedurende 5 minuten.
- Was het rooster 15x in 50% methanol. Daarna wassen in ultrapuur water 15x, met elke wasbeurt gedurende 30 s.
- Kort aan de lucht drogen sectie en plaats het rooster in een monsterhouder van de TEM.
- Beeld bij 93,000X vergroting.
- Acquire beelden.
OPMERKING: Imaging wordt meestal gedaan blind voor de tijdstippen of genotypes, en typisch ~ 200 beelden worden verzameld / tijdstip.
8. Image Analysis
- Analyseren van de beelden met behulp van een software (bijvoorbeeld ImageJ) met een aangepaste macro (Watanabe, Davis, en Jorgensen, niet gepubliceerd).
OPMERKING: De x / y-coördinaten worden geregistreerd vanaf blaasjes, de plasmamembraan, de actieve zone membraan en alle andere aan membraan gebonden organellen bij synapsen. De tekst files met de gegevens worden geëxporteerd naar andere software (bijvoorbeeld Matlab). De gegevens worden verder geanalyseerd met behulp van aangepaste programma's.
Representative Results
Met het hierboven beschreven protocol, voerden wij "flash-en-freeze" experimenten in muizen hippocampale neuronen tot expressie channelrhodopsin. Deze neuronen werden ingevroren ofwel 15 ms of 100 ms na het aanzetten van licht. We hebben eerder aangetoond dat de exocytose en endocytose van synaptische blaasjes optreden in de synaptische uiteinden van het 15 ms en 100 ms tijdstippen, respectievelijk 18. Deze gebeurtenissen werden met succes gevangen op de juiste tijdstippen (figuur 2), hetgeen suggereert dat flash-en-vries experimenten kan goed worden uitgevoerd op het gekozen gespecialiseerde hogedruk vriezer (zie de Tabel Materials).
Figuur 1. Monster laden en programmeren in de hoge-druk Freezer. A) Voorbeeld laadtafel van een high-pressure vriezer. De middenplaat, getoond in de inzet van structureel detail wordt geplaatst in een houder voor CLEM monsterbelading. Eén van de halve cilinders geplaatst aan de onderkant van het monster vultafel en de andere is verbonden met een klem aan de bovenkap. Zodra het monster is geladen, wordt de middenplaat voren geduwd om de onderste halve cilinder en het deksel is gesloten voor het bevriezen leiden. B) Specimen samenstel. De saffierschijf neuronen is geplaatst in de put van de middenplaat, met de cel-naar boven. Een 100 urn ring wordt direct boven de saffierschijf in de put. Vervolgens wordt een lege saffierschijf ondergedompeld in fysiologische zoutoplossing gebracht met de oplossing naar beneden. Luchtbellen moet worden vermeden. Tenslotte wordt een ring 100 urn en 400 urn ring nauwsluitend boven geplaatst. Extra vloeistof verwijderd met filtreerpapier. C) een dwarsdoorsnede van een inbedding capsule met saffierschijf ondergedompeld in epoxyhars. de Sappverhuur schijf wordt geplaatst op de bodem van de capsule, waarbij de cel-zijde naar boven en bedekt met epoxyhars voor infiltratie en inbedding. D) programmeren hogedruk vriezer voor een 10 ms stimulus. De monsters worden bevroren 90 ms na de lichtpuls. E) programmeren hogedruk vriezer 10 stimuli bij 20 Hz. De monsters worden bevroren 5 ms na de laatste lichtpuls. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Visualisatie van exocytose en endocytose Mouse hippocampale neuronen. Hippocampale neuronen zijn eenmaal gestimuleerd en ingevroren bij de aangegeven tijdstippen. Electron microfoto tonen de exocytose van een synaptischeblaasjeseiwit A) en ultrasnelle endocytose
Discussion
De "flash-freeze-en" benadering visualiseert membraan dynamiek door het induceren van een bepaalde cellulaire gebeurtenis met optogenetics en bevroren cellen op gedefinieerde tijdstippen na stimulatie 19. In deze demonstratie, gebruikten we channelrhodopsin, een lichtgevoelige kationenkanaal, neuronen stimuleren en gevangen het smelten en herstel van synaptische blaasjes in de synaptische uiteinden. In de afgelopen jaren hebben veel optogenetic instrumenten ontwikkeld 22, 23, die allemaal compatibel zijn met flash-and-vries zijn. Bijvoorbeeld kan organel handel worden geïnduceerd met behulp van door licht geïnduceerde heterodimerisatie van cryptochrome en CIB1 24. Evenzo kan de lipidesamenstelling van het plasmamembraan worden veranderd door licht geïnduceerde translocatie van fosfoinositide fosfatasen de 25 plasmamembraan. Bovendien kleine, lichtgevoelige chemische verbindingen zoals azobenzeen change conformatie afhankelijk van de verlichtingsgolflengten. Deze conformationele verandering kan worden gebruikt om ligand- gated kanalen te activeren of lipiden in het membraan 26, 27 wijzigen. Gekooide verbindingen kunnen ook worden gebruikt om cellulaire activiteit te induceren. Echter, de LED gebruikt worden in de huidige opstelling niet voldoende energie voor uncaging te produceren; dus verdere optimalisatie van het systeem waarschijnlijk noodzakelijk. Niettemin zijn de toepassingen van deze licht activeerbare gereedschappen zijn flexibel vele cellulaire gebeurtenissen kunnen worden geïnduceerd door een lichtflits. "Flash-and-freeze" kan de resulterende membraan dynamiek vast te leggen.
Er zijn twee belangrijke beperkingen aan de "flash-and-freeze" methode. Ten eerste, het vangt "snapshots" van een bepaalde gebeurtenis uit verschillende cellen. Met andere woorden, het is niet mogelijk om membraan dynamiek volgen één cel gedurende een tijdsperiode. Zo is voor de wederopbouw van elke cellulaire zelfst, moet men verwerven en analyseren van een groot aantal beelden van elk monster en op elk tijdstip. Verder wordt in neuronen, een nog groter aantal beelden is noodzakelijk omdat de fusie van synaptische blaasjes Klaar plaatsen in 20-30% van de synapses in muizen hippocampale neuronen 18, 28. De analyse van een dergelijke grote dataset vergt enorm veel tijd. In de toekomst, beeldacquisitie en analyse moeten worden geautomatiseerd de aanpak efficiënter 29, 30 te maken.
De tweede beperking wordt opgelegd door de aard van de hogedruk vriestechniek. Wanneer cellen bevriezen cellulaire water herschikt ijskristallen vormen indien het bevriezen lager is dan 100 K / s 21. Deze ijskristallen kunnen membranen penetreren of concentraat opgeloste stoffen plaatselijke osmotische druk te veranderen, wat resulteert in het breken van de vliezen. Ijskristallen voorkomen, high druk (~ 2000 atm) toegepast op de monsters. Vanwege het super koeleffect, een bevriezing van 100 K / s voldoende is om water te vormen te verhinderen ijskristallen bij deze druk 21. Theoretisch monsters zo dik als 500 urn kunnen worden ingevroren zonder ijskristallen, maar ongeveer 200 pm is waarschijnlijk de praktische grens, zoals blokvormige vormen van ijs meestal gevormd in dikke weefsel morfologie compromitteren. Bij het verwerken van monsters dikker dan 5 urn, het gebruik van een goede cryo-beschermend middel zoals BSA, noodzakelijk. Echter BSA de osmolariteit van de oplossing verandert en kunnen de fysiologische respons van cellen beïnvloeden. Daarom zijn uitgebreide controle-experimenten nodig om het gebruik van BSA in het bijzonder te valideren. Ijskristallen bestaat verder na hogedruk vriezen indien de specimens per ongeluk uit de vloeibare stikstof bad verwijderd. Aldus is het essentieel om de monsters in vloeibare stikstof te allen tijde en voorgekoeld tang te gebruikenmanipuleren.
Bij het plannen van experimenten, moet de volgende drie punten worden overwogen. Ten eerste is de maximale lichtintensiteit (de 460 nm lijn) is 5,5-8,0 mW / mm2. Of dit intensiteit voldoende is om de activiteit te induceren moet worden geverifieerd met live-cell imaging op een fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan flash-and-vries experimenten. Ten tweede moeten experimenten worden uitgevoerd bij fysiologische temperatuur. De trap van de hogedruk diepvriezer wordt opgewarmd tot 37 ° C voor experimenten met muizen hippocampale neuronen 31. Ten slotte moet de tijdstippen zorgvuldig worden gekozen om het membraan dynamiek vast te leggen. Initiële studies aantonen endocytose is na 100 ms stimulatie. Zo werden drie extra tijdstippen (15, 30, en 50 ms) onderzocht om het membraan dynamiek 17, 18 volgen. Deze tijdstippen waren nodig visualiseren membraantransport events in synaptische transmissie. Echter, de eis voor het aantal tijdstippen zijn verschillend in elk cellulaire gebeurtenis. Daarom moet een aantal tijdstippen worden bemonsterd voor het begin van grote dataset collectie.
Disclosures
Open Access publiceren van dit artikel werd gesponsord door Leica Mikrosysteme GmbH.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Johns Hopkins University (SW). Wij danken de Johns Hopkins School of Medicine Microscoop faciliteit voor hun technische ondersteuning. Wij danken Erik Jorgensen en Christian Rosenmund en de leden van hun laboratoria voor de ontwikkeling van de techniek. Wij danken M. Wayne Davis voor het ontwerp van de oorspronkelijke inrichting. Wij danken Paul Wurzinger, Cveta Tomova en Delgermaa Luvsanjav voor hun technische bijstand. We danken ook Natalie R. Hamilton en Grant F. Kusick voor hun kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
- Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
- Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
- Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
- Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
- Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
- van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
- Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
- Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
- Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
