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Biology

फ्लैश और फ्रीज: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ झिल्ली गतिशीलता कैप्चर करने के लिए एक उपन्यास तकनीक

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55664
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, "फ्लैश और फ्रीज," में एक उपन्यास तकनीक है कि एमएस लौकिक संकल्प के साथ झिल्ली गतिशीलता के दृश्य को सक्षम बनाता विकसित की है। इस तकनीक को उच्च दबाव ठंड के साथ न्यूरॉन्स की optogenetic उत्तेजना को जोड़ती है। यहाँ, हम प्रक्रियाओं का प्रदर्शन और विस्तार से प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

कोशिकाओं लगातार अपनी झिल्ली वास्तुकला और प्रोटीन वितरण बदलने के लिए, लेकिन यह क्रमश: एमएस और एनएम के आदेश पर एक अस्थायी और स्थानिक संकल्प पर इन घटनाओं कल्पना करने के लिए बहुत मुश्किल है। हम एक समय का संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, "फ्लैश और फ्रीज," कि optogenetics साथ सेलुलर घटनाओं को प्रेरित करता है और उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर ठंड कोशिकाओं द्वारा जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली गतिशीलता की परिकल्पना करती विकसित किया है। इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, हम channelrhodopsin, एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल, माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में व्यक्त किया। प्रकाश की एक फ्लैश न्यूरोनल गतिविधियों को बढ़ावा और synaptic vesicles के संलयन के माध्यम से synaptic टर्मिनलों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज प्रेरित करता है। न्यूरॉन्स की optogenetic उत्तेजना synaptic प्रसारण के दौरान रूपात्मक परिवर्तन का पालन करने के उच्च दबाव ठंड के साथ मिलकर कर रहा है। एक व्यावसायिक साधन का उपयोग करना, हम synaptic vesicles के संलयन और syna की वसूली पर कब्जा कर लियाptic पुटिका झिल्ली। घटनाओं के अनुक्रम कल्पना करने के लिए, बड़े डेटासेट उत्पन्न और, आँख बंद करके विश्लेषण किया के बाद से रूपात्मक परिवर्तन समय के साथ विभिन्न कोशिकाओं में पीछा किया गया था रहे थे। फिर भी, फ्लैश और फ्रीज एमएस लौकिक संकल्प के साथ इलेक्ट्रॉन micrographs में झिल्ली गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता है।

Introduction

एक कोशिका के भीतर झिल्ली और प्रोटीन गतिशीलता विज्युअलाइजिंग विशेष प्रक्रियाओं की कोशिका जीव विज्ञान को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। गतिशील तस्करी की घटनाओं प्रकाश या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कब्जा कर लिया जा सकता है। हालांकि, subcellular संदर्भ काफी हद तक इस तरह की छवियों में लापता क्योंकि subcellular संरचनाओं नहीं कर सकते पूरी तरह से रंगों या फ्लोरोसेंट जांच से "पेंट" किया और स्थानिक संकल्प लिया और प्रेतसंबंधी 1, 2 है। दूसरी ओर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उत्तम विस्तार से subcellular वास्तुकला को चित्रित कर सकते हैं, यह सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा नहीं कर सकते, क्योंकि नमूनों इमेजिंग से पहले तय की जानी चाहिए। इस प्रकार, यह आम तौर पर पूरी तरह से केवल एक ही इमेजिंग साधन का उपयोग कर सेलुलर गतिशीलता को समझने के लिए पर्याप्त नहीं है।

प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सीमाओं को पार करने के लिए, correlative माइक्रोस्कोपी तकनीक विकसित किया गया है। Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(क्लेम) प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ अंतर्निहित subcellular संरचनाओं का उपयोग कर intracellular गतिशीलता की परिकल्पना करती। क्लेम में, इस तरह cytokinesis और endocytosis 3, 4, 5, 6 के रूप में विभिन्न प्रक्रियाओं, में लगी हुई कोशिकाओं, लिव-ली गई और यह तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित कर रहे हैं। हालांकि क्लेम intracellular गतिशीलता के कुछ पहलुओं को दर्शाता है, वहाँ चार कारकों है कि इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को सीमित कर रहे हैं। धीमी गति से प्रसार और fixatives 7 की प्रतिक्रिया के कारण मिनट - सबसे पहले, लौकिक संकल्प कितनी जल्दी कोशिकाओं स्थिर किया जा सकता है, जो आम तौर रों लेता है द्वारा सीमित है। दूसरा, subcellular वास्तुकला मनाया जाता है पोस्ट कार्योत्तर 8; इस प्रकार, गतिशील रूपात्मक परिवर्तन इस दृष्टिकोण का उपयोग कर काटा नहीं जा सकता। तीसरा, प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन micrographs ठीक ऊतक श की वजह से गठबंधन नहीं किया जा सकताइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 9, 10 के लिए नमूना तैयारी के दौरान निर्जलीकरण की वजह से rinkage। चौथा, cytokinesis और endocytosis तरह की घटनाओं हर कोशिका 5, 11 में एक ही समय में जगह नहीं लेते हैं, और इस तरह, एक विशेष कक्ष है कि घटना में लगी हुई है कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी से पहचान की जानी चाहिए। यह प्रक्रिया अक्सर श्रमसाध्य है। इस प्रकार, एक नई विधि हर कोशिका में विशेष घटनाओं के लिए प्रेरित करने और निर्धारित समय बिंदुओं पर कोशिकाओं का तेजी से स्थिरीकरण से जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है।

हाल ही में, कई उपकरण प्रकाश (optogenetics) का उपयोग विशेष रूप से सेलुलर गतिशीलता प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया है। Channelrhodopsin, reinhardtii 12 Chlamydomonas से 13 अलग-थलग एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील, गैर चयनात्मक कटियन चैनल है। जब channelrhodopsin neurona में व्यक्त किया हैएल झिल्ली, प्रकाश का एक संक्षिप्त फ़्लैश न्यूरॉन्स में सोडियम आयनों की एक बाढ़ लाती है और एक संभावित कार्रवाई 14, 15 से चलाता है। संभावित कार्रवाई तो synaptic टर्मिनल, जहां synaptic vesicles मिलीसेकेंड 16, 17 के भीतर फ्यूज, 18 इसलिए, channelrhodopsin न्यूरोनल गतिविधि को प्रेरित करता है में से प्रसारित। synaptic टर्मिनलों पर झिल्ली गतिशीलता का पालन करने के लिए, न्यूरॉन्स एमएस परिशुद्धता के साथ उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर स्थिर किया जाना चाहिए।

न्यूरोनल गतिविधि उत्प्रेरण के बाद झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए, हम उच्च दबाव ठंड 17, 18, 19 के साथ प्रकाश उत्तेजना मिलकर। उच्च दबाव ठंड कम बर्फ क्रिस्टल गठन 20 के साथ कोशिकाओं के पास तात्कालिक स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है। बर्फ के क्रिस्टल can झिल्ली टूटना और subcellular वास्तुकला 21 को बाधित। उत्तेजना और ठंड के बीच समय अंतराल अलग करके, synaptic टर्मिनलों के भीतर झिल्ली तस्करी एक संभावित कार्रवाई के शामिल होने निम्नलिखित कब्जा कर लिया था।

यहाँ, हम एक वाणिज्यीकरण उच्च दबाव फ्रीजर कि जोड़ों उच्च दबाव ठंड के साथ प्रकाश उत्तेजना की एक एमएस अस्थायी नियंत्रण का उपयोग प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। अन्य उपकरणों है कि प्रकाश उत्तेजना और ठंड नियंत्रित करने के लिए एक बाह्य उपकरण की आवश्यकता के विपरीत, प्रकाश उत्तेजना पूरी तरह से इस प्रणाली में एकीकृत है और एमएस परिशुद्धता 19 के साथ लागू किया जा सकता। इस प्रक्रिया को कई चरण होते हैं। 1) माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स नीलमणि डिस्क पर सभ्य और lentivirus channelrhodopsin 18 के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर ले जाने से संक्रमित हैं। 2) न्यूरॉन्स को प्रेरित किया और उत्तेजना के बाद निर्धारित समय बिंदुओं पर जमे हुए हैं। 3) vitrified पानी विकल्प हैfixatives द्वारा एक कार्बनिक विलायक के साथ घ, जबकि लिपिड और प्रोटीन होते हैं पार से जुड़े intracellular वास्तुकला संरक्षित करने के लिए। 4) नमूने घुसपैठ की और epoxy राल में एम्बेडेड रहे हैं। 5) Ultrathin वर्गों एक ultramicrotome का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं। 6) पतला वर्गों एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर imaged कर रहे हैं। 7) छवि अधिग्रहण और विश्लेषण समय अंक या जीनोटाइप के संबंध में आँख बंद करके प्रदर्शन कर रहे हैं। सेलुलर गतिशीलता समय संकल्प लिया छवियों 17, 18 के पुनर्निर्माण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता। नमूना तैयारी (कदम 2 - 5 ऊपर) एक सप्ताह की आवश्यकता है, लेकिन बाद में छवि विश्लेषण एक वर्ष के लिए महीनों की आवश्यकता है।

Protocol

प्रयोगों के सभी नियम और पशु उपयोग के नियमों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा के अनुसार प्रदर्शन किया गया। प्रोटोकॉल पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) चिकित्सा के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल में द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. अलगाव और माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति

  1. एक प्रसव के बाद 0 दिन से cortices काटना - दिन 2 (P0 - 2) माउस मस्तिष्क 18। cortices से astrocytes अलग।
    नोट: माउस मस्तिष्क कत्ल के बाद पृथक किया गया। Astrocytes हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए एक फीडर परत के रूप में सेवा करते हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA के 800 μL के साथ cortices इलाज astrocytes अलग कर देना करने के लिए।
  3. संस्कृति DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 0.2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एक सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2 से युक्त 13 एमएल के साथ एक टी 75 फ्लास्क में astrocytes।
  4. एक एसिड धोये और निष्फल 18 मिमी कांच coverslip पे रखेंएक 12 अच्छी तरह से थाली के आर अच्छी तरह से।
  5. संक्षेप में 70% इथेनॉल में दो 6 मिमी कार्बन में लिपटे नीलमणि डिस्क धोने और प्रत्येक गिलास coverslip के शीर्ष पर रख दें।
  6. चूहा पूंछ कोलेजन के 1 एमएल और पीडीएल के 1 एमएल (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 17 एनएम एसिटिक एसिड के 3 एमएल मिश्रण से पाली-D-लाइसिन (पीडीएल) समाधान तैयार करें। आरटी पर 5 मिनट के लिए नीलमणि डिस्क और कांच coverslips को पीडीएल समाधान के 200 μL लागू करें।
  7. पीडीएल समाधान और हवा शुष्क निकालें। पराबैंगनी प्रकाश के तहत 30 मिनट के लिए 1.6 -, का उपयोग चरणों में तैयार के रूप में 1.4 थाली नसबंदी से पहले।
  8. थाली में / अच्छी तरह से 5x10 4 कोशिकाओं की एक घनत्व पर DMEM के 2 एमएल में 1.3 कदम से astrocytes बीज चरणों 1.4 में तैयार के रूप में - 1.6। एक सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें विकसित और 5% सीओ 2।
  9. न्यूरॉन्स संवर्धन से पहले कम से कम कुछ घंटे के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए: (80 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) फ्लोरो डिऑक्सीयूरिडीन के 20 μL जोड़ें।
    ध्यान दें: फ्लोरो डिऑक्सीयूरिडीन बंद हो जाता है तारिकाकोशिका विभाजन।
  10. न्यूरोनल बस के 1.5 एमएल मध्यम बदलेंअल मध्यम (सामग्री की तालिका देखें) युक्त 1% एल alanyl-एल glutamine (सामग्री की तालिका देखें), न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए 2% सीरम मुक्त पूरक (सामग्री की तालिका देखें), और 0.2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन ।
  11. एंजाइम समाधान के 5 एमएल (1.65 मिमी Cysteine, 1 मिमी 2 CaCl, और DMEM में 0.5 मिमी EDTA) के लिए papain की 20 इकाइयों को जोड़कर papain समाधान तैयार करें। 20 मिनट के लिए गुजर सीओ 2 गैस से समाधान खट्टा करना। एक 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ फ़िल्टर-नसबंदी।
  12. 2 माउस 18 - एक P0 से मस्तिष्क जल को संचित करें। इसके तत्काल बाद ठंडा Hanks'-संतुलित नमक समाधान (HBSS) के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण। stereomicroscope के तहत हिप्पोकैम्पस काटना, ऊतक HBSS में डूबे हुए रखे हुए हैं।
  13. कदम 1.11 में तैयार papain समाधान के 1 एमएल में दो हिप्पोकैम्पस रखें। 37 डिग्री सेल्सियस और 750 rpm पर एक thermomixer पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  14. युक्त समाधान निष्क्रिय के 1 एमएल के साथ papain बदलेंट्रिप्सिन अवरोध करनेवाला के 2.5 मिलीग्राम और DMEM के प्रति मिली एल्बुमिन की 0.5 मिलीग्राम। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। निष्क्रिय समाधान बंद महाप्राण।
  15. न्यूरोनल बेसल मध्यम (सामग्री की तालिका देखें) अलग हिप्पोकैम्पस के 200 μL जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने की एक 200 μL विंदुक टिप का उपयोग Triturate। जब तक undissociated कोशिकाओं तल पर बसने तक प्रतीक्षा करें। ध्यान से ऊपर से कोशिकाओं के साथ मध्यम हटा दें।
  16. दोहराएँ कदम 1.15 3x। पूल एक नया 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी dissociated कोशिकाओं।
  17. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या गिनें। 6.5 x 10 4 कोशिकाओं की एक घनत्व पर प्लेट न्यूरॉन्स / अच्छी तरह पर तारिकाकोशिका परत चरणों 1.1 में तैयार के शीर्ष - 1.10।
  18. Lentivirus DIV 3 (इन विट्रो में 3 घ) 18 पर channelrhodopsin व्यक्त न्यूरॉन्स संक्रमित।
  19. नीचे 2.5, - फ्लैश और फ्रीज चरणों 2.1 में वर्णित है, DIV 14 पर निष्पादित करें।

2. फ्लैश एकडी-फ्रीज

  1. लगानेवाला की तैयारी
    1. glutaraldehyde के 2.5 एमएल (एसीटोन में 10% शेयर), आज़मियम tetroxide का 0.25 ग्राम, पानी की 0.25 एमएल, और निर्जल एसीटोन के 22.25 एमएल: एक रासायनिक हुड के अंतर्गत, बंधक तैयार करने के लिए एक शंक्वाकार ट्यूब के लिए निम्न पदार्थों जोड़ें।
      नोट: प्रत्येक घटक की अंतिम एकाग्रता एसीटोन में 1% होना चाहिए। Glutaraldehyde फ्रीज प्रतिस्थापन के दौरान प्रोटीन संरचनाओं की रक्षा करने के लिए जोड़ा गया है। चेतावनी: आज़मियम tetroxide की तीव्र विषाक्तता अधिक है। वाष्प के संपर्क में आंख की कॉर्निया को नुकसान पहुंचा सकता। यह केवल एक प्रमाणित रासायनिक हुड में संभाला जाना चाहिए।
    2. विभाज्य गिने क्रायोजेनिक शीशियों (2 एमएल) में बंधक के 1 एमएल। बंधक के प्रयोग से पहले तक तरल नाइट्रोजन में जमे हुए रखें।
      नोट: आज़मियम tetroxide और glutaraldehyde पार प्रतिक्रिया और तलछट; इस प्रकार, एक बार तुरंत मिलाया, विभाज्य, ट्यूब टोपी, और तरल नाइट्रोजन में cryotubes डूब बंधक फ्रीज करने के। क्रायो नंबर एक पेंसिल का प्रयोग करेंgenic शीशियों, के बाद से एसीटोन मार्कर को धोने के कर सकते हैं।
  2. शारीरिक नमकीन की तैयारी
    1. Hepes (10 मिमी, पीएच 7.5), सोडियम क्लोराइड (140 मिमी), KCl (2.4 मिमी), और ग्लूकोज (10 मिमी) के मिश्रण से शारीरिक नमकीन घोल बना लें।
      नोट: ये मान अंतिम सांद्रता हैं। क्रायो-protectants monolayer संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। हालांकि, एक उचित क्रायो-protectant 5 सुक्ष्ममापी से अधिक गहरा नमूनों के लिए आवश्यक है। 20% बीएसए का उपयोग आमतौर पर की सिफारिश की है। खमीर पेस्ट और ई कोलाई OP50 भी मक्खी लार्वा या सी.एलेगन्स के लिए क्रायो-protectants रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 1 मिमी अंतिम सांद्रता में 4 मिमी और 2 MgCl में 2 CaCl जोड़ें।
      नोट: 2 CaCl और 2 MgCl की सांद्रता प्रयोगों के आधार पर बदलती। Exocytic मध्यवर्ती पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए 4 मिमी कैल्शियम पुटिकाओं 18 की रिहाई संभावना में वृद्धि करने के लिए इन विशेष प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है।
    3. चेकपरासारिता एक osmometer का उपयोग कर। सुनिश्चित करें कि यह है 300 ± 5 mOsm।
    4. 30 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए 3 सुक्ष्ममापी और गाबा रिसेप्टर प्रतिपक्षी (bicuculline) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए AMPA रिसेप्टर प्रतिपक्षी (NBQX) जोड़ें।
      ध्यान दें: स्नायुसंचारी रिसेप्टर विरोधियों न्यूरोनल उत्तेजना 18 निम्नलिखित आवर्तक नेटवर्क गतिविधि से बचने के लिए जोड़ रहे हैं।
    5. उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए शारीरिक खारा वार्म अप।
  3. विशिष्ट उच्च दबाव फ्रीज़र और एक स्वचालित फ्रीज प्रतिस्थापन यूनिट की तैयारी
    1. उच्च दबाव ठंड करने से पहले, तरल नाइट्रोजन के साथ टैंक भरने से -90 डिग्री सेल्सियस के लिए एक स्वचालित फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई को ठंडा।
    2. नीचे एसीटोन नमूना कक्ष के अंदर रखकर डिग्री सेल्सियस -90 के लिए एक छोटे कप में कूल।
    3. तरल नाइट्रो के साथ तरल नाइट्रोजन Dewar और उच्च दबाव फ्रीजर के भंडारण Dewar (सामग्री की तालिका देखें) भरेंजनरल।
    4. टच स्क्रीन मॉनिटर का उपयोग कर प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल सेट करें।
      1. करने के लिए "कार्यक्रम का नाम" अगले प्रकाश उत्तेजना खिड़की पर "संपादित करें" पर क्लिक करके कार्यक्रम को नाम दें। एक अन्य विंडो पॉप अप होगा।
      2. "15,000 एमएस" में "अंधेरे चरण," "100 एमएस अवधि" में "" "10 एमएस" में लिखकर एक कार्यक्रम सेट करें "नाड़ी," और "1" 10 में से एक भी प्रोत्साहन के लिए "अवधियों की संख्या" में सुश्री। कोशिकाओं 90 एमएस बाद में (चित्रा 1C) फ्रीज।
        नोट: "अंधेरे चरण" कोशिकाओं नमूना लोड करने के दौरान प्रकाश जोखिम से उबरने के लिए अनुमति देता है। "अवधि" उत्तेजना आवृत्ति को परिभाषित करता है। उदाहरण के लिए, यदि प्रोत्साहन 20 हर्ट्ज पर लागू किया जाना चाहिए, यह कॉलम 50 एमएस में सेट किया जाना चाहिए। "पल्स" प्रकाश उत्तेजना की अवधि परिभाषित करता है। अंत में, "अवधियों की संख्या" लागू किया उत्तेजनाओं की कुल संख्या को परिभाषित करता है। एक उच्च आवृत्ति उत्तेजना की स्थापना के लिए, कृपया
    5. एक "कोई उत्तेजना" नियंत्रण, प्रकार "15 s" में "अंधेरे चरण," "0 एमएस अवधि" में "" "1 एमएस" में "नाड़ी," और "0" "अवधियों की संख्या" में प्रकाश में लिए उत्तेजना सेटअप विंडो, के रूप में कदम 2.3.4 में वर्णित है।
      नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से, "पल्स" कम से कम 1 एमएस होना चाहिए।
    6. मुख्य स्क्रीन पर, सुनिश्चित करें कि प्रकाश उत्तेजना के लिए बॉक्स चिह्नित है।
    7. "नमूना संग्रहण" मुख्य स्क्रीन पर क्लिक करके भंडारण प्रोटोकॉल सेट करें। पर क्लिक करें "संपादित करें।" "-" "2" 2 डिस्क प्रत्येक चैनल में (कुल 3 चैनल) स्टोर करने के लिए चयन करने के लिए निम्न विंडो में, "+" या का उपयोग करें। चेक "संग्रहण LN2 सक्षम होना चाहिए।"
  4. नमूना लोड हो रहा है और उच्च दबाव फ्रीज़र में बर्फ़ीली
    नोट: सभी नमूना विधानसभा और लोड हो रहा है कदम एक 7.5-60X आवर्धन रेंज के साथ एक stereomicroscope के तहत किया जाता है। एक tweezएर 2.4.1 चरणों में प्रयोग किया जाता है - 2.4.4 नमूनों में हेरफेर करने के। प्रयोगों शारीरिक तापमान पर किया जाना चाहिए।
    1. एक नीलमणि डिस्क रखें, सेल की ओर, ऊपर की तरफ काले, मध्यम प्लेट (चित्रा 1 बी) के साथ-साथ में।
    2. नीलमणि डिस्क (चित्रा 1 बी) के ऊपर एक 100 सुक्ष्ममापी स्पेसर अंगूठी रखें।
    3. कदम 2.2 से पूर्व गर्म नमकीन घोल में डिस्क के एक तरफ डुबकी के बाद स्पेसर अंगूठी (चित्रा 1 बी) पर एक खाली नीलमणि डिस्क रखें। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले दो नीलमणि डिस्क के बीच फंस कर रहे हैं।
    4. एक और 100 सुक्ष्ममापी स्पेसर अंगूठी और एक 400 सुक्ष्ममापी स्पेसर अंगूठी (चित्रा 1 बी) रखें। अतिरिक्त तरल फिल्टर पेपर का उपयोग कर निकालें।
    5. दो पारदर्शी आधा सिलेंडर (चित्रा 1 ए) के बीच कदम 2.4.3 से विधानसभा रखें। ठंड की प्रक्रिया आरंभ करने शीर्ष लाल कवर बंद कर दें।
      नोट: पूर्व निर्धारित प्रोटोकॉल स्वचालित रूप से एक बार कवर बंद कर दिया है चलाता है। नमूना ठंड चैम्बर में एक ही ओरिएंटेशन में रहता है, और प्रकाश की एक फ्लैश नमूना विधानसभा के ऊपर से लागू किया जाता है। लाल कवर वापस ऊपर स्वचालित रूप से एक बार ठंड प्रक्रिया पूरी हो जाने दिखाई नहीं देता।
    6. भंडारण Dewar में नमूना संग्रहित करें।
      नोट: ठंड के बाद, नमूना स्वचालित रूप से तरल नाइट्रोजन से भरा एक भंडारण Dewar में गिरा दिया और आगे की प्रक्रिया जब तक वहाँ संग्रहीत किया जाता है। भंडारण Dewar तीन कक्षों हैं, और प्रत्येक कक्ष ज्यादा से ज्यादा 3 नमूने रखे जा सकते हैं। आमतौर पर, दो नमूनों में एक ही उत्तेजना की शर्तों के तहत जमे हुए हैं, और उच्च दबाव फ्रीजर एक ही कक्ष में दोनों स्टोर करने के लिए प्रोग्राम किया जाता।
    7. चरण दोहराएं 2.4.1 - 2.4.6 प्रत्येक नमूना के लिए।
    8. कदम 2.5 एक बार सभी कक्षों भरे हुए हैं आगे बढ़ें।
      नोट: इस उपकरण में एक समय में भंडारण Dewar में 6 नमूनों तक जमा करने वाले थे। इसलिए, हर 6 वें नमूना के बाद, कदम 2.5 किया जाना चाहिए। एक बार उतार दिया, दोहराने कदम 2.4.1 - 2.4.6।
  5. संग्रह नमूना और एक स्वचालित फ्रीज-प्रतिस्थापन यूनिट के लिए स्थानांतरण
    1. भंडारण Dewar, जो उच्च दबाव फ्रीजर के टेबल के नीचे स्थित है के लिए दरवाजा खोलो। भंडारण Dewar निकालें और benchtop पर रखें।
    2. हाथ का उपयोग करना, Dewar से नमूना कक्ष को हटाने और तरल नाइट्रोजन से भरा विशेष नमूना ट्रे में यह हस्तांतरण। घुंडी नमूना कप जारी करने के लिए अनलॉक।
    3. तरल नाइट्रोजन के साथ चिमटी के सुझाव दिए गए पूर्व ठंडा होने के बाद चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर नमूना कप से पारदर्शी आधा सिलेंडर निकालें (~ -196 डिग्री सेल्सियस)। ध्यान से तरल नाइट्रोजन युक्त एक छोटे कप के बीच, काले थाली हस्तांतरण।
      नोट: चिमटी के सुझावों तरल नाइट्रोजन के तापमान को precooled किया जाना चाहिए। नमूना बर्फ क्रिस्टल गठन को रोकने के लिए हर समय तरल नाइट्रोजन के तहत रखा जाना चाहिए।

3. Au में फ्रीज प्रतिस्थापनtomated फ्रीज-प्रतिस्थापन यूनिट

  1. (~ -196 डिग्री सेल्सियस पर सुझाव) precooled चिमटी का उपयोग करना, जल्दी से precooled एसीटोन करने के लिए कदम 2.5.3 से मध्यम प्लेट हस्तांतरण (-90 डिग्री सेल्सियस)।
  2. धीरे मिलाते हुए या दोहन से अलग बीच थाली से नीलमणि डिस्क।
    नोट: कभी कभी, यह मध्य थाली से नीलमणि डिस्क को अलग करना मुश्किल हो सकता है। ऐसी स्थिति में, precooled एसीटोन में मध्यम थाली छोड़ देते हैं (-90 डिग्री सेल्सियस) कुछ मिनट के लिए। चिमटी से कोमल दोहन भी मध्यम थाली से नीलमणि अलग कर देना मदद करता है।
  3. प्रतिस्थापन इकाई की एक नमूना कक्ष के अंदर fixatives (कदम 2.1) से युक्त एक क्रायोजेनिक शीशी रखें। क्रायोजेनिक शीशी के लिए नीलमणि डिस्क स्थानांतरण और शीशी पर एक टोपी जगह।
  4. फ्रीज प्रतिस्थापन कार्यक्रम सेट अप इस प्रकार है: (i) -90 ° 5 के लिए सी - 30 घंटे, (ii) -90 - -20 डिग्री सेल्सियस में 14 घंटे (5 डिग्री सेल्सियस / घंटा), (ग) -20 डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री सेल्सियस में 4 घंटे (10 डिग्री सेल्सियस / घंटा) - 12 घंटे, और (iv) -20 डिग्री सेल्सियस के लिए।
    नोट: डु-90 डिग्री सेल्सियस पर पहला कदम का राशन अलग किया जा सकता है। फ्रीज प्रतिस्थापन की कुल अवधि इस तरह से कि कार्यक्रम सुबह (~ 1.5 घ postexperiment) लगभग 8 ऐम में समाप्त हो जाती है, ताकि बाद में चरणों दिन के दौरान किया जा सकता है में सेट है।

4. Epoxy राल के साथ घुसपैठ और प्लास्टिक एम्बेडिंग

  1. एक बार प्रोग्राम समाप्त हो जाती है, एक रासायनिक हुड के प्रतिस्थापन इकाई के नमूना कक्ष से नीलमणि डिस्क युक्त क्रायोजेनिक शीशियों स्थानांतरण करने के लिए दस्ताने हाथ का उपयोग करें।
  2. एक विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक क्रायोजेनिक शीशी के लिए एसीटोन (कमरे के तापमान) जोड़ सकते हैं और प्रत्येक नीलमणि डिस्क 4 धोने - 2 घंटे - 1 के लिए 6x।
  3. वैकल्पिक रूप से, 1 घंटे के लिए 0.1% uranyl एसीटेट में नमूनों को सेते हैं, तो अतिरिक्त विपरीत की जरूरत है। धो 4 - 2 घंटे - से अधिक 1 एसीटोन साथ 6x।
    नोट: चेतावनी: वहाँ uranyl एसीटेट, जो ऊपरी श्वास नलिका की जलन का कारण बनता है की साँस लेना निम्न आंतरिक जोखिम के साथ जुड़े जोखिम है। उच्च जोखिम damag कर सकते हैंई रक्त कोशिकाओं। uranyl एसीटेट के साथ काम करें निकास वेंटिलेशन के तहत किया जाना चाहिए। सुरक्षात्मक कपड़ों की सिफारिश की है।
  4. ग्लिसरॉल polyglycidyl ईथर के 6.2 ग्राम, bisphenol-ए epoxy राल की 4.4 ग्राम, और dodecenyl succinic एनहाइड्राइड (DDSA) की 12.2 ग्राम वजन से तरल epoxy राल मध्यम तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और मिश्रण जबकि बेंजाइल dimethylamine (BDMA) के 800 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए डी-गैस।
  5. 100% epoxy राल कदम 4.4 में तैयार से एसीटोन में 30, 70, और 90% epoxy राल तैयार करें।
  6. नीलमणि डिस्क युक्त क्रायोजेनिक शीशियों 30% epoxy राल जोड़ें और 2 के लिए सेते हैं - 120 rpm पर एक कक्षीय शेकर में आरटी पर 3 एच।
  7. pipetting द्वारा 70% epoxy राल के साथ 30% epoxy राल बदलें और 3 के लिए सेते हैं - एक कक्षीय शेकर में आरटी पर 4 घंटे।
  8. चिमटी का प्रयोग, एक embedding कैप्सूल की टोपी के लिए, प्रत्येक नीलमणि डिस्क, सेल साइड-अप के लिए स्थानांतरण। टोपी के लिए 90% epoxy राल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  9. अगले दिन, चरण 4 में के रूप में, ताजा epoxy राल मध्यम बनाना.4।
  10. एक embedding कैप्सूल की टोपी का सामना प्रत्येक नीलमणि डिस्क, सेल की ओर स्थानांतरण,। ताज़ा तैयार 100% epoxy राल के साथ टोपी भरें। ताजा 100% epoxy राल के लिए परिवर्तित करें हर 2 घंटे, तीन बार दोहरा।
  11. एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में नमूने रखें 48 ज भाजन करना के लिए।

5. बढ़ते नमूने

  1. stereomicroscope ताकि नीलमणि डिस्क राल ब्लॉक के शीर्ष पर स्थित है पर नमूना उलटा रखें। एक रेजर ब्लेड के साथ यह छीलन द्वारा ऊपर से epoxy राल की पतली परत निकालें।
  2. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, नीलमणि डिस्क के किनारे के साथ एक उथले लाइन काट इस लाइन कदम 5.3 में epoxy राल से नीलमणि डिस्क को अलग करने में मदद करता है।
  3. लगभग 10 s के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबकी द्वारा अलग epoxy राल से नीलमणि डिस्क।
    नोट: कोशिकाओं epoxy राल में रहना होगा।
  4. नीलमणि डिस्क हटाने के बाद, एक चीर-फाड़ गुंजाइश का उपयोग कोशिकाओं के साथ एक क्षेत्र को खोजने के लिए (4-10X आवर्धन)। (दो धार) ब्याज की क्षेत्र (~ 2 एक्स 2 मिमी) एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर चारों ओर काटें। जगह में नमूना रखने के लिए, जबकि नमूना माइक्रोस्कोप की सतह के लिए टेप किया गया है इस कदम प्रदर्शन करते हैं।
  5. प्लास्टिक का छोटा सा टुकड़ा (~ 2 एक्स 2 एक्स 5 मिमी) epoxy राल से बना एक बेलनाकार डमी खंड पर एथिल cyanoacrylate युक्त गोंद का उपयोग कर कोशिकाओं से युक्त माउंट करें। 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक सेते हैं।

6. सेक्शनिंग

  1. नमूना अनुभाग के लिए एक ultramicrotome का उपयोग करें।
    1. के 3 मिमी / गति और 200 एनएम / अनुभाग का एक मोटाई पर एक गिलास चाकू के साथ प्लास्टिक एम्बेडेड नमूना की सतह ट्रिम। सतह जहां astrocytes स्थित हैं से 5 वर्गों - 4 काटें।
    2. का 0.8 मिमी / गति और 40 एनएम / अनुभाग का एक मोटाई में एक हीरे की चाकू और अनुभाग में स्विच करें। 25 वर्गों - 20 काटें।
  2. एकल स्लॉट तांबे ग्रिड पर वर्गों 0.7% पॉलीविनाइल एसीटेट के साथ कवर के रिबन इकट्ठा (देखेंसामग्री की तालिका)।

7. इमेजिंग एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEM) का उपयोग करना

  1. इमेजिंग मंदिर के, 5 मिनट के लिए मेथनॉल में 2.5% uranyl एसीटेट के साथ अनुभाग दाग पहले।
  2. 50% मेथनॉल में ग्रिड 15x धो लें। फिर, ultrapure पानी 15x में धोने के प्रत्येक धोने तक चलने वाले 30 s के साथ।
  3. अनुभाग संक्षेप में एयर सूखे और TEM का एक नमूना धारक में ग्रिड जगह।
  4. 93,000X आवर्धन पर छवि।
  5. चित्र प्राप्त।
    नोट: इमेजिंग आम तौर पर समय अंक या जीनोटाइप अंधा किया जाता है, और आम तौर पर ~ 200 छवियों एकत्र कर रहे हैं / समय बिंदु।

8. छवि विश्लेषण

  1. एक कस्टम मैक्रो (वातानाबे, डेविस, और जॉर्गेन्सन, अप्रकाशित) के साथ एक सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करें।
    नोट: x / y निर्देशांक पुटिकाओं से दर्ज हैं, प्लाज्मा झिल्ली, सक्रिय क्षेत्र झिल्ली, और अन्त्रग्रंथन s अन्य सभी झिल्ली से बंधा अंगों। पाठ filजानकारी युक्त तों एक और सॉफ्टवेयर (जैसे, मैटलैब) को निर्यात कर रहे हैं। डेटा आगे कस्टम प्रोग्राम का उपयोग विश्लेषण किया जाता है।

Representative Results

प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित का उपयोग करना, हम माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में "फ्लैश और फ्रीज" प्रयोगों channelrhodopsin व्यक्त प्रदर्शन किया। इन न्यूरॉन्स या तो 15 एमएस या प्रकाश शुरू होने के बाद 100 एमएस जमे हुए थे। हम पहले से पता चला है कि एक्सोसाइटोसिस और synaptic पुटिका endocytosis 15 एमएस में synaptic टर्मिनलों और 100 एमएस समय अंक क्रमश: 18 में होते हैं। इन घटनाओं को सफलतापूर्वक उचित समय (चित्रा 2) पर कब्जा कर लिया गया, सुझाव है कि फ्लैश और फ्रीज प्रयोगों सफलतापूर्वक चुना विशेष उच्च दबाव फ्रीजर पर किया जा सकता (सामग्री की तालिका देखें)।

आकृति 1
चित्र 1 नमूना लोड हो रहा है और उच्च दबाव फ्रीज़र में प्रोग्रामिंग। ए) एक उच्च पी का नमूना लोड हो रहा है तालिकाressure फ्रीजर। मध्यम थाली, संरचनात्मक विस्तार के लिए इनसेट में दिखाया गया है, नमूना लोड करने के लिए एक क्लेम होल्‍डर में रखा गया है। आधा सिलेंडरों में से एक नमूना लोड हो रहा है तालिका के निचले हिस्से पर रखा गया है, और अन्य शीर्ष कवर करने के लिए एक क्लिप के साथ जुड़ा हुआ है। एक बार नमूना लोड किया जाता है, मध्यम प्लेट नीचे आधा सिलेंडर के लिए आगे धकेल दिया जाता है और कवर ठंड शुरू करने के लिए बंद कर दिया है। बी) नमूना विधानसभा। नीलमणि न्यूरॉन्स युक्त डिस्क सेल साइड ऊपर की ओर रखते बीच प्लेट की अच्छी तरह से में रखा गया है,। एक 100 सुक्ष्ममापी अंगूठी सीधे अच्छी तरह से अंदर नीलमणि डिस्क ऊपर रखा गया है। फिर, एक खाली नीलमणि डिस्क शारीरिक खारा में डूबा हुआ नीचे समाधान-पक्ष के साथ रखा गया है। हवाई बुलबुले से परहेज किया जाना चाहिए। अंत में, एक 100 सुक्ष्ममापी अंगूठी और एक 400 सुक्ष्ममापी अंगूठी आराम से ऊपर रखा जाता है। किसी भी अतिरिक्त तरल फिल्टर पेपर के साथ हटा दिया जाता है। सी) नीलमणि डिस्क epoxy राल में डूबे हुए के साथ एक embedding कैप्सूल का एक पार अनुभाग। Sappकिराया डिस्क सेल साइड ऊपर की ओर रखते कैप्सूल में सबसे नीचे रखा, और घुसपैठ और एम्बेडिंग के लिए epoxy राल के साथ कवर किया जाता है। डी) एक एकल, 10 एमएस प्रोत्साहन के लिए उच्च दबाव फ्रीजर प्रोग्रामिंग। नमूनों प्रकाश नाड़ी के बाद 90 एमएस जमे हुए हैं। ई) 20 हर्ट्ज पर 10 उत्तेजनाओं के लिए उच्च दबाव फ्रीजर प्रोग्रामिंग। नमूनों पिछले प्रकाश नाड़ी के बाद 5 एमएस जमे हुए हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में शामिल 2. exocytosis और endocytosis का विजुअलाइजेशन। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स एक बार उत्तेजित और संकेत दिया समय पर जमे हुए हैं। इलेक्ट्रॉन micrographs एक synaptic पुटिका एक की एक्सोसाइटोसिस) और ultrafast endocytosis दिखाने यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

"फ्लैश और फ्रीज" दृष्टिकोण optogenetics के साथ एक विशेष सेलुलर घटना उत्प्रेरण से और उत्तेजना 19 के बाद ठंड निर्धारित समय बिंदुओं पर कोशिकाओं द्वारा झिल्ली गतिशीलता की परिकल्पना करती। इस प्रदर्शन में, हम न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने channelrhodopsin, एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल का इस्तेमाल किया, और synaptic टर्मिनलों पर संलयन और synaptic vesicles की वसूली पर कब्जा कर लिया। हाल के वर्षों में कई optogenetic उपकरण 22, 23, जो सभी के फ्लैश और फ्रीज के साथ संगत कर रहे हैं विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, organelle तस्करी cryptochrome और CIB1 24 के आलोक प्रेरित heterodimerization का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता। इसी तरह, प्लाज्मा झिल्ली की लिपिड रचना प्लाज्मा झिल्ली से 25 phosphoinositide फास्फेटेजों के प्रकाश प्रेरित अनुवादन द्वारा बदला जा सकता। इसके अलावा, छोटे, प्रकाश के प्रति संवेदनशील azobenzene ch तरह यौगिकोंAnge रचना रोशनी तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करता है। इस गठनात्मक परिवर्तन ligand-गेटेड चैनल सक्रिय करने के लिए या झिल्ली 26, 27 में लिपिड रचना को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। बंदी यौगिकों भी सेलुलर गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, मौजूदा सेटअप में इस्तेमाल किया एलईडी uncaging के लिए पर्याप्त ऊर्जा का उत्पादन नहीं कर सकते; इस प्रकार, प्रणाली के आगे अनुकूलन की संभावना जरूरी हैं। फिर भी, इन प्रकाश सक्रिय उपकरणों के अनुप्रयोगों लचीला-कई सेलुलर घटनाओं प्रकाश की एक फ्लैश द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। "फ्लैश और फ्रीज" जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा कर सकते हैं।

वहाँ "फ्लैश और फ्रीज" विधि के लिए दो मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह विभिन्न कोशिकाओं से एक विशेष घटना की "स्नैपशॉट" कैप्चर करता है। दूसरे शब्दों में, यह समय की अवधि में एक सेल में झिल्ली गतिशीलता का पालन करने के लिए संभव नहीं है। इस प्रकार, किसी सेलुलर के पुनर्निर्माण के लिए भीटी, एक को प्राप्त करने और प्रत्येक नमूने से और हर बार बिंदु पर छवियों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करना चाहिए। इसके अलावा, न्यूरॉन्स में, छवियों के एक और भी बड़ी संख्या के लिए आवश्यक है, के बाद से synaptic vesicles के संलयन केवल 20 में स्थानों लेता है - माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 18, 28 में synapses के 30%। इतनी बड़ी डेटासेट के विश्लेषण के लिए समय की भारी मात्रा की आवश्यकता है। भविष्य में, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दृष्टिकोण और अधिक कुशल 29, 30 बनाने के लिए स्वचालित किया जा करने की जरूरत है।

दूसरी सीमा उच्च दबाव ठंड तकनीक की प्रकृति के द्वारा लगाया गया है। जब कोशिकाओं फ्रीज, सेलुलर पानी बर्फ के क्रिस्टल के रूप में करता है, तो ठंड दर से नीचे 100 कश्मीर / एस 21 है rearranges। ये बर्फ के क्रिस्टल झिल्ली घुसना या विलेय ध्यान केंद्रित स्थानीय आसमाटिक दबाव को बदलने के लिए, झिल्ली का टूटना, जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं। बर्फ के क्रिस्टल से बचने के लिए, higज दबाव (~ 2,000 एटीएम) नमूनों के लिए लागू किया जाता है। सुपर शीतलन प्रभाव के कारण, 100 कश्मीर / s की ठंड दर इस दबाव 21 में बर्फ के क्रिस्टल के गठन से पानी को रोकने के लिए पर्याप्त है। सिद्धांत रूप में, के रूप में मोटी नमूनों के रूप में 500 सुक्ष्ममापी बर्फ के क्रिस्टल के बिना जमे हुए किया जा सकता है, लेकिन लगभग 200 सुक्ष्ममापी संभावना व्यावहारिक सीमा, के रूप में बर्फ के आयातफलकी रूपों मोटी ऊतक में फार्म के लिए करते हैं, है आकृति विज्ञान समझौता किए। जब प्रसंस्करण नमूने मोटा से अधिक 5 सुक्ष्ममापी, इस तरह के बीएसए के रूप में एक उचित क्रायो-protectant का उपयोग करते हैं, आवश्यक है। हालांकि, बीएसए समाधान की परासारिता बदल जाएगा और कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता। इसलिए, व्यापक नियंत्रण प्रयोगों विशेष प्रणालियों में बीएसए के उपयोग को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं। बर्फ के क्रिस्टल उच्च दबाव ठंड के बाद अगर नमूनों गलती से तरल नाइट्रोजन स्नान से निकाल दिए जाते बना सकते हैं। इस प्रकार, यह हर समय तरल नाइट्रोजन में नमूनों रखने के लिए और करने के लिए पूर्व ठंडा संदंश का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैउन्हें हेरफेर।

जब प्रयोगों की योजना बना रहा है, तो निम्न तीन अंक माना जाना चाहिए। 8.0 मेगावाट / मिमी 2 - सबसे पहले, प्रकाश की अधिक से अधिक तीव्रता (460 एनएम लाइन) 5.5 है। क्या यह तीव्रता गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी फ्लैश और फ्रीज प्रयोगों से पहले पर लाइव सेल इमेजिंग के साथ सत्यापित किया जाना चाहिए। दूसरा, प्रयोगों शारीरिक तापमान पर किया जाना चाहिए। उच्च दबाव फ्रीजर के मंच माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 31 के साथ प्रयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस को गरम किया जाता है। अंत में, समय अंक ध्यान से झिल्ली गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए चुना जाना चाहिए। प्रारंभिक अध्ययन बताते endocytosis उत्तेजना के 100 एमएस के बाद पूरा हो गया है कि। इस प्रकार, तीन अतिरिक्त समय अंक (15, 30, और 50 एमएस) भी झिल्ली गतिशीलता 17, 18 का पालन करने के जांच की गई। ये समय अंक झिल्ली तस्करी घटना कल्पना करने के लिए आवश्यक थेअन्तर्ग्रथनी संचरण के दौरान। हालांकि, समय बिंदुओं की संख्या के लिए आवश्यकता प्रत्येक सेलुलर घटना में अलग हैं। इसलिए, कुछ समय अंक बड़े डाटासेट संग्रह शुरू करने से पहले नमूना किया जाना चाहिए।

Disclosures

इस लेख के ओपन एक्सेस प्रकाशन लीका Mikrosysteme GmbH द्वारा प्रायोजित था।

Acknowledgments

इस काम के जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय (दप) से धन द्वारा समर्थित किया गया। हम उनके तकनीकी सहायता के लिए चिकित्सा माइक्रोस्कोप सुविधा के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल धन्यवाद। हम तकनीक के विकास के लिए एरिक जॉर्गेन्सन और क्रिश्चियन रोजेनमंड और उनके प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद। हम आरंभिक उपकरण के डिजाइन के लिए एम वायने डेविस धन्यवाद। हम उनके तकनीकी सहायता के लिए पॉल वुर्जिंगर, क्वेटा टोमोवा, और Delgermaa Luvsanjav धन्यवाद। हम यह भी पांडुलिपि के उनके महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए नेटली आर हैमिल्टन और ग्रैंट F कुसिक धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System  for Light and Electron Microscopy -AFS II Leica 
High Pressure Freezer - EM-ICE Leica  EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.
Osmometer Gonotec
Ultramicrotome UC7 Leica 
Oven Blue M
Razor blade Personna
Glutaraldehyde EMS 16530
Osmium tetroxide EMS RT19132 Toxic, open only under certified chemical hood
Acetone EMS RT10016
HEPES Emdmillipore 391340-250GM
Glucose Sigma 49159-1KG
KCl Sigma 746436-1KG
NaCl Sigma S7653-1KG
CaCl2 Sigma 21115-250ML
MgCl2 J.T.Baker 2444-01
Liquid epoxy resin Eponate 12 Ted Pella 18028
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 Ted Pella 18028
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) Ted Pella 18028
Benzyl dimethyl amine (BDMA) Ted Pella 18241
Special embedding (BEEM) capsule EMS 70021
Copper Grid Ted Pella 1GC12H
Polyvinyl acetate (Pioloform F) Ted Pella 19244
Uranyl acetate Polysciences 21447-25
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) Scotch 170497
Trypsin-EDTA Themo scientific 25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Thermo scientific 10569-044 Should be warmed to 37 °C before use
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo scientific 26140-079
Pen-Strep Thermo scientific 15140-122
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503
Glass cover slip Fisher S175223 Should be acid-washed
Sapphire disc Technotrade 616-100
Acetic acid Emdmillipore 1000631011
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma P6407
Rat tail collagen Thermo scientific A10483-01
Neurobasal A Fisher 10888022 Should be warmed to 37 °C before use
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Fisher 35050-079
Seraum free supplement  (B-27)  Fisher 17504044
Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific 24020117
Papain Worthington LS003126 Active Unit should be calculated for each batch
Thermomixer Eppendorf  Thermomixer C
Trypsin inhibitor Sigma T9253
NBQX Tocris 03-731-0
Bicculine Tocris 01-091-0
Whatman I filter paper GE
Transmission Electron Microscope Philips CM20

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References

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Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe, S. Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55664, doi:10.3791/55664 (2017).

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