Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55664
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

Abstract

שנת תאי אדריכלות הקרום והפצת חלבון שלהם כל זמן, אבל זה מאוד קשה לדמיין את האירועים האלה ברזולוציה של זמן ומרחב על סדר ms ו ננומטר, בהתאמה. פיתחנו טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים זמן לפתור, "פלאש-ו-הקפאה," כי גורם אירועים הסלולר עם optogenetics ו 'ממחיש את הדינמיקה הקרום המתקבל על ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדר לאחר גירוי. כדי להדגים את הטכניקה הזו, הבענו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, ב נוירונים בהיפוקמפוס העכבר. בזק של אור מגרת פעילות עצבית וגורם לשחרור הנוירוטרנסמיטר ממסופי הסינפטי באמצעות השילוב של שלפוחית ​​סינפטית. גירוי optogenetic של נוירונים מצמיד עם מקפיא בלחץ גבוה כדי לעקוב אחרי שינויים מורפולוגיים במהלך שידור סינפטי. באמצעות מכשיר מסחרי, אנו כבשנו את השילוב של שלפוחית ​​סינפטית וההתאוששות של synaקרום שלפוחית ​​ptic. כדי להמחיש את השתלשלות האירועים, מערכי נתונים גדולים נוצרו וניתח באופן עיוור, שכן שינויים מורפולוגיים לוו בתאים שונים לאורך זמן. אף על פי כן, פלאש-ו-הקפאה מאפשרת ההדמיה של דינמיקת הממברנה ב micrographs אלקטרונים עם רזולוצית ms זמנית.

Introduction

חזותי קרום וחלבון דינמיקה בתוך תא הוא צעד מפתח להבנת הביולוגיה של התא של תהליכים מסוימים. אירועי סחר דינמי ניתן ללכוד באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי. עם זאת, בהקשר התת-תאי חסר בעיקר בתמונות מסוג זה משום מבני subcellular לא ניתן לחלוטין "צבוע" על ידי צבעים או בדיקות ניאון ו נפתרו מרחבית 1 ספקטרלית, 2. מצד השני, בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים יכול להתוות ארכיטקטורה התת-תאי בפירוט יוצא דופן, זה לא יכול ללכוד דינמיקת סלולר, כי דגימות חייבות להיות קבועה לפני ההדמיה. לכן, זה בדרך כלל לא מספיק כדי להבין את הדינמיקה הסלולר לחלוטין באמצעות שיטת הדמיה יחידה.

כדי להתגבר על המגבלות של אור במיקרוסקופ אלקטרונים, שיטות מיקרוסקופיה המצטרף פותחו. אור הקורלטיבי במיקרוסקופ אלקטרונים(קלם) מדמיין דינמיקה תאית באמצעות מיקרוסקופ אור ומבנים התת-תאי בסיסיים עם מיקרוסקופ אלקטרונים. בשנת קלם, תאים עוסקים בתהליכים שונים, כגון cytokinesis ו אנדוציטוזה 3, 4, 5, 6, הם חיות-צלם ולאחר מכן מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. למרות קלם לוכד היבטים מסוימים של דינמיקה תאית, ישנם ארבעה גורמים המגבילים את התועלת של גישה זו. ראשית, ההחלטה הזמנית מוגבלת על ידי כמה יכול להיות משותקת התאים במהירות, אשר בדרך כלל לוקח שניות - דקות עקב דיפוזיה התגובה האיטית של fixatives 7. שנית, את ארכיטקטורת subcellular שנצפתה בדיעבד 8; לפיכך, השינויים מורפולוגיים הדינמיים לא ניתן ללכוד באמצעות גישה זו. שלישית, micrographs פלואורסצנטי אלקטרונים לא ניתן להתאים אותה בדיוק בגלל sh רקמותrinkage שנגרם על ידי התייבשות במהלך הכנת המדגם עבור במיקרוסקופ אלקטרונים 9, 10. הרביעית, אירועים כמו cytokinesis ו אנדוציטוזה אינם מתרחשים בעת ובעונה אחת בכל תא 5, 11, ובכך, תא מסוים עוסק האירוע חייב להיות מזוהה מאוכלוסייה גדולה של תאים. תהליך זה הוא לעתים קרובות מייגע. לפיכך, שיטה חדשה יש צורך לגרום לאירועים בפרט בכל תא כדי ללכוד את דינמיקת הסלולר וכתוצאה ידי הקיבוע המהיר של תאים בנקודות זמן מוגדרים.

לאחרונה, מספר כלים פותחו כדי לגרום דינמיקה סלולר מסוימת באמצעות אור (optogenetics). Channelrhodopsin הוא ערוץ קטיון רגיש לאור, הלא סלקטיבי מבודד Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. כאשר channelrhodopsin מתבטאת neuronaממברנות l, הבהוב קל של אור מעורר זרם של יוני נתרן לתוך הנוירונים מפעיל פעולה 14 פוטנציאל, 15. פוטנציאל הפעולה ואז מתפשט לתוך מסופי הסינפטי, שבו שלפוחית סינפטית פתיל בתוך אלפיות 16, 17, 18 לכן, channelrhodopsin גורם פעילות עצבית. כדי לעקוב אחרי דינמיקת קרום במסופים הסינפטי, נוירונים חייב להיות משותק בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי עם דיוק ms.

כדי ללכוד דינמיקת קרום לאחר גרימת פעילות עצבית, אנו מצמידים גירוי אור עם בלחץ גבוה מקפיא 17, 18, 19. הקפאה בלחץ גבוה מאפשר קיבוע כמעט מיידי של תאים עם היווצרות קרח קריסטל מופחת 20. גבישי קרח can להתפקע ממברנות ולשבש את הארכיטקטורה subcellular 21. על ידי שינוי מרווחי הזמן בין הגירוי והקפאה, סחר קרום בתוך מסופי הסינפטי נתפס בעקבות אינדוקציה של פוטנציאל פעולה.

הנה, אנחנו מדגימים פרוצדורות באמצעות הקפאה בלחץ גבוה ממוסחרת כי זוגות שליטת ms זמנית של גירוי אור עם מקפיא בלחץ גבוה. בשונה מכשירים אחרים שדורשים בהתקן חיצוני כדי לשלוט גירוי אור והקפאה, גירוי אור משולב במלואו במערכת זו והוא יכול להיות מיושם עם דיוק ms 19. תהליך זה כרוך שלבים מרובים. 1) נוירונים בהיפוקמפוס עכבר מתורבתים על דיסקים ספיר נגוע lentivirus נושאת וקטור ביטוי עבור channelrhodopsin 18. 2) נוירונים הם מגורה קפוא בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי. 3) המים המזוגגים הוא תחליףד עם ממס אורגני, ואילו שומנים וחלבונים הם צולבים ידי fixatives לשמר את הארכיטקטורה התאית. 4) הדגימות הם הסתננו ומוטבעי שרף אפוקסי. 5) סעיפים Ultrathin נאספים באמצעות ultramicrotome. 6) סעיפים Thin הם צילמו על מיקרוסקופ אלקטרונים חודרת. 7) תמונת רכישה וניתוח מבוצעים באופן עיוור לגבי נקודות זמן או גנוטיפים. דינמיקה סלולר ניתן לקבוע באמצעות שחזור של תמונות הזמן נפתר 17, 18. הכנת דוגמאות (שלבים 2 - 5 לעיל) מחייב שבוע, אך בניתוח התמונה העוקב דורש חודשים עד שנה.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי החוקים והתקנות של השימוש בבעלי חיים על ידי ה- National Institutes of Health. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים שימוש (IACUC) באוניברסיטת ג'ונס הופקינס הספר לרפואה.

1. ניתוק והתרבות של עכבר נוירונים בהיפוקמפוס

  1. לנתח הקורטקס מיום הלידה 0 - יום 2 (P0 - 2) עכבר המוח 18. לבודד את האסטרוציטים מן הקורטקס.
    הערה: מוח העכבר בודד לאחר עריפת הראש. האסטרוציטים לשמש שכבת מזין עבור נוירונים בהיפוקמפוס.
  2. פנקו את קליפת המוח עם 800 μL של 0.05% טריפסין- EDTA עבור 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את האסטרוציטים.
  3. תרבות האסטרוציטים בבקבוק T-75 עם 13 מ"ל של DMEM המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) ו 0.2% פניצילין, סטרפטומיצין עבור שבוע אחד בכל 37 ° C ו 5% CO 2.
  4. מניחים חד חומצה שטף מעוקר 18 מ"מ PE coverslip זכוכיתגם r של צלחת 12-היטב.
  5. בקצרה לשטוף שני דיסקים ספיר 6 מ"מ מצופה פחמן באתנול 70% ומניחים אותם על גבי כל coverslip זכוכית.
  6. הכן Poly-D- ליזין (PDL) פתרון על ידי ערבוב 3 מ"ל של 17 חומצה אצטית ננומטר עם 1 מ"ל של קולגן זנב חולדה 1 מ"ל של PDL (1 מ"ג / מ"ל). החל 200 μL של פתרון PDL אל דיסקים ספיר וזכוכית coverslips עבור 5 דקות ב RT.
  7. סר פתרון PDL ואוויר יבש. לפני השימוש, לעקר את הצלחת כפי שהוכנו צעדים 1.4 - 1.6 30 דק 'תחת אור אולטרה סגול.
  8. זרעים האסטרוציטים משלב 1.3 ב 2 מ"ל של DMEM בצפיפות של 5x10 4 תאים / היטב בצלחת כפי שהוכנו צעדים 1.4 - 1.6. לגדל אותם בבית 37 ° C ו 5% CO 2 למשך שבוע.
  9. להוסיף 20 μL של fluoro-deoxyuridine (ריכוז סופי: 80 מיקרומטר) זה טוב לפחות כמה שעות לפני culturing נוירונים.
    הערה: Fluoro-deoxyuridine מפסיק חטיבת astrocyte.
  10. שינוי המדיום כדי 1.5 מ"ל של bas העצביתהמדיום אל (ראה טבלה של חומרים) המכיל 1% L-alanyl-L-גלוטמין (ראו טבלה של חומרים), 2% תוספת סרום ללא עבור תאים עצביים (ראו טבלה של חומרים), ו 0.2% פניצילין, סטרפטומיצין .
  11. הכן פתרון פפאין ידי הוספת 20 יחידות של פפאין כדי 5 מ"ל של תמיסת אנזים (1.65 מ"מ ציסטאין, 1 מ"מ CaCl 2, ו- 0.5 mM EDTA ב DMEM). לחומצת הפתרון על ידי העברת CO 2 גז במשך 20 דקות. מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  12. קציר המוח של P0 - 2 עכבר 18. מייד להעביר את המוח כדי Hanks'-מאוזן קרים כקרח מלח פתרון (HBSS). לנתח את hippocampi תחת סטראו, שמירה על הרקמות שקועות HBSS.
  13. מניחים את שני hippocampi ב 1 מ"ל של הפתרון פפאין מוכן בשלב 1.11. דגירה של 1 h על thermomixer ב 37 ° C ו 750 סל"ד.
  14. החלף את פפאין עם 1 מ"ל של תמיסה המכילה inactivating2.5 מ"ג של מעכבי טריפסין ו 0.5 מ"ג אלבומין לכל מ"ל של DMEM. דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לשאוב את הפתרון inactivating.
  15. הוספת 200 μL של מדיום בסיס עצבי (ראה הטבלה של חומרים) להיפוקמפוס המבודד. Triturate באמצעות קצה פיפטה 200 μL לנתק את התאים. חכו עד שהתאים undissociated ליישב בתחתית. מוציאים בזהירות את המדיום עם תאים מהחלק העליון.
  16. חזור על שלב 1.15 3x. בריכה כל התאים ניתק צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדש.
  17. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. פלייט הנוירונים בצפיפות של 6.5 x 10 4 תאים / גם על גבי שכבת astrocyte הערוכה צעדים 1.1 - 1.10.
  18. להדביק את הנוירונים עם lentivirus להביע channelrhodopsin ב DIV 3 (3 ד במבחנה) 18.
  19. בצע פלאש-ו-הקפאת DIV 14, כמתואר בשלבים 2.1 - 2.5, בהמשך.

2.-פלאשד-Freeze

  1. הכנה מקבע
    1. מתחת למכסה המנוע כימי, מוסיפים את החומרים הבאים צינור חרוטי להכין מקבע: 2.5 מ"ל של glutaraldehyde (מלאי 10% ב אצטון), 0.25 גרם של tetroxide אוסמיום, 0.25 מ"ל של מים, ו 22.25 מ"ל של אצטון נטול מים.
      הערה: הריכוז הסופי של כל רכיב צריך להיות 1% אצטון. Glutaraldehyde מתווסף לשמר את מבני החלבון במהלך החלפת הקפאה. זהירות: הרעילות החריפה של tetroxide אוסמיום היא גבוהה. חשיפה לאדים יכול לפגוע בקרנית העין. זה צריך להיות מטופלים רק במנדף כימי מוסמך.
    2. Aliquot 1 מ"ל של מקבע לתוך צלוחיות קריוגני ממוספרים (2 מ"ל). שמור מקבע קפוא בחנקן נוזלי עד לשימוש.
      הערה: tetroxide אוסמיום ו glutaraldehyde צולב להגיב משקע; וכך, פעם מעורב, aliquot מיד, מכסה את הצינורות, ואת להטביע את cryotubes בחנקן נוזלי להקפיא את מקבע. השתמש עיפרון למספר את קריובקבוקונים genic, מאז אצטון יכול לשטוף סמנים.
  2. הכנת תמיסת מלח פיזיולוגית
    1. הפוך תמיסת מלח פיזיולוגית על ידי ערבוב Hepes (10 מ"מ, pH 7.5), NaCl (140 מ"מ), KCl (2.4 מ"מ), ו גלוקוז (10 מ"מ).
      הערה: ערכים אלה הם ריכוזים סופיים. קריו protectants אינו משמש תרבויות בשכבה. עם זאת, קריו-מגן נאות נדרש דגימות עבות יותר 5 מיקרומטר. השימוש BSA 20% מומלץ בדרך כלל. ממרח שמרים ו OP50 החיידק יכול לשמש גם-protectants קריו עבור זחלי זבוב או C. elegans.
    2. להוסיף CaCl 2 ב 4 מ"מ ו MgCl 2 ב 1 ריכוזים סופיים מ"מ.
      הערה: ריכוזים של CaCl 2 ו MgCl 2 משתנים בהתאם ניסויים. כדי להבטיח את תפיסתו של ביניים exocytic, 4 סידן מ"מ משמש לניסויים בפרט אלה כדי להגדיל את ההסתברות שחרורו של שלפוחית 18.
    3. בדוק את הosmolarity באמצעות osmometer. להבטיח שהיא תהיה 300 ± 5 mOsm.
    4. הוספת אנטגוניסט לקולטן AMPA (NBQX) לריכוז סופי של 3 מיקרומטר ו אנטגוניסט לקולטן GABA (bicuculline) לריכוז סופי של 30 מיקרומטר.
      הערה: אנטגוניסטים לקולטן נוירוטרנסמיטר מתווספים להימנע מפעילות הרשת חוזרת בעקבות גירוי עצבי 18.
    5. לחמם את תמיסת מלח פיזיולוגית כדי 37 מעלות צלזיוס לשימוש.
  3. הכנת מקפיא בלחץ גבוה Specialized ויחידת חילוף Freeze אוטומטי
    1. לפני הקפאה בלחץ גבוה, להתקרר יחידת החלפת הקפאה אוטומטית -90 ° C על ידי מילוי המכל עם חנקן נוזלי.
    2. להתקרר אצטון בכוס קטנה -90 ° C על ידי הצבתו בתוך תא הדגימה.
    3. מלא את דיואר חנקן הנוזל דיואר אחסון מהמקפיא בלחץ גבוה (ראה הטבלה של חומרים) עם ניטרוגליצרין הנוזלgen.
    4. הגדרת פרוטוקול גירוי האור באמצעות צג מסך מגע.
      1. שם התכנית על ידי לחיצה על "ערוך" ליד "שם תכנית" על חלון גירוי האור. חלון נוסף יצוץ.
      2. הגדרת תכנית על ידי הקלדה "15,000 ms" ב "שלב אפל", "100 ms" ב "נקודה", "10 ms" ב "דופק" ו- "1" ב "מספר התקופות" עבור גירוי יחיד של 10 גברת. להקפיא את התאים 90 מילישניות מאוחר יותר (איור 1C).
        הערה: "השלב האפל" מאפשרת לתאים להתאושש חשיפה לאור במהלך טעינת מדגם. "תקופה" מגדירה את תדר הגירוי. לדוגמא, אם הגירוי צריך להיות מיושם ב 20 הרץ, הטור הזה צריך להיות מוגדר ב 50 מילישניות. "דופק" מגדיר את משך הזמן של הגירוי אור. לבסוף, "מספר התקופות" מגדיר את המספר הכולל של גירויים מיושם. להקמת גירוי בתדירות גבוהה, עיין
    5. לקבלת "אין גירוי" שליטה, סוג "15 של" ב "השלב האפל", "0 ms" ב "נקודה", "1 ms" ב "דופק" ו- "0" ב "מספר התקופות" לאור חלון התקנת גירוי, כפי שמתואר בשלב 2.3.4.
      הערה: כברירת מחדל, את "דופק" חייב להיות לפחות 1 ms.
    6. במסך הראשי, לוודא שהתיבה להבזקי אור נבדקת.
    7. הגדרת פרוטוקול האחסון על ידי לחיצה על "דגימה חפצה" על המסך הראשי. לחץ על "ערוך". בחלון הבא, להשתמש "+" או "-" כדי לבחור "2" כדי לאחסן 2 דיסקים בכל ערוץ (3 ערוצים בסך הכל). בדוק "חפצי LN2 מופעלת."
  4. טוען מדגם ו קופא במקפיא בלחץ גבוה
    הערה: שלבים כל הרכבת המדגם וטעינה נעשים תחת סטראו עם מגוון הגדלה 7.5-60X. tweezER משמש צעדים 2.4.1 - 2.4.4 כדי לתפעל את הדגימות. ניסויים חייבות להתבצע בטמפרטורה פיזיולוגית.
    1. מניחים דיסק ספיר אחד, בצד התא כלפי מעלה, בבאר של צלחת שחורה, באמצע (איור 1B).
    2. מניחים טבעת spacer 100 מיקרומטר מעל הדיסק ספיר (איור 1B).
    3. מניחים דיסק ספיר ריק מעל טבעת spacer (איור 1B) לאחר טבילה צד אחד של הדיסק תמיסת מלח מחומם מראש משלב 2.2. יש לוודא שאין בועות אוויר לכודות בין שני הדיסקים ספיר.
    4. במקום אחר טבעת 100 מיקרומטר spacer וטבעת spacer 400 מיקרומטר (איור 1B). הסר את הנוזל הנוסף באמצעות נייר פילטר.
    5. מניח את הרכבת משלב 2.4.3 בין שני חצאי הגלילים השקופים (איור 1A). סגור את כיסוי אדום העליון ליזום את תהליך ההקפאה.
      הערה: הפרוטוקול הקבוע מראש מפעיל באופן אוטומטי לאחר שהמכסה סגורה. המדגם נשאר בכיוון זהה בתא ההקפאה, והבזק של אור מוחל מהחלק העליון של הרכבה מדגם. הכיסוי האדום קופץ בחזרה באופן אוטומטי לאחר סיום תהליך ההקפאה הושלם.
    6. אחסן את הדגימה של דיואר האחסון.
      הערה: לאחר ההקפאה, הדגימה היא ירד באופן אוטומטי לתוך דיואר אחסון מלא בחנקן נוזלי ומאוחסנת שם עד לעיבוד נוסף. דיואר האחסון יש שלושה תאים, וכל תא יכול להכיל עד 3 דגימות לכל היותר. בדרך כלל, שתי דגימות קפואות תחת אותם תנאי הגירוי, והמקפיא בלחץ הגבוה מתוכן לאחסן שניהם באותה קאמרית.
    7. חזור על שלבים 2.4.1 - 2.4.6 עבור כל דגימה.
    8. המשך לשלב 2.5 לאחר שכל התאים מלאים.
      הערה: המכשיר נקבע לאחסן עד 6 דגימות של דיואר האחסון בכל פעם. לכן, לאחר כל דגימה 6 th, צעד 2.5 חייב להתבצע. לאחר שהטעינה בוטלה, חזור על שלבים 2.4.1 - 2.4.6.
  5. בוא לטעום איסוף והעביר ליחידה אוטומטית Freeze-ההחלפה
    1. פתח את הדלת אל דיואר האחסון, הנמצא מתחת לשולחן מהמקפיא בלחץ גבוה. הסר את דיואר אחסון ולמקם אותו על המעבדתיים.
    2. באמצעות ידות, להסיר את תא הדגימה מן דיואר ולהעביר אותו במגש המדגם המיוחד מלא בחנקן נוזלי. שחרר את הכפתור כדי לשחרר את כוס הדגימה.
    3. הסר במחצית גלילים השקופים מגביע הדגימה באמצעות פינצטה אחרי טרום קירור הקצוות פינצטה עם חנקן נוזלי (~ -196 ° C). להעביר בזהירות באמצע, צלחת שחורה כדי כוס קטנה המכילה חנקן נוזלי.
      הערה: הטיפים של פינצטה חייבים להיות precooled לטמפרטורה של חנקן נוזלי. המדגם חייב להיות כל הזמן תחת חנקן נוזלי בכל עת כדי למנוע היווצרות קרח קריסטל.

3. הקפאת חילוף של Automated Freeze-החלפה יחידה

  1. בעזרת פינצטה precooled (טיפים ב ~ -196 ° C), במהירות ולהעביר את הצלחת באמצע משלב 2.5.3 אל אצטון precooled (-90 ° C).
  2. הפרד את הדיסק ספיר מהצלחת באמצע ידי ניעור או הקשה בעדינות.
    הערה: לפעמים, זה עלול להיות קשה להפריד את הדיסק ספיר מהצלחת באמצע. במצב כזה, לעזוב את הצלחת באמצע אצטון precooled (-90 ° C) במשך כמה דקות. הקשה עדינה עם פינצטה גם עוזרת לנתק את הספיר מהצלחת באמצע.
  3. מניח בקבוקון המכיל קריוגני fixatives (שלב 2.1) בתוך תא דגימה של יחידת ההחלפה. העברת דיסק ספיר הבקבוקון קריוגני ומניח מכסה על הבקבוקון.
  4. הגדרת תכנית החלפת הקפאה כדלקמן: (i) -90 מעלות צלזיוס למשך 5 - 30 שעות, (ii) -90 - -20 ° C ב 14 שעות (5 מעלות צלזיוס / h), (iii) -20 ° C עבור 12 ח, ו (iv) -20 ° C - 20 ° C ב 4 h (10 ° C / h).
    הערה: duמנה של הצעד הראשון לעבר C -90 ° יכולה להיות מגוונת. משך הסך של החלפת הקפאה מוגדר באופן כזה שהתכנית מסתיימת בבוקר (~ 1.5 ד postexperiment) בסביבות 8 בבוקר, כך השלבים הבאים ניתן לבצע בשעות היום.

4. הסתננות פלסטיק הטבעה עם שרף אפוקסי

  1. עם הפסקת התוכנית, להשתמש בידיים עטויות כפפות להעביר את בקבוקוני קריוגני המכיל את הדיסקים ספיר מבית הבליעה הדגימה של יחידת החלפה כדי במנדף כימי.
  2. בעזרת פיפטה, להוסיף אצטון (בטמפרטורת החדר) בקבוקון אחד קריוגני ולשטוף כל דיסק ספיר 4 - 6x 1 - 2 שעות.
  3. לחלופין, דגירת הדגימות ב יצטט uranyl 0.1% עבור 1 h אם יש צורך בניגוד מיותר. לשטוף 4 - 6x עם אצטון מעל 1 - 2 שעות.
    הערה: זהירות: יש סיכון הקשורים לחשיפה פנימית בעקבות השאיפה של אצטט uranyl, הגורם לגירוי בדרך הנשימה העליונה. חשיפה גבוהה יכולה damagתאי דם דואר. עבודה עם אצטט uranyl צריך להיעשות תחת לאוורור. ביגוד מגן מומלץ.
  4. הכן בינוני שרף אפוקסי נוזלי על ידי שקילה 6.2 גרם של אתר polyglycidyl גליצרול, 4.4 גרם של ביספנול- A שרף אפוקסי, ו 12.2 גרם של אנהידריד succinic dodecenyl (DDSA). מערבבים היטב ומוסיפים 800 μL של בנזיל dimethylamine (BDMA) תוך ערבוב. דה-גז עבור 10 דקות.
  5. כן 30, 70, ו 90% שרף אפוקסי ב אצטון מן שרף אפוקסי 100% המוכנים בשלב 4.4.
  6. הוספת שרף אפוקסי 30% ל צלוחיות קריוגני המכילות דיסקי ספיר דגירה במשך 2 - 3 שעות ב RT ב שייקר מסלולית ב 120 סל"ד.
  7. החלף את שרף אפוקסי 30% עם 70% אפוקסי שרף על ידי pipetting ו דגירה של 3 - 4 שעות ב RT ב שייקר מסלולית.
  8. בעזרת פינצטה, להעביר בכל ספיר דיסק, תא-בצד למעלה, אל הכובע של קפסולה הטבעה. להוסיף 90% אפוקסי שרף את הכובע. דגירה O / N ב 4 ° C.
  9. למחרת, להפוך את המדיום שרף אפוקסי טרי, כמו בשלב 40.4.
  10. העבר כל דיסק ספיר, תא-לוואי פונה כלפי מעלה, אל הכובע של קפסולה הטבעה. מלא את הכובע עם שרף אפוקסי 100% מוכנים טרי. שנה כדי שרף אפוקסי טרי 100% כל 2 h, חוזרת שלוש פעמים.
  11. מניחים את דגימות בתנור C 60 ° עבור 48 שעות כדי לְפַלְמֵר.

5. דוגמאות הרכבה

  1. מניח את הפוך המדגם על סטראו כך דיסק הספיר ממוקם בחלק העליון של הבלוק שרף. הסר את השכבה הדקה של שרף אפוקסי מלמעלה על ידי מגרד אותו עם סכין גילוח.
  2. באמצעות סכין גילוח, לחתוך קו רדוד בשולי דיסק הספיר; קו זה עוזר להפריד את הדיסק ספיר מן שרף אפוקסי בשלב 5.3.
  3. הפרד את הדיסק ספיר מן שרף אפוקסי ידי טבל חנקן נוזלי למשך כ 10 s.
    הערה: התאים יישארו שרף אפוקסי.
  4. לאחר הסרת דיסק ספיר, להשתמש בהיקף לנתח כדי למצוא אזור עם תאים (הגדלת 4-10X). חותכים סביב האזור של עניין (~ 2 x 2 מ"מ) באמצעות סכין גילוח (פיפיות). כדי לשמור את הדגימה במקום, לבצע את השלב הזה במהלך הדגימה היא מודבקת על פני השטח של המיקרוסקופ.
  5. הר חתיכה קטנה של פלסטיק (~ 2 x 2 x 5 מ"מ) המכיל את התאים באמצעות דבק המכיל cyanoacrylate אתיל על בלוק דמה גלילי עשוי שרף אפוקסי. דגירת הבלוק ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.

6. חתך

  1. השתמש ultramicrotome סעיף המדגם.
    1. חתוך את השטח של הדגימה פלסטיק-מוטבע עם סכין זכוכית במהירות של 3 מ"מ / s ו- בעובי של 200 ננומטר / קטע. חותכים 4 - 5 חלקים מפני השטח שבו האסטרוציטים נמצאים.
    2. Switch to סכין סעיף יהלום במהירות של 0.8 מ"מ / s ו בעובי של 40 ננומטר / קטע. חותכים 20 - 25 חלקים.
  2. אסוף סרטים סעיפים על רשתות נחושת משבצת אחת מכוסה אצטט פוליוויניל 0.7% (ראההטבלה של חומרים).

הדמיה 7. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)

  1. לפני TEM הדמיה, להכתים את הקטע עם אצטט uranyl 2.5% מתנול עבור 5 דקות.
  2. שטפו את 15x רשת ב מתנול 50%. ואז, לשטוף 15x מים ultrapure, אחרי כל שטיפה שנמשך 30 s.
  3. בקצרה להתייבש באוויר בסעיף ולמקם את הרשת לתוך מחזיק דגימה של TEM.
  4. תמונה בהגדלה 93,000X.
  5. לרכוש תמונות.
    הערה: ההדמיה בדרך כלל נעשתה עיוורת לנקודות הזמן או גנוטיפים, ובדרך כלל ~ 200 תמונות נאספות / שעת נקודה.

ניתוח תמונה 8.

  1. לנתח את התמונות באמצעות תוכנה (למשל, ImageJ) עם מאקרו מותאם אישית (Watanabe, דייויס, ו יורגנסן, לא פורסם).
    הערה: x / y קואורדינטות נרשמות מן השלפוחית, הממברנה, הממברנה האזור הפעילה, וכל אברונים האחרים הקרום נכנס ב סינפסות. טקסט files המכיל את המידע מיוצא תוכנה אחרת (למשל, Matlab). הנתונים מנותחים נוסף באמצעות תוכניות מותאמות אישית.

Representative Results

שימוש בפרוטוקול לעיל, ביצענו "פלאש-ו-הקפאה" ניסויים נוירונים בהיפוקמפוס העכבר להביע channelrhodopsin. נוירונים אלה הוקפאו או 15 מילישניות או 100 מילישניות לאחר תחילת האור. הראינו בעבר כי exocytosis ו אנדוציטוזה של שלפוחית סינפטית להתרחש מסופי הסינפטי על 15 מילישניות ונקודות זמן 100 ms, בהתאמה 18. אירועים אלה נתפסו בהצלחה במועדים המתאימים (איור 2), דבר המצביע על כך ניסויים פלאש-ו-הקפאה יכול להתבצע בהצלחה על במקפיא בלחץ גבוה מיוחדים שנבחרו (ראו טבלה של חומרים).

איור 1
איור 1. לדוגמא טוען ותכנות במקפיא בלחץ גבוה. א) שולחן טעינת מדגם של א-p גבוההמקפיא ressure. צלחת באמצע, המוצגים השיבוץ לפרטים מבניים, ממוקמת בעל קלם לטעינה מדגם. אחד הגלילים והחצי מושם בחלק התחתון של טבלת טעינת מדגם, והשני מחובר עם קליפ על המכסה העליון. לאחר המדגם הוא טעון, הצלחת באמצע נדחפה קדימה אל חץ הגליל התחתון ו שהמכסה סגורה ליזום את ההקפאה. B) הרכבת דגימה. דיסק הספיר המכיל נוירונים ממוקם היטב של הצלחת באמצע, עם צד התא פונה כלפי מעלה. טבעת 100 מיקרומטר מושמת ישירות מעל דיסק ספיר בתוך הבאר. ואז, דיסק ספיר ריק טבול תמיסת מלח פיזיולוגית ממוקם עם צד הפתרון למטה. בועות אוויר יש להימנע. לבסוף, טבעת 100 מיקרומטר וטבעת 400 מיקרומטר בנוחות ממוקמות מעל. כל נוזל נוסף מוסר עם נייר סינון. ג) הצלבה של קפסולה הטבעה עם דיסק ספיר שקוע שרף אפוקסי. סאפדיסק לשכור מושם בתחתית הקפסולה, עם צד התא כלפי מעלה ומכוסה שרף אפוקסי עבור חדירה והטבעה. D) תכנות במקפיא בלחץ גבוה עבור גירוי יחיד, 10 מילישניות. הדגימות קפואות 90 מילישניות לאחר דופק האור. E) תכנות במקפיא בלחץ גבוה עבור 10 גירויים ב 20 הרץ. הדגימות קפואות 5 מילישניות לאחר דופק האור האחרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ויזואליזציה של Exocytosis ו אנדוציטוזה ב עכבר נוירונים בהיפוקמפוס. נוירונים בהיפוקמפוס הם מגורה אחת קפוא במועדים המצוינים. Micrographs אלקטרונים להראות exocytosis של שלפוחית סינפטית) ו אנדוציטוזה מהיר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

גישת "פלאש-ו-ההקפאה" מדמיין דינמיקת קרום ידי גרימת אירוע הסלולר בפרט עם optogenetics ועל ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדרת לאחר גירוי 19. בהפגנה זו, השתמשנו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, כדי לעורר נוירונים וכבשנו את ההיתוך והתאוששות של שלפוחית ​​סינפטית במסופי הסינפטי. בשנים האחרונות, כלי optogenetic רבים פותחו 22, 23, שכולן עולים בקנה אחד עם פלאש-ו-הקפאה. לדוגמה, סחר אברון יכול להיגרם באמצעות heterodimerization המושרה-לאור קריפטוכרום ו CIB1 24. בדומה לכך, הרכב השומנים של קרום התא ניתן לשנות על ידי טרנסלוקציה אור המושרה של phosphatases phosphoinositide קרום הפלזמה 25. יתר על כן, קטנות, רגישות לאור תרכובות כמו azobenzene chקונפורמציה Ange תלוי באורכי גל תאורה. ניתן להשתמש זה שינוי קונפורמציה להפעיל ערוצים מגודרים ליגנד או לשנות רכב שומנים בקרום 26, 27. תרכובות בכלוב יכול לשמש גם כדי לגרום פעילות הסלולר. עם זאת, ה- LED המשמשים את ההתקנה הנוכחית לא יכול לייצר מספיק אנרגיה עבור משחררות רפרוף; וכך, אופטימיזציות נוספות של המערכת נחוצות סביר. עם זאת, היישומים של כלי אור-activatable אלה הם אירועים הסלולר גמישים-רבים יכולים להיגרם על ידי בזק של אור. "פלאש-ו-הקפאה" יכול ללכוד את הדינמיקה הקרום המתקבל.

ישנן שתי מגבלות עיקריות לשיטת "פלאש-ו-ההקפאה". ראשית, היא לוכדת "תמונות" של אירוע מסוים מתאים שונים. במילים אחרות, לא ניתן לעקוב הדינמיקה הממברנה בתא אחד על פני תקופה של זמן. לפיכך, לבנייה מחדש של כל הסלולר אפילוt, אחד חייב לרכוש ולנתח מספר רב של תמונות מכל מדגם ו בכל נקודת זמן. יתר על כן, בנוירונים, למספר גדול אף יותר של תמונות יש צורך, שכן שילוב של שלפוחית סינפטית לוקח רק במקומות 20 - 30% של סינפסות ב נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 18, 28. הניתוח של נתונים כזה גדול דורש כמויות עצומות של זמן. בעתיד, רכישת תמונה וניתוח צריכים להיות אוטומטית על מנת להפוך את הגישה יעילה יותר 29, 30.

המגבלה השנייה היא שהטיל הטבע של טכניקת ההקפאה בלחץ גבוה. כאשר תאים להקפיא, מים הסלולר מארגנים מחדש כדי ליצור גבישי קרח אם שיעור המקפיא הוא מתחת 100 K / s 21. גבישי קרח אלו יכולים לחדור ממברנות או להתרכז מומס לשנות לחץ האוסמוטי מקומי, וכתוצאה מכך פקיעת קרומים. כדי למנוע גבישי קרח, בפולחץ h (~ 2000 ATM) מוחל על דגימות. בשל אפקט הקירור-העל, שיעור מקפיא של 100 K / s מספיק כדי למנוע מהמים ויוצרים גבישי קרח על הלחץ הזה 21. בתיאוריה, דגימות עבה כמו 500 מיקרומטר אפשר להקפיא בלי גבישי קרח, אבל כ 200 מיקרומטר צפוי הגבול המעשי, כמו צורות cuboidal קרח נוטים להיווצר רקמה עבה, להתפשר מורפולוגיה. כאשר עיבוד הדגימות עבות יותר 5 מיקרומטר, השימוש קריו-מגן ראוי, כגון BSA, יש צורך. עם זאת, BSA ישנה את osmolarity של הפתרון ועשוי להשפיע על התגובה הפיזיולוגית של תאים. לכן, ניסויים שליטה נרחבת נדרשים כדי לאמת את השימוש BSA במערכות בפרט. גבישי קרח יכול להיווצר גם לאחר הקפאה בלחץ גבוה אם דגימות מוסרים בטעות מן האמבט חנקן נוזלי. לכן, חשוב לשמור על הדגימות של החנקן הנוזלי בכל העת להשתמש במלקחיים טרום מקורריםלתפעל אותם.

כאשר מתכננים ניסויים, שלוש הנקודות הבאות צריכות להיחשב. ראשית, העוצמת המקסימלי של אור (460 קו ננומטר) היא 5.5 - 8.0 mW / מ"מ 2. אם האינטנסיביות הזו מספיקה כדי לגרום פעילות יש לוודא עם דימות תאים חיים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ניסויים-ו-להקפיא פלאש. שנית, יש לבצע ניסויים בטמפרטורה פיזיולוגית. השלב מהמקפיא בלחץ גבוה מחומם עד 37 ° C עבור ניסויים עם נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 31. לבסוף, בנקודות הזמן חייבות להיות שנבחרו בקפידה על מנת ללכוד את הדינמיקה הממברנה. מחקרים ראשוניים מציינים כי אנדוציטוזה תושלם לאחר 100 ms של גירוי. לפיכך, שלוש נקודות זמן נוסף (15, 30, 50 & ms) נבדקו גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה קרום 17, 18. נקודות הזמן הללו היו דרושות כדי לחזות באירוע סחר קרוםים במהלך שידור סינפטי. עם זאת, הדרישה עבור מספר נקודות זמן שונה בכל אירוע הסלולר. לכן, כמה נקודות זמן צריכות להיות שנדגמו לפני ביצוע איסוף במערך גדול.

Disclosures

פרסום גישה פתוחה של מאמר זה מומן על ידי לייקה Mikrosysteme GmbH.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס (SW). אנו מודים ספר ג'ונס הופקינס של מתקן מיקרוסקופ לרפואה לתמיכה הטכנית שלהם. אנו מודים אריק יורגנסן ונוצרים Rosenmund וחברי המעבדות שלהם לפיתוח הטכניקה. אנו מודים M. ווין דייוויס עבור העיצוב של המכשיר הראשוני. אנו מודים פול Wurzinger, Cveta Tomova, ו Delgermaa Luvsanjav לקבלת הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם נטלי ר המילטון ו גרנט פ Kusick לקריאה ביקורתית שלהם של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System  for Light and Electron Microscopy -AFS II Leica 
High Pressure Freezer - EM-ICE Leica  EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.
Osmometer Gonotec
Ultramicrotome UC7 Leica 
Oven Blue M
Razor blade Personna
Glutaraldehyde EMS 16530
Osmium tetroxide EMS RT19132 Toxic, open only under certified chemical hood
Acetone EMS RT10016
HEPES Emdmillipore 391340-250GM
Glucose Sigma 49159-1KG
KCl Sigma 746436-1KG
NaCl Sigma S7653-1KG
CaCl2 Sigma 21115-250ML
MgCl2 J.T.Baker 2444-01
Liquid epoxy resin Eponate 12 Ted Pella 18028
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 Ted Pella 18028
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) Ted Pella 18028
Benzyl dimethyl amine (BDMA) Ted Pella 18241
Special embedding (BEEM) capsule EMS 70021
Copper Grid Ted Pella 1GC12H
Polyvinyl acetate (Pioloform F) Ted Pella 19244
Uranyl acetate Polysciences 21447-25
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) Scotch 170497
Trypsin-EDTA Themo scientific 25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Thermo scientific 10569-044 Should be warmed to 37 °C before use
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo scientific 26140-079
Pen-Strep Thermo scientific 15140-122
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503
Glass cover slip Fisher S175223 Should be acid-washed
Sapphire disc Technotrade 616-100
Acetic acid Emdmillipore 1000631011
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma P6407
Rat tail collagen Thermo scientific A10483-01
Neurobasal A Fisher 10888022 Should be warmed to 37 °C before use
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Fisher 35050-079
Seraum free supplement  (B-27)  Fisher 17504044
Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific 24020117
Papain Worthington LS003126 Active Unit should be calculated for each batch
Thermomixer Eppendorf  Thermomixer C
Trypsin inhibitor Sigma T9253
NBQX Tocris 03-731-0
Bicculine Tocris 01-091-0
Whatman I filter paper GE
Transmission Electron Microscope Philips CM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
  2. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
  4. Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
  5. Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
  6. Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
  7. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
  8. Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
  9. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
  10. Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
  11. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  12. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  13. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  14. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  15. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  16. Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
  17. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
  18. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  19. Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
  20. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
  21. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  22. Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
  23. Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
  24. van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
  25. Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
  26. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
  27. Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
  28. Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
  29. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
  30. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  31. Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 123 מיקרוסקופית אלקטרונים optogenetics סינפסה הדינמיקה הממברנה להקפיא החלפה channelrhodopsin הקפאת בלחץ גבוה exocytosis אנדוציטוזה מיקרוסקופית אלקטרונים זמן נפתרה פלאש-ו-הקפאה
פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe,… More

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe, S. Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55664, doi:10.3791/55664 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter